GuiaMicrobiologiadealimentos

UniversidadTecnolgicaMetropolitana FacultaddeCienciasNaturales,MatemticaydelMedioAmbiente DepartamentodeBiotecnologa
Microbiologa g de Alimentos
Profesores: M.SoledadToledo GustavoFandez
Laboratorio de Microbiologa de Alimentos

Universidad Tecnolgica Metropolitana Facultad de Ciencias Naturales, Matemtica y del Medio Ambiente Departamento de Biotecnologa
Instrucciones y normas del trabajo en el laboratorio

1. Materiales que debe traer el alumno Delantal blanco obligatorio para todos. Los alumnos deben ponerse su delantal ANTES de entrar al laboratorio. Cuaderno de cualquier tipo para todas las clases (Obligatorio). Lpiz marcador de vidrio (Obligatorio). Se exigir 1 lpiz marcador por mesn el que deber ser rotulado con la carrera, seccin y mesn de trabajo. Este lpiz debe ser entregado a la profesora o asistentes quienes en cada clase los entregarn a cada grupo y los retirarn al trmino no de ellas. Pauelo de tela para limpiar las lentes del microscopio. Basta con 1 por mesn que puede quedar guardado en el laboratorio.
2. Evaluacin Controles de entrada: Se realizarn en cada clase durante los 15 primeros minutos. Se evaluar la actividad idad prctica de la clase anterior y el contenido terico de la gua que corresponde en ese momento. Los controles Informes: Para todas las actividades prcticas realizadas debern entregar un informe por grupo de trabajo. Estos informes debern ceirse estrictamente al formato especfico que se encontrara disponible en el sistema Reko para la asignatura. Evaluacin:
La nota final de laboratorio se pondera en un 40% para efecto de la nota final de la asignatura (terico-prctico) prctico) El Laboratorio se aprueba con nota igual o superior a 4.0 independientemente de la nota obtenida en la ctedra
La asistencia a los laboratorios es de 100%. Se aceptar slo un 10% inasistencia debidamente justificada. Una inasistencia superior al 10% ser motivo de reprobacin. reprobacin NO
INGRESARAN RAN AL LABORATORIO LOS ALUMNOS QUE LLEGUEN ATRASADOS Y NO TENDRN LA POSIBILIDAD DE RE REALIZARLO ALIZARLO EN OTRA OPORTUNIDAD.

Recursos en la Web
Reglamento Sanitario de los alimentos ( (actualizado actualizado a abril de 2009)
http://www.redsalud.gov.cl/portal/url/page/minsalcl/g_proteccion/g_alimentos/reglamento_sanitario _alimentos.html
Agencia Chilena para la Inocuidad Alimentaria (ACHIP (ACHIPIA) http://www.achipia.cl/prontus_inocuidad/site/edic/base/port/home.html p://www.achipia.cl/prontus_inocuidad/site/edic/base/port/home.html Bacteriological Analytical Manual (BAM)
http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualB http://www.fda.gov/Food/Scie nceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualB AM/default.htm
FDA (U.S. Food and Drug Administration)
http://www.fda.gov/default.htm
FAO (Organizacin Organizacin de las Naciones N Unidas para la Agricultura gricultura y la Alimentacin) Oficina Regional para Amrica Latina y el Caribe
http://www.rlc.fao.org/default.htm
USDA (United States Department of Agriculture)
http://www.usda.gov/wps/portal/usdahome

Prctico N 1 Reglamento Sanitario de los Alimentos (RSA)

Criterios microbiolgicos y planes de muestreos Inocuidad de los alimentos Los brotes de enfermedades transmitidas por los alimentos (ETAs) se han multiplicado y los costos econmicos, sociales y comerciales asociados a la prevencin y control de ellas han aumentado. A pesar del mayor conocimiento y desarrollo tecnolgico disponible nuevos riesgos vinculados a los alimentos emergen cada cierto tiempo, los que son percibidos rpidamente por consumidores ms informados y exig exigentes. entes. Lo anterior, ha reposicionado la preocupacin por la inocuidad y seguridad de los alimentos. El Codex Alimentarius define la inocuidad como la garanta de que los alimentos no causarn dao al consumidor cuando se preparen y / o consuman de acuerdo con el uso a que se destinan. El concepto de inocuidad hace referencia a todos los riesgos, sean crnicos o agudos, que pueden hacer que los alimentos sean nocivos y no aptos para la salud de las personas. La inocuidad de los alimentos se asegura princi principalmente palmente mediante el control en el punto de origen, el control de la planificacin y formulacin del producto y la aplicacin de buenas prcticas de higiene durante la produccin, la elaboracin (incluido el etiquetado), la manipulacin, la distribucin, el el almacenamiento, la venta, la preparacin y el uso, junto con la aplicacin del Sistema de Anlisis de Peligros y de Puntos Crticos de Control (HACCP). Este enfoque preventivo ofrece un control mayor del que se obtiene con los ensayos microbiolgicos, tomando tomando en cuenta de que la eficacia del ensayo microbiolgico para evaluar la inocuidad de los alimentos es limitada. Los criterios microbiolgicos deben establecerse de conformidad con estos principios y basarse en anlisis y asesoramiento cientficos y, cuando uando se disponga de datos suficientes, en un anlisis de riesgos adecuado para el producto alimenticio y su uso. Adems, tienen que elaborarse de forma transparente, cumpliendo con los requisitos necesarios para un comercio equitativo, y revisarse peridicamente camente para comprobar su utilidad frente a nuevos agentes patgenos, tecnologa en evolucin y nuevos conocimientos cientficos. Reglamento Sanitario de los Alimentos (RSA) Este reglamento establece las condiciones sanitarias a que deber ceirse la produccin, importacin, elaboracin, envase, almacenamiento, distribucin y venta de alimentos para uso humano, con el objeto de proteger la salud y nutricin de la poblacin y garantizar el suministro de productos sanos e inocuos. Este reglamento se aplica apli igualmente a todas las personas, naturales o jurdicas, que se relacionen o intervengan en los procesos aludidos anteriormente, as como a los establecimientos, medios de transporte y distribucin destinados a dichos fines.
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El RSA en su Titulo V se refiere a los Criterios Microbiolgicos que deben cumplir los alimentos. En el RSA se definen 18 grupos de alimentos segn su origen y/o tecnologa aplicada en su elaboracin. Adems, se establecen los parmetros microbiolgicos que se controlarn en los distintos grupos de alimentos: microorganismos indicadores, microorganismos patgenos, toxinas, etc. Los microorganismos indicadores son aquellos microorganismos no patgenos pero frecuentemente asociados a stos, utilizados para reflejar el riesgo de la presencia de agentes productores de enfermedades. Por lo tanto, estos organismos indicadores no implican peligros sanitarios pero pueden ser indicativos de la presencia de patgenos y pueden emplearse como indicadores indirectos de un peligro para la salud. El anlisis de microorganismos patgenos puede ayudar a garantizar la seguridad de los alimentos. La definicin de si es til o no considerar de deteccin de un microorganismo patgeno puede ser resuelto utilizando un rbol de decisin, que se presenta en la siguiente figura. Lo anterior, es aplicable cuando el microorganismo patgeno no se encuentra como parmetro microbiolgico en el RSA; situacin que era aplicable a patgenos como Listeria monocytogenes y Campylobacter jejuni que no se encontraban especificados para ninguno de los 18 grupos de alimentos. No obstante, los reportes recientes de casos producidos por Listeria monocytogenes llevaron a las autoridades del Ministerio de Salud (Minsal) a poner a discusin pblica la incorporacin la exigencia de este parmetro microbiolgico a los alimentos de mayor riesgo; es as como hoy se encuentra especificado su deteccin y cuantificacin para alimentos listos para consumir (LPC). Debemos sealar que aunque existen patgenos, como Campylobacter jejuni, que no se encuentra especificado en el RSA, este en su Artculo 173 seala: Si en un alimento se detecta la presencia de microorganismos patgenos no contemplados en el reglamento, la autoridad sanitaria podr considerarlo alimento contaminado, conforme a la evaluacin de los riesgos que de su presencia se deriven.
Figura: rbol de decisin para definir si un anlisis de patgenos debe ser utilizado como criterio de aceptacin de un lote. Definiciones: PCCs (puntos criticos de control); FSO (Objetivo de seguridad alimentaria).
Criterios microbiolgicos La Comisin Internacional de Especificaciones Microbiolgicas de los Alimentos (ICMSF) ha definido criterios microbiolgicos que permiten distinguir los alimentos de calidad aceptable de los no aceptables. El criterio microbiolgico para un alimento define la aceptabilidad de un producto o un lote de un alimento basada en la ausencia o presencia, o en la cantidad de microorganismos, incluidos parsitos, y/o en la cantidad de sus toxinas/metabolitos, por unidad o unidades de masa, volumen, superficie o lote. Los criterios microbiolgicos pueden utilizarse para formular requisitos de diseo y para indicar, segn proceda, el estado microbiolgico requerido de las materias primas, los ingredientes y los productos terminados en cualquier fase de la cadena alimentaria. Los criterios microbiolgicos normalmente no son adecuados para la vigilancia de los lmites crticos definidos en el Sistema HACCP. Los procedimientos de vigilancia deben permitir detectar prdidas de control en un punto crtico de control (PCC). Mediante la vigilancia esta informacin deber proporcionarse a tiempo para que puedan adoptarse medidas correctivas, con objeto de recuperar el control antes de que sea necesario rechazar el producto. Por esta razn, con frecuencia se prefiere efectuar mediciones de los parmetros fsicos y qumicos sobre la lnea de produccin en vez de realizar ensayos microbiolgicos, teniendo en cuenta de que los resultados pueden obtenerse a menudo ms rpidamente y en el lugar de la produccin. Los criterios microbiolgicos pueden ser de carcter de ley o gua: a) Estndar microbiolgico, es un criterio especificado en una ley o regulacin; b) especificacin microbiolgica, es un criterio aplicado en el comercio, es una condicin contractual de aceptacin que permite definir la calidad microbiolgica de un producto o ingrediente; c)
pautas microbiolgicas, es usado para el monitoreo de la aceptabilidad microbiolgica de un producto o proceso. Para definir el criterio analtico que debe usarse para evaluar la calidad microbiolgica de un alimento, debe considerarse la poblacin a la cual va dirigido, las caractersticas del alimento (factores intrnsecos), el proceso tecnolgico aplicado, la forma de conservacin durante su almacenamiento, distribucin y preparacin antes de consumir. El RSA no especifica sobre las metodologas, pero en la medida de lo posible, debern aplicarse solamente mtodos cuya fiabilidad (precisin, reproducibilidad, variacin entre laboratorios y dentro de ellos) se haya establecido estadsticamente en base a estudios comparativos o realizados en colaboracin entre varios laboratorios. Adems, deber darse preferencia a los mtodos que se hayan validado para el producto en cuestin, preferentemente con relacin a los mtodos de referencia elaborados por organismos internacionales. Si bien los mtodos debern ser lo ms sensibles y reproducibles posible para que puedan obtenerse los efectos que se persiguen, los mtodos que han de utilizarse para llevar a cabo ensayos en las fbricas, a menudo la sensibilidad y reproducibilidad podrn sacrificarse hasta cierta medida en aras de la rapidez y la sencillez. No obstante, deber haberse demostrado que dichos mtodos dan una evaluacin suficientemente fiable de la informacin que se requiere. Los mtodos que se aplican para determinar la idoneidad para el consumo de alimentos altamente perecederos, o de alimentos con una breve duracin en almacn, debern elegirse, en lo posible, de tal forma que los resultados de los exmenes microbiolgicos puedan obtenerse antes de que los alimentos se consuman o lleguen a superar su duracin en almacn. Las metodologas que pueden ser aplicadas son las definidas por Normas ISO, FDA (Bacteriological Analytic Methods; BAM), Instituto de Salud Pblica (ISP), entre otras. Planes de muestreo para el anlisis microbiolgico de alimentos El xito del control microbiolgico de los alimentos depende del anlisis de un nmero y tamao de muestra adecuada. Considerando que la distribucin de los microorganismos en un alimento es raramente uniforme (se pueden encontrar distribuidos al azar, en forma regular o en agregados de clulas) se tendera a tomar un mayor nmero de muestras, lo cual por la naturaleza de los anlisis sera un muestreo destructivo y difcil de llevar a cabo por razones de costo. En 1974 la ICMSF con el libro Microorganisms in Foods 2, lleno el vaco existente en lo referente a planes de muestreos en el anlisis microbiolgico. En dicho libro se describen los conceptos bsicos sobre el peligro microbiolgico, la severidad, el tipo y la estrictez de los planes de muestreos. El RSA incorpora estos conceptos en la definicin de aceptabilidad o rechazo de un lote de alimento. Todo plan de muestreo incluye un procedimiento de muestreo y los criterios decisorios que han de aplicarse al lote, basndose en el examen del nmero prescrito de unidades de la muestra y de las unidades analticas subsiguientes del tamao indicado en los mtodos determinados. Un plan de muestreo adecuadamente diseado define la probabilidad de deteccin de microorganismos en un lote, pero debe tenerse presente que ningn plan de muestreo puede asegurar la ausencia de un determinado organismo.
La seleccin de planes de muestreo deber tener en cuenta: los riesgos para la salud pblica asociados con el peligro; la susceptibilidad del grupo de consumidores destinatario; la heterogeneidad de distribucin de los microorganismos cuando se utilizan planes de muestreo con variables; y el nivel de calidad aceptable y la probabilidad estadstica deseada de que se acepte un lote que no cumple con los requisitos. El RSA aplica el esquema propuesto por ICMSF donde el muestreo es por atributo y los resultados analticos son asignados dentro de clases:
Plan de 2 clases: Las muestras (lotes) son clasificadas como aceptables o rechazables (o defectuosas). Una muestra es definida rechazable cuando presenta o contiene un nmero mayor de microorganismos especificados o cuando se aplica un anlisis que determina presencia o ausencia. El plan de atributos de 2 clases se define por tres nmeros: n = N de unidades de muestra; c = N de unidades de muestras defectuosas; y m = lmite que separa la calidad buena de la defectuosa. Ejemplo: n =5; c= 2; y m =103 UFC/g. Lo anterior, significa que deben tomarse 5 unidades de un lote y si en 2 o menos unidades presentan un nmero igual o menor a 103 UFC/g del microorganismo en estudio el lote puede ser aceptado. Otro ejemplo, n = 10; y c=0. Deben tomarse 10 unidades de muestra y para aceptar el lote, en ninguna de las unidades de muestra debe estar presente el microorganismo testeado. Plan de 3 clases: Este plan divide las muestras (lotes) en tres clases: aceptables, aceptacin con reserva (o medianamente aceptable) y rechazables. El plan de atributos de 3 clases se define por cuatro nmeros: n = N de unidades de muestra; c = N de unidades de muestra que caen dentro de la categora medianamente aceptable (entre m y M); m = separa la calidad buena de la marginalmente aceptable; y M = lmite mximo. Ejemplo: n=5; c=2; m=103 UFC/g y M=105 UFC/g. Lo anterior, significa que deben tomarse 5 unidades de muestra de un lote y si en 2 o menos unidades de muestra presentan un nmero igual o menor a 105 UFC/g del microorganismo estudiado el lote puede ser aceptado. El nmero mximo de unidades de muestras que puede exceder el lmite M es siempre cero.
Referencias:
ICMSF. 1986. Microorganisms in foods 2. Sampling for Microbiological Analysis: Principles and Aplications. 2nd University of Toronto Press, Toronto. ICMSF. 2002. microorganismos de los Alimentos 7. Anlisis microbiolgico en la gestin de la seguridad alimentaria. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. Minsal. 1996. Reglamento Sanitario de los Alimentos.
Prctico N 2 Organismos Indicadores (I)

