SYNTHSE

mdecine/sciences 2001 ; 17 : 836-44

Organisation et fonctionnement des cellules souches vgtales : le mristme apical dArabidopsis

Daphn Autran Jan Traas
Le dveloppement de lappareil arien des vgtaux suprieurs se caractrise par la production continue dorganes partir des mristmes apicaux caulinaires, eux-mmes constitus de groupes de cellules souches mises en place au cours de lembryogense. Le mristme apical caulinaire maintient la prsence dune population de cellules en prolifration, tout en assurant la diffrenciation des organes latraux. Ces deux fonctions sont accomplies grce laction coordonne de domaines fonctionnels distincts, mis en vidence par lanalyse histochimique dtaille du mristme apical des angiospermes. Au cours de la dernire dcennie, des analyses gntiques, ralises chez lespce modle Arabidopsis thaliana, ont permis lidentification de nombreux mutants affects dans les diffrentes fonctions du mristme. Le clonage et ltude de lexpression des gnes identifis a dmontr le haut niveau dorganisation des cellules mristmatiques. Lanalyse des interactions entre ces diffrents systmes contrlant le fonctionnement du mristme fournit les premires bases permettant la comprhension de la dynamique de cette structure organise.

E
ADRESSE
D. Autran, J. Traas : Laboratoire de biologie cellulaire, Inra, route de St-Cyr, 78026 Versailles Cedex, France.

836

n raison de leur nature sessile, la croissance des plantes dpend largement des variations de leur environnement. Cette plasticit dveloppementale, spcifique du rgne vgtal, est due principalement une organogense continue. Une telle particularit les distingue des animaux suprieurs, chez lesquels la majeure partie des organes

sont labors au cours de la vie embryonnaire. Chez les plantes suprieures, des groupes de cellules souches, appels mristmes, sont mis en place au cours de lembryogense. Celles-ci peuvent tre dfinies comme des cellules capables de produire la fois des cellules identiques elles-mmes et des cellules destines se diffrencier. Ainsi, les mristmes sont des ensembles orgam/s n 8-9, vol. 17, aot-septembre 2001

niss de cellules souches qui sautomaintiennent et produisent en parallle des organes et des tissus, cela tout au long de la vie de la plante. Typiquement, chez les plantes fleurs, le mristme apical racinaire donne naissance lappareil racinaire, tandis que le mristme apical caulinaire (MAC), auquel est consacre cette revue, donne naissance toute la partie arienne de la plante. Le MAC est caractris par un dveloppement de type itratif, au cours duquel sont produites des unit s squentielles, appeles phytomres. Un phytomre comporte une feuille, portant ventuellement son aisselle un mristme axillaire, lensemble constituant le nud, soutenu par une portion de tige, appele lentrenud (figure 1). Des changements progressifs de lidentit du mristme interviennent au cours du dveloppement de la plante. En effet, le MAC vgtatif, form au cours de lembryogense, produit des feuilles. Lors de la transition florale, le MAC v g tatif devient un m rist me d inflorescence produisant des feuilles modifies, ou feuilles cau-

lines, et des mristmes floraux latraux. Contrairement leurs prdcesseurs (m rist me v g tatif et dinflorescence), ces mristmes floraux ont une croissance dfinie ou d termin e, puisque leur activit cesse apr s la production d un nombre dfini dorganes. De plus, les organes floraux sont produits sous la forme danneaux concentriques, ou verticilles, et non plus en spirale comme pour les feuilles vgtatives ou caulines. Les diffrents verticilles formant une fleur correspondent, de l ext rieur vers l int rieur, aux s pales, p tales, tamines et carpelles. L activit des m rist mes a riens dtermine la base de larchitecture de la plante. Ainsi, lorsque seul le mristme apical primaire est actif, larchitecture gnrale de la plante est lin aire. En revanche, si des m rist mes axillaires sont activ s, des hampes florales secondaires sont formes, donnant naissance une architecture branch e plus complexe (figure 1). Dautres types de mristmes peuvent galement tre actifs, comme les mristmes adventifs, forms de novo partir de tissus

diffrencis. Ils peuvent tre situs sur les feuilles (adultes ou juvniles), les tiges ou les racines. Des mristmes secondaires plus diffus, appels cambiums, existent dans la racine et la tige, et sont responsables de la croissance en paisseur de ces structures. La position et lactivit des m rist mes influencent donc la croissance et la forme gnrale de la plante. Dans cette revue, nous nous concentrerons sur le mristme apical caulinaire vgtatif, tout en faisant rfrence aux connaissances et aux modles tablis partir de ltude des m rist mes d inflorescence. Nous aborderons principalement les facteurs impliqus dans la maintenance des mristmes et la mise en place proprement dite des primordiums. Nous ne pourrons dvelopper dans cette courte synthse la question fort intressante de lidentit des organes produits (feuillles vgtatives ou caulinaires, fleurs, ou organes floraux). Bien que la prsence dun mristme apical soit une caractristique gnrale des vgtaux terrestres multicellulaires, sa structure peut varier de faon significative dune espce

A
Fleur MAC Mristme axillaire

Phytomre

Entre-nud Nud

Inflorescence secondaire Feuille cauline Inflorescence primaire Feuille vgtative

Mristme racinaire

Figure 1. A. Reprsentation schmatique de larchitecture dArabidopsis thaliana. Le mristme apical caulinaire (MAC) produit toute la partie arienne de la plante, tandis que le mristme apical racinaire donne naissance lappareil racinaire. Le MAC vgtatif, form au cours de lembryogense, produit des feuilles vgtatives. Lors de la transition florale, le MAC vgtatif devient un mristme dinflorescence, produisant des feuilles modifies, ou feuilles caulines, et des fleurs. La partie arienne de la plante mature est constitue dunits squentielles appeles phytomres. Un phytomre comporte une feuille, portant ventuellement son aisselle un mristme axillaire, lensemble constituant le nud, soutenu par une portion de tige, appele lentre-nud. B. Visualisation en microscopie confocale du mristme apical vgtatif dune plantule dArabidopsis au stade 6 jours aprs germination. Les deux premiers primordiums foliaires sont visibles. Un double marquage iodure de propidium/rhodamine 123 a t utilis, colorant respectivement les noyaux en rouge et le cytoplasme des cellules en vert.
m/s n 8-9, vol. 17, aot-septembre 2001

