UNIVERSIDADE PAULISTA UNIP ATIVIDADE PRTICA SUPERVISIONADA

ANGLICA DE FTIMA MACEDO RA 0830BB-2 LUCINIA DELGADO DA SILVA MODOLO RA B06FHG-0 NAYARA ROBERTA ALMEIDA GOMES RA A73201-2 ZILDA NUNES CUVAS RA B106BB-3

CINTICA ENZIMTICA DOS PROCESSOS FARMACUTICOS FERMENTATIVOS

Trabalho Informativo e educacional apresentado como requisito comum para a obteno de nota na Atividades Prticas Supervisionadas da Universidade Paulista, UNIP.

Orientador: Prof. Ari Thiago Colaboradoras: Prof. Dra. Teresa Cristina de Barros Profa. Rejane

BAURU SP 2012

AGRADECIMENTOS

Agradecemos a Dra. Profa. Teresa Cristina de Barros, pela ateno dispensada e pelo carinho que sempre nos dedica e especialmente na orientao desse trabalho, do qual no seria possvel sua realizao sem sua participao, bem como tambm a nossos familiares do qual nos deram total apoio e compreenso para que esse trabalho se realizasse.

Sumrio
1- Introduo......................................................................................................... 3 2 Objetivos ......................................................................................................... 4 3 - Cintica dos processos fermentativos ............................................................. 4 4 - Uso de Microorganismos na Fermentao ...................................................... 6 5 - O processo fermentativo .................................................................................. 7 6 - Enzimas em Medicamentos e Anlises Clnicas ............................................. 7 7 - Atividade Enzimtica ....................................................................................... 7 8 - Produo Industrial de Enzimas ...................................................................... 8 9 - Aplicaes na Indstria Farmacutica ............................................................. 9 10 - Produo de Vitaminas................................................................................ 10 11 - Produo de antibiticos ............................................................................. 11 12 Concluso ................................................................................................... 12 13 - Referncias Bibliograficas ........................................................................... 12

1- Introduo

A cintica enzimtica nos processos farmacuticos fermentativos se baseia no estudo cintico de um processo fermentativo no qual microrganismos utilizam uma fonte orgnica e produzem metablitos, que so formados durante a fase de crescimento exponencial, ao mesmo tempo em que as novas clulas so produzidas por processos fermentativos, e so utilizados para a produo de substncias de interesse comercial, como: antibiticos, cidos orgnicos, solventes, enzimas e biocombustveis . O produto pode ser ainda o prprio microrganismo, como a produo de levedura de panificao e inoculantes agrcolas, ou as clulas microbianas podem ser utilizadas em processos de biotransformao, como por exemplo, para a produo de esterides, aromas e fragrncias. Alm da produo de bens de consumo, os microrganismos so tambm utilizados em processos de tratamento de resduos e efluentes urbanos e industriais, na recuperao de metais, tais como cobre, chumbo e urnio, ou em processos de biorremediao de solos contaminados. Os principais produtos da Biotecnologia podem ser agrupados de acordo com o seu uso, em produtos da indstria farmacutica (antibiticos, hormnios, vacinas, vitaminas e protenas teraputicas humanas), da indstria de alimentos (aminocidos, flavorizantes, polissacardeos e gomas xantana) e da indstria qumica (etanol, acetona, butanol, glicerol, cido lctico, cido ctrico, polisteres, inseticidas microbianos). As enzimas so utilizadas em diferentes segmentos industriais, e so catalizadoras dessas reaes, acelerando o processo de transformao. As enzimas, tambm denominadas de biocatalisadores, so catalisadores proticos com caractersticas particulares pela sua alta eficincia em condies fisiolgicas e alta especificidade, sendo inclusive capazes de catalisar reaes estereoespecficas. Este potencial cataltico utilizado industrialmente no s nos clssicos processos fermentativos, mas tambm em processos de biotransformaes microbianas para a catlise de reaes qumicas de difcil ocorrncia e de grande importncia na indstria farmacutica.