(Alimento modelo: Leche y productos lcteos)
Organismos Indicadores El control microbiolgico de alimentos contempla la aplicacin de parmetros cuantificacin de organismos indicadores y deteccin de microorganismos patgenos Los microorganismos indicadores no implican peligros sanitarios pero pueden ser indicativos indi de la presencia de patgenos y pueden emplearse como indicadores indirectos de un peligro para la salud. Es importante reconocer que las relaciones entre los patgenos y los microorganismos indicadores no son universales y estn muy influenciadas por p el alimento y el proceso de produccin. La eleccin de un microorganismo indicador debe considerar que este no constituya parte de la flora normal del alimento, ya que pueden interferir en los resultados y hacer que los recuentos obtenidos carezcan de sentido. Los organismos indicadores pueden ser tiles para valorar la eficacia de las operaciones de limpieza y desinfeccin o en muestreos investigativos. Al no tener certeza absoluta sobre las relaciones entre los indicadores y los patgenos, el nivel de preocupacin que la presencia de ellos genera es moderado, por lo que no resulta apropiada la aplicacin de planes de muestreo muy rigurosos para el microorganismo indicador. Para esta actividad prctica hemos seleccionados los parmetros de Enterobacteriaceae, aceae, organismos coliformes y Escherichia coli, los cuales sern evaluados en productos lcteos. El recuento de Enterobacteriaceae fue utilizado inicialmente para evaluar la calidad microbiolgica de productos que son sometidos a tratamientos trmicos, por lo tanto su presencia en nmero significativo indica anomala o fallo en el tratamiento aplicado. Actualmente, este parmetro microbiolgico es aplicado para algunos alimentos en reemplazo de los organismos coliformes, la ventaja radica principalmente en que el anlisis para coliformes no detecta cepas de Escherichia coli lactosa negativa y la posible presencia de otros microorganismos patgenos lactosa negativa como Salmonela y Shigela. Para la cuantificacin de ambos parmetros se emplea el mismo medio medio de cultivo, pero se sustituye la lactosa por glucosa para la cuantificacin de Enterobacterias, ya que todos los miembros de la Familia de las Enterobacteriaceae fermentan glucosa. Los organismos coliformes constituyen un grupo dentro de la familia Enterobactereaceae (bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, no formadores de esporas) que adems de fermentar la glucosa son capaces de fermentar lactosa a 35 C dentro de 48 horas. Este grupo incluye especies de origen no fecal (coliformes totales total CT) y origen fecal (coliformes fecales CF). El grupo coliformes ha sido empleado por dcadas como indicador de posible contaminacin en agua de bebida, aunque, su significancia en los alimentos debe ser interpretada con precaucin. Algunas especies
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bacterianas se encuentran abundantemente en el intestino del hombre y animales; sin embargo, el aislamiento de organismos coliformes desde los alimentos no necesariamente refleja contaminacin fecal. La presencia de un gran nmero de estas bacterias en algunos alimentos puede indicar la prdida de buenas prcticas sanitarias. Tambin, puede ser reconocido que ciertas bacterias coliformes son parte de la flora normal del alimento. Para establecer la significancia de bacterias coliformes en los alimentos es necesario conocer las caractersticas microbiolgicas y la historia del producto. Escherichia coli pertenece al grupo de los coliformes y su presencia en los alimentos indica la posible contaminacin de origen fecal y por tanto implica la posible presencia de microorganismos patgenos y no solamente bacterianos sino tambin de virus entricos, los cuales no pueden ser detectados por los anlisis rutinarios. La diferencia entre detectar el grupo coliformes y E. coli queda reflejado en los lmites permitidos para cada parmetro y del tipo de alimento. Por ejemplo el nmero de coliformes en vegetales frescos puede ser elevado por la presencia de Enterobacter spp, coliformes no fecal, gneros que forma parte de la flora natural de plantas y por tanto los coliformes no tienen significancia como organismos indicadores en este tipo de alimentos. En cambio, la presencia de E. coli en lechugas puede provenir del suelo o agua contaminada utilizada para el regado, adems es conocido que los vegetales frescos pueden ser vectores de patgenos humanos como por ejemplo Salmonella typhi. Por tanto la presencia de coliformes puede no tener significancia en este tipo de alimentos, pero si la presencia de E. coli ya que indica un potencial riesgo para la salud. Leche y productos lcteos La leche representa un medio de cultivo ptimo para el crecimiento de una serie de microorganismos, debido a su alta actividad de agua, pH moderado y una amplia gama de nutrientes (grasa, protenas, lactosa, etc.). Aunque, la leche presenta sustancias con efecto bacteriosttico (inmunoglobulinas, el sistema lactoperoxidasa/tiocianto/perxido de hidrogeno y lactoferrina) estas no son suficientes para evitar el desarrollo de microorganismos alteradores o patgenos. Por lo tanto, la leche y productos lcteos demandan altos estndares de higiene en su produccin y procesamiento. La leche es un buen vehculo para la transmisin de microorganismos patgenos, debido a que su contenido en grasas los protege de la acidez gstrica. Entre los microorganismos que han sido implicados como causa de ETA asociados con este alimento se encuentran Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica y Staphylococcus aureus. La presencia de Campylobacter jejuni en la leche puede ser como resultado de contaminacin fecal en las granjas o posiblemente por mastitis por Campylobacter jejuni. Esta bacteria no es capaz de sobrevivir al proceso de pasteurizacin y la mayora de los brotes son originados por leche no pasteurizada o por tratamientos deficientes. Contaminaciones post proceso pueden tener lugar cuando las condiciones de saneamiento de las plantas no es adecuado. Los productos lcteos y leche cruda o pasteurizada han sido implicados como vehculos de transmisin de varios brotes de listeriosis. Se ha estimado que la incidencia de Listeria monocytogenes en leche cruda en Europa y Estados Unidos es 2,2%. En algunos brotes se ha demostrado que el proceso de
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pasteurizacin ha sido apropiado, lo cual ha indicado que en algunos casos este microorganismo presenta una importante resistencia al calor. Se han descrito varios brotes de yersiniosis resultantes del consumo de leche pasteurizada. En tres brotes producido en Estados Unidos, el alimentos implicado fue leche chocolatada, este microorganismo fue introducido a la leche cuando se adiciono chocolate a la leche despus de la pasteurizacin, es decir contaminacin post-proceso trmico. Son muy pocos los brotes descritos en los cuales Staphylococcus aureus ha estado involucrado en ETA por leche pasteurizada, ya que este microorganismo es destruido mediante este tratamiento trmico. Sin embargo, las enterotoxinas producidas antes del tratamiento pueden resistir el proceso de pasteurizacin. En la leche cruda los microorganismos indicadores son tiles para juzgar el funcionamiento del establecimiento productor, pues sealan la existencia de defectos durante la manipulacin, el incumplimiento de las pautas de higiene y permiten inferir la vida til y la inocuidad del alimento. Entre los grupos o microorganismos indicadores, las enterobacterias y Escherichia coli sugieren el origen fecal de la contaminacin, mientras que Staphylococcus aureus se relaciona con la ubre infectada (mastitis), la piel, las mucosas y el tracto respiratorio de los animales y el hombre. Objetivos: o Conocer la preparacin de muestras de alimentos para Anlisis Microbiolgicos. o Conocer y aplicar las metodologas de Recuento en placa y NMP empleadas para el anlisis de Enterobactereaceas, Coliformes y E. coli en alimentos. o Interpretar resultados de los anlisis realizados. Muestras: Leche UHT y quesillo Procedimientos: 1.- Preparacin y dilucin de las muestras: Previo al anlisis microbiolgico de los alimentos se requiere liberar los microorganismos que se encuentran en el interior o adheridos en las superficies secas o gelatinosas del alimento. Para ello es necesaria la homogeneizacin de los alimentos con la solucin diluyente de forma tal que los microorganismos pasen al medio fluido, este procedimiento se puede realizar con licuadoras con vasos esterilizables o idealmente con Stomacher 400. En esta etapa se obtiene la dilucin 10-1. Sin embargo, existen alimentos que por su naturaleza requieren tratamiento especial, los cuales se detallan en la Anexo 1, Entre la homogenizacin y la siembra en los medios apropiados no deben pasar ms de 20 minutos. * Desinfectar la superficie del envase con alcohol al 70%. Pesar 25 g (o 25 mL) de la muestra y depositarla en una bolsa de Stomacher estril. Aadir 225 mL del diluyente (agua peptonada) para obtener la dilucin 10-1 * Homogeneizar la muestra en el Stomacher por 2 minutos. * Traspasar 1 mL de la dilucin 10-1 a un tubo que contiene 9 ml del diluyente.
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* Mezclar la dilucin en un vortex o en su defecto debe aspirar un 1 mL de la solucin y volver este al tubo (repetir 10 veces). De este modo se obtiene la dilucin 10-2. Repita este procedimiento para preparar las diluciones consecutivas necesarias (10-3, 10-4, etc.).
2.- Recuento de Enterobacteriaceae
Lectura: Elegir las placas que presenten entre 15 y 150 colonias. Si slo se dispone de placas con menos de 20 colonias, utilizar dichas placas. Contar colonias purpuras. Registrar recuento presuntivo: N de colonias x 1/dilucin Pruebas confirmativas: * Prueba Oxidasa: * Prueba de fermentacin de la glucosa (medio glucosa-sal cubierta con parafina slida). Las colonias pertenecientes a la Familia de Enterobacteriaceae dan la prueba de la oxidasa negativa y fermentan la glucosa. Expresin de resultados:
N colonias confirmadas Rto. Enterobacterias = Recuento X -----------------------------------------------Presuntivo N de cols. sometidas a confirmacin
3.- Nmero Ms Probable de Coliformes: La tcnica del nmero ms probable (NMP) o tcnica de tubos mltiples es utilizada para estimar el nmero de unidades formadoras de colonias (UFC) en muestras de alimento. La tcnica es particularmente til para organismos indicadores o para microorganismos patgenos que se encuentran en un nmero muy bajo para ser recuperados y cuantificados por el mtodo de recuento en placa, como por ejemplo Staphylococcus aureus. La tcnica
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del NMP es un mtodo estadstico basado sobre la probabilidad de transferir una UFC desde una dilucin usando muestras mltiples y empleando una tabla estadstica (tabla NMP) que entregan el valor NMP para varias combinaciones de tubos positivos. (ver tcnica).
3.1. Prueba presuntiva: * Inocular 9 tubos de caldo Lauril Sulfato Triptosa (CLST): 3 tubos con 1 mL de la dilucin 10-1 3 tubos con 1 mL de la dilucin 10-2 3 tubos con 1 mL de la dilucin 10-3 Incubar a 35 C por 24 a 48 horas Lectura : Observar la formacin de gas en los tubos de fermentacin a las 24 horas. En caso necesario incubar por 24 horas ms. Registrar el nmero de tubos positivos. 3.2. Pruebas confirmativas: 3.2.1. Coliformes totales: Transferir un inculo con el asa de cada tubo positivo a caldo Bilis Verde Brillante (BVB). Adems como controles se siembra un tubo con S. aureus como control negativo y otro tubo con Enterobacter aerogenes como control positivo. * Incubar a 35C durante 24 a 48 horas. Lectura : Observar la formacin de gas en las campanas de Durham. Registrar el nmero de tubos positivos 3.2.2. Coliformes fecales : *
Transferir un inculo con asa de cada tubo positivo a caldo EC. Nota: Los tubos de caldo EC deben estar templados a 44,5C (30 minutos antes de su utilizacin). Adems, como controles se siembra un tubo con Enterobacter aerogenes como control negativo y otro tubo con Escherichia coli como control positivo. Incubar a 44,5 C 0.2 C durante 24 a 48 horas. Lectura : Observar la formacin de gas en las campanas de Durham. Registrar el nmero de tubos positivos. El cdigo obtenido en la fase confirmativa se consulta en la tabla para NMP anexo 2. 4.- NMP de Escherichia coli : * Inocular 9 tubos de caldo Lauril Sulfato Triptosa (CLST): 3 tubos con 1 mL de la dilucin 10-1 3 tubos con 1 mL de la dilucin 10-2
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3 tubos con 1 mL de la dilucin 10-3 * Incubar a 35 C por 24 a 48 horas Lectura : Observar la formacin de gas en los tubos de fermentacin * De cada tubo de caldo CLST que presente formacin de gas en el test presuntivo transferir una asada a caldo EC-MUG. * Incubar los tubos a 44.5C por 24 horas. Exponer los tubos a una fuente de luz UV y observar la fluorescencia emitida. Registre el nmero de tubos positivos (fluorescencia +). Adems, debe utilizar 2 controles para el anlisis de los resultados: Control positivo: E. coli Control negativo: Klebsiella pneumoniae. Confirmacion de E. coli * Tomar una muestra de cada tubo positivo y sembrar por agotamiento en agar EMB e incubar a 35 C por 24 horas. Lectura: Observar colonias que presenten un centro oscuro con o sin brillo metlico. Transferir las colonias sospechosas en agar nutritivo tendido e incubar por 24 horas a 35C. A partir de este cultivo realizar tincin de Gram y las pruebas bioqumicas IMViC Las pruebas bioqumicas se realizan a todos los cultivos en que se observen bacilos cortos Gram negativos.
_______________________________________________________ Indol Rojo metilo Voges Proskauer Citrato _____________________________________________________________________ Biotipo I + + _____________________________________________________________________ Biotipo II + _____________________________________________________________________
Todos los cultivos que se observen como bacilos Gram negativos y cuyas pruebas IMViC sean biotipo I o II son consideradas E. coli. Referencias Reglamento Sanitario de los Alimentos (1996). Ministerio de Salud. Chile. Food and Drug Administration (FDA). Bacteriological Analytical Manual. AOAC. 8 Edition. 1995 Tambin puede encontrar en internet la ltima versin de este manual. Http://www.cfsan.fda.gov/~ebam
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Anexo 1
Diluyentes y tratamiento de las muestras Alimento Alimentos cidos (pH inferior a 4,5) Procedimiento Mezclar 10 g o mL con 10 mL de solucin buffer pH 7.0 para tamponada. Tomar 2 mL y mezclar con 8 mL del diluyente (dilucin 10-1 ) Utilizar la solucin diluyente temperada a 45C. Pesar 2 gr y aadir 200 mL de diluyente (10-2 ) Dejar rehidratar por 30 minutos a 4C y luego agitar por 3 minutos Agregar al diluyente 1% de Tween 80, para aumentar dispersin de los glbulos de grasa. Fundir bajo agitacin en bao termorregulado a 40C por no ms de 15 minutos. Utilizar como diluyente para preparar la dilucin 10-1 una solucin de citrato de sodio al 2%.
Alimentos deshidratados : sopas, leche en polvo, huevo en polvo, etc. Gomas, especias molidas Vegetales deshidratados Alimentos grasos (>20%) Mantequilla o margarina Quesos
Anexo 2
TABLA DE NUMERO MAS PROBABLE PARA SERIE DE TRES TUBOS PARA DILUCIONES DE 0,1 - 0,01 - 0,001 gramos
Pos. tubes Conf. lim. MPN/g 0.10 0.01 0.001 Low High -9.5 0 0 0 <3.0 0.15 9.6 0 0 1 3.0 0.15 11 0 1 0 3.0 1.2 18 0 1 1 6.1 1.2 18 0 2 0 6.2 3.6 38 0 3 0 9.4 0.17 18 1 0 0 3.6 1.3 18 1 0 1 7.2 3.6 38 1 0 2 11 1.3 20 1 1 0 7.4 3.6 38 1 1 1 11 3.6 42 1 2 0 11 4.5 42 1 2 1 15 4.5 42 1 3 0 16 1.4 38 2 0 0 9.2 3.6 42 2 0 1 14 4.5 42 2 0 2 20 3.7 42 2 1 0 15 4.5 42 2 1 1 20 Pos. tubes Conf. lim. MPN/g 0.10 0.01 0.001 Low High 42 2 2 0 21 4.5 94 2 2 1 28 8.7 94 2 2 2 35 8.7 94 2 3 0 29 8.7 94 2 3 1 36 8.7 94 3 0 0 23 4.6 110 3 0 1 38 8.7 180 3 0 2 64 17 180 3 1 0 43 9 200 3 1 1 75 17 37 420 3 1 2 120 420 3 1 3 160 40 420 3 2 0 93 18 420 3 2 1 150 37 430 3 2 2 210 40 1,000 3 2 3 290 90 1,000 3 3 0 240 42 2,000 3 3 1 460 90 4,100 3 3 2 1100 180
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2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 --
Prctico N 3 Organismos Indicadores (II)

