Universidad Nacional del Nordeste - Facultad de Medicina - Microbiologa e Inmunologa

Gentica bacteriana
Luis A. Merino

NCLEO O GENOMA BACTERIANO

Debido a las diferencias que existen entre el material gentico de clulas procariotas y eucariotas, algunos autores han preferido denominarlo equivalente nuclear, cromosoma bacteriano o nucleoplasma. De aqu en ms lo llamaremos cromosoma bacteriano, aunque su estructura y asociacin a protenas es muy diferente del cromosoma verdadero presente en las clulas eucariotas. El cromosoma bacteriano es una estructura filamentosa superenrollada de un nico filamento de ADN que una vez separado de la bacteria aparece en forma circular. A diferencia de los cromosomas eucariotas no est asociado con histonas y ocupa aproximadamente el 10% de la clula bacteriana. El superenrollamiento en el cromosoma bacteriano se debe a la asociacin con enzimas denominadas topoisomerasas (que producen cortes en las cadenas de ADN, aumentan o disminuyen el superenrollamiento y resellan) por lo que son indispensables para el mantenimiento y la divisin del ADN bacteriano. El ADN est compuesto por dos cadenas de polinuclotidos compuestos por mononucletidos unidos entre s por molculas de ortofosfato. Cada una de estas molculas esterifica por un lado la desoxirribosa de un nuclotido en posicin 5 y por el otro, el azcar del nucletido siguiente en posicin 3 (Figura 1). Las bases del ADN bacteriano son pricas (adenina y guanina) y pirimdicas (citosina y timina) y generalmente contiene de 1000 a 9000 kilobases (kb), dependiendo de la bacteria en estudio. Ambas cadenas poseen polaridades opuestas y es por ello que se establecen uniones adenina-timina y guaninacitosina en los dos sentidos posibles (AT o TA y CG o GC).

Fig. 1: Estructura de un nuclotido

Funciones de ADN 1. El ADN confiere a la bacteria todas sus caractersticas genticas. El cromosoma se subdivide en segmentos denominados loci que actan como unidades genticas funcionales (genes). Cada gen posee una secuencia de bases y por lo tanto, determina la estructura de un polipptido. La localizacin de cada gen dentro de un cromosoma constituye el denominado mapa gentico de la bacteria. Se ha establecido que la composicin de bases de un cromosoma se expresa como el porcentaje de guanina-citosina sobre el nmero total de bases y este porcentaje puede ser utilizado para estudiar relaciones filogenticas entre diferentes bacterias. 2. Interviene en los mecanismos de transferencia gentica de bacteria madre a hija. 3. La duplicacin del ADN trae aparejada la simultnea divisin celular. 4. Regula la sntesis proteica ya que es capaz de portar genes que codifican hasta 4.000 cadenas polipeptdicas diferentes, cuya sntesis requiere la formacin inicial de ARN a partir del ADN mediante la ARN-polimerasa en un proceso denominado transcripcin.

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Replicacin del ADN El ADN se reproduce mediante un mecanismo semiconservador, o sea que las cadenas se separan y cada una de ellas acta como un molde para la nueva cadena suplementaria que se ir formando, obtenindose como resultado dos nuevas hlices dobles idnticas a la original (Figura 2). El cromosoma es considerado un replicn, es decir, que es quien decide el momento de duplicarse pues es portador de los genes iniciador y autoduplicador. El autoduplicador es el gen que est unido a la ADN-polimerasa y el iniciador es el gen que le informa al autoduplicador para que comience la replicacin. El autoduplicador estara unido a la membrana y ocupara un sitio del ADN denominado oriC y en ese lugar ira girando la molcula de ADN (Figura 3). La duplicacin del ADN por la ADN-polimerasa implica la ruptura de los puentes de hidrgeno entre ambas cadenas y su separacin y esto ocurre por giro del cromosoma sobre el punto de unin en el mesosoma. Terminada la replicacin los dos cromosomas se

separan dividiendo el mesosoma sobre el cual estaban fijos, asegurando al mismo tiempo la divisin bacteriana mediante la formacin de septos.