837

l autre. Le m rist me des angiospermes* a t plus particulirement tudi (pour revue [1]). Tous les m rist mes apicaux des vgtaux suprieurs sont pluricellulaires. Cependant, au sein du MAC, ces cellules, qui constituent les units de base construisant le mristme, ne fonctionnent pas de fa on autonome. Elles sont organises en des domaines multicellulaires permettant le fonctionnement du MAC comme un ensemble coordonn . Ces domaines sont distincts au niveau cytologique et reprsentent des units fonctionnelles. Les connaissances issues des approches g n tiques, men es au cours de la derni re d cennie principalement chez lespce modle Arabidopsis thaliana, ont rvl une partie des mcanismes molculaires qui sous-tendent lorganisation du MAC. Ces connaissances, associ es aux approches biochimiques et cellulaires, ont tabli les premires bases de la comprhen* Angiospermes (du grec angeion, vase, bote, et sperma, graine) : sous-embranchement de plantes phanrogames dont les graines sont enfermes dans un fruit, comprenant prs de 300 000 espces (les angiospermes se divisent en monocotyldones et dicotyldones).

sion de lintgration des processus cellulaires au sein du mristme.

Organisation des cellules mristmatiques

Des analyses cytologiques classiques ont permis de mettre en vidence plusieurs modles dorganisation cellulaire au sein du mristme. Tout dabord, lobservation microscopique de coupes longitudinales du MAC des Angiospermes rvle lexistence de plusieurs assises cellulaires distinctes. L assise externe, appele tunica, est forme et maintenue par l orientation anticlinale (perpendiculaire la surface du mristme) invariable des plans de division. La tunica entoure un ensemble de cellules plus interne, appel corpus, qui ne prsentent pas de plans de division prfrentiels [2]. Chez les dicotyldones, comme Arabidopsis, la tunica se compose de deux assises cellulaires, L1 et L2, entourant le corpus (figure 2). Lassise L2 peut son tour tre compose de plusieurs assises, en fonction du stade de dveloppement. A cette stratification horizontale du MAC se superpose une organisation radiale. Trois domaines, ou zones,

ZC P1 ZP P2

L1 Tunica L2 L3

ZM

P0

Corpus

Figure 2. Description histologique de lorganisation du mristme apical. Les assises externes, L1 et L2, formant la tunica, sont caractrises par lorientation anticlinale (perpendiculaire la surface du mristme) des plans de division. Les assises sous-jacentes, L3, ou corpus, ne prsentent pas de plans de division prfrentiels. Trois domaines, ou zones, ont t dfinis sur la base de critres cytologiques, tels que la taille cellulaire, la densit cytoplasmique et le taux de prolifration cellulaire : la zone centrale (ZC) contient les cellules souches assurant le maintien du mristme, la zone priphrique (ZP) est compose de cellules plus petites et se divisant plus rapidement, permettant linitiation des primordiums dorganes. La formation du futur primordium (P0) dbute avec une augmentation de la frquence des divisions priclines (parallles la surface du mristme) dans lassise L2. La zone mdullaire (ZM) comporte des cellules plus grandes, allonges, et produit les tissus internes de la tige. P1, P2 : primordiums.

838

ont t dfinis sur la base de critres cytologiques, tels que la taille cellulaire, la densit cytoplasmique et le taux de prolifration cellulaire : il sagit de la zone centrale (ZC), de la zone priphrique (ZP) et de la zone mdullaire (ZM) (figure 2). La ZC occupe le sommet du mristme et stend en profondeur sur une partie de la tunica et du corpus. Elle est entoure par la ZP o naissent les primordiums. Les cellules de la ZP, chez de nombreuses espces, sont plus petites, moins vacuolises et se divisent gnralement plus rapidement que celles de la ZC. Les diffrences observes dans la dure du cycle cellulaire peuvent varier significativement dune espce lautre : ainsi, chez le riz, les cellules de la priphrie du mristme se divisent huit fois plus vite que celles du centre, alors que chez le pois, ce rapport varie entre 1,2 et 2,4 [3 , 4]. Chez Arabidopsis, sur la base de ce critre cytologique, une zone centrale relativement prcise a pu tre dfinie au sein du MAC dinflorescence [5]. Sous-jacente la ZC et la ZP, la ZM constitue la base du mristme et est compose de cellules plus grandes, organises en files, qui produisent les parties internes de la tige. Dautres tudes de cytologie ont analys les rgions du mristme o sont mis en place les primordiums. Le dbut de la formation dune feuille saccompagne de modifications des taux et de lorientation des divisions et de la croissance cellulaires au sein dun groupe de cellules de la PZ. Chez la plupart des espces tudies, y compris Arabidopsis, le taux de division augmente dans le secteur du futur primordia par rapport aux rgions situes aux alentours de la ZP [5]. De plus, la formation du primordium dbute avec une augmentation de la frquence des divisions priclines (parall les la surface du m rist me) dans les assises sup rieures, comme cela a t observ chez le pois [6]. Simultanment, on observe une expansion polarise des cellules dans laxe de dveloppement de la future feuille [7]. L ensemble de ces donn es classiques de cytologie montre que le MAC est une structure hautement organis e, et sugg re un mod le selon lequel les diff rentes zones d finies correspondent aux deux
m/s n 8-9, vol. 17, aot-septembre 2001

fonctions principales du mristme : mise en place des organes latraux dans la zone priphrique, et automaintien du mristme par lactivit de la zone centrale. Au cours des dix dernires annes, les fonctions distinctes suggres par les observations cytologiques des diffrentes zones ont pu tre confirmes et labores, grce diffrentes approches. En particulier, principalement chez Arabidopsis, grce lanalyse de diff rents mutants affects dans la mise en place et lorganisation du MAC, coupl e l tude des profils dexpression des gnes isols correspondants au sein du mristme.