2 Objetivos

Trabalho Informativo e educacional apresentado como requisito comum para a obteno de nota na Atividades Prticas Supervisionadas da Universidade Paulista, UNIP, sobre cintica enzimtica nos processos fermentativos, atravs de consulta do assunto em livros e artigos acadmicos, como tambm em sites de pesquisa, para aprimoramento do conhecimento.

3 - Cintica dos processos fermentativos

O estudo cintico de um processo fermentativo consiste na anlise da evoluo dos valores de concentrao de um ou mais componentes do sistema de cultivo, em funo do tempo de fermentao, entende-se por componentes microorganismos ou biomassa, os produtos do metabolismo e os nutrientes e substratos que compem o meio de cultura. Microorganismo ou agente ativo promove a transformao dos componentes do meio em produtos, pela atividade das enzimas que por sua vez so sintetizadas pelos prprios organismos. (LIMA, et AL, 2001) Um processo fermentativo envolve um conjunto de operaes e tcnicas envolvidas na transformao de um dado substrato num produto de interesse econmico e estas transformaes sero efetuadas por um microorganismo especialmente selecionado para aquela transformao em particular a nvel industrial.

Denominamos fermentao estas transformaes efetuadas sob determinadas condies controladas de pH, temperatura, de nutrientes, de aerao, etc. Isso se processa dentro de um biorreator tambm conhecido como fermentador ou dorna de fermentao. A nvel industrial esses fermentadores apresentam de dezenas a milhares de litros. (LIMA, et AL, 2001) O sucesso de um dado processo fermentativo depende muito das caractersticas do meio de cultivo e da escolha dos microorganismos, sendo assim necessrio observas alguns aspectos, como os citados abaixo: Elevada eficincia na converso de substrato em produto; Permitir o acmulo do produto no meio, de forma a ter elevada concentrao do produto no caldo fermentativo;
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No produzir substncias incompatveis com o produto; Apresentar Constancia quanto ao comportamento fisiolgico; No ser patognico; No exigir condies de processo muito complexos e dispendiosos; Permitir a rpida liberao do produto para o meio.

O meio de cultura e a matria prima utilizada para obt-lo tambm deve possuir caractersticas para ser utilizado numa aplicao industrial, por exemplo, ser de fcil obteno e exigir o mnimo de tratamentos prvios e obviamente conter o substrato que ser transformado no produto. Os microorganismos em geral utilizam como fonte de carbono e de energia diversos acares (glicose, sacarose, frutose, amido e celulose), como fonte de nitrognio sais, como (NH4)2SO4 , o qual costuma provocar redues significativas de pH, e inibies por sulfato, o (NH4)2HPO4, ou aminocidos, ou a uria permite reduzir os problemas de controle de pH. Como fonte de fsforo utilizam-se fosfatos solveis como o monoamnio fosfato (MAP), ou o diamnio fosfato (DAP), os quais passam a ser fonte de nitrognio e fsforo simultaneamente. Ainda necessrio adicionar outros elementos como: Na, K, Ca, Fe, Cu, Mg, Mn, Co, etc., em concentraes bem pequenas, na forma de seus sais solveis. Meios de cultura constitudos apenas por esses elementos so chamados de meios definidos, ou meios sintticos, cuja composio qumica conhecida e pode ser reproduzida a qualquer instante, esses meios proporcionam boa recuperao e purificao do produto final gerando uma maior economia nas etapas de recuperao do produto, no entanto para uma grande variedade de linhagem de microorganismos necessrio a adio de fatores de crescimento , ou seja alguns aminocidos especficos ou vitaminas tais como biotina, tiamina e riboflavina. (BORSANI , W., 2001). Com relao s formas de conduo do processo fermentativo estas podem ser dimensionadas para operao contnua ou descontnua (batelada), cada uma com as caractersticas prprias de controles fsico-qumicos. Cada uma delas apresenta vantagens e desvantagens. Com relao a recuperao do produto vai depender das caractersticas deste produto, a elaborao de estratgias com a seleo de um conjunto de operaes unitrias a serem utilizadas numa sequncia at a obteno do produto final na
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forma desejada, que dever obedecer normas legais dependendo de sua aplicao, por exemplo, consumo humano ou animal. Alm disso, no se pode esquecer dos tratamentos dos efluentes produzidos de tal modo que a produo tenha maior impacto possvel. Todas as etapas que se seguem aps a fermentao so denominadas de tratamentos downstream, e so da mais alta importncia para o rendimento final do produto. Em geral deve-se estabelecer o menor nmero de operaes downstream para maximizar o rendimento do produto. Alm dos aspectos econmicos envolvidos. (LIMA, et al, 2001).