Fig. 2: Duplicacin del ADN bacteriano en dos cadenas idnticas

Fig. 3: Replicacin del ADN a partir de su unin al mesosoma y posterior divisin en dos cadenas completas

ARN BACTERIANO Son tres los tipos de ARN presentes en el citoplasma bacteriano: 1. ARN mensajero (ARNm) que lleva el menaje gentico que codifica la sntesis de protenas recogida en forma de tripletes de bases (codones). 2. El ARN ribosmico (ARNr) que es quien traduce el mensaje del ARNm. Consta de dos subunidades (50S y 30S) con dos lugares funcionales: aminoacil o aceptor (sitio A) donde se unen los aminocidos y peptidil o dador (sitio P). 3. El ARN de transferencia (ARNt) es el encargado de transportar los aminocidos hacia el ribosoma para realizar la sntesis proteica. (Figura 4). Fig. 4: Formacin de polirribosomas y sntesis proteica. A: subunidades ribosmicas; B: extremo 5 del ARNm; C,D y F: cadenas polipeptdicas en desarrollo; F: extremo terminal 3 del ARNm; G: Sntesis completa del polipptido; H: subunidades ribosmicas salientes.

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ADN EXTRACROMOSMICO Plsmidos Se consideran como tales una serie de molculas facultativas no esenciales para la bacteria con las siguientes caractersticas: 1. 2. 3. 4. 5. Son replicones (capaces de coordinar su propia replicacin). Se duplican independientemente de la duplicacin del cromosoma. Se transmiten por herencia a las clulas hijas. Son portadores de genes con gran funcin biolgica pero generalmente no esencial para la vida bacteriana. Pueden ser transferidos a otra bacteria por conjugacin (Figura 5). Los plsmidos de mayor tamao portan genes que codifican la formacin de pili sexuales y por ende su propia transferencia (plsmidos conjugativos) mientras que los de menor tamao no lo hacen (no conjugativos). Aparecen como molculas circulares de ADN de cadenas helicoidales y superenrolladas conocida como crculo cerrado covalente (ccc). Pueden aparecer en nmero mayor que uno. La competicin entre plsmidos muy similares por la ADN-polimerasa y por el sitio de unin a los mesosomas hace que exista incompatibilidad entre distintos plsmidos lo que permite clasificarlos. La incompatibilidad condiciona que dos plsmidos muy similares (igual grupo de incompatibilidad) no puedan heredarse en forma conjunta. Puede ocurrir la prdida espontnea o inducida de plsmidos durante la divisin bacteriana (curacin). La presencia de un plsmido conjugativo puede inducir la transferencia de uno no conjugativo presente en la misma bacteria. Los plsmidos no conjugativos pueden transferirse mediante transduccin por un bacterifago. Los plsmidos pueden recombinarse con el cromosoma o con otros plsmidos mediante un mecanismo de crossing-over regulado por enzimas recombinasas e integrasas.

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Fig. 5: Mecanismo de conjugacin entre dos bacterias.. Tipos y funciones de los plsmidos Los plsmidos se clasifican en base a los caracteres que expresan. 1. Factores sexuales: son autotransferibles y codifican la produccin de pili sexuales F. Las bacterias portadoras de este plsmido se denominan F+ y las que no lo poseen se denominan F-. 2. Factores de resistencia o factores R: codifican la resistencia de las bacterias frente a antibiticos. Estn formados por dos componentes denominados factor de transferencia de la resistencia (FTR) y determinantes r que portan los genes responsables de las enzimas que destruyen los antibiticos (Figura 6). Los plsmidos R se transmiten de una bacteria resistente a una sensible propagando la resistencia a los antimicrobianos planteando situaciones epidemiolgicas graves. Algunas bacterias presentan plsmidos R cointegrados que portan genes de resistencia a mltiples antibiticos covalentemente unidos en una misma molcula circular simple. 3. Plsmidos determinantes de patogenicidad: son aquellos que portan genes que codifican la produccin de sustancias nocivas para el husped. Ejemplos: Plsmidos Ent: codifican la sntesis de enterotoxinas (Escherichia coli, Vibrio cholerae). Plsmidos Inv: codifican la penetracin (invasin) en clulas epiteliales (Shigella sp). Plsmidos Hly: codifican la produccin de -hemolisinas (S. pneumoniae). 4. Factores Col: son los que codifican la produccin de sustancias antibacterianas similares a los antibiticos, las bacteriocinas, letales para bacterias del mismo o diferente gnero. Son ejemplos las colicinas (Escherichia coli), piocinas (Pseudomonas aeruginosa), marcescinas (Serratia marcescens). 3