Maintien du mristme
Plusieurs classes de gnes homodomaines, codant pour des facteurs de transcription impliqus dans la dfinition et le dveloppement du plan de base du corps chez de nombreux organismes multicellulaires, sont impliqus dans le fonctionnement du MAC. La famille des gnes knotted a t initialement identifie chez le mas. Le premier membre isol , le g ne knotted 1 (kn1) , sexprime dans tout le mristme et son expression disparat lorsque les cellules entrent dans la formation dun primordium (figure 3). Chez les

mutants kn1, le nombre de branches est r duit, alors qu il y a plus dorganes dtermins que chez le sauvage, ce qui suggre un rle du gne kn1 dans le maintien du MAC [8]. Les mutants dominants kn1, qui expriment de faon ectopique la prot ine hom odomaine dans les feuilles, prsentent des feuilles anormales formant des nuds (knots) de cellules surnumraires autour des nervures. Ceci confirme lide dun rle de la protine kn1 dans la persistance des cellules ltat mristmatique [9]. Les mutations dans le gne shootmeristemless (stm), membre de la famille des gnes knotted chez Arabidopsis, entranent une incapacit dvelopper un m rist me fonctionnel au cours de lembryogense [10]. La protine STM, comme KN1, est prsente dans les mristmes vgtatifs et dinflorescence, ainsi que dans les m rist mes floraux, mais elle est absente des primordiums dorganes. Au cours de lembryogense, le gne stm sexprime trs prcocement dans les cellules apicales de lembryon, puis est progressivement exclu des cotyldons (feuilles embryonnaires) en formation [11]. Ce profil dexpression, ainsi que le phnotype des mutants stm, suggrent un rle de ce gne dans la mise en place du

MAC au cours de lembryogense. Cependant, les plantes portant des all les forts stm sont capables de mettre en place des organes (cotyldons, feuilles) bien quen nombre trs rduit, et conserveraient donc une activit m rist matique r siduelle. Une hypoth se alternative pourrait tre que les mutants stm sont capables de mettre en place un MAC, mais nont pas la capacit de le maintenir. Le gne stm, de mme que kn1, serait donc ncessaire pour maintenir les cellules ltat mristmatique. Il existe au moins neuf gnes de la famille des gnes knotted chez Arabidopsis : il sagit des gnes knat (knotted Arabidopsis thaliana) 1 5, de stm et dau moins trois autres gnes, prsents dans les bases de donnes gnomiques. Parmi ces gnes, knat1, knat2 et stm sont exprims dans le MAC, dans des domaines distincts mais chevauchants. Knat1 sexprime selon un profil proche de celui de stm [13], alors que knat2 est prsent dans l assise L3 uniquement, et stend dans les parties plus internes de l apex couvrant la ZM [14]. Aucun mutant de type perte de fonction des gnes knat1 et knat2 na t dcrit. Cependant, la surexpression du g ne knat1 , sous le contrle dun promoteur constitutif, induit la formation de lobes et de

P1

P2
ZC + ZP ZC

WUS + STM CLV3 + CLV1 + STM CLV1 + STM STM Frontire CUC2 + STM ANT/LFY/PIN/AS1

P0

Primordiums

Figure 3. Profils dexpression des principaux gnes contrlant le fonctionnement du MAC. Les profils dexpression transcriptionnelle reprsents sont fonds sur les donnes dhybridation in situ obtenues sur le MAC dArabidopsis. Le gne shootmeristemless (stm) sexprime dans tout le domaine mristmatique, lexception des sites de dmarrage de la formation des primordiums. Les transcrits du gne clavata 3 (clv3) sont dtects dans un petit groupe de cellules au sommet du mristme concidant probablement avec la ZC dfinie partir de critres cytologiques. clv1 sexprime dans un large domaine central, entourant le domaine clv3. Le gne wuschel (wus) sexprime dans un ensemble restreint de cellules sous-jacent au domaine clv3. La frontire entre le mristme et les primordiums est dfinie par la prsence des transcrits du gne cupshapedcotyledons 2 (cuc2). Lensemble de ces domaines dexpression est inclus dans le domaine STM. Plusieurs gnes sexprimant spcifiquement dans les primordiums ont t dcrits chez Arabidopsis : aintagumenta (ant), leafy (lfy), pin-formed (pin) et asymetric leaves (as1). Les gnes phantastica (phan) chez Anthirrinum, et son homologue roughsheath 2 (rs2) chez le mas, prsentent un profil dexpression similaire. ZC : zone centrale ; ZP : zone priphrique.

