UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA QUMICA

JANAINA DUARTE BAUMER

SIANNAH MARIA MAS DIEGO


ESTGIO EM DOCNCIA


PROF. AGENOR FURIGO JR.











Florianpolis
2008

SUMARIO

1.Introduo .............................................................................................................................3
2. Histrico ..............................................................................................................................3
3. Propriedades Gerais ..........................................................................................................4
3.1 A maioria das enzimas so protenas...........................................................................5
3.2 Diferenas entre enzimas e catalisadores qumicos .................................................5
3.3 Nomenclatura das enzimas ............................................................................................6
3.4 Especificidade ..................................................................................................................8
3.5 Mecanismo de ao de uma enzima............................................................................9
4. Reaes Catalisadas por Enzimas............................................................................... 10
5. Fatores que Influenciam a Ao Enzimtica................................................................ 12
5.1 pH..................................................................................................................................... 12
5.2 Temperatura ................................................................................................................... 12
5. 3 Concentrao da Enzima ........................................................................................... 13
5.4 Concentrao do Substrato......................................................................................... 13
6. Inibio enzimtica.......................................................................................................... 14
6.1Inibio Reversvel ......................................................................................................... 15
6.2 Inibio Reversvel Competitiva.................................................................................. 16
6.3 Inibio Reversvel No Competitiva ......................................................................... 15
6.4 Inibio Irreversvel ....................................................................................................... 16
7. Co-fatores e Coenzimas................................................................................................. 17
7.1 As coenzimas devem ser regenaradas ..................................................................... 17
8. Regulao da Atividade Enzimtica............................................................................. 17
9. Medida de atividade enzimtica.................................................................................... 18
10. Produo industrial de enzimas.................................................................................. 19
11. Referencias Bibliogrficas ........................................................................................... 23







1. Introduo

Os sistemas vivos so formados por uma enorme variedade de reaes
bioqumicas, e quase todas elas so mediadas por uma srie de
extraordinrios catalisadores biolgicos conhecidos como enzimas. A funo
da enzima viabilizar a atividade das clulas, quebrando molculas ou
juntando-as para formar novos compostos.
As enzimas so protenas (com exceo de um pequeno grupo de molculas
de RNA) especializadas em catalisar reaes biolgicas, ou seja, aumentam a
velocidade de uma reao qumica sem interferir no processo. Elas esto
associadas a biomolculas, devido as sua extraordinria especificidade e poder
cataltico.

2. Histrico

A atividade cataltica de enzimas tem sido utilizada pelo homem h
milhares de anos, em processos tais como fermentao do suco de uva para
obteno do vinho, fabricao de queijo e po. No entanto, estas eram apenas
aplicaes prticas, uma vez que o conhecimento do modo de ao dos
catalisadores biolgicos s recentemente foi elucidado.
- 1833 - A primeira hidrlise enzimtica do amido
Os cientistas franceses Payen e Persoz isolaram um complexo
enzimtico do malte que catalisava a transformao do amido em glicose,
denominando-o "diastase" do grego "separar") porque separava os blocos de
amido em unidades individuais de glicose. a primeira vez que foi isolado uma
enzima, um composto orgnico que apresentava as propriedades de um
catalisador. O sufixo ase de diastase passou a ser usado para designar as
enzimas.
- 1835 - o qumico sueco Berzelius descreveu a primeira hidrlise enzimtica
do amido.
O sueco Jons Jacob Berzelius demonstrou que o amido pode ser mais
eficientemente decomposto usando-se extrato de malte preferencialmente ao
cido sulfrico e cunhou o termo catlise, foi o primeiro a notar que certas
substncias aceleram uma reao.
- 1836 - Theodor Schwann descobre a enzima digestiva Pepsina
- 1860 - Debate: Qual o papel da levedura no processo de fermentao?
Pasteur, em 1860, demonstrou atravs de uma srie de experimentos
que a fermentao alcolica s ocorria em presena de clulas vivas de
levedura. Na mesma poca, Liebig defendia que os processos fermentativos
eram reaes qumicas.
1897 - A polmica foi resolvida. Os irmos Buchner demonstraram que
um extrato de levedura livre de era capaz de fermentar o acar do mesmo
modo que a clula de levedura. Isto significava que o extrato continha
catalisadores da fermentao alcolica, o que tornava possvel estudar in
vitro reaes qumicas da fermentao.
- 1878 - William Kuhne props que o nome enzima fosse utilizado, a palavra
em si significa 'na levedura'.
- 1894 - Primeira produo comercial de alimentos com enzimas. Nos EUA, o
bioqumico e lder industrial japons Dr. Jokichi Takamine comeou a produo
comercial de koji a partir do fungo Aspergillus.
- 1894 - Cientistas definem a teoria Fechadura e Chave
- 1913 - Michaelis e Lyn descreveu cintica enzimtica matematicamente.
- 1914 - lanado o primeiro detergente compacto
- 1926 - Cientistas descobrem que as enzimas so protenas
- 1926 James Summers isolou e cristalizou a primeira enzima, a urease.
- A partir 1960 - A evoluo no estudo das enzimas, acompanhado por
avanos tecnolgicos, possibilitou o isolamento e a identificao de
propriedades das enzimas. Desde ento, vem sendo feita a caracterizao e o
estudo cintico de milhares de enzimas de diferentes fontes: animais, vegetais
e de microrganismos.
- 1986 - A primeira enzima a partir de organismo geneticamente modificado
(OGM).

