You are on page 1of 6

UNIDAD DE BIOQUMICA

DEPTO. BIOMDICO FAC. CS. DE LA SALUD

APUNTESDEFOTOMETRA Dr.BenitoGmezSilva,Ph.D. 1. ESPECTROFOTOMETRA. 1.1. LUZ,RADIACIONESELECTROMAGNTICASYENERGTICA. Lo que se conoce como luz es ms precisamente una forma de energa que corresponde a radiaciones electromagnticas (un componente elctrico y otro magntico) que viajan en la forma de untrendeondas.Ladistanciaentredosondasdeunamismaradiacincorrespondealalongitudde onda () de esa radiacin (expresada en unidades de nanmetros; 1nm=109m). Diferentes radiaciones poseen diferentes longitudes de onda. La radiacin policromtica es un conjunto de radiaciones de diferentes longitudes de onda, por ejemplo, la luz visible o luz blanca (aprox. 400700 nm).Encambio,luzoradiacinmonocromticaeslaradiacindeslounaounrangomuycortode longitudesdeonda,porejemplo,luzUVde260nm. La energa contenida en una radiacin est organizada en la forma de corpsculos sin masa llamados fotones. Estos paquetes de energa contienen una cantidad fija y precisa de energa que es inversamente proporcional a su longitud de onda. Las siguientes ecuaciones permiten el rpido clculo del contenido energtico de un fotn: E = h x c / (nm) (donde h y c son las constantes de Planckydelavelocidaddelaluzenelvaco,respectivamente)ydelcontenidoenergticodelnmero deAvogadrodefotones,esdecir,deunmoldefotonesde unaradiacindada,denominadoEinstein: (Kcal/mol)=28.585/(nm). Por este motivo, mientras menor sea la longitud de onda de una radiacin, mayor ser el contenido energtico de sus fotones y ms peligrosa ser esa radiacin para los organismos vivos. Por ejemplo, los fotones de las denominadas radiaciones ionizantes (entre otros, los rayos X y csmicos) poseen un contenido energtico tan alto que inducen la formacin de ines en las biomolculas sobre las que inciden y hasta pueden romper enlaces covalentes entre los tomosdelabiomolcula,daandoseriamentealaclulairradiada. La Tierra recibe constantemente energa en la forma de radiaciones electromagnticas provenientes, principalmente del Sol y del espacio exterior. Las radiaciones conocidas como luz visible (VIS), luz ultravioleta(UV)yluzinfrarroja(IR)ysuscomponentes(VIS:violetaazulverdeamarillonaranjarojo; UV:UVA,UVB,UVC)sonunaporcinrelativamentepequeadelespectroelectromagntico. Tabla.Radiacionesquecomponendelespectrovisibleyultravioleta. LUZ RANGO(nm) UVC 190290 UVB 290315 UVA 315400 violeta 400450 azul 450500 verde 500570 amarillo 570590 naranja 590620 rojo 620770 1.2 LASINTERACCIONESLUZMATERIAYLOSPROCESOSFOTOQUMICOS. Si consideramos que la materia en la naturaleza est formada por tomos y estos se organizan en molculas, la interaccin luzmateria es algo parecido a un choque entre fotones y tomos de las molculas.Dadalaanteriorinteraccin,sepuedenvisualizarlossiguientesfenmenos:(i)reflexinde la o las ondas de luz incidente, (ii) refraccin de la luz incidente y (iii) absorcin total o parcial de los fotones de la radiacin incidente. Este ltimo proceso representa uno de los fenmenos pticos ms tiles en las Ciencias Biolgicas Experimentales, ya que permite la identificacin y cuantificacin de biomolculasensolucin. Elfenmenodeabsorcindeluzimplicalacapturadelaenergadelosfotonesdelaluzincidentepor parte de electrones en orbitales especficos, los que se alejan del ncleo atmico pero siguen siendo parte de la molcula absorbente. Una vez absorbida la energa de un fotn, la molcula absorbente alcanzaunestadoelectrnicoexcitadodemuycortaduracin(aprox.1012segundos).Transcurrido tancortoperodo,lamolculaexcitadapierdelaenergaabsorbidayelelectrninvolucradoregresaa su orbital original y la molcula regresa a su estado electrnico basal, ya sea, (1) perdiendo la

