Documentacin y estandarizacin de la tcnica para la determinacin de fibra en
productos alimenticios para el laboratorio de anlisis de aguas y alimentos de la
Universidad Tecnolgica de Pereira
Daniel Alejandro Silva Montoya
Director:
Carlos Humberto Montoya Navarrete
Universidad Tecnolgica de Pereira Facultad de Tecnologa Escuela de Tecnologa Qumica
Documentacin y estandarizacin de la tcnica para la determinacin de fibra en productos alimenticios para el laboratorio de anlisis de aguas y alimentos de la Universidad Tecnolgica de Pereira
TRABAJO DE GRADO Requisito final para optar al titulo de tecnlogo qumico
Daniel Alejandro Silva Montoya
Director:
Carlos Humberto Montoya Navarrete
UTP Facultad de Tecnologa Escuela de Tecnologa Qumica 2007
AGRADECIMIENTOS
Gracias a la Universidad Tecnolgica de Pereira por las herramientas y fuentes de conocimiento puestas a disposicin para la realizacin de este trabajo, a la escuela de qumica y a sus profesores por la educacin y formacin recibida durante estos aos. Se agradece de forma particular a:
Carlos Humberto Montoya Navarrete: Jefe de laboratorios de la escuela de qumica y docente.
Liliana Bueno: Analista de laboratorio de anlisis de suelos.
As mismo a todas las personas que de una u otra forma contribuyeron en la realizacin de este trabajo.
DEDICATORIA
Al superar una etapa tan importante en mi vida quiero dedicar este logro a:
Mi padre JEHOV y a su hijo JESUCRISTO por que me dieron la oportunidad de estudiar para salir adelante y hacer un sueo realidad al permitirme alcanzar este triunfo.
A mis seres queridos por que me han apoyado siempre en los momentos difciles y a mis amigos y profesores
Daniel
NOTA DE ACEPTACION DE TRABAJO DE GRADO
Documentacin y estandarizacin de la tcnica para la determinacin de fibra en productos alimenticios para el laboratorio de anlisis de aguas y alimentos de la Universidad Tecnolgica de Pereira
Presentado por:
Daniel Alejandro Silva Montoya
Los suscritos director y jurado del presente trabajo de grado, una vez realizada la versin escrita y presenciado la sustentacin oral, decidimos otorgar la nota de:
Con la connotacin:
Para la constancia firmamos en la ciudad de Pereira hoy
3. MARCO REFERENCIAL 4 3.1 Fibra dietaria 4 3.2 Clasificacin de fibra dietaria 4 3.2.1 Fibra soluble 4 3.2.2 Fibra insoluble 5 3.3 Fuentes de fibra soluble e insoluble 5 3.4 Localizacin de los compuestos que forman la fibra dietaria 6 3.5 Composicin qumica 6 3.5.1 Celulosa 6 3.5.2 Hemicelulosa 7 3.5.3 Lignina 8 3.5.4 Pectina 8 3.6 Propiedades y usos de la fibra dietaria 9 3.6.1 La funcin intestinal 10 3.6.2 Los niveles de glucosa en la sangre 10 3.6.3 El colesterol sanguneo 11 3.6.4 El cncer gastrointestinal 11 3.6.5 Otros efectos 11 3.7 Solubilidad y fermentabilidad de la fibra dietaria. 12 3.7.1 Efectos de la fibra insoluble, no fermentable 13 3.7.2 Efectos de la fibra soluble fermentable 13 3.8 Estructura celular 15
4. MARCO TEORICO 17 4.1 Introduccin al anlisis cuantitativo 17 4.1.2 Mtodo gravimtrico 17 4.2 Introduccin a la bromatologa y el anlisis de alimentos 17
4.2.1 Mtodo gravimtrico para determinar humedad 18 4.2.2 Mtodo gravimtrico para determinar cenizas 18 4.2.3 Mtodo para determinar grasa con extraccin por soxhlet 18 4.2.4 Mtodo para determinar fibra bruta 19 4.2.5 Anlisis por micro Kjeldhal para la determinacin de protena 19
5. METODOLOGIA 20
5.1 Descripcin de la muestra 20 5.2 Preparacin de la muestra 20 5.3 Mtodos utilizados 21 5.4 Ensayos adicionales 22 5.5 Estudio estadstico de los resultados 22
6. RESULTADOS Y DISCUSIN 23 6.1 Resultados determinacin de fibra insoluble 23 6.1.1 Primer mtodo 23 6.1.2 Segundo mtodo 24 6.1.3 Repeticin primer mtodo 26 6.2 Resultados determinacin de pectina 27 6.2.1 Primer mtodo 27 6.2.2 Segundo mtodo 28 6.3 Resultados determinacin de fibra soluble e insoluble a productos comerciales. 30 6.3.1 All bran de Kelloggs 30 6.3.2 Avena Quaker 31 6.3.3 Starbien 32 6.3.4 Hit vital 33 6.4 Procedimiento para la determinacion de fibra insoluble 34 6.5 Procedimiento para la determinacion de pectina 42
7. DISCUSIN GENERAL 50 7.1 Comparacin entre los datos de fibra insoluble obtenidos en el laboratorio y los datos de la literatura 50 7.2 Comparacin entre los datos de pectina obtenidos en el laboratorio y los datos de la literatura 51 7.3 Comparacin entre los datos de fibra soluble e insoluble obtenidos en el laboratorio para productos comerciales y los datos de la literatura. 52
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
ANEXOS
BIBLIOGRAFIA
I. LISTA DE TABLAS
Pg
Tabla 1. Determinacin del contenido de fibra insoluble primer mtodo 24
Tabla 2. Determinacin del contenido de fibra insoluble segundo mtodo 25
Tabla 3. Determinacin del contenido de fibra insoluble repeticin primer mtodo 26
Tabla 4. Determinacin del contenido de pectina primer mtodo 27
Tabla 5. Determinacin del contenido de pectina segundo mtodo 28
Tabla 6. Determinacin del contenido de fibra insoluble al all bran mediante primer mtodo 30
Tabla 7. Determinacin del contenido de pectina al all bran mediante segundo mtodo 30
Tabla 8. Determinacin del contenido de fibra insoluble en la avena mediante primer mtodo 31
Tabla 9. Determinacin del contenido de pectina a la avena mediante segundo mtodo 31
Tabla 10. Determinacin del contenido de fibra insoluble en starbien mediante primer mtodo 32
Tabla 11. Determinacin del contenido de pectina en starbien mediante segundo mtodo 32
Tabla 12. Determinacin del contenido de pectina en Hit vital mediante segundo mtodo 33
Tabla 13. Reactivos utilizados en la investigacin 55
II. LISTA DE FIGURAS
Pg Figura 1. Fuentes de fibra soluble e insoluble 5 Figura 2. Estructura qumica de la celulosa 6
Figura 3. Estructura qumica de los azucares presentes en la hemicelulosa 7
Figura 4. Estructura qumica de la lignina 8
Figura 5. Estructura qumica de la cadena de pectina 9
Figura 6. La solubilidad en agua y la fermentabilidad de las fibras 12
Figura 7. Pared celular primaria 16
Figura 8. Fotomicrografa electrnica de microfibrillas de celulosa 16
Figura 9. Preparacin de la muestra 20 Figura 10. Mtodos utilizados 21
III. RESUMEN
Debido a la importancia que tiene desde el punto de vista nutricional, conocer el contenido de fibra dietaria en un alimento. Y teniendo en cuenta que en el etiquetado exigido por la legislacin colombiana, se debe declarar el contenido en fibra dietaria. Es necesario disponer de mtodos analticos relativamente sencillos que permitan determinar fibra en un alimento. Por esta razn en este trabajo se hizo una revisin bibliogrfica de cuales de los mtodos conocidos para la determinacin de fibra soluble e insoluble se pueden realizar de manera prctica y sencilla en el laboratorio. Y que a la vez por medio de esos mtodos se pueda obtener unos valores acertados del contenido en fibra total presente en los alimentos, de esta manera los mtodos seleccionados se podrn seguir realizando en los anlisis de rutina del laboratorio de anlisis de aguas y alimentos de la Universidad Tecnolgica de Pereira abriendo una nueva opcin para posibles empresas de alimentos externas que necesiten conocer el contenido de fibra en sus productos, y para poder ensear a los estudiantes de qumica que estn cursando la materia anlisis de alimentos una nueva determinacin de un componente tan importante como lo es la fibra dietaria.