3. Propriedades Gerais



3.1 A maioria das enzimas so protenas

Com exceo de um pequeno grupo de molculas de RNA que
apresentam atividade cataltica, todas as enzimas so protenas.
Protenas so molculas compostas por aminocidos, unidos por
ligaes peptdicas. Os aminocidos apresentam em sua frmula qumica um
grupo carboxlico (-COOH), um grupo amino (-NH2) e um radical R. Os
aminocidos so diferenciados de acordo com o grupo R ligado ao carbono
assimtrico. Na natureza, so encontrados 20 aminocidos.
A atividade cataltica das protenas depende da integridade da sua
conformao protica nativa. Se uma enzima desnaturada ou dissociada em
subunidades, a atividade cataltica geralmente destruda. Se uma enzima
quebrada em seus aminocidos constituintes, a sua atividade cataltica
sempre destruda. Assim, a estrutura protica primria, secundria, terciria e
quaternria das enzimas so essenciais para sua atividade cataltica.
As enzimas como outras protenas tem pesos moleculares que variam
de cerca de 12.000 at mais de 1 mi lho.

3.2 Diferenas entre enzimas e catalisadores qumicos

As enzimas diferem-se dos catalisadores qumicos comuns em vrios
aspectos:
- Velocidade de reao mais rpida: as velocidades de reaes catalisadas por
enzimas so tipicamente 10
6
a 10
12
vezes maiores do que as reaes
correspondentes no catalisadas, e so no mnimo, varias ordens de
magnitude maiores do que as mesmas reaes catalisadas quimicamente.
- Condies reacionais mais brandas: as reaes catalizadas enzimaticamente
ocorrem em condies brandas: temperaturas inferiores a 100 C, presso
atmosfrica e pH quase neutro. Em contraste, geralmente uma catlise qumica
eficiente requer temperaturas e presso elevadas, assim como pH extremos.
- Maior especificidade da reao: as enzimas apresentam um grau de
especificidade imensamente maior do que os catalisadores qumicos em
relao a identidade dos seus substratos e dos seus produtos; isto , as
reaes enzimticas raramente produzem subprodutos. Diante de vrias rotas
potencialmente possveis, a enzima escolhe a com menor energia livre de
ativao.
- Capacidade de regulao: as atividades catalticas de muitas enzimas variam
em resposta s concentraes de outras substancias que no os seus
substratos. Os mecanismos desses processos regulatrios incluem o controle
alostrico, a modificao covalente de enzimas e a variao nas quantidades
de enzimas sintetizadas. Permite o ajuste fino do metabolismo em diferentes
condies fisiolgicas.

3.3 Nomenclatura das enzimas

As enzimas so comumente denominadas adicionando-se o sufixo ase
ao nome do substrato da enzima ou a uma expresso que descreva a sua ao
cataltica. Desse modo a urase catalisa a hidrolise da uria, e a lcool-
desidrogenase catalisa a oxidao de alcois em seus aldedos
correspondentes. Entretanto, o fato de no inicio no haver regras para a
nomenclatura das enzimas acabou gerando confuses, resultando na utilizao
de dois nomes diferentes para uma mesma enzima, ou ainda, a utilizao do
mesmo nome para duas enzimas diferentes. Alm disso, muitas enzimas, como
a catalase (que intermedeia a dismutacao de H
2
O
2
em H
2
O e O
2
) tinham
nomes que no ofereciam qualquer indicao da sua funo. Em esforo para
eliminar tal confuso e providenciar regras para a denominao racional do
crescente numero de enzimas descobertas, um esquema de classificao
funcional sistemtica e de nomenclatura de enzimas foi adotado pela
International Union of Biochemistry and Molecular Biology.
As enzimas so classificadas de acordo com a natureza da reao
qumica que catalisam. H seis classes principais de reaes enzimticas,
assim como subclasses e sub-subclasses. Para cada enzima so atribudos
dois nomes e um numero de classifio de quatro subdivises. O nome
alternativo conveniente para o uso rotineiro e , em geral, um nome trivial
utilizado anteriormente. O nome sistemtico utilizado para minimizar
ambiquidades; o nome do(s) seu(s) substrato(s) seguido por uma palavra
terminada em ase que especifica o tipo de reao que, de acordo com seu
grupo de classificao principal, a enzima cataliza. Por exemplo a enzima cujo
nome recomendado carboxipeptidase A possui nome sistemtico peptidil-L-
aminocido-hidrolase e nmero de classificao EC 3.4.17.1 (EC a
abreviatura de Enzyme Comission).