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5. Plsmidos degradantes: portan genes capaces de codificar enzimas que las bacterias utilizan para degradar sustancias presentes en el ambiente como tolueno, alcanfor y salicilatos. Son frecuentes en bacterias que habitan el suelo. Fig. 6: modelo de plsmido portador de genes de resistencia a diferentes antimicrobianos. FTR: factor de transferencia de la resistencia. Cm: cloramfenicol. Sm: estreptomicina. Nm: neomicina. Su. sulfas. Tc: tetraciclina.

ALTERACIONES EN LAS CARACTERSTICAS DE UNA POBLACIN BACTERIANA La informacin gentica codificada en el ADN se denomina genotipo, sin embargo no todos los caracteres codificados se manifiestan, sino que el medio ambiente condiciona la aparicin o no de ellos. Es por ello que a los caracteres manifestados o expresados por interaccin entre el genotipo y el medio ambiente se denomina fenotipo. Las modificaciones que pueden aparecer en una poblacin bacteriana pueden afectar su fenotipo o su genotipo. En el primer caso se denominan variaciones fenotpicas o adaptaciones y en el segundo caso se trata de variaciones genotpicas que pueden ser mutaciones o fenmenos de transferencia de material gentico. Variaciones fenotpicas o adaptaciones Las variaciones fenotpicas o adaptaciones son cambios en el fenotipo que no afectan al genoma bacteriano o sea que no son heredables. Responden a una presin del medio ambiente en el cual la bacteria se est desarrollando y revierten al estado inicial cuando se elimina la causa de presin. Las variaciones fenotpicas pueden ser: 1. Morfolgicas: cambios de forma, de tamao, aparicin o no de flagelos, esporas, cpsula, etc. 2. Cromgenas: produccin o no de pigmentos segn la temperatura a la que estn creciendo las bacterias, por ejemplo, algunas cepas de P. aeruginosa suelen producir pigmentos a temperatura ambiente pero no a 37C. 3. Enzimticas: produccin de enzimas inducibles, por la presencia del sustrato en el medio. Por ejemplo la produccin de -galactosidasa en presencia de lactosa. 4. Patognicas: cambios en la capacidad de producir enfermedad. Por ejemplo Corynebacterium diphteriae toxignica y la produccin de una toxina segn la concentracin de hierro en el medio. Mutaciones Las mutaciones son cambios espontneos, irreversibles y hereditarios de alguna caracterstica de la bacteria y que no dependen de la incorporacin de material gentico de otro microorganismo. La bacteria con la caracterstica original se denomina salvaje y la que vara se denomina mutante. Bioqumicamente las mutaciones son cambios en la secuencia nucleotdica por sustitucin, adicin o prdida de un par de bases (mutaciones puntuales), por alteraciones en muchos pares de bases (fragmento de ADN cromosmico) o por translocacin de secuencias de insercin o transposones. La consecuencia ser la produccin de una protena nueva que puede no producir alteraciones en la funcin, alterarla o incluso puede no ser funcional en cuyo caso, si la protena es esencial para la vida bacteriana, se tratara de una mutacin letal. Las mutaciones se caracterizan por. 8 1. Son de baja frecuencia de aparicin, con una probabilidad de 1 por cada 10 bacterias como promedio. 2. El carcter heredado por una mutacin solo puede ser revertido por otra mutacin (mutacin reversa). 3. La mutante puede producirse an en ausencia del agente que se ve afectado, pero ste selecciona a la mutante. Es el ejemplo de seleccin de mutantes resistentes a un determinado antimicrobiano durante un tratamiento prolongado. 4. Las mutaciones pueden traducirse en modificaciones de diferentes tipos: Morfolgicas: se manifiestan por cambios en la cpsula, flagelos, pared, fimbrias, etc.