UNIDAD DE BIOQUMICA

DEPTO. BIOMDICO - FAC. CS. DE LA SALUD

energaabsorbidacomocaloralmedioambienteo(2)emitiendounfotndeunaradiacindemayor longituddeonda(fluorescenciaofosforescencia). 1.3. LALEYDELAMBERTBEER.(J.H.Lambert,17281777;A.Beer,18251863) Si se hace incidir una radiacin monocromtica sobre un medio transparente como una solucin coloreada, parte de la luz incidente puede ser absorbida por algn componente del medio. Si esto ocurre,laintensidaddelaluztrasmitida,IT(luzquesaledelmedio)sermenorquelaintensidaddela luzincidente,I0. Si no hay absorcin, se aplica la relacin matemtica IT = I0. Por otra parte, a medida que la concentracin del compuesto absorbente aumenta en progresin aritmtica (1, 2, 3, 4...), la intensidad de la luz transmitida disminuir en progresin geomtrica (logartmica) (16, 8, 4, 2...), es decir, la intensidad de la luz transmitida (IT) era igual al producto entre I0 y una potencia en base 10 con exponente negativo. Dicho exponente incluye dos factores: uno es el llamado coeficiente de extincin(),unaconstantepropiadelasustanciaabsorbenteyelotrofactoreslaconcentracin(c) delasustanciaabsorbente,demodoque: IT=I0x10(c). Este tipo de estudio fue realizado por Beer (1852). Previamente, Lambert (1760) usando placas de vidrio de diferente grosor (l), encontr la misma relacin, por lo que la disminucin geomtrica de IT estrelacionadacontantoelaumentolinealdelaconcentracindelamolculaabsorbente,comode lalongitudolargodelmedioqueatraviesalaluzincidente. Estas conclusiones se combinaron en la Ley de LambertBeer, que relaciona la disminucin de la intensidaddelaluztransmitidaconlaconcentracinyelespesorolargodeunasolucin: IT=I0x10(lc) SiambostrminosdelaecuacinsondivididosporI0,seobtiene:IT/I0=10lc. LaraznIT/I0sedenominatransmisinotransparenciadelsistemacompleto. Cuando la intensidad de la luz transmitida es igual a la de la luz incidente, el valor de esta razn, o su transmisin,esiguala1.Estosignificaqueelsistemaestransparentealaradiacinusada. Mediante un control adecuado, llamado blanco colorimtrico, se puede descartar la luz absorbida por el solvente y las paredes del continente de la solucin. Entonces, la transparencia slo corresponderaladelsolutodisueltoquesedeseamedir,loquesedenominatransmitancia(T). Enconsecuencia,T=IT/I0esunamedidadecuntaluzdejapasarotransmiteunsistemaconunsoluto en estudio. Evidentemente, los valores extremos de T son cero (IT = 0) y uno (IT = I0). Los valores intermedios de T son decimales. Para evitar trabajar con valores numricos en decimales se ha definidoelporcentajedetransmitancia(%T),cuyosvaloresextremosson0%Ty100%T. Locontrarioatransmisinotransparenciasedenominaopacidadycorrespondealvalorrecprocoo inversodesta,esdecir,I0/IT.Alaplicarlogaritmosenambosmiembrosdelaecuacin,seobtiene: logI0/IT=lc.As,ellogaritmodelaopacidadsedenominaabsorbancia(A). A=lc(EcuacindeLambertBeer). Algebraicamente,laigualdades:A=lc=log(1/T)=log(I0/IT). En el laboratorio, los equipos usados para medir A, tambin pueden medir %T. Ambas medidas puedenrelacionarseusandolasiguienteecuacin:A=2log(%T). Mediantelasiguientefigura,comparelasescalasde%TyA:

DeacuerdoalaecuacindeLambertBeer,laabsorbanciaesdirectamenteproporcionalalespesor(l) y a la concentracin (c) de una solucin y, adems, depende de una constante (coeficiente de extincin).Porlotanto,sielespesorolargo(l)deunasolucinsemantieneconstante,laabsorbancia de dicha solucin depender exclusivamente de su concentracin (C), lo que permite medir la concentracindelassustanciasensolucin(aplicacincuantitativadelaespectrofotometra).