Classificao das Enzimas Segundo a Comisso de Enzimas
1. Oxido-redutases (reaes de oxidao-reduo ou transferncia de
eltrons Desidrogenases e Oxidases)
1.1.atuando em CH-OH
1.2.atuando em C=O
1.3.atuando em C=O-
1.4.atuando em CH-NH
2

1.5.atuando em CH-NH-
1.6.atuando em NADH, NADPH
2.Transferases (transferem grupos funcionais como amina, fosfato, acil,
carboxil Quinases e Transaminases)
2.1.grupos com um carbono
2.2.grupos aldedo ou cetona
2.3.grupos acil
2.4.grupos glicosil
2.7.grupos fosfatos
2.8.grupos contendo enxfre
3.Hidrolases (reaes de hidrlise de ligao covalente - Peptidases)
3.1.steres
3.2.ligaes glicosdicas
3.4.ligaes peptdicas
3.5.outras ligaes C-N
3.6.anidridos cidos
4.Liases (catalisam a quebra de ligaes covalentes e a remoo de
molculas de gua, amnia e gs carbnico Dehidratases e
Descarboxilases)
4.1. =C=C=
4.2. =C=O
4.3. =C=N-
5.Isomerases (reaes de interconverso entre ismeros ticos ou
geomtricos - Epimerases)
5.1.racemases
6.Ligases (catalisam reaes de formao de novas molculas a partir
da ligao entre duas pr-existentes, sempre s custas de energia -
Sintetases)
6.1. C-O
6.2. C-S
6.3. C-N
6.4. C-C



3.4 Especificidade

Existe uma correlao entre a estrutura das protenas ou peptdeos que
fazem parte da molcula enzimtica e suas propriedades biolgicas, e esta
propriedade leva a uma especificidade extraordinariamente alta e reproduzvel.
Provavelmente apenas uma frao da molcula, denominada stio ativo, a
responsvel pela ligao da enzima ao substrato ou substratos, e essa frao
determinaria a especificidade enzimtica.
A especificidade das enzimas varia muito de uma enzima para outra,
sendo muito baixa para algumas enzimas e muito alta para outras. chamada
especificidade baixa, quando esta relao existe apenas em relao a tipos de
ligao, como certas peptidases (ligaes peptdicas), fosfatases (ligaes
fosfato-ster) e estearases (ligaes carboxi-ster, podendo-se citar a lipase
que hidrolisa as ligaes cido-lcool de quase todos os steres orgnicos). A
especificidade baixa mais comumente encontrada em enzimas degradativas,
mas raramente encontrada em enzimas biosintticas. Um conjunto
intermedirio de enzimas apresenta especificidade de grupo, como as
hexoquinases, que catalisam a fosforilao de uma variedade de acares
contanto que sejam aldohexoses. A especificidade absoluta, o tipo de
especificidade exclusiva, isto , quando uma enzima atua somente sobre um
determinado composto, como a urease que hidrolisa a uria, mas nenhum de
seus derivados, ou a tripsina, que hidrolisa apenas ligaes peptdicas
formadas por grupos carboxlicos dos aminocidos bsicos. Esta enzima de
importncia extraordinria na determinao da seqncia de aminocidos em
protenas.
Outro aspecto importante da especificidade das enzimas a sua
estereo- especificidade com relao ao substrato. Uma enzima pode ter uma
especificidade tica em relao aos ismeros D e L dos aminocidos. A
maioria das enzimas hidrolisa apenas ligaes peptdicas de L-aminocidos, o
que deveria ser esperado, j que as protenas enzimticas so constitudas
por L-aminocidos e tem conformaes determinadas.
As foras no covalentes por meio das quais substratos e outras molculas se
ligam as enzimas so similares em carter s forcas que regem a conformao
das prprias protenas. Ambas envolvem foras de Van der Waals, interaes
eletrostticas, pontes de hidrognio e interaes hidrofbicas
Em geral, o sitio de ligao do substrato consiste de um entalhe ou
sulco na superfcie de uma enzima, complementar ao formato dos substratos
(complementaridade geomtrica). Alm disso, os resduos de aminocidos que
formam o sitio de ligao esto organizados de modo a formar interaes de
atrao especificamente com os substratos (complementaridade eletrnica). As
molculas que se diferem do substrato no formato ou na distribuio de grupos
funcionais no podem ligar-se produtivamente enzima.