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Bioqumicas: con cambios en el metabolismo con incapacidad para sintetizar un determinado metabolito. Patognicas: se traducen en alteraciones en la virulencia bacteriana. Mutantes letales condicionales: se expresan en determinadas condiciones ambientales y no en otras. De sensibilidad a fagos y bacteriocinas: de gran importancia en epidemiologa. De sensibilidad a antimicrobianos: de gran importancia en infectologa. Se manifiesta por la produccin de enzimas inactivantes de antimicrobianos o por cambios en los sitios sobre los cuales acta el antibitico. En algunos casos la mutacin no se expresa fenotpicamente y entonces a la bacteria se la denomina mutante reprimida, pero en determinada circunstancia sta puede comenzar a expresar el nuevo fenotipo y entonces pasa a ser una mutante desreprimida. 5. La tasa de aparicin de mutaciones puede incrementarse ampliamente por el uso de radiaciones ionizantes o ultravioletas, por productos qumicos como la mostaza nitrogenada, mitomicina C, 5bromouracilo, cido nitroso, etc. A todos estos agentes se los denomina mutgenos. TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO Las bacterias pueden cambiar su composicin gentica no slo por mutaciones sino por la adquisicin de ADN proveniente de otras bacterias o virus. Estas transferencias pueden llevarse a cabo por los siguientes mecanismos: Transformacin, Transduccin, Transfeccin, Conversin y Conjugacin. El ADN transferido se denomina exogenote por su condicin de extrao y puede permanecer libre en el citoplasma bacteriano o incorporarse al ADN cromosmico (endogenote) en un proceso de recombinacin o integracin. Transformacin Ciertas bacterias son capaces de tomar ADN exgeno a partir del medio ambiente e integrarlo a su cromosoma propio. El ADN se fija a la pared celular, es dividido en pequeos fragmentos, atraviesa la membrana citoplasmtica y en el interior se separan las dos cadenas de las cuales slo una se integrara al cromosoma. Transduccin Es la transferencia de un fragmento de ADN de una bacteria a otra por intermedio de un bacterifago cuyo cido nucleico es un ADN bicatenario. La transduccin puede ser generalizada o restringida. Transduccin generalizada: al ingresar el fago induce una nucleasa que fragmenta el cromosoma bacteriano a la vez que se forma ADN vrico y protenas de envoltura viral. Las protenas rodean al ADN vrico y a los fragmentos de ADN bacteriano. Se produce la lisis celular con liberacin de los bacterifagos nuevos. Al infectarse una nueva clula con el fago portador del fragmento de ADN bacteriano, la bacteria no es lisada sino que el fragmento de ADN se incluye en el ADN de la bacteria infectada (Figura 7).

Fig.7: Esquema de una transduccin generalizada completa que termina con una nueva clula infectada que adquiere un nuevo fragmento de genoma bacteriano.

Transduccin restringida o especializada: Cuando un fago no ltico infecta una bacteria, el ADN fgico se incorpora al ADN bacteriano (profago) y la bacteria permanece en estado lisognico hasta que algn factor induce la transformacin del profago en fago vegetativo y es en ese momento en el que el profago se separa del ADN bacteriano arrastrando algunos genes circundantes y la bacteria inicia un ciclo ltico con la liberacin de bacterifagos portadores de genes propios y ajenos. Cuando este bacterifago in5

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fecta a otra bacteria le transfiere ciertas caractersticas de la bacteria anterior pero sin dar lugar a un ciclo ltico. (Figura 8).