1. JUSTIFICACIN
La fibra dietaria o diettica es un componente importante de los alimentos, que consiste de material de origen vegetal resistente a la accin hidrolitica de las enzimas endgenas del tracto digestivo de los mamferos.(1)
La fibra dietaria , no es digerida por las enzimas del sistema digestivo humano pero cumple un papel importantsimo en este proceso dada su gran capacidad de retencin de agua produciendo heces de mayor volumen y mas blandas facilitando su eliminacin, y disminuyendo las posibilidades de diverticulitis, apendicitis y hemorroides. Es importante anotar que esta disminucin del transito intestinal de las heces, disminuye el tiempo de contacto con sustancias potencialmente cancerigenas y por ello se les atribuye la disminucin en la incidencia del cncer de colon. (2)
Hace 30 aos, Dennis P. Burkit medico en el servicio de la salud publica de frica, lanzo una hiptesis que no fue bien recibida por sus colegas. Fue el primero en hablar de una conexin entre fibra dietaria y enfermedad. El Dr. Burkit encontr que los nativos africanos cuya dieta natural era rica en fibra dietaria presentaban baja incidencia de enfermedades digestivas como apendicitis y clculos biliares, as como bajo nivel serico de colesterol y baja incidencia de diabetes. Dennis postulo que estas condiciones eran asociadas al alto consumo de fibra en la dieta.
Ha tomado casi treinta aos, y se ha trabajado gran cantidad de datos para que la comunidad medica y de nutricin acepte a la fibra como un componente valioso de la dieta y que su consumo diario es indispensable para promover y conservar la salud.(3)
En los tiempos actuales la gran preocupacin por la salud, ha llevado al estudio profundo del contenido y composicin de la fibra diettica presente en los alimentos, un campo de investigacin antiguo que hoy es nuevamente retomado.(2)
1 La demanda para los productos con alto contenido de fibra dietaria ha crecido y las compaas productoras de alimentos intentan satisfacer esta necesidad con una variedad amplia de alimentos adicionados de fibra.
La preparacin de fibras a partir de subproductos y residuos de origen vegetal se presenta como una alternativa tanto para un manejo adecuado de los desechos slidos, reduccin de los niveles de emisin y la disminucin de la degradacin del medio ambiente, como para la obtencin de nuevas fuentes de fibra dietaria con caractersticas nicas, y muchas aplicaciones interesantes, ya sea en la preparacin de alimentos funcionales o para formas farmacuticas, ofreciendo as a la poblacin colombiana una oportunidad de aumentar el consumo diario de fibra dietaria, (las referencias de valores de fibra que se deben consumir se calcula en 23 g por cada 2000 caloras ingeridas), adems de contribuir a disminuir los desechos slidos resultantes del proceso, con el consecuente mejoramiento de la calidad del medio ambiente favoreciendo la participacin en un desarrollo sostenible buscado por todos los gobiernos a nivel mundial.(4)
La fibra diettica en realidad es definida por el mtodo utilizado para su medida, de los cuales existen varios. Tanto los materiales insolubles de las paredes celulares de las plantas, entre ellos celulosa y lignina, como algunos polisacridos solubles distintos del almidn, son considerados componentes de la fibra diettica.(5)
Teniendo en cuenta que en el etiquetado exigido por la legislacin colombiana, se debe declarar el contenido en fibra dietaria. y que desde el punto de vista nutricional la fibra tiene mucha importancia (6). Es necesario disponer de mtodos analticos relativamente sencillos que permitan determinar el contenido en fibra dietaria total en los alimentos.
2 2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo general
Documentar y estandarizar la tcnica para la determinacin de fibra en el laboratorio de anlisis de aguas y alimentos de la Universidad Tecnolgica de Pereira.
2.2 Objetivos especficos
Cuantificar los contenidos de fibra diettica soluble e insoluble en los alimentos.
Determinar la exactitud de los mtodos utilizados haciendo una comparacin entre los datos obtenidos en el laboratorio y los datos de la literatura.
Determinar la reproducibilidad de los mtodos utilizados haciendo uso de la desviacin estndar.
Determinar cual de los dos mtodos utilizados en cada fraccin de fibra resulta mejor.
Elaborar los protocolos para la determinacin de las dos fracciones de fibra dietaria.
3 3. MARCO DE REFERENCIA
3.1 Fibra dietaria
La fibra diettica se define como la porcin comestible de plantas o de los carbohidratos anlogos que son resistentes a la digestin y a la absorcin en el intestino delgado con completa o parcial fermentacin en el intestino grueso, estos carbohidratos no son hidrolizados por las enzimas endgenas del tracto digestivo humano, no pueden ser digeridos por nuestro organismo ya que no tenemos las enzimas necesarias para poder llevar a cabo esta funcin, Las clases qumicas principales de la fibra diettica son celulosa, hemicelulosas, pectinas, gomas, y ligninas. Son todos polisacridos excepto la lignina. Y se determinan segn el mtodo convenido. Promueve efectos fisiolgicos beneficiosos tales como laxacin, y/o atenuacin del colesterol de la sangre, y/o la atenuacin de la glucosa de la sangre (7)(8)(9)(10).
3.2 Clasificacin de fibra dietaria Segn su solubilidad y grado de fermentacin, las fibras se pueden dividir en solubles e insolubles. En la composicin de las fuentes de fibra dietaria, la solubilidad tiene profundos efectos en la funcionalidad de la fibra. La fibra dietaria soluble ejerce principalmente actividad metablica y la insoluble, mecnica. La fibra soluble se encuentra en alimentos tales como el salvado de avena, la cebada, las nueces, las semillas, los frjoles, las lentejas, los guisantes y algunas frutas y hortalizas. Entre tanto la fibra insoluble se encuentra en alimentos tales como el salvado de trigo, las hortalizas y los granos enteros (11)(12)(13).
3.2.1 Fibra soluble El efecto de la fibra dietaria soluble en el tubo digestivo del hombre est relacionado con su mayor capacidad para retener agua y formar geles, se vuelve gel durante la digestin e igualmente retarda la digestin y la absorcin de nutrientes desde el estmago y el intestino. Las fibras solubles comprenden gomas, muclagos, pectina y algunas hemicelulosas. Fermentan rpidamente por la accin de las bacterias colnicas y son
4 viscosas. adems, es un sustrato adecuado para la fermentacin que efectan las bacterias en el colon, lo que ayuda a mantener su estructura y adecuado funcionamiento (11)(12)(13).