3.5 Mecanismo de ao de uma enzima

A reao enzimtica ocorre em duas etapas:
(1) S + E ES* (etapa reversvel)
(2) ES E + P (etapa irreversvel)
* complexo enzima-substrato

Alguns modelos foram propostos para explicar o tipo de ligao
estabelecida entre enzima e substrato. Emil Fischer desenvolveu no sculo
passado o conceito de especificidade enzimtica, estabelecendo que existe
uma relao estrica entre enzima e substrato. Em 1894 enunciou a sua teoria
na qual a especificidade enzimtica comparada a um conjunto de chave e
fechadura onde a chave, neste caso o substrato, deve se ajustar fechadura,
neste caso a enzima (figura 1). Assim, cada enzima agiria sobre um nmero
muito limitado de compostos.


Figura 1: Representao esquemtica do modelo proposto por Fischer



Figura 2: Representao esquemtica do modelo do encaixe induzido de
Koshland.

A hiptese de Koshland, mais moderna, da enzima flexvel ou do
encaixe induzido considera que o stio ativo no precisa preexistir sob uma
forma geomtrica rgida, devendo contudo existir um arranjo espacial preciso e
especfico dos grupamentos R (cadeia lateral) dos aminocidos, arranjo esse
que induzido pelo contato com o substrato (figura 2).
Estudos por raio X indicam que os stios de ligao aos substratos da
maioria das enzimas so, em grande parte, pr-formados, mas sofrem
mudanas conformacionais no momento da ligao do substrato (um fenmeno
denominado ajuste induzido).

4. Reaes Catalisadas por Enzimas

Para reagir, as molculas presentes em uma soluo devem colidir com
orientao apropriada e com a quantidade de energia que lhes permitam
formar o complexo ativado, denominado estado de transio que representa
os reagentes em seu estado ati vado. Para atingir o estado de transio,
necessita-se de uma quantidade de energia definida como energia de ativao
(E a) ou mais comum em bioqumica energia livre de ativao, ?G+ (o
smbolo (+ ) indica o processo de ativao). Sob condies fisiolgicas, a
velocidade das reaes pode ser aumentada pela reduo da energia livre de
ativao conseguida pela ao de enzimas.
A comparao do perfil energtico das reaes catalisadas e no-
catalisadas mostrada na Figura 3 para a reao:
A + B ? C + D
No grfico, o estado de transio corresponde ao ponto de mais alta
energia da reao no-catalisada e a medida da energia livre de ativao,
?G+ . Ou ainda, ?G+ a energia livre do estado de transio subtrada da
energia livre dos reagentes. No complexo ativado (estado de transio do
sistema), os reagentes esto em forma intermediria de alta energia e no
podem ser identificados nem como reagentes nem como produtos. O
complexo do estado de transio pode ser decomposto em produtos ou voltar
aos reagentes.

Figura 3: diagrama energtico de reao catalisada e de reao no catalisada
?G+ = energia livre de ativao. ?G0 = variao de energia livre. A diferena
entre os valores da energia de ativao de uma reao catalisada e de uma
reao no-catalisada, indica a eficincia do catalisador.

A velocidade de uma reao inversamente proporcional ao valor de
sua energia livre de ativao. Quanto maior o valor de ?G+ , menor ser a
velocidade da reao. Os catalisadores aumentam a velocidade da reao
reduzindo a energia livre de ativao. A velocidade de uma reao pode
aumentar na ordem de 10
6
a 10
12
vezes mais do que a reao correspondente
no-catalisada.
Embora a enzima participe da seqncia da reao, ela no sofre
nenhuma transformao. Sendo assim, apenas poucas molculas de E so
capazes de catalisar a converso de milhares de molculas de S a P.
Um catalisador uma substncia que acelera uma reao qumica, at
torn-la instantnea ou quase instantnea, ao diminuir a energia de ativao.
Como catalisadores, as enzimas atuam em pequena quantidade e se
recuperam indefinidamente sem serem consumidas. No levam a cabo
reaes que sejam energeticamente desfavorveis, no afetam o ?G (energia
livre de Gibbs) e no modificam o sentido dos equilbrios qumicos.

5. Fatores que Influenciam a Ao Enzimtica

5.1 pH

Ao comprovar experimentalmente a influncia do pH na velocidade das
reaes enzimticas se obtm curvas que indicam que as enzimas
apresentam um pH timo de atividade. O pH pode afetar de vrias maneiras:
- O stio ativo pode conter aminocidos com grupos ionizados que podem
variar com o pH.
- A ionizao de aminocidos que no esto no stio ativo pode provocar
modificaes na conformao da enzima.
- O substrato pode ver-se afetado pelas variaes do pH.
As enzimas possuem grupos qumicos ionizveis (carboxilas COOH;
amino NH2; tiol SH; imidazol, etc) nas cadeias laterais de seus
aminocidos. Segundo o pH do meio, estes grupos podem ter carga eltrica
positiva, negativa ou neutra. Como a conformao das protenas depende, em
parte, de suas cargas eltricas, haver um pH no qual a conformao ser a
mais adequada para a atividade cataltica. Este o chamado pH timo.
Ligeiras mudanas de pH podem provocar a desnaturao da protena.
Algumas enzimas apresentam variaes peculiares. A pepsina do estmago
apresenta um timo de atividade a pH = 2, e a fosfatase alcalina do intestino a
pH = 12.