UNIDAD DE BIOQUMICA

DEPTO. BIOMDICO - FAC. CS. DE LA SALUD

Laconstante,ocoeficientedeextincin,escaractersticaopropiadecadasustanciaabsorbenteysu valor numrico depender de la longitud de onda de la radiacin monocromtica usada, del solvente usado en la solucin y, obviamente, de las unidades que se elijan para expresar el espesor y la concentracin(porejemplo,centmetroyconcentracinmolar). Si la concentracin de un soluto en solucin est expresada en moles por litro (M), el coeficiente de extincinseexpresacomocoeficientedeextincinmolar. Silaconcentracinseexpresaengramosporlitroseobtieneelcoeficientedeextincinespecfico. Culessonlasunidadesenqueseexpresanlosvaloresdeabsorbanciay%Tdeunasolucin? Alanalizarlasecuacionescorrespondientesquelosdefinen,sepuedeconcluirquealserunaraznde intensidades de luz transmitida e incidente, el resultado es un nmero sin unidades, tanto para A comoparaT. Cules son las unidades en que se expresan los valores de los coeficientes de extincin de las sustanciasabsorbentes? Ya que = A / (l x c), se puede demostrar que las unidades representan la superficie de los moles, gramos o mg del compuesto que est expuesta a los fotones de la radiacin incidente; as, mientras mayor sea el valor de , mayor ser su capacidad de absorber los fotones de la radiacin monocromtica incidente, pero cules son las unidades de ? Confirme su respuesta con un profesordelaasignatura! 1.4. ELINSTRUMENTODELECTURA. El valor de la absorbancia o del %T de un soluto en solucin se obtiene en un equipo llamado fotmetrooespectrofotmetro,cuyaorganizacinbsicaeslasiguiente:
Componentesdeunfotmetroyalgunasdesuscaractersticas. 1:Fuentedeluz;2:Monocromador;3:Cuveta;4:Fotomultiplicadorysistemaderegistro.
luz policromtica luz monocromtica incidente luz monocromtica transmitida

(1)

(2)

(3)

(4)

Enformasimple,sepuedenidentificar4elementosbsicos: una lmpara o fuente de luz, que permite disponer de radiacin policromtica en el rango deseado. Las lmparas de tungsteno proporcionan luz visible en el rango 340700 nm. La lmpara dehidrgenoseusaparaobtenerluzUVenelrango190360nm. Un monocromador, que permite seleccionar la longitud de onda luz monocromtica necesaria. La calidad de un monocromador dice relacin con el mayor o menor rango de longitudes de onda que comprende la luz monocromtica que transmite. En orden creciente de calidad, algunos monocromadoresson:filtrosdevidrio,filtrosdeinterferencia,prismasyrejillasdedifraccin. las cubetas, corresponden al recipiente que contiene la solucin a medir. Las cubetas estn disponibles en una gran variedad de formas (tubos, cubetas de caras planas y paralelas) y volmenes, pero en uno de tres materiales que se diferencian en la transparencia a la luz UV: plsticasydevidrio(transparentesalaluzvisible)ycuarzo(transparentesalaluzvisibleyUV).Las cubetasposeenunalongituddeparedaparedexactamentecalibrada,demodoqueladistancia delatrayectoriadelaluzesconstante. El fotomultiplicador, que permite transformar la energa de los fotones que no han sido absorbidos en la solucin en micro corriente elctrica que finalmente es traducida como una lecturadigitaloanloga.