839

840

folioles sur les feuilles, ainsi que celle de tiges ectopiques, suggrant que le gne knat1 est suffisant pour la mise en place de mristmes [15]. Le gne wuschel dfinit une autre classe de gnes homodomaines impliqus dans le fonctionnement du MAC. Chez les mutants correspondants wus, un MAC peut tre mis en place, mais le mristme se termine pr cocement, apr s avoir form quelques organes. De nouveaux mristmes sont produits continuellement, mais aboutissent des structures anormales. La fonctionnalit de la zone centrale du MAC nest pas maintenue puisque la mise en place de primordiums a lieu frquemment en position centrale, consommant les cellules m rist matiques. Des fleurs sont produites, mais elles prsentent un nombre rduit dorganes et se terminent prcocement en une tamine centrale [16]. Au sein du MAC, les transcrits du gne wus sont dtects dans un petit groupe central de cellules, en dessous des trois assises cellulaires externes, constituant probablement la base de la ZC (figure 3). Ce profil se retrouve dans les mristmes dinflorescence et floraux. Sur la base du profil dexpression du gne et du phnotype des mutants wus, il a t propos que WUS pourrait agir comme un centre organisateur du MAC, maintenant l identit des cellules souches de la zone centrale surplombant son domaine dexpression [17]. Les mutants clavata 1, 2 et 3 (clv1,2,3) correspondent l inactivation de trois locus ind pendants. Ils ont cependant un phnotype trs similaire, qui suggre un rle antagoniste de celui propos pour les gnes stm et wus. En effet, les mutants clv sont caract ris s par la pr sence d un mristme agrandi ds lembryogense. La taille du mristme saccrot graduellement au cours du dveloppement, produisant plus de feuilles vgtatives, puis donnant naissance des tiges largies. Celles-ci produisent des fleurs prsentant galement une augmentation du nombre dorganes [18]. Les doubles mutants clv1 clv3 sont identiques aux simples mutants, ce qui suggre un rle commun de ces deux g nes dans la m me voie de transduction. Les mutants clv2 ont un phnotype similaire celui des allles faibles clv1 et

clv3, et lanalyse des doubles mutants a montr que le gne clv2 agit galement dans la voie clv1/clv3 [19]. Le gne clv1 code pour un rcepteur activit kinase, et est exprim dans un large domaine du mristme comprenant le corpus et probablement lassise L2 (figure 3 [20]). Le gne clv3 code pour un petit peptide scrt et est exprim dans un domaine restreint au sommet du m rist me, qui pourrait correspondre la ZC dfinie partir de critres cytologiques (figure 3 [21]). Le gne clv2, qui code galement pour un r cepteur membranaire, serait associ clv1 [22]. Ces prot ines, associ es d autres partenaires, font partie dune mme voie de signalisation contrlant la taille du mristme. Des tudes biochimiques ont suggr que la protine clv3 serait un ligand extracellulaire de clv1, sa liaison permettant linteraction du complexe clv1/clv2 avec les autres prot ines du complexe actif, telles que la protine phosphatase Kapp [23] et la prot ine

GTPase Rho, qui relayeraient et contr leraient la transmission du signal des protines cibles [24]. Lune des cibles potentielles, directe ou indirecte, de la voie dfinie par les gnes clavata pourrait tre la protine homodomaine wus. En effet, les mutations du gne wus sont pistatiques sur clv, ce qui indique que wus agit en amont de clv dans le contrle de la taille du m rist me [16]. Dautres arguments sont en faveur de cette hypothse, et dmontrent en outre lexistence dun systme de rtro-contrle entre clv3 et wus. En effet, lexpression artificielle de wus dans les primordiums (sous le contrle du promoteur dun gne spcifique des primordiums, le gne ANT, cf. ci-dessous) est suffisante pour induire lexpression de clv3, entra nant la formation d un domaine mristmatique ectopique. Par ailleurs, le domaine dexpression de wus est agrandi et tendu aux assises externes dans les mristmes mutants clv, ce qui suggre lexistence dun contrle ngatif de wus par clv

P1
CLV1

CLV3

P2
STM

WUS PIN 1 CUC2

AS1

Figure 4. Un modle de fonctionnement du mristme apical. Dans le mristme apical dArabidopsis, les gnes stm, wus et clv contrlent la persistance et la taille du MAC. Stm serait ncessaire pour maintenir les cellules ltat mristmatique. Parmi ces cellules mristmatiques, les cellules de la ZC produisent la protine signal clv3. Clv3 active le complexe rcepteur membranaire clv1/clv2 dans les cellules alentours, correspondant au domaine dexpression clv1. La transmission du signal via la voie CLV limite lactivit wus en restreignant son expression un petit groupe de cellules sous-jacentes la ZC. Simultanment, WUS reprsente une voie positive activant ou maintenant lexpression de clv3. La mise en place des primordiums ncessiterait linactivation du gne stm. Le gne de type myb as1 est un bon candidat pour raliser cette inactivation. Au sein de la rgion de dmarrage de la formation des organes, les cellules peuvent appartenir deux domaines distincts : les primordiums et les frontires entre les primordiums. Les gnes sexprimant spcifiquement dans les primordiums, tels ant, lfy, permettent leur mergence, tandis que les gnes tels cuc2, ufo sexprimant la frontire des organes, inhibent la croissance ce niveau. Le gne pin1, permettant un flux entrant local dauxine au niveau du primordium mergeant, agirait simultanment sur ces deux identits en activant la croissance de lorgane et en inhibant lidentit frontire .