(Alimento modelo: Productos grasos)
Recuento de aerbios mes sfilos En algunos alimentos el nmero de microorganismos viables puede entregar informacin acerca de ciertas ertas condiciones relacionadas con la produccin, roduccin, proces procesamiento y distribucin. Por ejemplo, elevado nmero de microorganismos viables viabl en la leche (materia a prima) puede ser el resultado de inadecuado lavado y sanitizacin sanitizaci 1 de las maquinas recolectoras de la leche, tambores y sistema de enfriamiento iento inadecuado o una combinacin de ambos. En la leche pasteurizada, la presencia de elevado nmero de organismos viables puede ser producto de la contaminacin post-pasteurizacin asteurizacin a travs del inapropiado lavado y sanitizacin de los equipos, o crecimiento ento de bacterias que sobreviven al tratamiento ento y/o contaminantes que se multiplican lican por inadecuada temperatura de conservaci n. El recuento en placa es un mtodo comnmente usado para estimar la poblacin microbiana presente. resente. Bsicamente este mtodo consiste onsiste mezclar una alcuota del alimento (o dilucin) con un medio de cultivo estril de manera que las clulas microbianas de la muestra de alimento puedan multiplicarse y formar colonias visibles. Las colonias son entonces contadas y posteriormente se toma en consideracin el factor de dilucin y la cantidad de muestra plaqueada; el recuento entrega una estimacin del nmero de organismos os vivos presentes en el alimento. Recuento en placa puede ser utilizado para: a) chequear la calid idad microbiolgica de materias primas y produ oducto terminado; b) chequear las condiciones de higiene durante el proceso de produccin; c) determina si un alimento ha sido sometido metido a temperatura de abuso durante la produccin, transporte y conservacin; d) estimar la potencial vida til de un producto y e) determinar los niveles de contaminacin cin en el ambiente de procesamiento de los alimentos. ali Diferencias en el procedimiento procedi de recuento en placa (por ejemplo eje utilizacin de diferentes medios de cultivo, cul diluyentes o tiempo y temperatura) eratura) pueden dar lugar a diferencias en los resultados. Por esta razn, procedimientos estandarizados son necesarios para comparar y confirmar los resultados obtenidos intra y extra-laboratorios. El Reglamento Sanitario de los Alimentos, fija los parmetros microbilogicos microbilog pero no seala la metodologa a aplicar. Por este motivo la eleccin de la metodolog etodologa debe ser basada en las propuestas por Instituto de Salud Pblica (ISP) o por Organismos internacionales como la FAO AO o FDA. El recuento de aerbios mesfilos es uno de los parmetros etros microbiolgicos ms frecuentemente utilizados en el control de los alimentos. Aunque, dependiendo del
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Sanitizacin: Comprende los procesos implicados en la destruccin de la mayora de los microorganismos de las superficies y del equipo, pero no necesaria cesariamente las esporas bacterianas
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tipo de proceso tecnolgico al cual ha sido sometido el alimento se pueden determinar microorganismos aerbios de otros grupos fisiolgicos como son los termoduricos2, termofilicos3, psicrofilos4 o psicrotroficos5.
Recuento de Staphylococcus aureus Las enfermedades transmitidas por el consumo de alimentos contaminados constituyen un importante problema de salud pblica a escala mundial. Se ha reportado 6.5 a 33 millones de casos de infecciones alimentarias cada ao en Amrica y se estima que cerca de 9.000 afectados fallecen anualmente. El impacto econmico, de las enfermedades transmitidas por los alimentos (ETAs) se estima en miles de millones de dlares cada ao en USA, derivados de hospitalizacin, tratamientos, licencias, ausentismo laboral y muerte. Las estadsticas del ao 1996, en USA, revelan prdidas econmicas del orden de 9,3-12,9 billones de dlares anuales producto de las ETAs. De estos, 2,9 a 6,7 billones de dlares son atribuidos a brotes6 asociados a 6 especies bacterianas (Salmonella, Campylobacter jejuni, E. coli 0157:H7, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus y Clostridium perfringens). Staphylococcus aureus es comnmente establecido en la naturaleza, pero el hombre es la principal fuente o reservorio de este microorganismo; se encuentra boca, nariz y piel en alrededor de un 60% de individuos sanos. Por lo tanto, la cuantificacin de este microorganismo puede dar cuenta de contaminacin por mala manipulacin. Aunque, hay que tener presente que este agente bacteriano es capaz de causar enfermedad cuando son transmitidos por los alimentos. La enfermedad causada por Staphylococcus aureus es una toxinfeccin causada por enterotoxinas que son producidas por la bacteria cuando se multiplica en el alimento. Los sntomas de la enfermedad causada por Staphylococcus aureus usualmente se presenta a los 30 minutos a 8 horas despus de la ingesta de alimentos que contienen la toxina bacteriana. Los sntomas incluyen excesiva salivacin y nauseas seguida por violentos calambres abdominal (vmitos), diarrea. La enfermedad es raramente fatal y su duracin es usualmente de 1 a 2 das. S. aureus puede crecer en una amplia variedad de alimentos que contienen altos niveles de sal o azcar y puede ser destruidas por procesos de coccin, pero sus enterotoxinas son relativamente termoestable; y no son inactivadas por procesos de coccin habitual o por pasteurizacin. Alimentos grasos Los alimentos grasos corresponden segn el RSA al grupo 3 y comprenden a mantequillas y margarinas. Para conocer la microbiologa de los productos grasos es necesario tener presente la definicin de dichos productos. La mantequilla y margarina son emulsiones constituidas por aceite (o grasas) como fase continua y agua como fase
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Termoduricos: Sobreviven a la pasteurizacin pero no necesariamente crecen a esa temperatura (62.8C) Termofilicos: Crecen a temperatura elevadas (55c)
psicrofilos: Requieren temperaturas bajas, crecimiento ptimo entre 2 10C psicrotroficos: Pueden crecer en un amplio rango de temperaturas (similar a mesfilos, pero con un lmite ms bajo), incluso a 4 C. 6 Brote: incidente que involucra a 2 o ms casos de la misma enfermedad asociada al consumo del mismo alimento
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discontinua. La mantequilla est compuesta por grasa de la leche, una pequea cantidad de slidos de la leche, sal y agua. Las margarinas son productos de naturaleza grasa que contienen emulsificadores, saborizantes y colorantes, NaCl, vitaminas, sustancias preservantes. El tipo y cantidad de microorganismos presentes en estos productos dependen de: a) contenido de agua: los alimentos que contienen <20% de agua el crecimiento microbiano se ver afectado por el tamao fsico de las gotas de agua y el contenido de nutriente en ellas; b) distribucin de la fase acuosa, en las margarinas se considera una buena dispersin de la fase acuosa cuando 1mL de dicha fase se reparte en aproximadamente 1010 gotas con un dimetro inferior de 6 m, por lo tanto estas gotas son estriles y si los microorganismos estn presentes su crecimiento se ve limitado por nutrientes e inhibidores; c) contenido de nutrientes, la fase acuosa de la margarina contiene slidos de la leche; d) presencia de inhibidores en la fase acuosa, las margarinas adems de los slidos de la leche contienen sal, la cual puede inhibir un nmero importante de microorganismos. Si una margarina contiene 3% de sal, la fase acuosa tendr un 15,8% de sal, concentracin que solamente permite el desarrollo de microorganismos halfilos y halotolerantes (Ej. Staphylococcus aureus)
Objetivos: Conocer y aplicar las metodologas de Recuento de microorganismos aerbios mesfilos y su rol como organismos indicadores Conocer y adquirir destreza en las tcnicas para el recuento y NMP de Staphylococcus aureus Muestras: Margarina Procedimientos: 1. Preparacin de la muestra: Desinfectar la superficie del envase con alcohol al 70% Pesar 25 g de la muestra en una botella estril de 500 ml Fundir la muestra bajo agitacin en bao termoregulado a 40C por no ms de 15 minutos. Aadir 225 mL de diluyente (agua peptonada con 1% de Tween 80) para obtener la dilucin 10-1. Realizar diluciones seriadas hasta 10-5.
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2. Recuento de aerbios mesfilos (RAM): Depositar 1 mL por duplicado de cada dilucin en placas Petri estriles previamente rotuladas (Seccin, mesn, dilucin). Sembrar todas las diluciones. Verter en cada placa aproximadamente 15 a 18 mL de agar de recuento previamente fundido y mantenido a 45C. Mezclar el inculo con el medio fundido. Una vez solidificado el agar, invertir las placas e incubar a 35C durante 48 2 hrs
Recuento de colonias: El recuento de colonias en placa se realiza de acuerdo al siguiente esquema: Placas normales (25 250 colonias) Contar todas las colonias incluyendo aquellas de tamao muy pequeo. Anotar el nmero de colonias contadas en cada placa de cada una de las diluciones. Nota: No contar las placas con crecimiento invasivo. Calculo y registro de resultados: Si los recuentos de los duplicados (Placa 1 y 2) de slo una de las diluciones esta dentro del rango 25-250 colonias: Recuento = Promedio x 1/dilucin Si los recuentos de los duplicados de dos diluciones consecutivas quedan dentro del rango 25 250 colonias C N= ((1 x n1) + (0.1 x n2) x d Donde: N = nmero de colonias por mL de producto
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C = suma de todas las colonias contadas en todas las placas (de dos diluciones consecutivas con 25 250 colonias) n1 = nmero de placas contadas de la menor dilucin n2 = nmero de placas contadas de la dilucin consecutiva d = menor dilucin utilizada con el recuento (de las placas con 25-250 colonias) Ejemplo: Dilucin
10 10 -2 -3
Placa 1
254 34 288
Placa 2
234 29 263
TOTAL
288 + 263 N= ((1 x 2) + (0.1 x 2) x 10-2 N = 2,5 x 105 UFC/mL o g
Cuando el nmero de colonias de los duplicados queda tanto adentro como a fuera del rango 25 250 colonias, usar slo aquellos recuentos que estn dentro de este rango. Casos especiales: Placas sobrepobladas (Ms de 250 colonias) Anotar los recuentos de placas sobrepobladas como muy numerosas para contar (MNPC) cuando se dispone de placas normales en otras diluciones. Cuando no se dispone de placas normales (25 250 colonias), contar las colonias en sectores de la placa si su distribucin es homognea y calcular el recuento estimado en placas (RPES). Si hay menos de 10 colonias por cm2, contar las colonias en 12 cuadrados, seleccionar 6 cuadrados consecutivos horizontales de la placa y 6 cuadrados consecutivos formando ngulo recto. Contar cada cuadrado slo una vez (Figura ). Si hay ms de 10 colonias
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por cm contar las colonias en cuatro cuadrados. En ambos casos, mu ultiplicar el nmero promedio de las colonias contadas por cm2 por el rea de la placa usada, usa para estimar el nmero de colonias por placa. Si hay ms s de 10 colonias por cm c 2 , registrar como > 10 colonias/cm m2 Clculo y registro de resultados: 1.1. Placas con ms de 250 colonias, pero menos 10 por cm2: Utilizar los recuento de las placas ms cercano de 250, sacar promedio y multiplicar por el reciproco de la dilucin Ejemplo:
1.2. Placas >10 colonias promedio por c cm 2 Estimar que el RAM es mayor ayor 100 veces el promedio del rea de la placa por la dilucin ms alta sembrada. da.
: Basado en el rea de placa de 65 cm2 (9 cm de dimetro) ** : Basado en el rea de placa de 57,8 cm2 (8,5 cm dimetro 2. Placas con menos de 25 colonias (<25 colonias) Cuando las placas de las diluciones tienen menos de 25 colonias cada una, proceder como placas norm males. Calculo y registro de resultados: Cuando las placas de las diluciones menores tienen menos de 25 col lonias cada una, informar el recuento como: : <25 x 1/ dilucin menor 3. Placas sin desarrollo de colonias: Cuando ninguna de las placas presente desarrollo de colonias, registrar como sin desarrollo en la dilucin correspondiente (SD). 4. Crecimiento invasivo: Las colonias invasivas son generalmente general de tres tipos:
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Colonias en cadenas: Si solamente existe una cadena, contar como una colonia. Si una o ms cadenas parecieran originarse de fuentes distintas contar cada fuente como una colonia. Colonias que se desarrollan en una pelcula de agua entre el agar y el fondo de la placa Petri. Colonias que se forman en una pelcula de agua en el costado o en la superficie del agar. Si en las placas seleccionadas se presenta invasin, realizar recuento de las colonias solamente si: El rea invadida no excede la mitad de la placa Las colonias estn bien distribuidas fuera del rea invadida. Si no se cumple lo anterior, registrar como crecimiento invasivo o accidente de laboratorio 2.- Recuento de Staphylococcus aureus: * Distribuir 1 mL de cada dilucin equivalentemente (0,3 0,3 y 0,4 mL) en la superficie de tres placas de agar Baird Parker * Extender el inculo mediante rastrillo estril en toda la superficie del agar. Incubar a 35C durante 48 Horas. Lectura: Realizar recuento de todas las colonias de color negro o gris oscuro, brillantes, convexas, de 2-3 mm de dimetro, de consistencia cremosa y que presente una o ms de las siguientes caractersticas: Discreta zona de precipitado debajo de la colonia (lecitinasa) Halo alrededor de la colonia (lipasa), con una zona de precipitado debajo de ella. Halo alrededor de la colonia, sin precipitado. Registrar recuento presuntivo N colonias X 1/ dilucin
Pruebas de confirmacin: Prueba de la coagulasa: Repicar 3 a 5 colonias sospechosas y sembrar en caldo cerebro corazn. Realizar cultivos con cepa control (positivo: S. aureus, negativo S. epidermidis). Incubar a 35C durante 20-24 horas. Traspasar 0,1 mL de cultivo a un tubo con 0,3 mL de plasma de conejo. Incubar a 35C y examinar peridicamente por un lapso de 6 horas para observar la formacin de cogulo (Figura 3). Si se obtiene una coagulacin parcial (2+, 3+), estas colonias deben ser confirmadas mediante la prueba de nuclesasa termoestable. 22
Clculo y expresin de los resultados N de colonias confirmadas Recuento Confirmativo= Rto presuntivo X ____________________________ N de colonias ensayadas