UNIDAD DE BIOQUMICA

DEPTO. BIOMDICO - FAC. CS. DE LA SALUD

1.5. LOSESPECTROSDEABSORCIN. Elcolordeloscuerpososustanciasesconsecuenciadelainterpretacincerebraldelasealgenerada por el sistema visual humano. La retina recibe los fotones de la o las radiaciones que no han sido absorbidasporelcuerpoosustanciailuminadoconluzpolicromticablancaartificialonatural(solar). Una solucin de color rojo tiene ese color porque una sustancia de la solucin absorbe preferentementetodaslaslongitudesdeondadelespectrovisible,exceptoaquellascorrespondientes al color rojo, las que son reflejadasy transmitidas por la solucin. Por esta razn, si se desea medir la concentracindeunasustanciaensolucin,aprovechandolarelacinqueexisteentreconcentracin y absorbancia (ley de LambertBeer), debemos elegir aquella luz (longitud de onda) que es absorbida conmayorintensidadporlasustanciaensolucin. Cmo demostrar experimentalmente cul es la o las longitudes de onda de mayor absorcin por partedeuncompuestoensolucin? MedianteelEspectrodeAbsorcindedichocompuesto. Este se obtiene haciendo incidir luces monocromticas en la solucin y midiendo el valor de absorbanciaparacadaunadeellas.Luegosegraficaabsorbanciaversuslongituddeonda.Elespectro puedepresentarunoomsmximosdeabsorcin,indicandolaolaslongitudesdeondaenlasque el compuesto presenta mxima absorbancia. Muchos compuestos orgnicos en solucin presentan unoomsmximosdeabsorbanciaenelrangodelaluzvisible(400700nm).Sinembargo,cuandola solucin es incolora o transparente a la luz blanca, es muy probable que algn soluto presente en dicha solucin tenga la capacidad de absorber luz ultravioleta (UV, aprox. 200400 nm), por lo que su espectro de absorcin mostrar uno o ms mximos de absorbancia en el rango UV. Por ejemplo, la gran mayora de las protenas en solucin son incoloras pero poseen un mximo a 280 nm; los cidos nuclicosensolucinposeenunmxalos260nm. El espectro de absorcin de un compuesto en solucin es una herramienta experimental que, junto a otras,permiteidentificardichocompuesto(aplicacincualitativadelaespectrofotometra). Un procedimiento rpido para conocer el rango de las radiaciones que son preferentemente absorbidas por una sustancia coloreada es definir cul es el color complementario al color de la sustancia.Estoselogralocalizandocadaunodelos6rangosdecolorpresentesenlaluzblancaenlas puntasdeunaestrelladeseispuntas,enelsiguienteorden:violeta(400450nm),azul(450500 nm), verde (500570 nm), amarillo (570590 nm), naranja (590620 nm) y rojo (620760 nm). De esta forma,elrangorojoestenoposicinalrangoverde,porloquesilasolucintienecolorrojo,elcolor que absorbe con mayor intensidad es el color complementario verde. Esta aproximacin no indica cul es la longitud de mxima absorcin de luz sino que indica el rango de longitudes de onda en el queseencuentramxdelcompuestoabsorbente. Cul es el tipo de luz (color) que mejor o ms absorbe una sustancia slida o en solucin, iluminada conluzblanca? Para responder esta pregunta, se usa como referencia el color de la sustancia o solucin. El color o rango de luz visible absorbido preferentemente ser o estar incluido en el color complementario de ella(elcoloropuestoalcolorobservado) violeta (400-450 nm) rojo (620-760 nm) azul (450-500 nm) naranja (590-620 nm) verde (500-570 nm) amarillo (570-590 nm)

UNIDAD DE BIOQUMICA

DEPTO. BIOMDICO - FAC. CS. DE LA SALUD

1.6.DETERMINACINDECONCENTRACINDEUNCOMPUESTOENSOLUCIN. La ecuacin de LambertBeer indica que el valor de la absorbancia de un compuesto en solucin es directamenteproporcionalalaconcentracindelcompuestoabsorbenteenestudio.Estoesaplicable sloaradiacionesmonocromticasyquecorrespondanalalongituddeondademximaabsorbancia del compuesto. Como son muchos los compuestos de inters biolgico que no son coloreados (no absorben luz visible), es necesario aplicar un procedimiento o reaccin qumica que genere un compuestoconunmximodeabsorbanciaenelrangoUVvisible. Como en la ecuacin de LambertBeer, la absorbancia depende tanto de la concentracin como del largo entre paredes de la cubeta. Si slo se usa un mismo tipo de cubeta, el largo es constante, y la absorbancia de la solucin slo depender de la concentracin de la sustancia absorbente. En consecuencia, la ecuacin se puede simplificar ya que el producto entre las dos constante y l ser otra constante K (factor de calibracin) que reemplaza las dos anteriores; por lo tanto: A = K x c . Luego, la concentracin de una solucin estara dada por: c = A / K; esto significa que para calcular dichaconcentracindebemosconocerlaAdelasolucinyelvalordelfactorK. El valor del factor de calibracin K puede calcularse empricamente realizando una curva de calibracin, la que se prepara midiendo la absorbancia de una serie de soluciones de concentraciones crecientes (soluciones patrones) de la sustancia en estudio. Una vez obtenidos los valores de A para las diferentes concentraciones de las soluciones patrones, se grafica A vs concentracin(curvadecalibracin).Estegrficopermite: determinar los lmites de concentracin que obedecen la ley de LambertBeer (linealidad entre absorbanciayconcentracin), obtenerelvalordeKmedianteelclculodelapendientedelarecta, o, alternativamente, calcularel valor de K paracada punto de la recta (K = A/c) y luego, obtener el valorpromediooKpromedio. Conocido el valor del factor de calibracin K para la tcnica fotomtrica empleada, la concentracin desconocida de la sustancia tratada con el mismo procedimiento analtico, puede ser determinada despusdemedirlaabsorbanciadelasolucinproblema,aplicandolaecuacin:c=A/K. INSTRUCCIONESPARAELUSOCORRECTODELOSFOTMETROS 1. Conectarelequipoalaredde220volts. 2. Precalentamiento del equipo. Se requiere que el fotmetro permanezca encendido por unos 10 minutos antes de usarlo; as, la temperatura de la lmpara llegar a un mximo, estabilizndose el espectrodelaluzemitido. 3. Seleccionelalongituddeondaapropiada,segnelprotocoloenaplicacin. 4. Calibracin 0% T: ajuste la lectura de %T a un valor de cero (0,00), en el modo de operacin transmitanciayconelcompartimentoportacubetacerradoyvaco. 5. Seleccin de la cubeta o tubo de fotmetro, en funcin de la longitud de onda de trabajo (vidrio o plsticoparaluzvisible;cuarzoparaluzvisibley/oUV). 6. Calibracin 100 %T: ajuste la lectura de %T a un valor de 100, en el modo de operacin transmitancia y con el compartimento portacubeta cerrado pero conteniendo el tubo o cubeta llenoconlasolucinblancocolorimtrico. 7. Lecturas de la o las muestras problemas: el instrumento est calibrado con respecto a la longitud de onda preestablecida y con respecto a la solucin blanco; por lo tanto, se puede cambiar al mododeoperacinabsorbanciaeiniciarlalecturadelosvaloresdeabsorbanciadecadaunade lassolucionesdeabsorbanciadesconocida. NOTA: si las diversas soluciones a las que se les leer su absorbancia se ordenan en orden creciente de intensidad de color y se inicia la lectura de las absorbancias a partir de la solucin ms diluida, no esabsolutamentenecesariolavareltuboocubetadelfotmetroentrelecturas.