[25]. En outre, des plantes transgniques qui surexpriment le gne clv3 de manire constitutive, prsentent un phnotype similaire aux mutants wus, et nexpriment plus wus dans le mristme [26]. Combines aux profils d expression de ces diff rents gnes dans le mristme apical, ces donnes ont conduit la proposition dun modle de contrle de la taille de la population des cellules souches du m rist me (figure 4) . Dans le mristme apical dArabidopsis, les cellules souches de la ZC produisent la protine signal clv3. Celle-ci active le complexe r cepteur membranaire clv1/clv2 dans les cellules environnantes, correspondant au domaine dexpression de clv1. La transmission du signal via la voie clv limite lactivit de wus, en restreignant son expression un petit groupe de cellules sous-jacentes la ZC. Simultanment, wus reprsente une voie positive, en activant ou en maintenant lexpression de clv3. Cette modulation mutuelle, qui implique des interactions positives et ngatives, fournit un systme de contrle subtil de la taille du mristme. Les interactions de la voie clv avec le gne stm ont galement t tudies. Au cours du dveloppement postembryonnaire, les allles faibles clv et stm agissent comme des suppresseurs mutuels. En effet, un phnotype intermdiaire est observ lors de leur inactivation [27], ce qui suggre que les deux g nes agissent ind pendamment et de faon oppose, sur un processus commun, celui de la persistance du mristme. De mme, les allles svres stm sont pistatiques sur les mutations wus, qui aggravent les phnotypes des allles stm intermdiaires et faibles, conduisant ainsi une absence de mristme embryonnaire. stm agit donc un niveau de contrle diffrent de celui de wus [28]. Parmi lensemble des cellules exprimant le gne stm (cest--dire lensemble des cellules constituant la ZC et la ZP), la boucle de contrle wus/clv coordonnerait lactivit des cellules de la ZC (figure 4).

Mise en place des organes latraux

Au sein du mristme, les cellules se divisent perptuellement, et les cellules filles nouvellement produites
m/s n 8-9, vol. 17, aot-septembre 2001

sont intgres dans les primordiums dorganes la priphrie du mristme. Tandis que les gnes stm, wus et clv contrlent la persistance et la taille du MAC, un autre rseau de gnes contrle la rpartition de ces cellules en organes latraux. Une srie de processus interdpendants interviennent dans la formation des organes : recrutement des cellules dans les primordiums, croissance de lorgane, sparation des organes et dtermination de leur identit. Il est toutefois difficile de dfinir la succession exacte de ces vnements au cours du d veloppement d un organe. Lun des premiers processus observ est la sparation du mristme dun groupe de cellules destines former un primordium. Diffrents gnes ont t impliqus dans cette premire tape. Un v nement pr coce est linactivation des gnes kn1/stm dans les cellules initiales du primordium. Les facteurs de transcription de type myb, asymmetric leaves 1 (as1) chez Arabidopsis, et leurs orthologues rough sheath 2 (rs2) chez le mas, et phantastica (phan) chez Antirrhinum majus, pr sentent un profil d expression complmentaire celui de kn1/stm. Ces gnes sont exprims spcifiquement dans les cellules qui donneront les futurs primordiums, et seraient ncessaires linactivation de kn1/stm puisque ces gnes sexpriment de faon ectopique dans les primordiums chez les mutants as1, rs2 et phan [2931]. Un autre marqueur trs prcoce de la formation des primordiums est reprsent par lexpression du gne aintegumenta (ANT) associ la croissance et au maintien de la prolifration des cellules initiales du primordium. La protine ant est un facteur de transcription potentiel, exprim e dans les primordiums des organes latraux. Les mutants ant sont svrement affects dans le dveloppement floral et celui de la graine, et prsentent, entre autres phnotypes, une rduction de la taille et du nombre des organes floraux. Au cours du dveloppement vgtatif, la mutation ant entrane une rduction de la taille des feuilles, due la prsence dun nombre rduit de cellules. De plus, la surexpression de ant, sous le contrle dun promoteur constitutif, entrane une augmentation de la taille des feuilles, confirmant limportance

du gne ant dans le contrle de la croissance et donc de la taille des organes latraux [32]. De mme, le facteur de transcription leafy chez Arabidopsis (ou son orthologue floricaula chez Antirrhinum), qui joue un rle prpondrant dans la mise en place de lidentit du mristme dinflorescence, est exprim prcocement dans tous les primordiums dorganes [33].

Sparation des organes

La mise en place dun primordium implique galement la dfinition de ses frontires, conduisant la formation dorganes distincts les uns des autres. Plusieurs gnes sont impliqus dans ce processus. Les mutations dans les gnes unusual flower organ (ufo) dArabidopsis et dans son orthologue fimbriata (fim) chez Antirrhinum, affectent la sparation des organes, entranant la formation dorganes floraux fusionns et chimriques. Ces gnes codent pour des protines f-box . Les protines de cette famille sont impliques dans la protolyse de protines-cibles via la voie de lubiquitine, et elles sont, dans certains cas, associ es au contrle de la prolifration cellulaire. Ces gnes sexpriment dans les mristmes vgtatifs et dinflorescence, mais aussi la frontire entre les organes floraux, ce qui confirme leur fonction dans la mise en place des zones de fronti res entre les organes et le mristme [33]. Chez les doubles mutants cup shaped cotyledons 1,2 (cuc1 cuc2), il existe une fusion des cotyldons qui forment une coupe entourant le mristme apical. Les simples mutants 1 et 2 (cuc1, 2) nont en revanche pratiquement pas de phnotype apparent, probablement en raison d une redondance entre les gnes cuc1 et cuc2. Au cours du dveloppement de ces doubles mutants cuc1 cuc2, des fusions d organes sont galement observes. Le gne cuc2 a t clon, il est homologue au g ne no apical meristem (nam), identifi lorigine chez le Ptunia, chez lequel il est ncessaire pour la mise en place du MAC au cours de lembryogense. Plusieurs membres de cette famille de gnes, appels les gnes nac, ont t isols chez Arabidopsis, et coderaient pour des facteurs de transcription. Les gnes cuc2 et nam prsen-