3.- NMP de Staphylococus aureus: Realizar diluciones seriadas hasta 10-3 e inocular 9 tubos con caldo tripticasa de soya con 10% NaCl y 1% de piruvato de sodio: 3 tubos con 1 ml de la dilucin 10-1 3 tubos con 1 ml de la dilucin 10-2 3 tubos con 1 ml de la dilucin 10-3 * Incubar a 35C por 48 horas * Registrar como positivos aquellos tubos que presenten turbidez. De cada tubo positivo sembrar en superficie por agotamiento en agar Baird Parker * Incubar a 35 C por 24 horas * Seleccionar una o ms colonias sospechosas por tubo positivo y realizar la prueba de la coagulasa. Se considera como positivo el tubo en que se confirma al menos una colonia. * De acuerdo al nmero de tubos positivos se obtendr el cdigo del NMP. Calcular como se indic en NMP de coliformes. El resultado se expresa como NMP de Staphylococus aureus por g o ml de muestra.
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Prctico N 4 Microorganismos patgenos (I) (Alimento modelo: comidas y platos preparados) En la actualidad un gran porcentaje de la poblacin realiza la comida principal fuera del hogar y recurren a la comida preparada como una alternativa cmoda. Esto viene dado fundamentalmente por el ritmo de vida actual, el aumento del poder adquisitivo y la disminucin del d tamao de la unidad familiar entre otros, ya que han propiciado el avance de los nuevos hbitos de consumo. La elaboracin, distribucin y servicio de comidas preparadas, son realizados por los establecimientos de hostelera, catering, cocinas centrales centrales, , cocinas y comedores de colectividades, et etc.; as como las actividades de elaboracin, distribucin y comercio de comidas o platos precocinados y cocinados. Los servicios de alimentacin colectiva tienen una especial importancia desde el punto de vista de la salud pblica, ya que estos servicios pueden ser utilizados por grupos de poblacin vulnerable, como por ejemplos escolares. Se entiende por comida preparada toda elaboracin culinaria, resultante de la preparacin en crudo o del cocinado o precocinado, o, de uno o varios productos alimenticios, de origen animal o vegetal, con o sin adicin de otras sustancias autorizadas y, en su caso, condimentada (platos de men, raciones, sndwichs, bocadillos, etc.). Los platos preparados en ocasiones pueden ser veh vehculos para microorganismos patgenos o sus toxinas, con el consiguiente riesgo para la salud del consumidor, pudiendo causar brotes de origen alimentario, lo que puede representar un grave problema de salud pblica. Es imprescindible un control eficaz de la higiene, a fin de evitar las consecuencias perjudiciales que derivan de las enfermedades y los daos provocados por los alimentos y por el deterioro de los mismos para la salud y para la economa. El anlisis microbiolgico de un alimento permite conoce conocer r sus fuentes de contaminacin, valorar las normas de higiene utilizadas en la elaboracin y manipulacin de alimentos, detectar la posible presencia de microbiota patgena que suponga un riesgo para la salud del consumidor (siendo ste uno de los objetivos s ms importantes en microbiologa alimentaria) y establecer en qu momento se producen fenmenos de alteracin en los distintos alimentos, con el fin de delimitar su perodo de conservacin. El RSA considera en el grupo 15 de alimentos a las comidas y pl platos atos preparados y los subdivide en: a) comidas y platos cocidos, que se sirven en caliente, listos para el consumo; b) comidas y platos mixtos con ingrediente(s) crudo(s) y/o cocido(s) y c) comidas y platos pre pre-elaborados que necesariamente requieren cocc coccin. in. Los parmetros microbiolgicos y los lmites permitidos para cada 24
uno de estos subgrupos son diferentes de acuerdo al riesgo que implica la presencia de los microorganismos y la preparacin de los platos preparados. En esta actividad prctica se analizarn los parmetros deteccin de Salmonella spp., Clostridium perfringens y Bacillus cereus. El Genero Salmonella es miembro de la Familia Enterobacteriaceae y corresponde a bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos y flagelados. Las especies de este gnero son typhi, enteritidis, cholerae-suis. Este agente bacteriano es responsable de varias patologas como son gastroenteritis, fiebre enterica (tifoidea) o septicemias. Los cuadros de gastroenteritis por Salmonella son conocidos como salmonelosis y generalmente requiere un periodo de incubacin de 8-48 horas y los sntomas incluyen nauseas, vmitos y diarrea. El habitad natural de las especies responsables de gastroenteritis es el intestino de animales (pollos, cerdos, ganado vacuno). Las sero-variedades de Salmonella no son generalmente husped especfico, pero algunos tipos pueden ser detectados en ciertos animales, por ejemplo Salmonella typhimurium en roedores. Salmonella es excretada en alto nmero en las heces, permanece viable en el material fecal por largos periodos y puede ser detectada en el suelo y agua como resultado de contaminacin fecal. Los alimentos para animales pueden ser otra importante fuente de este organismo. Salmonella ha sido detectada en un amplio rango de alimentos: carne (cerdo, vacuno, ovino) y pollos siendo estos una fuente importante de estos organismos, la contaminacin de las carcasas se produce por el contenido intestinal y por contaminacin cruzada. Salmonella typhi causa fiebre tifoidea, fiebre enterica muy severa, en la cual el agente entra al torrente sanguneo va el intestino y sistema linftico y es distribuida a travs del cuerpo, y un elevado nmero de organismos son excretados en las heces y orina. La dosis infectiva es baja y la mortalidad relativamente alta. La fiebre tifoidea es generalmente transmitida de persona a persona y el periodo de incubacin es de 10 a 14 das. Los alimentos involucrados en brotes de fiebre tifoidea y paratifoidea incluyen leche, huevos no pasteurizados, helados y agua no potable. Clostridium perfringens ocasiona un cuadro de gastroenteritis, caracterizado por nauseas, dolor abdominal, diarrea y en algunas ocasiones vmitos. Estos sntomas aparecen a las 8 a 24 horas de consumido un alimento con elevado nmero de clulas vegetativas (106 108 UFC). Las clulas vegetativas sobreviven a la acidez gstrica y pasan al intestino delgado, donde ellas crecen, esporulan y liberan enterotoxinas (son sintetizadas durante la esporulacin). Algunos brotes ocasionados por Clostridium perfringens han estado asociados al consumo de carne de vacuno y pollos. Bacillus cereus causa dos tipos de cuadros clnicos originados por dos metabolitos distintos. El tipo diarreico es ocasionado por una protena de alto peso molecular y se caracteriza por diarrea acuosa, calambres abdominales, nauseas y raramente vmitos. Estos sntomas se presentan entre 6-15 horas de consumido el alimento. El cuadro emtico es causado por un pptido termoestable de bajo peso molecular y se caracteriza por nauseas, vmitos. La sintomatologa se manifiesta dentro de 0.5 a 6 horas del consumo de alimentos contaminados. Recuento superiores a 106 UFC/g en los alimentos son indicativos de activo crecimiento y proliferacin de este organismo e implican un riesgo potencial para la salud de la poblacin. Alimentos como carnes, vegetales y pescados han sido 25
asociados con cuadros del tipo diarreico. En cambio cepas productoras de cuadros emticos han sido asociadas con alimentos que tienen alto contenido de almidn como patatas, pastas y tambin productos lcteos (quesos) han sido implicados en brotes originados por este tipo de microorganismo.
Objetivos: Adquirir destreza en la tcnica de deteccin de Salmonella sp. en huevos. Conocer las tcnicas para la cuantificacin de Clostridium perfringens en alimentos. Adquirir destreza en la tcnica de recuento de Bacillus cereus. Conocer los diferentes alimentos asociados con Salmonella, Clostridium perfringens y Bacillus cereus su caractersticas intrnsecas y los factores externos que condicionan su crecimiento en los alimentos.
Procedimientos: MUESTRA: Plato preparado en base a carne y arroz
I. Deteccin de Salmonella: a.- Preparacin de la muestra: Pesar 25 gr y agregar 225 ml de caldo tripticasa de soya suplementado con sulfato ferroso (35 mg de sulfato ferroso / litro). Mezclar bien y dejar a temperatura ambiente por 60 minutos, medir el pH y ajustar a pH 6.8. Incubar por 24 a 35 C.
b.- Enriquecimiento selectivo: Tomar 1 mL del cultivo de preenriquecimiento y depositarlo en 10 mL de Caldo Selenito Cistina (CSC) adicionando de Novobiocina al 1% e incubar por 24 horas a 35C. Tomar 0.1 mL del cultivo de preenriquecimiento y depositarlo en 10 mL de Caldo Rappaport Vassiliadis (CRV) e incubar a 42 C por 24 horas e incubar las placas a 35 C por 24 a 48 horas. Lectura : Observar la presencia de colonias sospechosas: Agar SS : Colonias transparentes u opacas, por lo general lisas con o sin centro oscuro. Agar XLD : Colonias transparentes con o sin centro oscuro. Los serotipos S. paratyphi A y S. choleraesuis, pueden dar colonias transparentes sin centro negro.
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c.- Pruebas de Confirmacin : Seleccionar 2 o ms colonias sospechosas de cada medio selectivo e inocular cada una de las colonias en los medios TSI, LIA y MIO.. Incubar los medios a 35 C por 24 horas. (Ver tablas 1-3)
Lectura: Si las pruebas bioqumicas son compatibles con Salmonella se debe realizar serologa para su confirmacin.
II.- Recuento de Clostridium perfringens * Sembrar 1 mL en triplicado en placas Petri de las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 * Agregar 15 mL de Agar .Shahidi Fergunson Perfringens (SFP) o Agar Triptosa Sulfito Cicloserina (TSC) o Agar selectivo para C. perfringens (SPS), que se encuentre fundido y temperado a 45 C. Mezclar el inculo con el agar * Una vez solidificado agregar una segunda capa de 4 a 5 ml del medio, cubriendo toda la superficie para favorecer la anaerobiosis. Dejar solidificar. Colocar las placas sin invertir dentro de jarras de anaerobiosis e incubar a 35 C por 24 horas Lectura: Seleccionar las placas que contienen entre 20 y 200 colonias. Si slo dispone de placas con menos de 20 colonias, utilizar dichas placas. Contar las colonias negras. En caso de utilizar medio que contenga yema de huevo contar las colonias negras con y sin precipitado (zonas opacas). Pruebas de confirmacin: a.- Presuntivas: Sembrar cada colonia sospechosa seleccionada en caldo tioglicolato fluido fresco, e incubar por 18-24 horas a 35 C. Posteriormente verifique que el cultivo este puro mediante tincin de Gram. Test presuntivo leche/hierro: Inocular el medio leche/hierro con 1 ml del cultivo en tioglicolato e incubar a 46 C en bajo con agua. Observe despus de 2 horas la fermentacin y coagulacin de la leche. Si estas caractersticas no se observan a las 5 horas se descarta la presencia de Clostridium perfringens.
b.- Confirmativas: Sembrar en los siguientes medios: Agar Nitrato-movilidad y medio lactosagelatina (Ver tabla 4).
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Expresin de los resultados: (ufc/ g o mL)
Recuento de C. perfringens =
N colonias confirmadas Recuento X Presuntivo N de colonias sometidas a confirmacin
III.- Recuento de Bacillus cereus : Sembrar en duplicado 0,1 mL de cada dilucin ( 10 , 10 y 10 ), sobre la superficie de agar ManitolYema de huevo y polimixina (MYP) o agar Bacillus cereus (BC). Diseminar el inculo por toda la superficie, con la ayuda de un rastrillo estril, hasta que sea absorbida por el medio. Incubar a 30 C por 24 a 48 horas Lectura: Seleccionar las placas que contienen entre 20 y 200 colonias. Si slo se dispone de placas con menos de 20 colonias, utilizar dichas placas Colonias tpicas: Agar BC: Colonias de forma irregular que presentan un halo de color blanco ligeramente azul, con ribete azul. Registrar recuento presuntivo:
N colonias X 1/ dilucin
Pruebas de confirmacin: Seleccionar 3 o ms colonias y sembrar cada una en los siguientes medios de cultivo: caldo glucosa rojo fenol, caldo nitrato, medio VP modificado, agar tirosina, caldo lisozima, agar MYP. (ver tabla 5)
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TABLAS
Tabla 1 TSI Fermentacin glucosa Fermentacin de la lactosa y/o sacarosa Produccin de H2 S Positivo Fondo Amarillo (A) Tendido Amarillo (A) Ennegrecimiento del medio (intensidad variable) Ruptura o desplazamiento del agar Negativo Fondo Rojo (K) Tendido Rojo (K) Sin cambios
Produccin de gas
Sin cambios
Tabla 2 LIA Descarboxilacin de la lisina Deaminacin de la lisina Produccin de H2 S Positivo Fondo y tendido prpura (K/K) Tendido Rojo (R) Ennegrecimiento del medio (intensidad variable) Ruptura o desplazamiento del agar Negativo Fondo Amarillo (A) Tendido prpura (K)
Sin cambios
Produccin de gas
Sin cambios
Tabla 3 MIO Movilidad Produccin de indol Positivo Desarrollo difuso alejado de la lnea de inoculacin Formacin de un anillo rojo o rosado al agregar Reactivo de Kovacs la Coloracin azul, puede ser de distintas intensidades debido a la reduccin del indicador Negativo Solamente crecen en la lnea de siembra Anillo de color Amarillo
Descarboxilacin Ornitina
de
2/3 del tubo amarillo
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Tabla 4 Prueba Positivo Negativo Reduccin de Formacin de un color Cuando se aade nitritos a rojo polvo de Zn y dada nitritos color rojo. movilidad Desarrollo difuso alejado de la lnea de siembra Fermentacin Viraje del indicador de de lactosa rojo a amarillo (c. (+)) Hidrlisis de El medio permanece gelatina lquido despus de permanecer 1 hora en el refrigerador Tabla 5 Prueba Fermentacin glucosa Positivo Negativa Bacillus cereus Positivo Positivo Slo crecen en la lnea de siembra color rojo C. perfringens Positivo
Negativo
Positivo
Se encuentra solidificado despus de 1 hora en el refrigerador
Positivo
Reduccin de nitratos a nitritos*
Viraje del indicador no vira de rojo a amarillo y gas Cuando se Formacin de un color aade polvo de rojo Zn y dada color rojo.
Crecimiento en caldo con crecimiento 0.001% de lisozima Descomposicin de la Decoloracin tirosina medio Agar MYP - lecitinasa Precipitado - F. manitol Formacin de acetilmetil- Color rosado carbinol
positivo del positivo
Colonia rosadas
Positiva negativa Positiva
* : Agregar al medio 0,5 mL de cido sulfanlico y 0,2 mL de alfa naftol.
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Tabla: Diferenciacin entre especies de Bacillus
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Prctico N 5 Listeria monocytogenes y Campylobacter jejuni