Fig. 8: Esquema de una transduccin restringida en la cual la bacteria adquiere una porcin de ADN fgico y una porcin de ADN bacteriano.

Transfeccin Es la infeccin de la clula bacteriana con el ADN obtenido previamente de un virus. El resultado es la produccin de virus completos dentro de la bacteria con la posterior lisis de sta. Para que se produzca la transfeccin la bacteria debe estar en estado de competencia. Tiene gran aplicacin en ingeniera gentica. Conversin Cuando el ADN de un bacterifago se integra a un cromosoma bacteriano estamos en presencia de una conversin lisognica y aunque no hay transferencia de genes de una bacteria a otra, la bacteria infectada puede adquirir caractersticas que ante no posea como ser la produccin de toxinas. Conjugacin Es la transferencia de material gentico de una bacteria a otra por contacto directo entre ellas. La capacidad de transferir ADN est codificada en el plsmido que se conoce como factor de transferencia o + factor sexual. Las clulas que lo poseen se llaman F , masculinas o donantes y las que carecen de l se denominan F , femeninas o receptoras. El resultado de la conjugacin es una bacteria con las caractersticas de las dos cepas progenitoras. Para que se realice la transferencia es necesaria la presencia de pili sexuales (que son filamentos huecos) o de pili de sujecin o anclaje que mantendran juntas a las dos clulas establecindose un puente entre las membranas citoplasmticas por las que pasara el ADN. En algunas bacterias el factor F+ se encuentra integrado en el cromosoma y estas clulas pueden transferir genes cromosmicos a bacterias F- con gran frecuencia y se denominan Hfr (high frecuency recombination) ESTUDIO DEL GENOMA BACTERIANO - MTODOS Y APLICACIONES ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA Extraccin del ADN: la lisis celular es el primer paso para la extraccin del ADN bacteriano. Las clulas en crecimiento exponencial se someten a la accin de enzimas (lisozima), antibiticos (penicilina), calor, agentes tensioactivos (polianetol sulfonato de sodio), lcalis (NaOH), etc. o una combinacin de stos, lo que destruye la pared celular liberando sus componentes citoplasmticos incluyendo el ADN. Purificacin del ADN: El ADN se purifica con solventes orgnicos como el alcohol o fenol y el ARN que est presente se destruye por accin de una ARNasa. Digestin: una vez extrado y purificado, el ADN cromosmico puede ser dividido en fragmentos pequeos por enzimas de restriccin, o sea enzima que cortan la cadena en secuencias de bases especficas que presentan simetra binaria alrededor de un punto dado. Por ejemplo, la enzima EcoRi presente en Escherichia coli corta al ADN cuando encuentra la siguiente secuencia:

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5 . . . G-A-A-T-T-C . . . 3 3 . . . C-T-T-A-A-G . . . 5 Dado que esas secuencias pueden encontrarse varias veces dentro del genoma bacteriano, el ADN fragmentado resulta en numerosos fragmentos de diferente nmero de pares de bases y por ende de diferente peso molecular (Figura 9)