841

842

tent un profil dexpression similaire : les transcrits correspondants sont dtects dans une zone sparant les cotyldons dans lembryon et aux frontires de tous les organes ariens (figure 3) , ce qui confirme lhypothse de leur fonction de suppresseurs de la croissance la frontire des organes. stm interagirait avec le gne cuc2, puisquil est ncessaire lexpression spatiale correcte de cuc2 et que la fonction de cuc est requise pour lexpression de stm [34]. Les gnes pin-formed 1 (pin1) et pinoid (pid) sont impliqus la fois dans la mise en place et la sparation des organes tout au long du dveloppement. Au cours des phases embryonnaires et vgtatives, la perte de la fonction pin entrane une rduction du nombre de cotyl dons et de feuilles produits. Les effets des mutations pid sont moins drastiques au cours du dveloppement vgtatif. Aprs la floraison, ces deux mutations conduisent la formation dune inflorescence nue, ne produisant quoccasionnellement des fleurs, qui pr sentent alors des organes fusionns. Le gne pin appartient une famille multignique, qui coderait pour des protines transmembranaires. Le gne pid code pour une prot ine pr sentant une activit srine/thronine kinase. Ces deux g nes ont t associ s aux m canismes daction de lhormone vgtale auxine, suggrant ainsi un rle pr pond rant de cette hormone dans lmergence des primordiums. Chez le mutant pin1, les marqueurs des primordiums dorganes, tel que lfy , et des fronti res entre les organes, tel que cuc2, ne prsentent plus un profil d expression sp cifique. Ils sexpriment alors tous deux dans un domaine en anneau entourant le mristme, dont les cellules possdent donc une identit hybride, la fois frontire et primordiums . Le gne pin est exprim fortement dans les organes latraux, confirmant son rle suppos dans la mise en place des organes. Le rle du gne pin1 serait donc dinhiber cuc2 dans les primordiums pour permettre la croissance des organes [35]. Lidentit des organes latraux produits par les m rist mes varie au cours du dveloppement. Au cours des phases vgtatives et reproduc-

tives, diffrents types de feuilles sont produites. Il en est de m me au niveau des fleurs, qui poss dent quatre type d organes. Les m canismes physiologiques et gntiques mis en jeu dans le contrle de lidentit des organes ont t largement tudis, principalement en ce qui concerne le dveloppement floral (pour revue, voir [36]) et ne seront pas abords dans cette article.

Intgration des cellules dans le mristme

Tout en conservant une organisation stricte, le MAC prsente une stabilit remarquable, illustre par lge que peuvent atteindre certains arbres. Cependant, cette stabilit est ralise par un ensemble dynamique de cellules, qui se renouvellent de faon continue tout en assurant la diffrenciation des organes. Quels sont les mcanismes intgrant les diffrents comportements cellulaires, la fois dans les domaines fonctionnels distincts composant le mristme, et entre eux ? Selon lune des hypothses permettant dexpliquer la mise en place dun contrle spatial constant de la diffrenciation, le devenir dune cellule est dtermin par son origine clonale. Lorganisation en assises du mristme apical suggrerait lintervention dun tel mcanisme. Cependant, lanalyse de chimres priclines (cest--dire de plantes comportant des assises dont les cellules diffrent entre elles pour un ou plusieurs marqueurs visibles : plodie, albinisme...), indique que lorigine clonale na que peu dimportance. En effet, des divisions dorientation anormale ont parfois lieu au sein dune assise, lune des cellules filles se retrouvant alors dans lassise voisine. Les cellules ainsi dplaces vont adopter lidentit lie leur nouvelle position [37]. Une deuxime hypothse, suggre par ces observations, serait que lidentit cellulaire est acquise en fonction de la position de la cellule dans lorgane. Ceci suppose que les cellules peuvent ajuster leur comportement en fonction des cellules voisines, ncessitant donc un comportement collectif constant, malgr des variations au niveau des cellules individuelles. Des expriences dablation cellulaire, ralises en microscopie

confocale dans le mristme racinaire dArabidopsis, ont permis de montrer limportance des signaux positionnels dans ltablissement des profils de diffrenciation, et lorigine de ces signaux. En effet, lidentit des descendants des cellules mristmatiques ncessite la prsence de cellules adjacentes dj diffrencies. Les informations positionnelles proviennent donc des tissus proximaux plus matures [38]. Les cellules mristmatiques, comme la plupart des cellules vgtales, sont connectes par des canaux cytoplasmiques spcialiss, les plasmodesmes. La continuit symplasmique existant entre des cellules voisines permet la mise en place de domaines multicellulaires, ou champs symplasmiques , au sein desquels le comportement cellulaire est coordonn. La microinjection de marqueurs fluorescents dans des mristmes dIris a permis de mettre en vidence lexistence de diffrents champs symplasmiques [39]. Les cellules de la priphrie du mristme sont connectes entre elles, formant un champ spar de la rgion centrale. Ceci pourrait correspondre la zonation histologique du mristme dcrite prcdemment. En outre, au sein de la rgion centrale, les cellules de la tunica sont spares du domaine symplasmique form par le corpus. Les champs symplasmiques sont dynamiques et des connexions transitoires peuvent stablir. Certains rgulateurs du mristme peuvent transiter de cellule cellule via les plasmodesmes, dterminant le comportement de cellules distantes ou voisines nexprimant pas ces rgulateurs. Par exemple, chez le mas, le gne knotted sexprime dans tout le dme mristmatique lexception de lassise L1. La prot ine kn1 est en revanche dtecte dans lensemble des assises. Le transport de la protine kn1 a t tudi en microinjectant la protine marque par des anticorps fluorescents, dans des cellules de m sophylle foliaire [40]. Dans ce cas, la protine kn1 est capable de se dplacer vers les cellules situes aux alentours du syst me vasculaire et du m sophylle. De nombreux autres rgulateurs du mristme prsentent une activit qui ne serait pas autonome par rapport la cellule, comme le gne didentit florale flo
m/s n 8-9, vol. 17, aot-septembre 2001