(Alimento modelo: Carne de ave-pollo) ave
Listeria monocytogenes: Listeria monocytogenes es una bacteria Gram positiva que se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza; se encuentra en heces animales, de humanos, en el suelo, agua y vegetales. A pesar de ser una bacteria ubicua y de alta resistencia a condiciones ambientales adversas, es un patgeno poco frecuente en la poblacin en general, atacando de preferencia a personas en edades extremas de la vida, mujeres embarazadas y pacientes inmuno-deprimidos deprimidos (poblacin de riesgo). La infeccin producida por esta bacteria se conoce como el nombre de listerios listeriosis is y es considerada una zoonosis, aunque la mayora de las infecciones se adquieren de madre a hijo intrautero o durante el parto y por la ingestin de alimentos contaminados. Las manifestaciones clnicas de la listeriosis pueden variar y diferir sustancialmente ialmente entre los distintos grupos. En sujetos sanos, suele manifestarse como una gastroenteritis aguda febril, generalmente leve y autolimitada. En individuos inmunocomprometidos, en cambio, puede desencadenar cuadros de mayor gravedad y alta mortalidad como la meningitis, meningoencefalitis, septicemia. El riesgo de infeccin es mayor durante el embarazo y puede provocar la listeriosis neonatal, la cual puede ser de dos tipos; de comienzo precoz o tardo. En la primera, la madre puede presentar histori historia de enfermedad febril durante el embarazo, con parto prematuro y bajo peso al nacer. La infeccin en el neonato puede ser septicemia, apnea neonatal o dificultad respiratoria, hepato-esplenomegalia esplenomegalia y exantema. En la listeriosis tarda no aparecen complica complicaciones obsttrica alguna, el parto es de trmino y el peso del recin nacido es normal. La enfermedad aparece entre los 5 y 14 das de vida y se caracteriza por problemas alimentarios, irritabilidad y meningitis. Las diversas manifestaciones clnicas asoc asociadas iadas a la listeriosis pueden agruparse en dos categoras: listeriosis invasiva y listeriosis no invasiva. La listeriosis invasiva se refiere a los casos en que una infeccin inicial del tejido intestinal por L. monocytogenes deriva en la invasin de partes s del organismo que habitualmente son estriles, como el tero grvido, el sistema nervioso central o la sangre, o combinaciones de stos. La listeriosis invasiva se caracteriza por una tasa de letalidad alta, de 20 a 30% y las infecciones pueden producir secuelas, aunque la incidencia de stas pocas veces se determina. Los casos de listeriosis no invasiva (conocida como gastroenteritis febril por listerias) se han observado en algunos brotes en los que la mayora de los casos presentaron sntomas de gastroenteritis, gastro como
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diarrea, fiebre, cefalea y mialgia, tras un perodo de incubacin corto. Estos brotes se han producido generalmente tras la ingestin de dosis altas de L. monocytogenes por personas previamente sanas. No se conocen la incidencia ni los factores que ocasionan la aparicin de esta forma no invasiva de la enfermedad. El primer brote por Listeria monocytogenes relacionado al consumo de alimentos fue reportado en el ao 1983; en dicho brote el alimento implicado fue repollo contaminado con deposiciones de ovejas infectadas. A partir de ese momento esta bacteria se ha convertido en una ms de la enfermedades infecciosas transmitidas por los alimentos. La listeriosis transmitida por alimentos es una enfermedad relativamente poco comn, pero grave, con tasas de letalidad altas (20-30%), comparadas con las de otros microorganismos patgenos transmitidos por alimentos, como la Salmonella. Su gravedad y el hecho de que est muy frecuentemente asociada a alimentos de elaboracin industrial, especialmente cuando se producen epidemias, la sitan entre las enfermedades transmitidas por alimentos de mayor relevancia social y econmica. Listeria monocytogenes es un contaminante comn de alimentos frescos y procesados, de origen animal y vegetal (hortaliza), leche y lcteos no pasteurizados, carne de vaca, cerdo y aves, embutidos ahumados y fermentados y pescados. Adems, es resistente a varias condiciones ambientales desfavorables, como altas concentraciones de sal o acidez. Crece en condiciones de baja concentracin de oxgeno y a temperaturas de refrigeracin y sobrevive por largos perodos en el medio ambiente, en los alimentos, en las plantas de elaboracin de alimentos y en el refrigerador domstico. La presencia de Listeria monocytogenes en alimentos en Chile ha sido previamente reportada el ao 2001, detectndose en helados (3,6%), quesos blandos (0,8%), productos crnicos (3,6%) y mariscos (11,6%). Posteriormente, se ha estudiado la presencia de esta bacteria en ensaladas en venta en supermercados de Santiago; se analizaron 709 muestras y Listeria fue detectada en el 26% de las ensaladas congeladas y 10.5% ensaladas frescas de supermercados. No se aisl el patgeno desde ensaladas de preparacin industrial listas para el consumo (LPC). Frente a este nuevo escenario las autoridades de salud, han incorporado a partir del ao 2010 el parmetro Listeria monocytogenes para algunos alimentos LPC. Campylobacter jejuni: Campylobacter es un gnero de la familia Campylobacteriaceae. Las especies de este gnero son bacilos Gram negativos curvos, pequeos y finos, mviles y microaerfilos estrictos. Su habitat natural es el tracto gastrointestinal de una gran variedad de animales silvestres y domsticos, especialmente aves. La Campylobacteriosis es por tanto una enfermedad de tipo zoontica que se transmite al hombre a travs del consumo de alimentos o agua contaminada con deposiciones de animales infectados. Se puede presentar como una gastroenteritis leve y autolimitada, o como una diarrea aguada con deposiciones de tipo disentricas (presencia de mucosidad y sangre). Las personas
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infectadas pueden permanecer como portadores asintomticos y constituir tambin una fuente de infeccin. Las especies asociadas a enfermedad en el hombre son C. jejuni, C. coli, C. lari y C. fetus. De estas, las tres primeras son especies termfilas (se desarrollan bien a 42 C) y C. fetus es una especie mesfila ( se cultiva a 37C). Esto es importante de considerar cuando se requiere aislar estos organismos a partir de muestras de alimentos o muestras clnicas. C. fetus es una especie invasora por lo tanto puede producir enfermedades sistmicas como meningitis o neumona. Afortunadamente solo el 10% de los aislamiento de especies de Campylobacter en humanos corresponden a C. fetus. Una caracterstica del gnero es que no resisten condiciones ambientales adversas. Son sensibles al oxgeno, desecacin, temperatura ambiente, acidez y congelamiento. Por lo tanto los alimentos de origen animal que pueden ser vehculo de estos organismos son aquellos sometidos a coccin deficiente, mantenidos en refrigeracin y aquellos en envases cerrados (se reduce el oxigeno en su interior). Por ejemplo, C. jejuni sobrevive 2 a 4 semanas en ambiente hmedo, de bajo oxgeno y a 4 C, de 2 a 5 meses a 20 C, pero solo unos pocos das a temperatura ambiente. Por su sensibilidad a las condiciones ambientales externas al tracto intestinal animal, las clulas se daan fcilmente y por lo tanto para su aislamiento a partir de muestras de alimentos se requiere hacer etapas de preenriquecimiento. Se utilizan antibiticos selectivos y suplementos que bajen la presin de oxgeno en el medio de cultivo (ej: hemina, piruvato, FBP). Objetivo: Conocer las tcnicas para la deteccin de Campylobacter sp. y Listeria monocytogenes en alimentos Muestra : Carne de pollo Procedimientos: I. Campylobacter: El protocolo de aislamiento de Campylobacter depender del tipo de muestra. En algunos casos se requiere centrifugar inicialmente la muestra para concentrar el nmero de clulas presentes (ej: leche) o bien lavar la muestra con agua peptonada para recuperar los organismos (ej: trozo de pollo). En general las metodologas de preparacin de la muestra son complejas. a.- Preparacin de las muestras: * * * * Pesar 10 gramos de muestra y agregue 90 ml del medio de Hunt. Incubar por 4 horas a 37 C en atmsfera microaeroflica. Luego incubar por 44 horas a 42 C en atmsfera microaerofilia Aislamiento, identificacin y confirmacin: Tome una muestra con asa del
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caldo Hunt y siembre en dos placas de agar Skirrow * Coloque las placas en una jarra y la mezcla generadora de microaerofilia. * Incube a 42C por 24-48 horas. * Identificacin: Las colonias de Campylobacter son circulares a irregulares con bordes hmedos o ser ms extendidas con un crecimiento translucido gris o blanquecino en forma de pelcula. * De cada colonia sospechosa se hace una preparacin al fresco en suero fisiolgico para determinar motilidad. Adems, realizar la prueba de la oxidasa y tincin de Gram. Las colonias de bacilos Gram negativos curvos y mviles se traspasan a placas de agar Skirrow y se incuban a 42 C en microaerofilia por 24-48 horas. De esta forma obtenemos cultivos puro para realizar las siguientes pruebas bioqumicas. Prueba de la oxidasa: Para esta prueba utilice una varilla para prueba de la oxidasa. Con ella tome una muestra del cultivo puro. Espere unos segundos. La reaccin positiva se visualiza por ennegrecimiento del cultivo en la varilla. Todas las especies de Campylobacter son oxidasa (+), por lo tanto continu con aquellas colonias que den esta reaccin positiva. Prueba de Catalasa: Realice la prueba de la manera tradicional con agua oxigenada Utilizacin de glucosa: Inocular en profundidad 2 tubos de medio glucosa para Campylobacter. Al inocular repita el procedimiento 3 veces para cada tubo. Un tubo contendr glucosa y el otro solo la base. Incubar 4 das a 35-37C en microaerofilia. Campylobacter no utiliza glucosa ni otros azcares y no produce cambios visibles en ninguno de los dos tubos. Hidrlisis de hipurato: Emulsione una muestra del cultivo (asa de 2mm) en 0,4 ml de solucin de hipurato de sodio en un tubo de 13x100 mm. Incubar 2 horas en bao termorregulado a 37 C Agregue 0,2 ml de reactivo de ninhidrina e incube 10 minutos en iguales condiciones. Positivo: Color violeta intenso. Diferencia C. jejuni (+) del resto de especies. Reaccin en TSI produccin de H2S: Inocule un tubo de agar TSI (tendido y profundidad). Incubar en microaerofilia por 5 das a 35-37C. Todas las especies de Campylobacter producen reaccin K/K. Algunas de ellas producen H2S.
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II. Listeria monocytogenes a.- Preparacin de la muestra: Pese 25 g de la muestra en una bolsa de stomacher estril y agregue 225 ml de caldo de enriquecimiento. Agregue los agentes selectivos: Acriflavina-cido nalidxicoCycloheximida. Incube por 44 horas a 30 C b.-Aislamiento: A las 24 y 48 horas de incubacin traspase una muestra del caldo de enriquecimiento a una placa de agar Palcam y otra de agar OXA. Incube las placas por 24-48 horas a 30C. Puede utilizar atmsfera microaerofilica. Seleccione colonias sospechosas de ambas placas y transfiera al menos 5 de cada medio a agar TSAYE para obtener cultivo puro. Incube por 24-48 horas a 30 C Identificacin: Agar TSAYE: Examinar con sistema de iluminacin de Henry. Las colonias se observan de color azul-grisceo o azul. De estas colonias realice una preparacin al fresco en suero fisiolgico. Debe contener bastante inculo. Con objetivo de inmersin examine para determinar motilidad Listeria spp. Presenta motilidad lenta de rotacin o tumbos. Prueba Bioqumica: Tincin de Gram: Listeria spp. Son bacilos cortos (cocobacilos), Gram (+). Pueden verse en empalizada cuando hay mucha cantidad de clulas en la preparacin y verse semejantes a Diphteroides Para cada colonia sospechosa segn las pruebas anteriores inocule un tubo de agar TSBYE e incube por 24 h a 35 C. A partir del cultivo obtenido en el tubo de agar TSBYE siembre en agar sangre (5% sangre de cordero o caballo) haciendo cortes de unos 2 cm en forma perpendicular en el agar, utilizando un asa. Puede sembrar varias colonias en una misma placa, pero debidamente separadas. Incube por 48 horas a 35 C. Registre presencia de hemlisis. Test de Camp: Tarea Fermentacin de carbohidratos: A partir del cultivo del agar TSBYE siembre una bacteria de azcares al o,5% en caldo prpura de bromocresol. Incubar 7 das a 35 C en esculina-dextrosa-maltosa: Todas las especies de Listeria producen cido pero no gas. Manitol-ramnosa-xilosa: diferencia entre especies. Pruebas confirmatorias de gnero o especie si es necesario. Adicionalmente a las pruebas bioqumicas, existen algunos mtodos inmunolgicos y moleculares (ej: ELISA, sondas de DNA) que son recomendados para la confirmacin del diagnstico de Listeria o bien para acortar el tiempo de anlisis. Tales mtodos pueden ser aplicados despus de la etapa de enriquecimiento.
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Prctico N 6 Identificacin de Campylobacter mediante PCR
La reaccin en cadena de la (DNA) polimerasa (PCR) provee un mtodo para amplificar especficamente fragmentos de DNA, y tericamente podra realizar esta amplificacin a partir de unas pocas copias de la secuencia blanco. Este procedimiento depende de la disponibilidad de dos cortos fragmentos de DNA, los iniciadores (primers) de la reaccin, los que se unen a uno de los extremos (opuestos) del DNA de doble cadena, lo que requiere del conocimiento de las secuencias que flanquean la regin a amplificar.
La enzima DNA polimerasa cataliza la extensin de los partidores en 30 a 40 ciclos de reacciones de sntesis consecutivas, para producir un nmero muy grande de copias del fragmento que se busca amplificar. Es as que 25 ciclos producen aproximadamente 106 copias del fragmento original. Cada ciclo de amplificacin consta de tres etapas: en la primera, el DNA que contiene las secuencias a amplificar se denaturaliza mediante calor por incubacin a 94 C por 1 minuto; en la segunda se cambia la temperatura a 50-60 5 C para alinear los partidores con la secuencia blanco, mantenindose por 1 minuto; en la tercera etapa se produce la sntesis de DNA por medio de la Taq polimerasa, extendiendo la cadena a partir del extremo de los partidores.
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Este ciclo se repite 30 o ms veces en un dispositivo de regulacin automtica de la temperatura, y despus de cada uno de estos el nmero de molculas de DNA blanco se duplica. Al final de ciclo 32 hay alrededor de 1000 millones de copias (2 n-1 en donde n es el nmero de ciclos). Los equipos que realizan este procedimiento se denominan termocicladores, pues varan la temperatura de la reaccin en forma programada y cclica, y estn comercialmente disponibles en una amplia variedad.
Los fragmentos de ADN amplificados son identificados mediante electroforesis en geles de agarosa y posteriormente los geles son teidos con bromuro de etidio y los amplificados son visualizados por exposicin a luz ultravioleta en un transiluminador. En cada corrida se incluye un estndar de pares de bases conocidos. El mtodo tiene algunos inconvenientes, tales como la inhibicin de la reaccin por parte de componentes de alimentos, as como no distinguir entre clulas vivas y muertas, a menos que se utilicen protocolos especiales. Sin embargo, esta metodologa tiene un enorme potencial para detectar la presencia de microorganismos en un nmero muy bajo, en el lapso de pocas horas.
Campylobacter jejuni: bacilos Gram -, espiralmente curvados, mviles, bacterias termoflicas, crecen mejor a 42 C. Se encuentra en animales silvestres y domsticos, particularmente frecuente en pollos. La infeccin en humanos produce un cuadro diarreico de intensidad variable, y en algunos casos puede estar asociada a otras alteraciones.
El objetivo de esta actividad prctica es confirmar que aislados de C. jejuni por medio de la tcnica de PCR.
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Procedimiento
Se le proporcionar un tubo conteniendo 100 l de una muestra con C. jejuni. Para liberar el material gentico de las bacterias en la suspensin, se debe calentar el tubo en agua hirviendo por 15 minutos. Preparacin de las mezclas de reaccin Mezcla 1. Adicionar a un tubo de PCR los siguientes reactivos: Agua estril Partidores DNA templado (Muestra hervida) 15 l 5 l cada uno 5 l
Preparacin de la muestra
Mezcla 2. Adicionar a un tubo de PCR los siguientes reactivos: Buffer PCR 10x Deoxnucletidos 10x MgCl2 25 mM Taq DNA pol 5 l 5 l 8 l 2 l
Poner en termociclador el tubo con mezcla 1 e iniciar el programa correspondiente a Campylobacter. Al llegar al paso 2 (pausa) adicionar el contenido del tubo 2 al tubo 1 en el termociclador. Continuar con el programa Sacar los tubos al trmino del programa Visualizar el fragmento de DNA amplificado mediante electroforesis en gel de agarosa. Preparacin del gel de agarosa Pesar 2g de agarosa y agregarla a 100 ml de buffer TAE en un matraz Calentar hasta fundir la agarosa, y retirar inmediatamente utilizando un protector de goma Esperar a que se enfre (5 min.), pero sin llegar a la solidificacin. Verter en molde para que se forme el gel, y esperar que se solidifique Poner el gel en cmara de electroforsis y agregar buffer de corrida (TAE) Cargar las muestras con buffer de carga: Amplificado 5 l Buffer de carga 3 l
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Encender el equipo, ponerlo a 90 Volts y esperar a que termine la electroforesis Teir el gel con bromuro de etidio. Usar guantes, este compuesto es potencialmente cancergeno Visualizar la amplificacin en un transiluminador bajo luz UV Las muestras positivas deben producir un fragmento de 360 pares de bases
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Prctico N 7 Tipificacin de cepas Campylobacter jejuni aisladas de diferentes fuentes
Campylobacter jejuni ha emergido como una de las principales causas de ETAs ETAs, es la primera causa de diarrea en pases desarrollados y es una de las ms frecuentes causas d diarrea en nios, en pases en vas de desarrollo. La mayora de los casos de campylobacteriosis han sido asociados al consumo o manipulacin de productos av avcolas crudos, especialmente carne de pollos. Campylobacter, especialmente C. jejuni es ubicuo en el ambiente de granjas avcolas y se han sugerido varias vas de contaminacin de los pollos. Los factores de riesgo para la colonizacin de las poblaciones de estas aves incluyen malas prcticas de higiene, contaminacin de la fuente de agua, presencia de otros animales en la granja y transmisin vertical. Aunque se han realizado considerables esfuerzos por mejorar la higiene de las plantas de faenamiento, es muy difcil evitar la contaminacin de las carcasas con C. jejuni proveniente del contenido intestinal de las aves. Adems, aqu puede ocurrir la contaminacin cruzada de las carcasas entre diferentes poblaciones durante el procesamiento. Por otra parte, la a descarga de riles no procesados en el ambiente por parte de plantas faenadotas no reguladas, puede introducir la contaminacin de agua naturales con C. jejuni. Por razones de salud pblica, es importante estudiar y determinar los reservorios, las fuente fuentes y etapas en que se produce la contaminacin de las aves de consumo humano y los productos avcolas. Una de las metodologas frecuentemente utilizadas para este objetivo es la tipificacin de cepas del agente infeccioso aisladas de distintos ambientes y etapas e en el proceso de produccin y comercializacin. En este prctico utilizaremos una tcnica molecular ampliamente usada en tipificacin de cepas, RAPDRAPD PCR, por su facilidad, rapidez y nivel de discriminacin. Esta E tcnica consiste en una PCR con una variante. ariante. Los partidores que se utilizan son ms cortos de lo normal (10 nucletidos) y son de secuencia arbitraria. Adems, la fase de hibridacin de los cebadores se verifica a una temperatura de 34 a 36 C, en lugar de los 55-60 60 C habituales. El efecto de estas variaciones es que debido a estas condiciones de hibridacin tan poco restrictivas, los cebadores se hibridan en puntos al azar de todo el genoma. Como resultado se producen un gran nmero de bandas muy polimrficas y que permiten distinguir varie variedades. Esta tcnica utiliza un partidor (oligonucletido) relativamente inespecfico que produce usualmente varios fragmentos de ADN en la amplificacin cuyo nmero y tamao que dependern de la cepa, generando as un patrn de bandas en una electroforesis, s, que ser diferente para las distintas cepas de una especie. En E la
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Figura 1 se aprecia el aspecto de un experimento de RAPD-PCR, mostrndose las bandas de ADN amplificado mediante templado de diferentes cepas de Campylobacter jejuni. La complejidad tcnica de la RAPD-PCR es relativamente baja, dado que la visualizacin de las bandas amplificadas se realiza mediante separacin electrofortica en gel de agarosa y tincin con bromuro de etidio. Esta sencillez explica el gran xito que ha tenido la RAPD-PCR en la identificacin varietal en todo tipo de especies.
Objetivos: - Conocer la tcnica de tipificacin molecular RAPD-PCR - Determinar la variabilidad entre diferentes aislados de C.jejuni Materiales Cepas de C. jejuni aisladas de diferentes muestras Partidor para RAPD-PCR (OPA) Agarosa al 1% en buffer TAE Procedimiento Preparacin del templado Poner 100 l de agua destilada en un tubo eppendorf y hacer en este una suspensin diluida de la cepa a ensayar. Poner los tubos con las suspensiones en un vaso con agua hirviendo por 10 minutos
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Mezcla de reaccin En un tubo eppendorf de PCR mezclar los reactivos segn la siguiente tabla: Buffer PCR 5 l dNTPs 5 l MgCl2 (50 mM) 2 l Primer (OPA) 20 l Templado 5 l Taq DNA pol 1 l Agua 12 l Amplificacin Agregar a la mezcla unas gotas de aceite mineral y colocar los tubos en el termociclador y correr el programa RAPDCJ. El programa toma alrededor de 4 horas y media en terminar, despus de lo cual se deben sacar los tubos para utilizar el amplificado en la electroforesis. Electroforesis en gel de agarosa Preparar un gel de agarosa al 1 % disolviendo la agarosa en buffer de corrida (TAE), y luego calentar la solucin hasta ebullicin para permitir la completa disolucin de la agarosa. Esperar que se enfre a unos 45 C y luego verter en molde para formar el gel. Una vez solidificado el gel, cargar 12 l de amplificado mezclado con 3 l de buffer de carga. Correr la electroforesis a 90 V hasta que el frente llegue a unos 5-10mm del borde. Sacar el gel de la cmara y dejar tiendo con bromuro de etidio por 10 minutos. Manipular con guantes, evitando tocar la solucin de bromuro de etidio! Colocar el gel en transiluminador UV y observar el patrn de bandas. Fotografiar el gel para su anlisis.
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Prctico N 8 Otros parmetros microbiolgicos