5.2 Temperatura

A temperatura influi na atividade e o ponto timo representa o mximo
de atividade. A temperaturas baixas, as enzimas encontram-se muito rgidas e
quando se supera um valor considervel (maior que 50C) a atividade cai
bruscamente porque, como protena, a enzima se desnatura.
Em geral, os aumentos de temperatura aceleram as reaes qumicas:
a cada 10C de aumento, a velocidade de reao se duplica. As reaes
catalisadas por enzimas seguem esta lei geral. Entretanto, sendo protenas, a
partir de certa temperatura, comeam a desnaturar-se pelo calor. A temperatura
na qual a atividade cataltica mxima chama-se temperatura tima. Acima
desta temperatura, o aumento de velocidade da reao devido a temperatura
compensado pela perda de atividade cataltica devido a desnaturao trmica, e
a atividade enzimtica decresce rapidamente at anular-se.

5.3 Concentrao da Enzima

A velocidade mxima da reao uma funo da quantidade de enzima
disponvel. Assim, a velocidade inicial da reao enzimtica diretamente
proporcional concentrao de enzima (existindo substrato em excesso)
(Figura 4).
Figura 4: Efeito da concentrao da enzima sobre a velocidade inicial (V0). A
concentracao do substrato esta acima da necessria para atingir a velocidade
mxima.

5.4 Concentrao do Substrato


Para atender as necessidades do organismo, as reaes bioqumicas
devem ocorrer em velocidade compatvel. A velocidade de uma reao
bioqumica expressa em termos de formao de produto ou pelo consumo
do reagente por unidade de tempo.
Inicialmente a velocidade da reao diretamente proporcional a
concentrao do reagente A. O processo exibe cintica de primeira ordem
(Figura 5). Quando a adio de mais reagente no aumenta a velocidade, a
reao exibe cintica de ordem zero (Figura 5). A velocidade passa a ser
constante porque no depende mais da concentrao dos reagentes, mas de
outros fatores. A quantidade de reagente o suficiente grande para saturar
todos os stios catalticos das molculas enzimticas. Assim, o reagente s
existe na forma de complexos enzima-substrato (ES). Como a curva
velocidade-substrato hiperblica, a fase de ordem zero atinge uma
velocidade mxima.

Figura 5: efeito da concentrao de substrato sobre a velocidade inicial V0 em
reaes catalisadas por enzimas.

6. Inibio enzimtica

Muitas substncias alteram a atividade de uma enzima associando
reversivelmente a ela, de forma a influenciar a ligao do substrato e/ou seu
numero de reciclagem. As substncias que reduzem a atividade de uma
enzima so conhecidas como inibidores. Grande parte do arsenal farmacutico
moderno constitudo por inibidores enzimticos (Por ex. tratamento da AIDS
feito quase exclusivamente com drogas que inibem a atividade de certas
enzimas virais.
Os inibidores podem ser classificados em reversveis competitivos e no
competitivos ou irreversveis.

6.1 Inibio Reversvel

Neste tipo de inibio, a atividade enzimtica recuperada com a
remoo do inibidor.

6.2 Inibio Reversvel Competitiva

Uma substncia que compete diretamente com o substrato normal pelo
sitio de ligao de uma enzima. Esse inibidor normalmente semelhante ao
substrato, de modo que se liga especificamente ao sitio ativo, mas difere do
substrato por no poder reagir com ele.
O inibidor liga-se enzima formando o complexo EI cataliticamente
inativo.

6.3 Inibio Reversvel No Competitiva

Na inibio no-competitiva, o inibidor liga-se diretamente a enzimas ou
ao complexo enzima-substrato. Esta ligao pode distorcer a enzima tornando
o processo cataltico ineficiente.


O inibidor no competitivo pode ser uma molcula que no se
assemelha com o substrato, mas apresenta uma grande afinidade com a
enzima.

6.4 Inibio Irreversvel

A inibio irreversvel ocorre quando o inibidor liga-se to fortemente
enzima que a dissociao muito lenta. Podem destruir grupos funcionais que
so essenciais para a atividade enzimtica. A enzima no retoma a sua
atividade normal.
Ex.: Inibio dos gases neurovenenosos e inseticidas organofosforados
na acetilcolinesterase (enzima importante na transmisso dos impulsos
nervosos).