3.2.2 Fibra insoluble Las fibras insolubles estn compuestas principalmente por celulosa y lignina (se incluyen tambin algunas hemicelulosas), son poco fermentadas por la accin de las bacterias del colon, no son viscosas (poca capacidad de formar geles) y se excretan prcticamente ntegras en las heces. La fibra insoluble promueve la funcin intestinal normal mediante la absorcin de agua, acelera el paso de los alimentos a travs del estmago y los intestinos y le agrega peso al volumen de la masa fecal aumentando la velocidad del trnsito de las heces a travs del colon (11)(12)(13).
3.3 Fuentes de fibra soluble e insoluble La fibra alimentaria se encuentra en las frutas (pera, fresa, mora, frambuesa, grosella y naranja), las verduras (col de Bruselas, alcachofa, cebolla, ajo, maz, guisantes, judas verdes y brcol, etc), las legumbres (lentejas, garbanzos, alubias, etc.) y los granos de cereal enteros (salvado de trigo, de avena, pan de cereales integrales o multi-cereales, etc.) (14).
Figura 1. Fuentes de fibra soluble e insoluble
5 3.4 Localizacin de los compuestos que conforman la fibra dietaria Los compuestos que conforman la fibra dietaria se localizan en la pared de las clulas vegetales e intracelularmente en los plastidios, vacuolas, o en el citoplasma (5). 3.5 Composicin qumica Los componentes principales de la pared celular son la celulosa, hemicelulosa, pectinas y lignina (5). 3.5.1 Celulosa La celulosa es un polmero lineal de unidades de anhidroglucosa unidas entre ellas por junturas glicosidicas de tipo -1,4. el grado de polimerizacin es del orden de 10000 unidades por molcula. En el estado natural estas molculas estn asociadas en una estructura compleja a la vez fibrilar y cristalina, es el componente ms abundante de las paredes de las clulas vegetales donde se encuentra asociado con la hemicelulosa y la pectina. La celulosa es el componente principal de la madera, al algodn y el papel en todos sus tipos. Se encuentra en zanahorias, col, verduras y cereales integrales. (6)(15).
Figura 2. Estructura qumica de la celulosa
6 3.5.2 Hemicelulosa Las hemicelulosas son heteropolisacaridos cortos, ramificados, fcilmente hidrolizables enzimticamente, con este nombre se agrupa a una serie de molculas formadas por polmeros de hexosas y/o pentosas, las cuales se hallan ntimamente asociadas a la celulosa (de ah el nombre de hemicelulosa). Entre los ms conocidos se encuentran los polmeros llamados xiloglucanas, arabinogalactanas y ramnogalacturonanas cuyos monosacridos principales son: xilosa y glucosa, arabinosa y galactosa y en el ltimo caso ramnosa y cido galacturnico.Se les encuentra en cereales integrales y verduras en general, las de caa de maz contiene 70% de xilosa, 9% arabinosa, 14.5% de glucosa y 5.9% de otros. Los azucares C 5 (xilosa y arabinosa) son mayoritarios, la glucosa siempre esta presente y los otros estn constituidos por los cidos uronicos y otros azucares en menor proporcin (6)(15).
D- Xilosa D-Arabinosa
D-Glucosa D- Galactosa
Figura 3. Estructura qumica de los azucares presentes en la hemicelulosa
7 3.5.3 Lignina Las ligninas son polmeros tridimensionales de origen fenolico, sintetizados por la deshidrogenacion radical de tres alcoholes fenilpropenoicos: El alcohol cumarilico, el alcohol coniferilico y el alcohol sinapilico; las uniones entre molculas basales son de diferentes tipos, muchas de las cuales no son hidrolizables, es el principal componente no carbohidrato de la pared celular de las plantas. Tiene mnima capacidad para absorber agua. Se le encuentra principalmente en la cascarilla de los cereales y en la alfalfa (6)(15).
Figura 4. Estructura qumica de la lignina
3.5.4 Pectina La pectina nativa presente en la planta, denominada tambin protopectina, esta formada por cidos poligaracturonicos, cuyos grupos carboxlicos estn esterificados en parte con metanol. La gran longitud de la cadena y a la vez su pequeo grosor hacen que se origine una red tridimensional que se mantiene unida por fuerzas de van der waals relativamente fuertes y por en laces inicos (Ca 2+ ). La transformacin en el laboratorio del grupo carboxilo del cido galacturnico en metil ester, da lugar al polmero que recibe el nombre de cido pectnico, siendo esta forma, la llamada pectina soluble, que se usa para hacer mermeladas y jaleas en combinacin con adecuadas cantidades de fruta, cido orgnico y azcar. Las pectinas se encuentran en las paredes celulares y la porcin carnosa de la fruta,
8 verduras y plantas comestibles. La parte carnosa y blanca de la cscara de ctricos como la toronja y la naranja, as como en la manzana, el membrillo y el tejocote; contienen abundantes cantidades de pectina (cerca del 20%de su peso seco). La pectina comercial proviene de estas fuentes (15)(16).
Figura 5. Estructura qumica de la cadena de pectina
3.6 Propiedades y usos de la fibra dietaria La fibra alimentaria ingerida avanza por el intestino grueso, donde es fermentada parcial o totalmente por las bacterias intestinales. Durante el proceso de fermentacin, se forman diversos subproductos, cidos grasos de cadena corta y gases. Los efectos beneficiosos para la salud de la fibra alimentaria se derivan de la accin combinada del proceso de fermentacin y de los subproductos resultantes (14). La fibra diettica aumenta el poder de saciedad, disminuye la densidad energtica de los alimentos. La fermentacin de algunos tipos de fibra, libera cidos grasos de cadena corta que son absorbidos determinando una mayor sensacin de saciedad. Produce retardo en el vaciamiento gstrico y por consiguiente disminuye la glicemia e hiperinsulinemia postprandial. Las fibras dietticas son higroscpicas, por lo que suavizan el bolo fecal, aumentan su volumen y facilitan su transito por el intestino y la defecacin. Esto reduce o evita el
9 estreimiento en nios y adultos. En los adultos tambin reducen el riesgo de diverticulosis de colon. Hay una asociacin epidemiolgica entre la ingestin de dietas ricas en fibra y una menor incidencia de cncer de intestino grueso. Esto puede ser porque la fibra liga algunas sustancias cancergenas y porque aumenta la velocidad del transito intestinal, reducen la posibilidad de una interaccin de los cancergenos con la mucosa intestinal. Esa capacidad de ligar ciertas molculas y no permitir su absorcin intestinal hace que tambin, ciertos tipos de fibra, contribuyan a reducir el riesgo de hipercolesterolemia (17). 3.6.1 La funcin intestinal La fibra alimentaria, especialmente la fibra insoluble, ayuda a prevenir el estreimiento al incrementar el peso de las heces y a reducir la duracin del trnsito intestinal. Este efecto es aun mayor si el consumo de fibra se acompaa de un aumento de la ingesta de agua. Los cidos grasos de cadena corta, producidos cuando la fibra fermenta por la accin de las bacterias intestinales, son una fuente importante de energa para las clulas del colon y pueden inhibir el crecimiento y la proliferacin de clulas cancergenas en el intestino. Al mejorar la funcin intestinal, la fibra alimentaria puede reducir el riesgo de enfermedades y trastornos, tales como la enfermedad diverticular o las hemorroides y puede tener un efecto protector frente al cncer de colon (14). 3.6.2 Los niveles de glucosa en la sangre La fibra soluble puede ralentizar la digestin y la absorcin de hidratos de carbono y, por consiguiente, reducir la subida de la glucosa en la sangre que se produce despus de comer (postpandrial) y la respuesta insulnica. Esto puede contribuir a que las personas diabticas tengan un mejor control de la glucemia (14).