Mohos/levaduras, Esporas Sulfito Reductores, Lactobacillus obacillus
Mohos y levaduras Las levaduras y mohos (hongos hongos filamentos) pueden ser establecidos como parte de la microflora normal de los alimentos ali o debido a la inadecuada sanitizacin de los equipos o por mala calidad de aire en el rea de produccin. Pueden producir metabolitos txicos (micotoxinas), poseen resi istencia a la refrigeracin y pueden ser responsables de la aparicin olores y sabores desagradables en los alimentos. Todos los mohos y levaduras crecen bien a valores de pH de 5,0 y an inferiores, por lo que generalmente general sustituyen a las bacterias en los alim mentos cidos. Adems, muchos mohos y levaduras toleran bajas Aw (aproximadamente ente inferiores a 0,95) mucho mejor que la mayora de las bacterias; incluso a valores por debajo de 0,75, algunos mohos y levaduras son los nicos organismos os que pueden crecer. Esporas Sulfito Reductoras El principal objetivo de e la utilizacin de esporas sulfito reductoras redu es como indicadores de prcticas no sanitarias y revelar defectos de tratamiento iento que llevan consigo un peligro potencial para la Salud humana. Los anaerobios s sulfito- reductores constituyen un grupo asociado a los Clostridium spp y como tal se cara caracterizan por ser organismos Gram positivos, positi anaerbicos, formadores de esporas, que estn normalmente en las heces, aunque en nmero mucho ms reducido do que E. coli. Su representante ms caracterstico caracter es Clostridium perfringens, estos son deteriorantes, ya que producen malos olores y, con mucha frecuencia, ennegrecimiento del producto cuando ste tiene hierro, formando un precipitado oscuro de sulfuro de hierro. Estos microorganismos tienen la capacidad de reducir los sulfitos a sulfuros a partir de aminocidos y compuestos azufrados y para su deteccin se utiliza la evidente coloracin negra dada por la formacin acin del precipitado. El origen de los anaerobios sulfitoreductores no es exclusivam mente fecal, ya que pueden proceder de otras fuentes ambientales como suelo, sedimentos marinos, m vegetacin en descomposicin, heridas infectadas de hombre y animales, aguas superficiales, como tambin en los alimentos, especialmente cuando las condiciones de higiene en la elaboracin son deficientes. Debido a las caractersticas que poseen los anaerobios sulfito-reductores es que se han propuesto como indicadores de contaminacin conta de alto riesgo del agua y alim mentos como la miel. La miel es considerada un alimento microbiolgicamente seguro debido a su elevado contenido de azcares (70 - 80%), pH entre 3 y 4 y presencia de sustancias inhibidoras. No obstante, se ha reportado presencia Bacillus y Clostridium los cuales se presentan como esporas, aunque en mieles jvenes se pueden encontrar formas vegetativas. Est
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comprobado que la miel constituye un reservorio natural de esporas de Clostridium botulinum, aunque si bien dichas esporas son encontradas en muy pocas muestras analizadas, este hecho reviste particular importancia por su asociacin con el botulismo infantil. Su empleo en el anlisis de agua se basa en la ventaja que sus esporas sobreviven enresistentes a la desinfeccin, al punto que pueden ser detectados en algunas muestras de agua despus de haber recibido pre-desinfeccin, floculacin, sedimentacin, filtracin y la desinfeccin Terminal. Por las razones expuestas, el aislamiento de anaerobios sulfito-reductores se propone para indicar el riesgo de sobrevivencia de agentes patgenos en ciertos ecosistemas expuestos a contaminacin fecal remota, como tambin que, por sus caractersticas de tamao y resistencia a la desinfeccin, logren escapar a los tratamientos habitualmente aplicados al agua.
Lactobacillus El RSA considera el recuento de Lactobacillus solamente para el producto caf. La presencia de este grupo de bacterias cido lctica puede estar asociada a la participacin que estas tienen en la etapa de fermentacin del producto. Despus de que se han cosechado las bayas del caf, experimentan un proceso donde la carne de las bayas del caf se quita. Las bayas del caf se colocan en las mquinas especiales que separan la carne de la semilla. Esta semilla del caf comnmente se llama los granos de caf. Los granos de caf experimentarn un proceso de fermentacin por un perodo del tiempo,este proceso se hace para quitar el muclago fangoso que cubre los granos de caf. Despus de que los granos de caf hayan experimentado la fermentacin, se limpian con un chorro de agua con agua limpia. Este proceso es quitar el residuo que huele asqueroso debido al proceso de fermentacin y el agua es una causa principal de contaminacin. Los granos de caf entonces son secados debajo del sol o por las mquinas, hasta que el nivel de la humedad es el cerca de 10% antes de que puedan ser embalados para el almacenaje. En esta actividad prctica se realizar el recuento de Lactobacillus a un producto probitico (Uno al da o Chamito). Un alimento probitico es aquel que contiene microorganismos vivos presentes en un alimento que permanecen activos en el intestino y ejercen importantes efectos fisiolgicos. Por lo tanto, es necesario ingerir en cantidades suficientes para tener un efecto beneficioso, como contribuir al equilibrio de la flora bacteriana intestinal del husped y potenciar el sistema inmunolgico. Son capaces de atravesar el tubo digestivo, recuperarse vivos en las heces y adherirse a la mucosa intestinal y no son patgenos. El objetivo ser corroborar la cantidad de bacterias presentes, ya que esta debe ser del orden de 108 UFC/ml.
Objetivos: - Conocer la tcnica para cuantificar Lactobacillus y establecer la cantidad presente en un alimento prebitico.
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- Adquir destreza en la determinacin del nmero de esporas de anaerobios sulfito reductores en miel. - Conocer mtodos estandarizados para el recuento de mohos y levaduras.
Procedimientos: Recuento de mohos y levaduras : - Sembrar 1 mL en triplicado en placas Petri de las diluciones 10-1 , 10-2 y 10-4 - Agregar 15 mL de Agar papa dextrosa o Agar Sabouraud u otro, que se encuentre fundido y temperado a 45 C. - Mezclar el inculo con el agar segn se indica para RAM (gua n1) - Incubar sin invertir las placas a 22C por 3 a 5 das. Nota : No mover las placas antes de los tres das Lectura : - Seleccionar las placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si slo se dispone de placas con menos de 20 colonias, utilizar dichas placas. - Contar las colonias de mohos y registrar el n. - Contar las colonias de levaduras. Se presentan en forma de colonias cremosas, blancas o coloreadas. Confirmar mediante una tincin simple. Expresin de resultados: Se calcula multiplicando el promedio de los recuentos de las placas de la misma dilucin por el factor de dilucin correspondiente.
Recuento de Lactobacillus: - Sembrar 1 mL en duplicado en placas Petri de las diluciones 10-6, 10-8 y 10-9. - Agregar 15 mL de Agar Man Rogosa Sharpe (MRS), que se encuentre fundido y temperado a 45 C. - Mezclar el inculo con el agar segn se indica para RAM (gua n1) - Una vez solidificado agregar una segunda capa de 4 a 5 ml del medio. Dejar solidificar. - Incubar las placas invertidas a 35C por 48 a 96 horas. Lectura : Contar las colonias tpicas con forma lenticular. Hacer tincin de Gram (Bacilos Gram positivos) y prueba de la catalasa (catalasa negativa).
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Expresin de resultados: (ufc/ g o mL) N colonias x 1/ dilucin
Esporas de anaerobios sulfito reductores: - Preparar la dilucin 10-1 , como se indica en preparacin y dilucin de las muestra Someter a la dilucin 10-1 , a tratamiento trmico (100C x 10 minutos). Luego diluir hasta 10-3 y sembrar 0,1 mL por duplicado en agar SFP. Adicionar 5 mL del mismo agar de manera que cubra toda la superficie del medio. Incubar en anaerobiosis como se indico para C. perfringens (gua 4) - Contar las colonias negras con y sin halo. Expresin
de resultados: (ufc/ g o mL) N colonias x 1/ dilucin
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Prctico N 9 Anlisis microbiolgico de agua