4 - Uso de Microorganismos na Fermentao A utilizao de microrganismos na biotransformao da matria vem desde a antiguidade. Atravs da observao do ambiente ao seu redor, o ser humano passou a perceber que certos processos se desenvolviam devido presena de microrganismos no meio. A descoberta de microrganismos que podiam modificar um determinado substrato possivelmente foi feita ao acaso, como ao perceber que a carne seca resistia a deteriorizao; ou que ao deixar o leite azedar era possvel retirar o lquido do coalho para fabricar queijo; ou ainda que ao secar os gros antes da estocagem era possvel evitar o aparecimento de fungos. (TORTORA et al., 2006) A partir dessas observaes, foi possvel estudar mais a fundo e utilizar esses microrganismos de forma a atender da melhor forma as nossas necessidades. Durante a Primeira Guerra Mundial comeou-se a utilizar microrganismos para a produo de substncias como etanol, acetona e cido ctrico. Foi durante esse perodo que foi feito pela primeira vez um cultivo microbiolgico assptico em larga escala, quando Chaim Weizmann usou um fermentador lquido para a produo de acetona por Clostridium acetobutylicum (STANBURY et al.,1995). A partir da Segunda Guerra Mundial, os microrganismos tiveram importncia na produo em larga escala de antibiticos. (TORTORA et al., 2006)

5 - O processo fermentativo Os meios de cultivo dos microorganismos so formulados atravs da utilizao de compostos quimicamente conhecidos (meio sinttico) ou de matrias primas naturais. Os meios devem conter fontes de carbono e energia, fontes de nitrognio, substncias minerais e fatores de crescimento. (SANTANNA JR., 2001)

6 - Enzimas em Medicamentos e Anlises Clnicas

Enzimas so protenas que apresentam atividade cataltica e para isso requerem a participao de molculas menores (co-fatores) de natureza no protica. Os cofatores podem ser ons (Zn2+, Ca2+ etc) ou molculas orgnicas (coenzimas). Exemplos de coenzimas so dinucleotdeos (NAD, NADP, FAD) e a coenzima A entre outros. A ao cataltica se faz, atravs da reduo da energia de ativao da reao, sem alterao do seu equilbrio termodinmico.Alm de reduzirem significativamente a energia de ativao, as enzimas apresentam elevada especificidade que pode expressar quanto ao tipo de reao ou de substrato, como por exemplo: enzimas que s catalisam a hidrlose de ligaes peptdicas, ou s de ligaes ster. Apenas alguns resduos aminocidos participam ativamente da reao cataltica. (SANTANNA JR, G. L., 2001)