10 3.6.3 El colesterol sanguneo Los resultados de varios estudios epidemiolgicos revelan otra funcin de la fibra alimentaria en la prevencin de la enfermedad cardiaca coronaria (ECC), la de mejorar los perfiles de lpidos en la sangre. Los ensayos clnicos confirman los resultados de dichos estudios. La fibra de consistencia viscosa, como la pectina, el salvado de arroz o el de avena, reducen el colesterol srico total y el nivel de colesterol LDL (de lipoprotena de baja densidad o colesterol malo). Entre tanto, las investigaciones siguen demostrando que una dieta con un elevado contenido de fibra alimentaria de origen mixto tambin protege contra la ECC (14). 3.6.4 El cncer gastrointestinal Desde hace varios aos se ha asociado el consumo de fibra con la disminucin de la incidencia de cncer, principalmente colorectal. Estudios prospectivos publicados en las ltimas 2 dcadas no han observado esta asociacin. Sin embargo, un estudio reciente que involucr 10 pases europeos demostr una reduccin del 25% en el riesgo de desarrollar cncer colorectal asociado a un alto consumo de fibra (18). 3.6.5 Otros efectos Aunque la prevencin del estreimiento, la mejora de los niveles de glucosa en sangre y los perfiles de lpidos en la sangre son los principales efectos beneficiosos derivados de una dieta rica en fibra alimentaria, no hay que olvidar otras consecuencias positivas. Por ejemplo, dado que la fibra aumenta el volumen de la dieta sin aadir caloras, puede tener un efecto saciante y ayudar as a controlar el peso. Para beneficiarse de todos los efectos de la fibra es importante variar las fuentes de fibra en la dieta. Las dietas con frutas, verduras, lentejas o alubias y cereales integrales no slo proporcionan fibra alimentaria, sino que aportan adems otros nutrientes y componentes alimentarios fundamentales para una salud ptima (14).
11 3.7 Solubilidad y fermentabilidad de la fibra dietaria. No todas las sustancias conocidas como fibra diettica se comportan de igual forma cuando llegan al intestino grueso. Este comportamiento depende de dos propiedades de las fibras (no equivalentes, pero s estrechamente relacionadas): su solubilidad en agua y su capacidad de ser fermentadas por las bacterias presentes en el intestino grueso (flora intestinal) (Figura 2). En general, cuanto ms soluble, ms fermentable es una fibra. Tal es el caso de las gomas, muclagos y pectina que son muy solubles y tambin muy fermentables. Las hemicelulosas tienen un grado de solubilidad y fermentabilidad intermedia. La lignina es un tipo de fibra totalmente insoluble y no es fermentable en absoluto, mientras que las celulosas son insolubles pero algunas pueden ser parcialmente fermentadas (hasta un 40-50%). A efectos prcticos, sin embargo, es til clasificar la fibra diettica como fibra insoluble, no fermentable o fibra soluble, fermentable (Figura 2) (19).
Figura 6. La solubilidad en agua y la fermentabilidad de las fibras
12 3.7.1 Efectos de la fibra insoluble, no fermentable Las acciones principales de la fibra insoluble a su llegada al intestino grueso son 1) la formacin de residuo fecal, constituido por la propia fibra, y 2) el atrapamiento de agua en su seno. De hecho, cuando hablamos de una dieta rica o pobre en residuos, nos estamos refiriendo a una dieta rica o pobre en fibra insoluble. Las consecuencias de estas acciones son el aumento del volumen de las heces y la aceleracin de los movimientos del colon. Ello hace que el consumo de alimentos ricos en fibra insoluble sea particularmente til para prevenir y tratar el estreimiento crnico. Sin embargo, la fibra insoluble no debe administrarse a personas que tienen estrecheces (estenosis) en el intestino (ya sea en el intestino delgado como en el colon) como algunos pacientes (no todos) con enfermedad de Crohn ya que el acumulo de residuos puede favorecer la obstruccin intestinal. Asimismo, la fibra insoluble, sobre todo la lignina (del latn, lignum=lea) contenida en alimentos integrales, puede daar la mucosa frgil y ulcerada del colon en un brote grave de colitis ulcerosa, por lo que tambin debe evitarse en estos casos (no en la colitis inactiva o en remisin)(19).
3.7.2 Efectos de la fibra soluble fermentable
Los efectos fisiolgicos de la fibra diettica soluble provienen en gran medida de su fermentacin colnica. La fermentacin de la fibra soluble por la flora bacteriana intestinal es un proceso que debemos considerar en trminos generales beneficioso para la salud. Como resultado de esta fermentacin bacteriana, se produce hidrgeno, dixido de carbono, gas metano y cidos grasos de cadena corta, de los cuales el butirato es el ms importante. El butirato es importante porque:
1) Es una sustancia que es utilizada como alimento especfico de las clulas del colon. Esto parece obviamente interesante en los casos de colitis ulcerosa, donde la mucosa del colon se encuentra daada. De hecho, se sabe que las clulas del colon de los pacientes con colitis
13 ulcerosa activa no aprovechan bien el butirato que les llega, de manera que proporcionarles mayores cantidades de ese alimento podra ser, al menos en teora, til.
2) La absorcin del butirato por las clulas del colon favorece, de manera indirecta, la absorcin de agua desde la luz intestinal. De esta manera, el consumo de fibras fermentables puede contribuir a aliviar (al menos en parte) la diarrea de los pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal.
3) Estudios recientes, llevados a cabo en el laboratorio, sugieren que el butirato podra disminuir la inflamacin intestinal en la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn. Aunque este efecto antiinflamatorio intestinal no se demostrado an de forma inequvoca en enfermos, de ser cierto sera un argumento importante a favor del consumo de fibra fermentable en estos casos.
4) En animales de experimentacin, el butirato previene el desarrollo de cncer de colon. De hecho, el consumo de frutas y verduras forma parte de los hbitos de vida que se han demostrado eficaces en la prevencin de ese cncer tan frecuente en los pases industrializados. Teniendo en cuenta que los pacientes con colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn del colon extensas y de muchos aos de evolucin tienen un mayor riesgo de padecer cncer de colon, el consumo de fibra fermentable en estos casos debe considerarse un hbito saludable.
Desafortunadamente, sin embargo, no todas las consecuencias de la fermentacin de la fibra diettica son agradables. Adems de cidos grasos de cadena corta (butirato), tambin se producen gases, que pueden causar hinchazn, molestias abdominales e incluso dolor. Habitualmente, estos sntomas no revisten gravedad (ms all de la molestia que producen) por lo que el consumo de fibra soluble slo debera limitarse por este motivo si los sntomas son muy intensos. Los brotes graves de colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn del colon constituyen una situacin particularmente delicada respecto al consumo de fibra
14 fermentable. En estas circunstancias, la flora intestinal puede modificarse de tal forma que la fermentacin de la fibra produzca otras sustancias (por ejemplo, cido lctico) que pueden lesionar an ms la mucosa del colon. Aunque no hay evidencias inequvocas de que esto ocurra en todos los casos, la prudencia aconseja evitar el consumo de fibra fermentable durante los brotes graves de enfermedad inflamatoria intestinal del colon (19)(20).