gica del agua para beber ha sido implicada en la La calidad microbiolgica diseminacin de importan ntes enfermedades infecciosas como clera, fiebre tifoidea, hepatitis. La presencia de microorganismos patgenos sigue teniendo un rol de alta importancia, se estima que ellos son responsables de aproximadamente ente el 40% de los problemas de salud relacionados onados al consumo de agua. A diferencia de la contaminacin qumica, el impacto de las enfermedades producidas por agentes mi icrobianos es agudo y puede afectar a un gran nmero de personas (epidemia del clera). Desde el punto de vista epidemiolgico epide el agua es un medio edio de difusin de agentes patgenos los cuales constituyen un peligro permanente para la salud pblica. blica. Los tipos de microorganismos presentes en el agua pueden ser: bacterias, acterias, virus, parsitos (protozoos y helmintos), los cuales pueden o no ser patgenos para el hombre. La procedencia de los microorganis croorganismos puede ser de la fuente de origen (flora autctona o natural) o bien alctona (no propia), en donde el origen de la contaminacin conta proviene principalmente de deposiciones humanas y/o materia fecal de origen en ani animal o desechos industriales. El grado y frecuencia de exposicin a agentes patgenos se ve aumentado entado por la expansin de las reas urbanas y las actividades ligadas a la agricultura y la industria, donde los recursos hdricos se van cargando con desechos domsticos e industriales. Por tanto, dichos desechos ejercen sobre las barreras infra- estructurales de saneamiento (abastecimiento y distribucin de agua, recoleccin y tratamiento de aguas residuales, etc.) resultando en el aumento de los riesgos epidemiolgicos. Hay que tener en cuenta, asimismo que los eventos tos de la naturaleza (sequas, inundaciones) tambin ta influyen en la calidad y cantidad de agua disponible. Se estima que hoy, a pesar de los grandes avances en las tecnologas de tratamiento de aguas naturales destinadas al consumo humano, hu siguen presentndose brotes o intoxicaciones por ingestin de agua contam minada. El origen de la contaminacin puede ser biolgico o qumico. Los brotes asociados al consumo consu de agua, bsicamente han sido atribuidos atrib a deficiencias en los sistemas de tratamiento, trata es decir, tratamientos inadecuados o interrumpidos, problemas en las redes de distribucin di o en la recepcin de grandes masas de agua con alto grado de contam minacin, donde los tratamientos habituales se hacen insuficientes para asegurar su calidad. Si consideramos que los mi icroorganismos para su desarrollo y sobrevida requieren que se conjuguen factores ambientales bientales y requerimientos nutricionales, las aguas naturales no son un medio ptimo o adecuado para el desarrollo de agentes microbianos, ello
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principalmente por el bajo contenido de nutrientes presentes en el agua. Este ambiente, favorece el desarrollo de microorganismos auttrofos, los cuales llegan a las fuentes de agua procedentes principalmente del suelo. En cambio, cuando las concentraciones de nutrientes aumentan, ya sea por efecto de la presencia de desechos domsticos y/o industriales, ello permite el desarrollo y sobrevivencia de la flora alctona, la cual corresponde bsicamente a organismos heterotrficos. Adems del contenido de nutrientes, el crecimiento microbiano esta condicionado por la temperatura y la aireacin de la fuente de agua. La temperatura y la aireacin de fuente de agua. La temperatura del agua propicia el desarrollo principalmente de especies psicrfilas y psicotrficas, y mesfilas. Estas ltimas incluyen a la mayora de los enteropatgenos del hombre, las que a pesar de tener una temperatura ptima de crecimiento elevada, son capaces de sobrevivir en el agua, en un estado de latencia (viables pero no cultivables). En este estado los microorganismos no se reproducen pero si metabolizan lentamente los nutrientes disponibles. Muchos microorganismos son capaces de permanecer en el agua por largos perodos (semanas y meses) y en ciertas instancias si las condiciones son favorables, se reproducen hasta alcanzar las dosis infectivas. Por otro lado, las condiciones de aireacin de las fuentes de agua, contribuyen a disminuir la carga microbiana presente en el agua, es decir ellas tienen un efecto depurador. Como se sealo, una amplia variedad de microorganismos pueden encontrarse en el agua, los cuales pueden persistir bajo una variedad de condiciones e incluso en aguas sometidas a procedimientos de desinfeccin. Con respecto a las bacterias que estn presentes en el agua, ellas pueden ser clasificadas como a) microbiota autctona, que corresponde a la flora propia del agua y est dada por las condiciones ambientales de las fuentes de origen del agua, tales como temperatura, contenido de nutrientes y otros. Entre los microorganismos de este grupo se encuentran varios representantes Gran negativos, con predominio de los gneros Pseudomonas, Acinetobacter, Alcaligenes y Flavobacterium. La proporcin de microbiota Gram positiva en el agua es en cambio generalmente baja y los gneros como Streptococcus sp, Bacillus sp, y micrococcus sp. son las ms comunes. b) microorganismos indicadores, en esta categora se encuentran los coliformes (totales y fecales) y Streptococcus feacalis, porque estos se encuentran en la flora intestinal del hombre y animales. La presencia de coliformes en el agua indica contaminacin fecal reciente o deficiencias en el tratamiento de las aguas. La ausencia de microorganismos indicadores es generalmente aceptada como un indicador de que el agua est libre de agentes patgenos. Por esta razn, las normas nacionales e internacionales no permiten la presencia de coliformes totales en el agua, su presencia implica un roesgo elevado de que tambin estn presentes potenciales agentes patgenos. No obstante, esta premisa no es vlida para algunos virus entricos y para varios protozoos como Giardia lamblia y Criptosporidium, ya que su presencia o ausencia no correlaciona necesariamente con ste parmetro microbiolgico. c) microorganismos patgenos, dentro de las bacterias que se han aislado de agua utilizada para el consumo humano se encuentran Vibrio cholerae, Campylobacter jejuni, Aeromonas sp y Pseudomonas sp. La calidad del agua est definida de acuerdo al uso al que va a ser destinada, por lo cual la legislacin vigente le impone ciertas caractersticas qumicas, fsicas y microbiolgicas. Para ello existen normas locales (INN) e internacionales (Codex- alimentarius, Comunidad
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Europea). Desde el punto de vista del consumo humano, los requisitos microbiolgicos que debe cumplir el agua, en nuestro pas estn especificados en la norma NCH 409-1, que indica que el agua debe estar exenta de determinacin del grupo coliforme mediante el mtodo de tubos mltiples o tcnica de filtracin por membrana de acuerdo a la norma NCH 1620/1 o NCH1620/2.
Objetivos:
Conocer los parmetros microbiolgicos que debe cumplir el agua dependiendo su uso, segn el IN Aplicar la tcnica de filtracin por membrana para agua clorada Conocer y aplicar la tcnica del nmero ms probable en agua clorada y no clorada
Procedimientos:
1.- Tcnica de filtracin por membrana: (NCh 1620/2.Of84) Esta norma se aplica al agua potable y se basa en la filtracin de un volumen de agua a travs de una membrana capaz de retener las bacterias y en la posterior incubacin de la membrana a 35 0,5C durante 22 a 24 horas en un medio lactosado, en el cual las bacterias coliformes son capaces de formar colonias tpicas por la liberacin de aldehidos a partir de la fermentacin de la lactosa. Armar el equipo de filtracin, colocando una trampa de agua entre la bomba de vaco y el matraz receptor del filtrado. Con ayuda de una pinza esterilizada por flameo, tomar una membrana y colocarla sobre el portafiltro con la parte cuadriculada hacia arriba. Colocar cuidadosamente sobre el portafiltro el embudo y cerrar. Agregar agua tamponada para la dilucin a la membrana para humedecerla, filtrndola bajo vaco. Agitar vigorosamente durante algunos segundos el frasco que contiene la muestra, destaparlo y flamear la boca del frasco. En una probeta estril medir 100 ml de la muestra a filtrar y vaciarla dentro del embudo. Filtrar la muestra bajo vaco parcial. Lavar el embudo con el filtro de membrana, con tres porciones de 20 a 30 ml de agua de dilucin estril, aplicando vaco. Sacar el embudo y en forma inmediata tomar el filtro con la ayuda de pinzas estriles y colocarlo con la parte cuadriculada hacia arriba sobre una placa de Petri con agar m-Endo LES, mediante un movimiento rotatorio sobre la superficie del medio para evitar atrapamiento de aire. Incubar las placas en posicin invertida, en ambiente hmedo, durante 22 a 24 horas a 35 0,5C. Recuento: Verificar el desarrollo de colonias, las cuales pueden presentar las siguientes caractersticas: Colonias tpicas de coliformes: de color rosado a rojo oscuro, con un brillo metlico
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verde-dorado superficial el cual puede cubrir la colonia total o parcialmente. Contar todas las colonias tpicas y atpicas que se desarrollaron a las 24 horas de incubacin. Verificar un nmero representativo de colonias de coliformes tpicas y atpicas. - Transferir, en forma individual, las colonias tpicas o atpicas seleccionadas a tubos de cultivo con caldo lauril sulfato triptosa (con campana Durham) e incubar durante 24 horas a 35 0,5C. - Verificar la formacin de gas dentro del tubo Durham. En caso de no obtener formacin de gas, reincubar por 24 horas adicionales. - De cada tubo que evidencie formacin de gas, traspasar un inculo a un tubo de cultivo con caldo bilis lactosa verde brillante e incubar durante 24 a 48 horas a 35 0,5C. - Se confirma la preencia de organismos coliformes totales si la formacin de gas en caldo lauril sulfato triptosa y en caldo bilis lactosa verde brillante es positiva en ambos casos. Expresin de resultados: Utilizar para el clculo slo aquellas membranas que presenten como mximo 80 colonias de coliformes y un mximo de 200 colonias de cualquier tipo. Membranas con ms de 80 colonias de coliformes pero con menos de 200 colonias de cualquier tipo pueden usarse para el clculo, siempre que stas sean fcilmente distinguibles. A CT = ------ x 100 V
CT= coliformes totales por 100 ml A= nmero de colonias coliformes verificadas V= Volumen total de muestra filtrada, ml Otros casos: Mayor de 200 colonias por membrana, o, si las colonias no son distinguibles como para efectuar un recuento preciso, expresar el resultado como: incontables colonias. Crecimiento confluente que cubra el rea de filtracin de la membrana, ya sea total o parcialmente, no diferencindose separacin de colonias, expresar el resultado como: desarrollo confluente por 100 ml, con o sin presencia de organismos coliformes totales
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2.- Mtodo de los tubos mltiples (NMP) (NCh 1620/1.Of84) El mtodo se basa en la capacidad que tiene los organismos coliformes de fermentar la lactosa con produccin de gas, al ser incubados a 35 0,5C. 2.1.- Agua potable (clorada): - Sembrar 5 tubos con caldo lauril triptosa o caldo lactosado doble concentracin con 10 ml de muestra cada uno. - Sembrar 1 tubo con caldo lauril triptosa o caldo lactosado simple concentracin con1 ml de la muestra. - Sembrar 1 tubo con caldo lauril triptosa o caldo lactosado simple concentracin con 0,1 ml de la muestra3. 2.2. Agua no clorada: - Sembrar 5 tubos con caldo lauril triptosa o caldo lactosado doble concentracin con 10 ml de muestra cada uno. - Sembrar 5 tubo con caldo lauril triptosa o caldo lactosado simple concentracin con 1 ml de la muestra. - Sembrar 5 tubo con caldo lauril triptosa o caldo lactosado simple concentracin conn0,1 ml de la muestra. Incubar los tubos a 35 0,5C. Examinar los tubos a las 24 horas 2 horas de incubacin, y reincubar por 24 horas adicionales aquellos tubos que no presenten formacin de gas dentro del tubo Durham, o sean dudosos. Anotar el nmero total de tubos que presenten turbiedad y formacin de gas dentro de las 48 horas 3 hora de incubacin. El enturbiamiento del medio de cultivo acompaado de formacin de gas, en cualquier cantidad, dentro de 48 hrs 3horas de incubacin constituye un ensayo presuntivo positivo. Ensayo confirmativo: Todos los tubos de caldo Lauril sulfato triptosa que dieron positivo el ensayo presuntivo a las 24 horas y al las 48 horas sern confirmados siguiendo la siguiente metodologa: Agitar suavemente los tubos positivos y transferir una asada de cada tubo a otro tubo de cultivo que contenga caldo bilis lactosa verde brillante (BVB) para confirmar COLIFORMES TOTALES y caldo EC para confirmar COLIFORMES FECALES. Ambos medios llevan campana Durham.
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Incubar los tubos de caldo bilis lactosa verde brillante a 35 0,5C y los tubos de caldo EC a 44,5 0,5C. Examinar los tubos despus de la incubacin presente formacin de gas. Con el cdigo establecido, entrar a la tabla de NMP (disponible en el laboratorio) y leer directamente el Nmero Ms Probable de bacterias coliformes por 100 ml, en la columna correspondiente al nmero de tubos sembrados en cada dilucin. Expresar el resultado como NMP coliformes por 100 ml
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Instrucciones y normas del trabajo en el laboratorio