7. Co-fatores e Coenzimas

Algumas enzimas como a quimotripsina (enzima que hidrolisa protena)
ou triosefosfato isomerase so ativas sem necessitar a presena de outro fator.
No entanto, quase um tero das enzimas conhecidas requerem um componente
no protico para sua atividade, denominado cofator.
Os co-fatores podem ser ons metlicos, como o Cu2+, o Fe3+ ou o
Zn2+. A natureza essencial de tais co-fatores explica por que razo os
organismos necessitam de quantidades diminutas de certos elementos nas
suas dietas. Isso tambm explica, em parte, os efeitos txicos de certos metais
pesados. Por exemplo, o Cd2+ e o Hg2+ podem substituir o Zn2+ (todos se
encontram no mesmo grupo na tabela peridica) nos stios ativos de certas
enzimas, incluindo a RNA-polimerase, tornando, desse modo, essas enzimas
inativas.
Os co-fatores tambm podem ser molculas orgnicas, conhecidas
como co-enzimas, tal como o NAD+ na YADH. Alguns co-fatores (p.ex., o
NAD+) so apenas temporariamente asssociados com uma dada molcula
enzimtica, de maneira que elas funcionam como co-substratos. Outros co-
fatores, conhecidos como grupos protticos, esto permanentemente
associados com suas protenas, em geral por meio de ligaes covalentes. Por
exemplo, o grupo prosttico heme do citocromo c fortemente ligado a essa
protena por uma extensa rede de interaes hidrofbicas e pontes de
hidrognio junto com ligaes covalentes entre o heme e as cadeias laterais
especificas da protena.
Um complexo enzima-co-fator cataliticamente ativo chamado de
holoenzima. A protena enzimaticamente inativa resultante da remoo do co-
fator da holoenzima chamada de apoenzima; ista ,
Apoenzima (inativa) + cofator ? holoenzima (ativa)

7.1 As coenzimas devem ser regenaradas

As coenzimas so quimicamente modificadas pelas reaes enzimticas
em que participam. Na reao da YADH, por exemplo, o NAD+ reduzido a
NADH. A fim de complementar o ciclo cataltico, a coenzima deve retornar ao
seu estado original (no exemplo da YADH, o NADH deve ser reoxidado a
NAD+).

8. Regulao da Atividade Enzimtica

Um organismo deve poder regular as atividades catalticas de suas
enzimas para que ele possa coordernar seus processos metablicos,
responder s mudanas no meio, crescer e diferenciar-se, tudo de maneira
ordenada. H duas maneiras pelas quais isso pode ocorrer:
1. Controle da disponibilidade da enzima. A quantidade de uma dada
enzima em uma clula depende da sua velocidade de sntese e da sua
velocidade de degradao. Cada uma dessas velocidades diretamente
controlada pela clula e esta sujeita a mudanas drsticas em perodos
que vo de minutos (em bactrias) at horas (em organismos
superiores).
2. Controle da atividade da enzima. A atividade cataltica de uma enzima
pode ser diretamente regulada por meio de alteraes estruturais que
influenciem a afinidade da ligao do substrato enzima. A afinidade de
ligao do substrato a uma enzima pode, de modo semelhante, variar
com a ligao de pequenas molculas, chamadas efetores alostricos.
Os mecanismos alostricos podem ocasionar grandes alteraes da
atividade enzimtica, tanto aumentando, como diminuindo a atividade.
Um modelo muito comum de regulao alostrica a inibio por "feed-
back", onde o prprio produto da reao atua como modulador da
enzima que a catalisa.

9. Medida de atividade enzimtica

As medidas de concentrao, expressas em unidades de massa por
unidades de volume no tem aplicao para solues enzimticas, j que o
que importa no a massa, mas a atividade. Uma soluo de enzimas
desnaturadas conserva a massa protica mas a propriedade cataltica est
perdida. Desnaturaes parciais podem levar duas solues de mesma
concentrao enzimtica a ter atividades muito diferentes.
Em virtude disto, a dosagem de enzimas sempre feita atravs da
medida de sua atividade, que avaliada pela velocidade da reao que a
enzima cataliza. Dada a especificidade das enzimas, essa medida possvel,
mesmo na presena de outras protenas. Para efetuar essas dosagens, uma
amostra da soluo contendo a enzima incubada com concentraes altas de
substratos (para garantir a velocidade mxima e impedir que pequenas
variaes na concentrao do substrato possam afetar as medidas). A
velocidade da reao medida e expressa em Unidades Internacionais. Uma
Unidade Internacional (U) a quantidade de enzima capaz de formar 1mol de
produto por minuto em condies timas de medida (pH, temperatura, etc.),
especificadas para o caso.
A medida da atividade enzimtica imprescindvel para monitorar a
purificao de uma enzima.
A atividade especfica o nmero de Unidades de enzima por
miligramas de protena. Portanto se a etapa de purificao for bem sucedida a
atividade especfica encontrada deve aumentar. Esse aumento significa que o
procedimento adotado eliminou protenas indesejveis.
A concentrao de produtos aumenta linearmente com o tempo num
dado intervalo (velocidade constante). No entanto, a partir de certo tempo, a
velocidade (valor da tangente curva num dado instante) decresce. Vrios
fatores podem contribuir para este decrscimo: diminuio da concentrao de
substrato, inativao parcial da enzima no decorrer da reao, inibio por
produto e deslocamento do equilbrio se a reao for reversvel. Para evitar a
influencia destes fatores costuma-se associar a atividade medida da
velocidade de reao em condio inicial, ou seja, aquela que assegura
velocidade constante.
A escolha de um mtodo para a determinao da atividade de uma
enzima produzida por fermentao requer conhecimento prvio da faixa de
concentrao enzimtica que permite obter uma variao linear da
concentrao de produto (ou substrato) com o tempo. Podem ser usados
mtodos variados para avaliar a acriacao das concentraes das espcies.
Alguns deles so muito diretos (espectrofotometria, fluorimetria, titulometria) e
outros menos (medida da viscosidade).