3.8 Estructura celular En la figura 7, se puede observar la pared celular primaria engrosada irregularmente, no lignificada. Formada por celulosa, mucha pectina y hemicelulosas y ricas en agua (21). La celulosa es un componente fibrilar presente en las paredes celulares vegetales, constituda por un polmero lineal de glucosas unidas por enlaces -1,4. La ausencia de cadenas laterales y la estructura lineal permite la formacin de agregados moleculares: las microfibrillas (Fig. 8). La estabilizacin se da por puentes de hidrgeno intermoleculares. La deposicin microfibrilar de la celulosa permite la existencia de espacios entre las microfibrillas, que estn ocupados por la matriz, que puede presentar entre otras molculas suberina y lignina (22).
15
Figura 7. Pared celular primaria
Figura 8. Fotomicrografa electrnica de microfibrillas de celulosa
16
4. MARCO TEORICO
4.1 Introduccin al anlisis cuantitativo El anlisis qumico cuantitativo tiene por objeto determinar la cantidad relativa de uno o varios componentes de una sustancia o mezcla. Aunque las reacciones qumicas del anlisis cuantitativo, as como los principios que las fundamentan, son en su mayora las que se emplean en el anlisis cualitativo, en el anlisis cuantitativo se debe medir exactamente la cantidad de muestra que se toma y la del reactivo que reacciona con ella, o en algunos casos la cantidad de uno de los productos de la reaccin (23). El anlisis cuantitativo es indispensable en una amplia variedad de operaciones tcnicas y comerciales: agricultura, alimentos, medicamentos, minera, metalurgia, suministro de aguas, aprovechamiento de desperdicios, productos manofacturados de variedad casi infinita, etc. (24).
4.1.2 Mtodo gravimtrico La cantidad de sustancia buscada se determina mediante el peso de la propia sustancia pura, o de algn compuesto qumico que la contiene o equivale qumicamente a ella (24).
4.2 Introduccin a la bromatologa y el anlisis de alimentos La palabra Bromatologa viene del griego Bromatos que quiere decir Alimentos y logos, enseanza, conocimiento; siendo por lo tanto, la ciencia que se ocupa del conocimiento de los alimentos (25).
Se relaciona con ciencias como la qumica, la biologa y la fsica, igualmente con la nutricin, la bioqumica, la farmacologa y la toxicologa (26).
La investigacin bsica de los alimentos y de sus materias primas comprende no solo la determinacin de sus principales componentes, tales como grasas, protenas, carbohidratos y compuestos especiales. Se trata de parmetros globales de componentes mayoritarios y minoritarios que se determinan de manera sencilla por mtodos fisicoqumicos y que se utilizan para la evaluacin y caracterizacin de los distintos productos (16).
17 En la evaluacin fisicoqumica de alimentos se realiza la determinacin del contenido de humedad y cenizas utilizando el mtodo gravimtrico, grasa o extracto etreo siguiendo el mtodo soxhlet, fibra cruda o insoluble por digestin acida y alcalina, y protena mediante el anlisis por micro kjeldhal(27)(28).
4.2.1 Mtodo gravimtrico para determinar humedad La determinacin de humedad o voltiles a 100 o C se basa en la perdida de peso que sufre el alimento al calentarlo a 100 o C. Este valor incluye adems del agua propiamente dicha, las sustancias voltiles que acompaan al alimento (6).
La muestra se seca directamente, o tras triturarla, en una estufa a 100 o C de temperatura hasta pesada constante, calculndose el residuo por diferencia de peso (16).
4.2.2 Mtodo gravimtrico para determinar cenizas El concepto de residuo de incineracin o de cenizas se refiere al residuo que queda tras la combustin (incineracin) completa de los componentes orgnicos de un alimento, este residuo corresponde entonces con el contenido en minerales, partculas de carbono procedentes de una combustin incompleta, y otras posibles impurezas de los alimentos.
Se calcina/incinera la muestra a 550 o C en la mufla y se calcula el residuo de incineracin por diferencia de peso (16).
4.2.3 Mtodo para determinar grasa con extraccin por Soxhlet Las grasas verdaderas o triglicridos son compuestos orgnicos carentes de nitrgeno, que se forman en el metabolismo animal y vegetal y que poseen desde el punto de vista fisiolgico un elevado valor calorfico. Son los nutrientes con mayor poder energtico (1g de grasa = 9.3 cal = 38.9 KJ ). Las grasas, por lo general, se encuentran asociadas con numerosas sustancias acompaantes (lipoides), estrechamente relacionadas biogenticamente unas con otras. Las grasas y sus sustancias acompaantes, que en conjunto se denominan tambin lpidos, se diferencian entre si bsicamente por su
18 estructura qumica, aunque presentan en su totalidad propiedades quimico-fisicas similares, como por ejemplo la solubilidad en disolventes orgnicos. La muestra se extrae con ter dietilico o ter de petrleo en un aparato soxhlet, cuyo recipiente haya sido previamente tarado, se recupera la mayor parte del solvente por destilacin, despus se determina gravimtricamente el extracto seco.
4.2.4 Mtodo para determinar fibra bruta La fibra bruta es el residuo orgnico lavado y seco que queda despus de hervir sucesivamente el material desengrasado con acido sulfrico e hidrxido sdico diluidos (29). Se filtra, el residuo se lava con etanol y ter, se seca y se pesa. Despus de incinerado, se resta el contenido en cenizas del peso que se haba obtenido (16).
4.2.5 Anlisis por micro kjeldhal para la determinacin de protenas Las protenas son compuestos altamente polimerizados, que estn formados por - aminocidos de configuracin L. tambin se denominan proteicos. Las protenas se encuentran entre los nutrientes ms importantes, junto con los lpidos y los carbohidratos. Esto es as no por su funcin energtica (1g de protena = 4.1 Kcal = 17.2 KJ), sino porque son necesarias por su naturaleza nitrogenada para la sntesis de compuestos propios del organismo (16).
Para esta determinacin se efecta una digestin sobre la muestra para destruir la materia orgnica en medio de acido sulfrico, el N orgnico se transforma en NH 4 + con ayuda de un catalizador. Luego se destila en medio bsico donde se desprende el NH 3 , el cual se captura en una solucin de acido brico. Posteriormente se determina volumtricamente el NH 3
capturado, al titular con HCl de Normalidad conocida. El contenido en protena de la muestra se calcula teniendo en cuenta el contenido medio en nitrgeno de la protena en cuestin (16)(30).
19 5. METODOLOGIA 5.1 Descripcion de la muestra El trabajo se realizo utilizando dos tipos de muestra para la fraccion fibra insoluble se utilizo un concentrado para animales llamado enerfibra un producto de la agropecuaria pastos y ganados Ltda, el cual fue obtenido en el laboratorio de analisis de suelos de la Universidad Tecnologica de Pereira, donde previamente se le habia determinado la cantidad de fibra insoluble utilizando un equipo para dicha determinacion. y para la fraccion fibra soluble se utilizo una mezcla a base de fructosa con vitaminas llamada Starbien un producto de Omnilife, este producto contiene fibra de manzana y tiene reportado en la tabla de informacion nutricional el contenido de fibra soluble.
5.2 Preparacion de la muestra Llegada la muestra al laboratorio el material seco se pulveriza obtenindose partculas de igual tamao. Si es necesario se seca la muestra en estufa a 60 0 C durante el tiempo suficiente para lograr peso constante, si la muestra es muy grasa se realiza una extraccin tipo Soxhlet con hexano, posteriormente se empaca la muestra en bolsa de polietileno con cierre hermtico y se rotula. (figura9)
Figura 9. Preparacin de la muestra
20 Extraer en soxhlet con hexano Empacar
Rotular
Secar en estufa a 60 0 C
Pulverizar
5.3 Mtodos utilizados
Figura 10. Mtodos utilizados
Se tomo como base la realizacin de 10 ensayos por tcnica, son cuatro tcnicas, por lo cual da un total de 40 ensayos.