7 - Atividade Enzimtica

A expresso da atividade enzimtica medida atravs de sua velocidade de reao, determinada em condies experimentais estabelecidas. A concentrao de um produto formado aumenta linearmente com o tempo num dado intervalo (velocidade de reao constante). No entanto a partir de certo tempo a velocidade (valor da tangente curva num dado instante) decresce. Vrios fatores influem nesse decrscimo: diminuio da concentrao de substrato, inativao parcial da enzima no decorrer da reao, inibio do produto e deslocamento do equilbrio se a reao for reversvel. Para evitar a influncia dos fatores acima mencionados, costuma-se
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associar a atividade medida da velocidade de reao em condio inicial, ou seja, aquela que assegura velocidade constante. importante frisar que nos processos industriais, as enzimas atuam em condies muito distantes daquelas vigentes para a reao a velocidade constante. (condio inicial). A escolha de um mtodo para a determinao da atividade de uma enzima produzida por fermentao, requer conhecimento prvio da faixa de concentrao enzimtica, que permite obter uma variao linear da concentrao de produto (ou substrato) com o tempo, num intervalo que no seja suficientemente grande para que os fatores acima citados venham a interferir. Podem ser utilizados mtodos variados para avaliar a variao das concentraes das espcies. Alguns deles so muito diretos

(espectrofotometria, fluorimetria,, titulometria) e outros menos (medida da variao da viscosidade. A atividade expressa em unidades de atividade. A atividade expressa em unidades de atividade. A definio proposta pela IUB (unidade internacional IU) considera uma unidade de atividade como a quantidade de enzima que catalisa a transformao de um micromol de substrato por minuto em condies de ensaio definidas.

8 - Produo Industrial de Enzimas

A produo de enzimas em escala industrial se faz majoritariamente por fermentao submersa. A grande eficincia das enzimas aliadas sua

especificidade, as tornam em princpio agentes de grande potencial para uso teraputico. Para esta finalidade, a enzima precisa ter um elenco de caractersticas apropriadas, principalmente para uso interno, dentre elas: Baixa resposta imunolgica, com afinidade dirigida ao problema em questo; De preferncia proveniente de organismos no patognicos, que contenham pouca ou nenhuma toxina; Alta atividade e estabilidade em pH fisiolgico, com reteno da atividade e estabilidade em soro animal; Alta afinidade pelo substrato, bem como baixa taxa de eliminao da circulao quando injetados;

Pouca inibio pelos produtos ou constituintes normais encontrados em fludos corporais; No tenham necessidade de co-fatores exgenos; Efetiva irreversibilidade da reao enzimtica sob condies fisiolgicas.

Evidentemente poucas enzimas se encontram dentro dos requisitos acima. Dentre as enzimas atualmente em uso destacam-se aquelas empregadas no tratamento de pacientes com alguma forma de leucemia, como por exemplo L-asparaginase (obtida de Escherichia coli ou Erwinia carotovora), no tratamento de tromboembolias, inclusive infarto do miocrdio, so utilizadas streptoquinase e uroquinas. Vrias proteases so utilizadas em alguns casos de condies inflamatrias como a tripsina e quimotripsina, geralmente associadas a antibiticos ou analgsicos. A papana, uma mistura de enzimas extradas do ltex do mamo, tem sido empregada com sucesso no debridamento de feridas, escaras e enxerto de pele. Algumas possibilidades, que esto ainda em pesquisa, incluem a reposio de enzimas em deficincias enzimticas causadas por doenas hereditrias e tambm no caso de falhas orgnicas e desordens metablicas, vrios tipos de modificaes, tais como modificao qumica de grupos funcionais, ligaes cruzadas e imobilizao tm sido sugeridas para aumentar a estabilidade e a meia vida plasmtica, assim como melhorar as caractersticas cinticas de enzimas para utilizao teraputica. Existe uma ampla variedade de aplicaes de enzimas que no foram citadas acima e novas enzimas e usos esto sendo continuamente descobertos e a utilizao de enzimas tender a aumentar no futuro, porque grande parte dos produtos manufaturados de origem biolgica. (SANTANNA JR., 2001)

9 - Aplicaes na Indstria Farmacutica Os processos fermentativos e enzimticos so usados na indstria farmacutica para a obteno de inmeros produtos, tais como: esterides, vacinas, antibiticos, vitaminas, enzimas microbianas, industriais de origem animal e vegetal inoculantes agrcolas, bioinseticidas, dentre outros usos, industriais tais como: produo de lcool e fermentos biolgicos para a indstria alimentcia.
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10 - Produo de Vitaminas