dAntirrhinum orthologue de LFY d Arabidopsis , qui pourrait faire intervenir un transport de ces protines via les plasmodesmes [41]. De mme que dans les systmes animaux, la matrice extracellulaire chez les vgtaux semble galement intervenir dans la mise en place et le maintien de la diffrenciation cellulaire. Les diffrents signaux de dveloppement transitant par l apoplasme peuvent passer lintrieur des cellules, sans toutefois emprunter la voie des plasmodesmes, ce qui implique un contrle membranaire du transport. Cela a t propos pour le transport de lauxine par les prot ines membranaires pin, par exemple [35]. Les signaux extracellulaires peuvent galement interagir avec des composants de la surface cellulaire, comme les r cepteurs membranaires. Ce dernier cas est illustr par la voie de signalisation impliquant les g nes clavata (clv) dcrits prcdemment, qui contrlent la taille du mristme. Ainsi, des signaux de diff rente nature, ARN messagers, protines, hormones, transitent par les voies de communication symplasmiques et apoplasmiques, et permettraient l int gration des cellules en une unit fonctionnelle dans le mristme apical.

ment du mristme, et plus gnralement sur le dveloppement de lorganisme, est au centre des recherches actuelles, qui visent comprendre comment le mristme apical ralise l tat d quilibre dynamique que nous avons dcrit ici s
Remerciements Les auteurs remercient Richard Berthomme, Olivier Hamant et Teva Vernoux pour discussions et lecture du manuscrit, et Olivier Grandjean pour son aide en microscopie confocale.

13. Lincoln C, Long J, Yamaguchi J, Serikawa K, Hake S. A knotted1-like homeobox gene in Arabidopsis is expressed in the vegetative meristem and dramatically alters leaf morphology when overexpressed in transgenic plants. Plant Cell 1994 ; 6 : 1859-76. 14. Dockx J. On homeobox genes and plant development. Ph.D. Thesis, University of Utrecht, 1995. 15. Chuck G, Lincoln C, Hake S. knat1 induces lobed leaves with ectopic meristems when overexpressed in Arabidopsis. Plant Cell 1996 ; 8 : 1277-89. 16. Laux T, Mayer KFX, Berger J, Jrgens G. The wuschel gene is required for shoot and floral meristem integrity in Arabidopsis. Development 1996 ; 122 : 87-96. 17.Mayer KFX, Schoof H, Haecker A, Lenhard M, Juergens G, Laux T. Role of wuschel in regulating stem cell fate in Arabidopsis shoot meristem. Cell 1998 ; 95 : 805-15. 18. Clark SE, Running MP, Meyerowitz EM. clavata1, a regulator of meristem and flower development in Arabidopsis . Development 1993 ; 119 : 397-418. 19. Kayes JM, Clark SE. clavata2, a regulator of meristem and organ development in Arabidopsis. Development 1998 ; 125 : 3843-51. 20. Clark SE, Williams RW, Meyerowitz EM. The clavata1 gene encodes a putative receptor kinase that controls shoot and floral meristem size in Arabidopsis. Cell 1997 ; 89 : 575-85. 21. Fletcher JC, Simon R, Running MP, Brand U, Meyerowitz EM. Signaling of cell fate decision by clavata3 in Arabidopsis shoot meristem. Science 1999 ; 123 : 1911-4. 22. Jeong S, Trotochaud AE, Clark SE. The arabidopsis clavata2 gene encodes a receptorlie protein required for the stability of the clavata1 receptor-like kinase. Plant Cell 1999 ; 1 : 1925-34. 23. Williams RW, Wilson JM, Meyerowitz EM. A possible role for kinase-associated protein phosphatase in Arabidopsis clavata1 signaling pathway. Proc Natl Acad Sci USA 1997 ; 94 : 10467-72. 24. Trotochaud AE, Hao T, Wu G, Yang Z, Clark SE. The clavata1 receptor-like kinase requires clavata3 for its assembly into a signalling complex that includes kapp and a Rho-related protein. Plant Cell 1999 ; 11 : 393-405. 25. Schoof H, Lenhard M, Haecker H, Mayer KFX, Jurgens G, Laux T. The stem cell population of Arabidopsis shoot meristems is maintained by a regulatory loop between the clavata and wuschel genes. Cell 2000 ; 100 : 635-44. 26. Brand U, Fletcher JC, Hobe M, Meyerovitz EM, Simon R. Dependence of stem cell fate in Arabidopsis on a feedback loop regulated by clv3 activity. Science 2000 ; 289 : 617-9. 27. Clark SE, Jacobsen SE, Levin JZ, Meyerowitz EM. The clavata and shoot meristemless loci competitively regulate meristem activity in Arabidopsis. Development 1996 ; 122 : 1567-75.