10. Produo industrial de enzimas

A produo de enzimas em escala industrial se faz majoritariamente por
fermentao submersa, embora nos pases orientais haja uma tradio
estabelecida de utilizao da fermentao semi-slida.
Um dos processos mais importantes prvios fermentao o preparo
do inoculo. Pode-se partir de um cultivo em frasco agitado, inoculado com a
cultura estoque liofilizada. Decorrido o tempo suficiente, essa cultura
inoculada no fermentador principal. A quantidade de inoculo pode variar de 1 a
10% (p/v) e a produo da enzima pode ser afetada por esse parmetro.

Fonte
As enzimas podem ser obtidas de animais (amilase pancretica, lpase
pancretica, pancreatina, pepsina, quimosina), vegetais (a-amilase, -amilase,
bromelina, ficina, papana) e microrganismos [a) enzimas amilolticas: Bacillus
subtilis, Aspergillus oryzae, A.niger, A.flavus, A.awamori; b) glicoseoxidase:
A.niger, Penicillium amagasakiense, P.notatum; c) lactase: Saccharomyces
fragilis, Zygosaccharomyces lactis; d) lpase: A.niger, Rhysopus sp; e)
proteases: B.subtilis, A.oryzae, A.flavus, A.niger, Endothia parastica, Mucor
pusillus.



O processo fermentativo
A linhagem microbiana utilizada industrialmente , em geral, fruto de um
longo trabalho de melhoramento e, portanto, sigilosamente protegida. Sendo
que os cuidados de estocagem e manuteno so muito importantes para a
reproduo dos resultados.
Os meios de cultivo so formulados atravs da utilizao de compostos
quimicamente conhecidos (meios sintticos) ou de matrias-primas naturais.
Os meios devem conter fontes de carbono e energia, fontes de nitrognio,
substncias minerais e fatores de crescimento. Os meios de cultivo so, em
geral, resultado de um processo de otimizao. A influncia de certos
componentes do meio na produo da enzima-alvo pode ser muito significativa.
A composio dos meios de cultivo usados industrialmente tambm
sigilosamente guardada.
A fermentao industrial conduzida em fermentadores mecanicamente
agitados. A produo de enzimas geralmente ocorre em fermentadores com
capacidade de 10.000 a 100.000 litros, operados de modo descontinuo
(batelada). Tais fermentadores so munidos de camisas ou serpentinas
internas para as necessidades de aquecimento e refrigerao e de sistemas de
medidas (sensores de pH, temperatura, oxignio dissolvido e espuma). As
fermentaes em batelada para produo de enzimas tem durao da ordem
de 30 a a150 horas.

Processo a jusante (downstream) da fermentao
As operaes que se seguem ao processo fermentativo dependem da
localizao da enzima de interesse (intra ou extracelular).