A denominao genrica de vitamina, dada a substncia orgnicas complexas de diferente classificao qumica encontradas em alimentos, geralmente em quantidades pequenas, e indispensveis para o metabolismo animal ou vegetal. Embora quase todas elas sejam formadas no metabolismo de microorganismos, atualmente s h produo por fermentao da riboflavina (Vitamina B2) e principalmente, das cobalaminas (onde est situada a cianocobalamina ou vitamina B12. A Cianocobalamina um slido cristalino de cor vermelho intenso, inodoro e inspido, higroscpico, muito solvel em gua e etanol e insolvel nos solventes orgnicos. Decompe-se em meios alcalinos e em solues com pH inferior a 4,5. O uso de cepas de espcies de Propionibacterium para a obteno de vitamina B12 deve-se desenvolver em processo de anaerobiose nos primeiros 50% do processo, segundo (BYKHOVSKI em 1979), embora a aerao no deixe de propiciar a formao de DBI (e portanto vitamina B12) ela, por sua vez reprime na propionibactria um dos estgios da biossntese. No estgio inicial mantm se a anaerobiose at o consumo total do acar e crescimento do microorganismo, na ltima fase o ar introduzido para induzir a sntese de DBI e a converso de cobanamida em cobalamina. Para a manuteno do micro organismo usa-se em tubos de ensaio, um meio contendo (g/L): triptona, extrato de levedura, suco de tomate filtrado, Agar, em pH 7,2. Incuba-se por 4 dias a 30. Para a multiplicao do microorgnismo (1 fase) usam-se 400 mL de mosto em erlenmeyers de 2 L: mesmo meio de manuteno sem Agar, incuba-se por 48 horas a 30 sem agitao. Para a multiplicao (2 fase), usam-se 10 L em fermentador de ao inox de 500 L contendo em g/L: gua de milho, glicose pH 6,5 por 24 horas a 30 sem agitao, mantendo pH a 6,5 com sol. NH4OH. Nas fermentao propriamente dita usam-se 340 L em fermentador de ao inox de 500 L contendo em g/L: gua de milho, glicose, CoCl26H2O pH 7, nas primeiras 80 horas a 30 sem aerar e com lenta agitao, nas 88 horas seguintes agitao e pequena aerao, mantendo pH a 7 com sol. NH4OH. (SATO. S., 2001) YONGSMITH e CHUTIMA (1983) verificaram que clulas vivas de Propionibacterium sp imobilizadas em gel de alginato e incubadas em meio rico em fontes de carbono e
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hidrognio, contendo sulfato de cobalto, DBI e um agente anti espumante podem produzir mais de 20 mg/L de vitamina B12 em 5 dias. As clulas podem ser reutilizadas numerosas vezes e mantm sua habilidade em sintetizar a vitamina durante cerca de duas semanas. (SATO. S., 2001) Muitas outras cepas so utilizadas no processo de fermentao para obteno de vitaminas, no mesmo modo como exposto acima e frisando que a produo de vitaminas s possvel devida a microorganismos que no processo de fermentao, faz as transformaes necessrias para a obteno do produto.