21 El material seco y molido el cual contiene el adicionado de fibra se almacena en un recipiente plstico hasta su evaluacin analtica.
Mtodos utilizados para determinar fibra insoluble Mtodos utilizados para determinar fibra soluble
Mtodo 1
La fibra insoluble se analizo por tratamiento de las muestras secas y desengrasadas con soluciones acida y alcalina diluidas y posterior calcinacin del residuo insoluble segn el mtodo propuesto en el libro Anlisis de alimentos. (Ins Bernal de Ramrez)(6). Mtodo 1
La pectina se analiza por medio de la precipitacin etanolica en medio acido para posteriormente filtrar y pesar.
Mtodo 2
Tambin se analizo por el mtodo adoptado en el libro Anlisis de los alimentos. (fundamentos, mtodos, aplicaciones). Matissek, schnepel, steiner.(16) en el que se hace una digestin de la muestra con una mezcla de cidos para la posterior calcinacin del residuo. Mtodo 2
En el otro metodo la pectina se analiza haciendo una precipitacin con cloruro de calcio en medio acido para posteriormente filtrar y pesar.
Para determinar el contenido en fibra soluble se analizo tambin la pectina segn los dos mtodos propuestos en el libro Anlisis de alimentos. (Ins Bernal de Ramrez)(6). 5.4 Ensayos adicionales Posteriormente se escogieron cuatro productos comerciales a los que se les determino fibra soluble e insoluble mediante los mtodos convenidos. Los cuatro productos fueron All- Bran de kelloggs, Avena Quaker, Starbien de Omnilife y Hit Vital. Los resultados obtenidos de fibra soluble e insoluble se compararon con los datos reportados en la tabla de contenido de los productos. Las cantidades de fibra soluble e insoluble se determinaron por triplicado para cada producto, al Hit vital solo se le determino fibra soluble, lo cual da un total de 21 ensayos.
5.5 Estudio estadstico de los resultados
El estudio estadstico de los resultados se hizo mediante la estadstica descriptiva, se realizo un numero de diez ensayos por mtodo, posteriormente a los diez datos obtenidos para cada mtodo se les calculo la media (X) para evaluar exactitud y la desviacin estndar (S) para evaluar reproducibilidad.
22 6. RESULTADOS Y DISCUSIN
6.1 Resultados determinacin de fibra insoluble
6.1.1 Primer mtodo
Datos obtenidos en el primer mtodo utilizado, propuesto por el libro Anlisis de alimentos. Ins Bernal de Ramrez (6). En el cual La fibra insoluble se analiza por tratamiento de las muestras secas y desengrasadas con soluciones acida y alcalina diluidas y posterior calcinacin del residuo insoluble.
Como se muestra en la tabla 1 el contenido de fibra insoluble fue de 0.55 g con una desviacin estndar de 0.093 indicando que el mtodo utilizado es reproducible.
Los datos errneos obtenidos en el primer mtodo son debidos a que hubo prdida de muestra por transferir el residuo que queda en la segunda filtracin a otro papel filtro que se haba tarado previamente. En el momento de transferir el residuo al papel de filtro tarado para la cuantificacin, no fue imposible hacerlo totalmente dado que una cantidad de materia insoluble se quedaba adherida al papel filtro utilizado en dicha filtracin. Luego el papel filtro junto con el residuo se calcinaba en un crisol que tambin se haba tarado previamente, lo que tambin pudo generar interferencias puesto que el papel filtro utilizado no era libre de cenizas.
23 No ensayos Peso fibra (g) % fibra Peso muestra (g) 1 0.41 17.83 2.3 2 0.48 20.87 2.3 3 0.55 23.81 2.31 4 0.46 20.00 2.3 5 0.54 23.48 2.3 6 0.75 32.61 2.3 7 0.49 21.30 2.3 8 0.58 25.00 2.32 9 0.65 28.14 2.31 10 0.56 24.24 2.31 Media 0.55 23.73 Desviacin estndar 0.093 Porcentaje obtenido con el equipo 40.05 Tabla 1. Determinacin del contenido de fibra insoluble primer mtodo
6.1.2 Segundo mtodo
Datos obtenidos en segundo mtodo utilizado, propuesto por el libro Anlisis de los alimentos. (fundamentos, mtodos, aplicaciones). Matissek, schnepel, steiner (16). En el cual La fibra insoluble se analiza haciendo una digestin de la muestra con una mezcla de cidos para la posterior calcinacin del residuo.
Como se muestra en la tabla 2 el contenido de fibra insoluble fue de 0.45 g con una desviacin estndar de 0.114 indicando que el mtodo utilizado es reproducible.
Al comparar el porcentaje de fibra obtenido mediante el segundo mtodo con el porcentaje obtenido mediante la utilizacin del equipo se encuentran diferencias significativas, lo cual no quiere decir que el segundo mtodo esta mal, lo que pasa es que los dos mtodos manejan principios diferentes, y la mezcla de cidos utilizada para la digestin en el segundo mtodo puede solubilizar por oxidacin o nitracin ciertos componentes de la fraccin insoluble de fibra como por ejemplo la lignina, posiblemente por esta razn porcentaje de fibra obtenido mediante el segundo mtodo es menor al porcentaje obtenido mediante la utilizacin del equipo.
24
No ensayos Peso fibra (g) % fibra Peso muestra (g) 1 0.5 21.74 2.3 2 0.58 25.11 2.31 3 0.39 16.88 2.31 4 0.71 30.74 2.31 5 0.37 16.02 2.31 6 0.33 14.29 2.31 7 0.36 15.65 2.3 8 0.35 15.22 2.3 9 0.46 20.00 2.3 10 0.47 20.43 2.3 Media 0.45 19.61 Desviacin estndar 0.114 Porcentaje obtenido con el equipo 40.05 Tabla 2. Determinacin del contenido de fibra insoluble segundo mtodo
Analizando los datos reportados anteriormente de fibra insoluble, se puede decir que ambos mtodos son reproducibles, pero hubo diferencias significativas al comparar con los datos reportados con el equipo, por lo que se repitieron los ensayos para el primer mtodo aplicando algunas mejoras, como hacer la segunda filtracin con papel filtro libre de cenizas en un crisol gooch, el papel filtro y el crisol se tararon en conjunto previamente, el primer mtodo se encontr como mas apropiado para dicha repeticin puesto que maneja el mismo principio que el equipo del laboratorio de suelos lo que hace que los dos mtodos sean casi iguales.
25 6.1.3 Repeticin primer mtodo
Como se muestra en la tabla 3 el contenido de fibra insoluble fue de 0.38 g con una desviacin estndar de 0.038 indicando que el mtodo utilizado es reproducible.
No hay diferencias significativas entre el porcentaje de fibra obtenido, y el porcentaje obtenido mediante la utilizacin del equipo, teniendo en cuenta que con el equipo no se calcina despus de las digestiones, por lo cual no se restan las cenizas al residuo final, es por esta razn que el porcentaje de fibra obtenido mediante el primer mtodo es un poco menor. Si se observa en la tabla 3 el porcentaje sin restar el contenido en cenizas se acerca mucho mas al porcentaje obtenido con el equipo.