Etapas iniciais de separao e concentrao
No caso de enzimas extracelulares, ao trmino do processo
fermentativo, o caldo resfriado a cerca de 5C, para assegurar condies de
estabilidade do produto e evitar o crescimento de microrganismos
contaminantes. O pH geralmente ajustado para o valor timo de atuao da
enzima produzida.
A separao das clulas pode ser feita por centrifugao ou filtrao.
A soluo clarificada contendo a enzima de interesse deve ser
concentrada. A concentrao pode ser feita por ultrafiltrao (utilizando a
tecnologia de processos com membranas) ou por evaporao a vcuo
(conduzida a temperaturas inferiores a 35C.
Esta soluo concentrada diluda a nveis convenientes e acondiciona
com estabilizantes da atividade enzimtica pode ser embalada para
comercializao.
No caso das enzimas intracelulares, a separao da biomassa celular j
fornece um alto fator de concentrao da enzima. A biomassa, em geral, obtida
por centrifugao, lavada e as clulas so rompidas. Diversas tcnicas
podem ser usadas nessa operao: moagem com esferas de vidro,
homogeneizao em alta presso (ruptura proporcionada pelo bombeamento
em alta presso da suspenso contra uma vlvula de descarga que dispe de
um pequeno orifcio para passagem do fluido), sonificao, congelamento,
tratamentos qumicos (como solues de soda caustica tem aplicao muito
limitada pois a enzima deve ser tolerante a valores elevados de pH) e
enzimticos.
A ruptura das clulas libera inmeras substncias para o meio aquoso.
A precipitao dos cidos nuclicos um procedimento necessrio.
Essa precipitao pode ser feito com sais de Mn (II). Deve-se escolher uma
agente que no precipite a enzima de interesse ou provoque sua desativao.
o sobrenadante pode ser clarificado por filtrao e concentrado por
ultrafiltrao ou evaporao a vcuo.

Purificao e acabamento
A partir da obteno do concentrado enzimtico as operaes de
processamento no se diferenciam quanto natureza da enzima, mas quanto a
forma de apresentao (solida ou liquida) e o grau de pureza desejado.
A soluo concentrada e diluda a nveis convenientes pode ser um
produto comercializvel. Ou pode ser prefervel a obteno de um produto na
forma slida. Nesse caso o produto deve ser seco a vcuo ou por atomizao
(spray drying). O produto final no pode apresentar baixa granulometria, pois
h riscos de gerao de poeiras, que podem provocar problemas de sade
para os trabalhadores que o manuseiam. Deve proceder-se peletizacao ou
aglomerao desse material slido, para obter partculas maiores, na faixa de
200 a 500 m. para padronizao da atividade enzimtica misturam-se
quantidade apropriadas de material slido inerte.
Quando pretende-se obter uma preparao enzimtica com maior grau
de pureza deve submeter-se a uma srie de tcnicas de fracionamento e
purificao.
A adio de sais como o sulfato de amnia (NH
4
)
2
SO
4
provoca a
precipitao de molculas proticas, ento a realizada centrifugao para
obter as molculas proticas. A precipitao pode ser feita tambm com
solventes (etanol, metanol) embora deve-se tomar cuidado para no provocar a
desnaturao das protenas. Outras tcnicas para separao de protenas
consistem na utilizao de membranas como ultrafiltracao, microfiltracao e
osmose inversa.
Quando busca-se um alto grau de pureza do produto, tcnicas
cromatogrficas so empregadas, como a cromatografia de troca inica que se
baseia na carga das molculas, a cromatografia de partio ou de filtrao em
gel, baseada no tamanho da molculas, a cromatografia de afinidade baseada
na ligao bio-especfica da enzima com os ligantes, que podem ser substratos
ou inibidores.
A concentrao pode ser obtida das seguintes formas:
- adio de um polmero tipo Sephadex G-25, cujos poros so muito pequenos
para permitir a entrada de molculas grandes. Remove cerca de 70% da gua.
- ultrafiltro: remoo do solvente por uma mebrana semi-permevel no que
permite a passagem da enzima.
- Remoo de gua sob vcuo liofilizao.

Controle de Pureza
O controle da pureza pode ser realizado por eletroforese. A eletroforese
uma tcnica de separao de molculas que envolve a migrao de
partculas com a aplicao de uma diferena de potencial. As molculas so
separadas de acordo com o seu tamanho, forma ou carga. Das muitas tcnicas
existentes para a anlise de protenas (enzimticas ou no), a eletroforese em
gel sem dvida a mais verstil e facilmente aplicvel. A eletroforese to
sensvel que se podem detectar protenas que s diferem em um aminocido
de um total de vrias centenas que as constituem.
O grau de purificao almejado esta relacionado aplicao do produto.
No mercado esto disponveis tanto preparaes pouco purificadas, para uso
tcnico ou industrial, como preparados de alto grau de pureza para uso
analtico ou farmacutico.

11. Referencias Bibliogrficas

AQUARONE, Eugnio; BORZANI, Walter; ALMEIDA LIMA, Urgel de;
SCMIDELL, Willibaldo. Biotecnologia industrial. Volumes 1, 2, 3 e 4.
CHAMPE, Pamela C. & HARVEY, Richard A. - Bioqumica Ilustrada. Artes
Mdicas. Porto Alegre, 1997. pp 126-131.
LEHNINGER, Albert L; NELSON, David L.; COX, Michael M. Principios de
bioquimica. 4. ed. So Paulo: Sarvier, 2006.
STRYER, Lubert. Bioqumica. Rio de Janeiro:Guanabara Koogan,1996.
VOET, Donald; VOET, Judith G. Bioqumica. 3. ed. Porto Alegre: ARTMED,
2006. 1596p.