RFRENCES
1. Steeves TA, Sussex IA. Patterns in plant development, 2nd ed. New York : Cambridge University Press 1989. 2. Satina S, Blakeslee AF, Avery AG. Demonstration of the three germ layers in the shoot apex of Datura by means of induced polyploidy in periclinal chimeras. Am J Bot 1940 ; 27 : 895-905. 3.Lyndon RF. The shoot apex. In : Yeoman MM, eds. Cell division in higher plants. London : Academic Press, 1976. 4. Francis D, Dudits D, Inz D. Plant cell division. London : Portand Press, 1998. 5. Laufs P, Grandjean O, Jonak C, Kieu K, Traas J. Cellular parameters of the shoot apical meristem in Arabidopsis. Plant Cell 1998 ; 10 : 1375-89. 6. Cunninghame ME, Lyndon RF. The relationship between the distribution of periclinal cell divisions in the shoot apex and leaf initiation. Ann Bot 1986 ; 57 : 737-46. 7. Green PB. Surface of the shoot apex : a reinforcement-field theory for phyllotaxis. J Cell Sci 1985 ; 2 (suppl) : 181-201. 8. Kerstetter RA, Laudencia-Chingcuanco D, Smith LG, Hake S. Loss-of-function mutations in the maize homeobox gene, knotted1, are defective in shoot meristem maintenance. Development 1997 ; 124 : 3045-54. 9. Sinha NR, Williams RE, Hake S. Overexpression of the maize homeobox gene, knotted1, causes a switch from determinate to indeterminate cell fates. Genes Dev 1993; 7: 787-95. 10. Barton MK, Poethig RS. Formation of the shoot apical meristem in Arabidopsis thaliana : An analysis of development in the wild type and in the shoot meristemless mutant. Development 1993 ; 119 : 823-31. 11. Long JA, Moan EI, Medford JI, Barton MK. A member of the knotted class of homeodomain proteins encoded by the STM gene of Arabidopsis. Nature 1996 ; 379 : 66-9. 12. Long JA, Barton MK. The development of apical embryonic pattern in Arabidopsis. Development 1998 ; 125 : 3027-35.

Conclusions
Nous avons prsent les principales donnes gntiques, biochimiques et cellulaires qui dcrivent lorganisation et le fonctionnement du mristme apical. Des facteurs spcifiques des diffrents domaines du mristme, ainsi que les premiers lments de leurs interactions (figure 4) ont t identifis. En outre, limportance des communications intercellulaires, ncessaires au maintien dune structure mristmatique organise, a t mise en vidence. Ces rseaux fonctionnels, relay s par diff rents signaux, doivent interagir avec les mcanismes impliqus dans la morphogense cellulaire, comme le montrent la modulation spatiale (et temporelle) fine de la prolifration et de lexpansion des cellules observe par lanalyse histologique classique du mristme et des primordiums. Cette question des consquences du comportement cellulaire sur le comportem/s n 8-9, vol. 17, aot-septembre 2001

843

RFRENCES
28. Endrizzi K, Moussian B, Haecker A, Levin JZ, Laux T. The shoot meristemless gene is required for maintenance of undifferentiated cells in Arabidopsis shoot and floral meristems and acts at a different regulatory level than the meristem genes wuschel and zwille. Plant J 1996 ; 10 : 967-79. 29. Waites R, Selvadurai HR, Oliver IR, Hudson A. The phantastica gene encodes a MYB transcription factor involved in growth and dorsoventrality of lateral organs in Antirrhinum. Cell 1998 ; 93 : 779-89. 30. Timmermans MCJ, Hudson A, Becraft PW, Nelson T. rough sheath2 : a myb protein that represses knox homeobox genes in maize lateral organ primordia. Science 1999 ; 284 : 151-6. 31. Byrne ME, Barley R, Curtis M, et al. Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis. Nature 2000 ; 408 : 967-71. 32. Mizukami Y, Fischer R. Plant organ size control : aintegumenta regulates growth and cell numbers during organogenesis. Proc Natl Acad Sci USA 2000 ; 97 : 942-7. 33. Lee I, Wolf DS, Nilsson O, Weigel D. A leafy co-regulator encoded by unusual flower organs. Curr Biol 1997 ; 7 : 95-104. 34. Aida M, Ishida T, Tasaka M. Shoot apical meristem and cotyledon formation during Arabidopsis embryogenesis : interactions among the cup-shaped cotyledon and shoot meristemless genes. Development 1999 ; 126 : 1563-70.

35. Vernoux T, Kronenberger J, Grandjean O, Laufs P, Traas J. pin-formed 1 regulates cell fate at the periphery of the shoot apical meristem. Development 2000 ; 127 : 5157-65. 36. Weigel D, Meyerowitz EM. The ABCs of floral homeotic genes. Cell 1994 ; 78 : 203-9. 37. Stewart RN, Dermen H. Flexibility in ontogeny as shown by the contribution of the shoot apical layers to leaves of periclinal chimeras. Am J Bot 1975 ; 62 : 935-47. 38. Van den Berg C, Willemsen V, Hage W, Weisbeek P, Scheres B. Cell fate in Arabidopsis root meristem determined by directional signalling. Nature 1995 ; 378 : 62-5. 39. Rinne PLH, Van der Schoot C. Symplastic fields in the tunica of the shoot apical meristem coordinate morphogenetic events. Development 1998 ; 125 : 1477-85. 40. Lucas WJ, Bouch-Pillon S, Jackson DP, et al. Selective trafficking of knotted1 homeodomain protein and its mRNA thourgh plasmodesmata. Science 1995 ; 270 : 1980-4. 41. Hantke SS, Carpenter R, Coen ES. Expression of floricaula in single cell layers of periclinal chimeras activates downstream homeotic genes in all layers of floral meristems. Development 1995 ; 121 : 27-35.

Summary
Plant stem cells organisation and function : the shoot apical meristem in Arabidopsis Shoot development in higher plants is characterised by continuous organ formation from groups of stem cells established during embryogenesis : the shoot apical meristem. The shoot meristem must maintain a central population of dividing cells and allow cell differentiation in lateral organs. The existence of distinct functional domains corresponding to these two roles has been postulated from extensive histological studies of the shoot meristem. During the last decade, genetic analysis performed in Arabidopsis lead to the identification of several mutants affected in the different meristem functions. Cloning and expression pattern studies of the corresponding genes have confirmed and elaborated the classical models of meristem cells organisation. Based on the meristem regulators interactions and on cell-cell communication mechanisms instrumental in meristem function, the first basis in the understanding of the dynamic of these highly ordered structures can be drawn.

TIRS PART
J. Traas.

844

m/s n 8-9, vol. 17, aot-septembre 2001