UNIDAD DE BIOQUMICA

DEPTO. BIOMDICO - FAC. CS. DE LA SALUD

AUTOEVALUACIN: Quesluzmonocromtica?Radiacinionizante?Luzvisible? Culeslarelacinentrecontenidoenergticodeunfotndeluzylalongituddeondadeesaluz? Qurepresentalalongituddeondademximaabsorbanciadeunasustanciaensolucin? Cmoserealizayquinformacinentregaunespectrogramaoespectrodeabsorcin? SiuncompuestoensolucinabsorbeluzUV,puedeabsorberenelrangodeluzvisible?Porqu? Escorrectodecirquetodosloscompuestosqumicosensolucinabsorbenluzvisible?Porqu? Culeselmximodeabsorcindelosprotenasydeloscidosnuclicos?Porqu? CuleslaecuacinbsicadelaLeydeLambertBeer? Culeselsignificadodecadaunodeloscomponentesdedichaecuacin? Quinformacinproporcionaelcoeficientedeextincindeuncompuesto? Dequmanerasepuedealterarelcoeficientedeextincindeuncompuesto? Porqusedicequeelcoeficientedeextincindeunasustanciaesunvalorconstante? Culoculesvariablesafectanelvalordelaabsorbanciadeunasolucin? Culessonyqurolcumplecadacomponentedeunfotmetro? Queselfactordecalibracindeunmtodofotomtrico? Culeslaformadecalcularelfactordecalibracin? Cmosepreparaunacurvadecalibracin? Paraqusepreparaunacurvadecalibracin? CundounatcnicafotomtricaobedecelaLeydeLambertBeer? Queselrangoptimodeunprocedimientofotomtrico? Cmosemidefotomtricamentelaconcentracindeunasustanciaquenoabsorbeluzvisible? Porqusemidelaabsorbanciaa540nmtantoenelmtodoSomogyNelsoncomoenelBiuret? PROPORCIONEOTRASPREGUNTASSIMILARESALASANTERIORES EJERCICIO: Usando los datos de la siguiente tabla, prepare los grficos correspondientes, analcelos y saquelasconclusionescorrespondientes. CONCENTRACIN %T CONCENTRACIN A 0 100 0 0 1 80 1 0,097 2 64 2 0,194 3 51,2 3 0,291 4 40,96 4 0,388 5 32,77 5 0,485 6 26,21 6 0,582 7 20,97 7 0,678 8 16,78 8 0,775 9 13,42 9 0,872 10 10,74 10 0,969 EJERCICIO: Prepare el grfico correspondiente a los datos de las siguiente tabla (curva de calibracin delmtodoiodoioduroparaalmidn)ycalculeelfactordecalibracinconsusunidades. galmidn/tubo 0 A620 0.0 50 0.035 125 0.086 250 0.15 375 0.25 500 0.32 625 0.38 750 0.44

You might also like