No ensayos Peso fibra (g) % fibra Peso muestra(g) 1 0.38 29.23 1.3 2 0.36 27.69 1.3 3 0.37 28.46 1.3 4 0.37 28.46 1.3 5 0.41 31.54 1.3 6 0.35 26.92 1.3 7 0.37 28.46 1.3 8 0.49 37.69 1.3 9 0.37 28.46 1.3 10 0.38 29.23 1.3 Media 0.38 29.61 Desviacin estndar 0.038 Media porcentaje sin restar cenizas 31.58 Porcentaje obtenido con el equipo 33.67 Tabla 3. Determinacin del contenido de fibra insoluble repeticin primer mtodo
26 6.2 Resultados determinacin de pectina
6.2.1 Primer mtodo
Datos obtenidos en primer mtodo utilizado, propuesto por el libro Anlisis de alimentos. (Ins Bernal de Ramrez) (6). En el cual La pectina se analiza por medio de la precipitacin etanolica en medio acido para posteriormente filtrar y pesar.
Como se muestra en la tabla 4 el contenido de pectina fue de 1.07 g con una desviacin estndar de 0.385 indicando que el mtodo utilizado es reproducible.
Al comparar la cantidad de pectina obtenida mediante el primer mtodo con la cantidad de fibra soluble reportada en la tabla de contenido de la muestra, se encuentran diferencias significativas, esto es por que la precipitacin etanolica adems de precipitar la pectina tambin puede precipitar otros compuestos (31). Posiblemente por eso la cantidad obtenida mediante la utilizacin del primer mtodo es mayor a la cantidad de fibra soluble reportada en la tabla de contenido del producto.
No ensayos Peso pectina (g) Peso muestra (g) 1 1.10 20,07 2 0.89 20,02 3 0.80 20,01 4 0.92 20.00 5 1.19 20,01 6 0.72 20,50 7 0.97 20,05 8 2.16 20.00 9 0.98 20.00 10 0.97 20,01 Media 1.07 Desviacin estndar 0.385 Cantidad de fibra soluble reportada en tabla de contenido 0.45 Tabla 4. Determinacin del contenido de pectina primer mtodo
27 6.2.2 Segundo mtodo
Datos obtenidos en segundo mtodo utilizado, propuesto por el libro Anlisis de alimentos. (Ins Bernal de Ramrez) (6). En el cual La pectina se analiza haciendo una precipitacin con cloruro de calcio en medio acido para posteriormente filtrar y pesar.
Como se muestra en la tabla 5 el contenido de pectina fue de 0.16 g con una desviacin estndar de 0.064 indicando que el mtodo utilizado es reproducible.
La cantidad de pectina obtenida mediante el segundo mtodo es menor que la cantidad de fibra soluble reportada en la tabla de contenido de la muestra, esto hace pensar que posiblemente la pectina no sea el cien por ciento de la fibra soluble ya que esta aparte de pectina tambin se conforma de otras sustancias como gomas, muclagos y otra serie de sustancias como agar, goma guar, utilizados en la industria alimentara.
No ensayos Peso pectina (g) Peso muestra (g) 1 0.11 20.00 2 0.31 20,02 3 0.07 20,01 4 0.17 20,04 5 0.15 20,01 6 0.13 20,07 7 0.21 20.00 8 0.17 20,04 9 0.13 20,03 10 0.10 20,03 Media 0.16 Desviacin estndar 0.064 Cantidad de fibra soluble reportada en tabla de contenido 0.45 Tabla 5. Determinacin del contenido de pectina segundo mtodo
28 Los datos reportados de pectina muestran que ambos mtodos son reproducibles, pero se escoge como mas conveniente para la determinacin el segundo mtodo, dado que la utilizacin de cloruro de calcio para precipitar la pectina en forma de pectato clcico puede hacer que el mtodo sea mas selectivo para pectinas teniendo en cuenta que ellas naturalmente se encuentran unidas por enlaces inicos (Ca 2+ ).
29 6.3 Resultados determinacin de fibra soluble e insoluble a productos comerciales 6.3.1 All Bran de kelloggs
En la tabla 6 se muestra que la cantidad de fibra insoluble para el All Bran de Kelloggs, la cual fue determinada mediante el primer mtodo es 0.080 g, con una desviacin estndar de 0.0017 indicando nuevamente la reproducibilidad del mtodo.
Se encuentra que la cantidad de fibra insoluble determinada mediante la utilizacin del primer mtodo y la cantidad reportada en la tabla de contenido del producto no coincide, pero nuevamente esto no quiere decir que el mtodo utilizado este mal lo que pasa es que el mtodo utilizado por Kelloggs para determinar fibra insoluble puede ser diferente. Estos resultados tambin se haban encontrado en una investigacin en la que se hizo un estudio comparativo de caractersticas fisicoqumicas de cereales kellogg's. Y se encontr para el all bran que las cantidades de fibra determinadas eran menores a las reportadas segn kellogg's (32). No ensayos Peso fibra Peso muestra 1 0.081 2.0035 2 0.082 2.002 3 0.078 2.0026 Media peso fibra 0.080 Desviacin estndar 0.0017 Cantidad reportada en tabla para 2g de muestra 0.43 Tabla 6. Determinacin del contenido de fibra insoluble al all bran mediante primer mtodo
Como se observa en la tabla 7 no se encontr pectina en el All Bran de Kelloggs mediante la utilizacin del segundo mtodo esto no indica que el All Bran no tiene pectina, posiblemente la cantidad que contiene este cereal es muy poca y la sensibilidad del mtodo no es suficiente para cuantificarla.
No ensayos Peso muestra Peso pectina 1 10.0052 0 2 10.0102 0 3 10.0254 0 Tabla 7. Determinacin del contenido de pectina al all bran mediante segundo mtodo
30 6.3.2 Avena Quaker
En la tabla 8 se muestra que la cantidad de fibra insoluble para la Avena Quaker, la cual fue determinada mediante el primer mtodo es 0.055 g, con una desviacin estndar de 0.0012 indicando otra vez la reproducibilidad del mtodo.
Tambin se encontr que la cantidad de fibra obtenida mediante la utilizacin del primer mtodo no concuerda con la cantidad reportada en la tabla de contenido del producto, la explicacin a esto es que posiblemente la determinacin de fibra se esta haciendo por un mtodo diferente.
No ensayos Peso fibra Peso muestra 1 0.055 2.0016 2 0.057 2.0215 3 0.054 2.0324 Media peso fibra 0.055 Desviacin estndar 0.0012 Cantidad reportada en tabla para 2g de muestra 0.087 Tabla 8. Determinacin del contenido de fibra insoluble en la avena mediante primer mtodo
Nuevamente no se pudo determinar el contenido de pectina a la avena, como se observa en la tabla 9, posiblemente la pectina presente en la avena es muy poca para poderse cuantificar.
No ensayos Peso muestra Peso pectina 1 10.0023 0 2 10.0110 0 3 10.0034 0 Tabla 9. Determinacin del contenido de pectina a la avena mediante segundo mtodo
31 6.3.3 Starbien
En la tabla 10 se muestra que la cantidad de fibra insoluble para el Starbien, la cual fue determinada mediante el primer mtodo es 0.043 g, con una desviacin estndar de 0.0009 indicando la reproducibilidad del mtodo.
Tampoco concuerda la cantidad de fibra insoluble obtenida mediante la utilizacin del primer mtodo con la reportada en la tabla de contenido, los mtodos utilizados para la determinacin no son los mismos.