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Reglamento Sanitario de los alimentos ( (actualizado actualizado a abril de 2009)

http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualB http://www.fda.gov/Food/Scie nceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualB AM/default.htm

FDA (U.S. Food and Drug Administration)

USDA (United States Department of Agriculture)

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Prctico N 1 Reglamento Sanitario de los Alimentos (RSA)

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Prctico N 2 Organismos Indicadores (I)

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2.- Recuento de Enterobacteriaceae

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Prctico N 3 Organismos Indicadores (II)

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288 + 263 N= ((1 x 2) + (0.1 x 2) x 10-2 N = 2,5 x 105 UFC/mL o g

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Procedimientos: MUESTRA: Plato preparado en base a carne y arroz

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Expresin de los resultados: (ufc/ g o mL)

N colonias confirmadas Recuento X Presuntivo N de colonias sometidas a confirmacin

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2/3 del tubo amarillo

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Se encuentra solidificado despus de 1 hora en el refrigerador

Reduccin de nitratos a nitritos*

positivo del positivo

Positiva negativa Positiva

* : Agregar al medio 0,5 mL de cido sulfanlico y 0,2 mL de alfa naftol.

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Tabla: Diferenciacin entre especies de Bacillus

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Prctico N 5 Listeria monocytogenes y Campylobacter jejuni

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