11 - Produo de antibiticos

Antibiticos so

produtos do metabolismo secundrio de microorganismo que

inibem o processo de crescimento de outros microorgnismos, quando utilizados em baixas concentraes. (SATO, S. 2001) No incio dos anos 40, Alexander Fleming notou a produo de penicilina pelo fungo Penicillium notatum, a qual inviabilizou a cultura de Staphylococcus aureus. Atualmente, a produo desse antibitico feita por uma outra espcie, Penicillium chrysogenum, pois assim h a formao de uma maior quantidade de produto (aproximadamente 1000 vezes mais). J antibiticos como a estreptomicina so produzidos por Actinomicetos. Para a produo de penicilina, podem ser utilizados resduos industriais como melao. As etapas de produo consistem basicamente em: Preparao do inculo. Preparao e esterilizao do meio. Inoculao do meio no fermentador. Aerao forada com ar estril durante a incubao. Aps a fermentao h a remoo do miclio formado. Extrao e purificao da penicilina.
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A penicilina produzida a partir da L-cistena e L-valina. A produo se d de forma no ribossomal, por meio de um dipeptdeo composto de L--aminoadpico (L- AAA) e L-cistena ou um produto de degradao da cistationina. Aps, ela se conecta a L-valina atravs de uma epimerizao. O produto da ciclizao do tripeptdeo a isopenicilina N. A benzilpenicilina produzida no intercmbio de L- AAA com cido fenilactico ativado. (LIMA et al., 2001) Dos antibiticos de origem microbiana, somente 123 so produzidos por fermentao, o resto produzido de forma sinttica ou semi-sinttica. As bactrias 40 produzem um nmero de 950 antibiticos, j os actinomicetos pruduzem 4600 antibiticos, e os fungos 1600 (LIMA et al., 2001).

12 Concluso

Aps a realizao deste trabalho, ficou a compreenso da grandiosidade da aplicao da cintica enzimtica nos processos fermentativos, para a obteno de diversos produtos na industria farmacutica e dos processos industriais em geral, aplicados nos mais diversos setores. O campo da pesquisa tem progredido bastante, mas ainda tem muito a ser estudado e catalogado, e esses estudos vem colaborar infinitamente para o avano das tecnologias bioqumicas em prol de melhorias significativas da produo industrial e farmacutica bem da economia em geral.

13 - Referncias Bibliograficas

LIMA, U. A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W.; SCHMIDELL, W. Biotecnologia Industrial Volume 2 Engenharia Enzimtica. Editora Edgard Blcher, So Paulo, 2001.

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LIMA, U. A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W.; SCHMIDELL, W. Biotecnologia Industrial Volume 3 Processos Fermentativos e Enzimticos. Editora Edgard Blcher, So Paulo, 2001. BORSANI, W.; AQUARONE, U. A.; LIMA. U. A. Biotecnologia Engenharia Bioqumica - Editora Edgard Blcher, So Paulo, 1988. TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, A. L. Microbiologia. 8 edio, 1 reimpresso, Artmed, Porto Alegre, 2006. ARTIGOS: ADITIVOS ALIMENTARES PRODUZIDOS POR VIA FERMENTATIVA, Dbora D. V. Silva, Walter Carvalho, Larissa Canilha e Ismael M. Mancilha, Revista Analytica, Outubro/Novembro 2005, N19 Disponvel acesso em: em - Volume 3 -

http://www.revistaanalytica.com.br/ed_anteriores/19/art03.pdf 12/11/2012.

BIOTECNOLOGIA NA INDSTRIA FARMACUTICA, Rogrio Saad Vaz, Maria Rosa Machado Prado, Ftima de Carvalho, Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 37, Disponvel em: http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio37/industria.pdf - acesso em 12/11/12 SOUZA, V. R DIFERENTES MEIOS DE CULTIVO E CONDIES

OPERACIONAIS NA PRODUO DE PENICILINA G ACILASE POR Bacillus megaterium Disponvel em:

http://www.bdtd.ufscar.br/htdocs/tedeSimplificado/tde_arquivos/10/TDE-2007-1123T16:16:14Z-1643/Publico/TeseVRS.pdf - Acesso em 10/11/12 HERNANDES, F. Fermentao da Riboflavina Disponvel em:

http://www.zemoleza.com.br/carreiras/biologicas/farmacia/trabalho/carreiras/trabalho s/9145-fermentacao-da-riboflavina.html acesso em 11/11/2012 ANA CRISTINA, "A Produo de Antibiticos". Disponvel em: http://www.zemoleza.com.br/carreiras/biologicas/farmacia/trabalho/23262-aproducao-de-antibioticos.html - Acesso em 11/11/2012

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