Lisis

Extraccin

Digestin

Fig. 9: Pasos para la extraccin y digestin enzimtica del ADN bacteriano. Electroforesis: dichos fragmentos pueden ser separados por electroforesis sobre gel de agarosa dado que las molculas ms pequeas migrarn rpidamente a travs de los poros del gel, mientras que las ms grandes lo harn con mayor lentitud. Estudio de las bandas: luego de terminada la electroforesis (usualmente unas pocas horas), los fragmentos se colorean con un colorante fluorescente (bromuro de etidio) y se visualizan con luz ultravioleta. El tamao de los fragmentos obtenidos se compara con un marcador de pesos moleculares conocido (Figura 10). Esta tcnica es muy til en estudios epidemiolgicos para comparar dos poblaciones bacterianas ya que si ambas provienen del mismo origen debern presentar igual nmero de bandas y del mismo peso molecular. Dotacin plasmdica: Un procedimiento similar al descripto anteriormente puede ser utilizado para el estudio de la presencia de plsmidos dentro de una bacteria. La comparacin de las bandas producto de la migraFig. 10: Bandas de ADN en gel de agarosa. cin de los diferentes plsmidos puede servir para A: patrn de pesos moleculares; B, C y D: comparar bacterias y de esta manera determinar si bacterias en estudio. estn emparentadas genticamente o no. Los plsmidos tambin pueden ser digeridos con enzimas de restriccin obtenindose un nmero mayor de bandas tras la electroforesis y esto es muy til para diferenciar bacterias con un solo plsmido o con plsmidos de peso molecular muy parecido. HIBRIDACIN DE ACIDOS NUCLEICOS Se entiende por hibridacin la construccin artificial de un cido nucleico de doble cadena por apareamiento complementario de bases de dos cidos nucleicos de cadena sencilla. Por accin del calor, las dobles cadenas de ADN en estudio se separan y si se las deje enfriar lentamente, muchas de las cadenas complementarias volvern a asociarse. La reasociacin solo se lleva a cabo si ambas cadenas son complementarias. As, la hibridacin de cidos nucleicos utilizando una de las cadenas sintetizada artificialmente y marcada con alguna sustancia detectable (istopo radioactivo, peroxidasa o fluorescena), permite la formacin de hbridos artificiales de doble cadena de ADN, ARN o ADN-ARN que pueden ser detectadas en el laboratorio. La hibridacin permite estudiar relaciones genticas entre dos cidos nucleicos provenientes de diferentes bacterias. Tambin permite detectar trozos de cido nucleico complementarios de una cadena sencilla de secuencia conocida. Esta cadena sencilla se denomina sonda y esta sonda puede utilizarse para localizar en una mezcla desconocida una secuencia de cido nucleico complementario con ella. La cadena de cido nucleico que se quiere estudiar se denomina conductor. La deteccin de la hibridacin de cidos nucleicos se hace por lo general con filtros de membrana de nitrocelulosa a los cuales se adhieren las cadenas simples de ADN y ARN y los hbridos (Figura 11). 7

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Fig.11: Esquema de la tcnica de hibridacin sobre filtros de celulosa.

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Es una tcnica que permite amplificar miles de veces una porcin del ADN en estudio (o ARN luego de la sntesis del ADN por accin de una transcriptasa inversa). El fundamento de esta tcnica es la amplificacin enzimtica de un fragmento de ADN flanqueado por dos oligonucletidos cebadores o iniciadores (primers) que hibridan con las cadenas opuestas de la secuencia nucleotdica que nos interesa (secuencia blanco) y es a partir de alli donde comenzar la sntesis de nuevo ADN. Para ello se necesita el ADN a estudiar, los cebadores, las bases nucleotdicas (dNTPs) y una ADN polimerasa resistente al calor (ya que la desnaturalizacin de las cadenas de ADN se realiza a altas temperaturas). La tcnica consta de ciclos que se repiten aproximadamente 40 veces y cada ciclo consta de los siguientes pasos: desnaturalizacin, hibridacin con los cebadores, sntesis de nuevo ADN (Figura 12).

Fig. 12: Amplificacin selectiva de ADN por PCR. (1) Separacin de las cadesnas de ADN (desnaturalizacin). (2) Unin de los cebadores o primers (Hibridacin). (3) Sntesis de nuevos fragmentos de ADN (Elongacin). (4) Reinicio de la reaccin P: ADN Polimerasa ADN en la muestra Iniciador o primer Fragmento nuevo

El producto de esta amplificacin puede evidenciarse en gel de agarosa teido con bromuro de etidio o puede hibridizarse con una sonda marcada, que son los procedimientos ms usados. Esta tcnica puede utilizarse para detectar pequeas cantidades de genoma de un agente infeccioso en una muestra clnica o para detectar ciertos genes de secuencia conocida dentro del genoma de algn agente infeccioso. 8