No ensayos Peso fibra Peso muestra 1 0.044 2.0169 2 0.042 2.0775 3 0.042 2.0061 Media peso fibra 0.043 Desviacin estndar 0.0009 Cantidad reportada en tabla para 2g de muestra 0.016 Tabla 10. Determinacin del contenido de fibra insoluble en starbien mediante primer mtodo
En la tabla 11 se muestra que la cantidad de pectina para el Starbien, la cual fue determinada mediante el segundo mtodo es 0.17 g, este dato es muy similar al obtenido cuando se hicieron los diez ensayos para la estandarizacin, con una desviacin estndar de 0.037 se indica la reproducibilidad del mtodo.
No ensayos Peso pectina Peso muestra 1 0.12 20.0015 2 0.21 20.0038 3 0.17 20.0580 Media peso pectina 0.17 Desviacin estndar 0.037 Cantidad reportada en tabla para 20g de muestra 0.45 Tabla 11. Determinacin del contenido de pectina en starbien mediante segundo mtodo
32 6.3.4 Hit vital
Como se muestra en la tabla 12 el contenido de pectina para el Hit vital, la cual fue determinada mediante el segundo mtodo fue de 6.47 g con una desviacin estndar de 0.79 indicando que el mtodo utilizado es reproducible.
La cantidad de pectina obtenida se acerco mucho a la cantidad reportada de fibra en la tabla de contenido.
No ensayos Peso pectina Volumen muestra 1 5.97 400 ml 2 5.86 400 ml 3 7.58 400 ml Media peso pectina 6.47 Desviacin estndar 0.79 Cantidad reportada en tabla para 400ml de muestra 7.26g Tabla 12. Determinacin del contenido de pectina en Hit vital mediante segundo mtodo
33 6.4 Procedimiento para la determinacin de fibra insoluble
1. OBJETIVO 2. ALCANCE 3. DEFINICIONES 3.2 ABREVIATURAS EMPLEADAS 4. CONTENIDO 4.1 DESCRIPCIN GENERAL DEL MTODO 4.2 RECOLECCIN Y PRESERVACIN DE LA MUESTRA 4.3 DESCRIPCIN DE MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS 4.4 NORMAS DE SEGURIDAD Y PRECAUCIONES 4.5 FLUJOGRAMAS 4.6 CALCULOS Y RESULTADOS
34 1. OBJETIVO Establecer el procedimiento para cuantificar la fibra insoluble en productos alimenticios para el Laboratorio de Anlisis de Aguas y Alimentos de la Universidad Tecnolgica de Pereira.
2. ALCANCE Este procedimiento se aplica a todas las muestras de alimentos concentrados en fibra (cereales, suplementos, concentrados para animales, y cualquier alimento de origen vegetal) sometidas al ensayo de fibra insoluble en el Laboratorio de Anlisis de Aguas y Alimentos de la Universidad Tecnolgica de Pereira.
3. DEFINICIONES Fibra insoluble: la fibra insoluble es el residuo orgnico lavado y seco que queda despus de hervir sucesivamente el material desengrasado con acido sulfrico e hidrxido de sodio diluidos.
3.1 ABREVIATURAS EMPLEADAS Fi : Fibra insoluble
4. CONTENIDO 4.1 DESCRIPCIN GENERAL DEL MTODO 4.1.1 Fundamento: El material a investigar una vez homogeneizado y en su caso desengrasado se trata sucesivamente con acido sulfrico e hidrxido de sodio diluidos, se filtra, el residuo se lava con etanol y ter, se seca y se pesa. Despus de incinerado, se resta el contenido en cenizas del peso que se haba obtenido.
4.1.2 Principio: El mtodo empleado para la determinacin consiste en efectuar dos digestiones. La primera con H 2 SO 4 y la segunda con NaOH. La finalidad del
35 mtodo es la de eliminar las protenas, carbohidratos solubles, residuos de grasas, vitaminas y otros compuestos que interfieren en su determinacin. El principio del mtodo es asemejar este proceso al que desempea el organismo humano.
4.1.3 Interferencias: Las muestras muy grasas pueden ocasionar problemas al momento de filtrar, extraer en soxhlet antes de empezar las digestiones.
4.2 RECOLECCIN Y PRESERVACIN DE LA MUESTRA Llegada la muestra al laboratorio el material seco se pulveriza obtenindose partculas de igual tamao. Si es necesario se seca la muestra en estufa a 60 0 C durante el tiempo suficiente para lograr peso constante, si la muestra es muy grasa se realiza una extraccin tipo Soxhlet con hexano, posteriormente se empaca la muestra en bolsa de polietileno con cierre hermtico y se rotula. (figura).
Preparacin de la muestra
36 Extraer en soxhlet con hexano Empacar
Rotular
Secar en estufa a 60 0 C
Pulverizar
4.3 DESCRIPCIN DE MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS
4.3.1 Materiales Matraz aforado 100 ml Pipeta graduada 10 ml Baln 250 ml Condensador para reflujo Soporte y pinza para soporte Esptula Papel filtro banda negra Papel filtro libre de cenizas (GF/C) Embudo Buchner Crisol gooch Desecador
4.3.2 Reactivos Solucin 0.255 N de H 2 SO 4 = 1.25 g / 100 ml
Solucin 0.313 N de NaOH = 1.25 g / 100 ml
Alcohol isoamilico o amlico (antiespumante)
Etanol de 95 %
ter etlico
4.3.3 Equipos Manta Bomba de vacio Estufa Mufla
37 1 FIN 4.4 NORMAS DE SEGURIDAD Y PRECAUCIONES Utilizar guantes y proteccin facial para manipular el cido sulfrico concentrado, en caso de accidente seguir el procedimiento descrito en el Manual de Higiene y Seguridad Industrial cdigo LAA-POR-001.
Trabajar en cabina extractora.
4.5 PROCEDIMIENTO DE ENSAYO 4.5.1 Preparacin de reactivos
4.5.1.1 Solucin de Acido Sulfrico 0.255 N
4.5.1.2 Solucin de Hidrxido de sodio 0.313 N
38 Inicio Pesar 1.25 g de H 2 SO 4
concentrado
Transferir a un matraz volumtrico de 100 ml que contenga 80 ml de agua destilada Aforar utilizando agua destilada
Inicio Pesar 1.25 g de NaOH
Pesar de 1 a 2 g de muestra Transferir a baln de 250 ml Adicionar 1 ml de alcohol amlico Adicionar 100 ml de H 2 SO 4
0.255 N 1 1 FIN
4.5.2 Anlisis de la muestra Se recomienda antes de empezar el anlisis secar un papel filtro libre de cenizas, por 2 horas a 100 o C utilizando un crisol gooch, Desecar y pesar el conjunto anotar este peso como (C).
39 Diluir en 80 ml de agua destilada con bao de hielo
Transferir a un matraz volumtrico de 100 ml
Aforar utilizando agua destilada
Conectar inmediatamente al condensador y calentar, manteniendo la ebullicin durante 30 minutos exactos. girar el baln poco a poco cada 5 o 10 minutos para que no haya material fuera de contacto con la solucin.
1 Retirar del calor y filtrar inmediatamente a travs de un papel filtro banda negra y con ayuda de vaco.
Lavar con agua caliente hasta fin de la acidez
2
40 Se transfiere nuevamente el residuo al recipiente de digestin y se lava el papel filtro adicionando 100 ml de solucin de hidrxido sdico por medio de un frasco lavador reservar todos los lavados en el baln.
Llevar a ebullicin bajo reflujo y mantener en ebullicin durante 30 minutos exactos. Mientras tanto preparar un crisol gooch seco, y tarado en conjunto con el papel filtro libre de cenizas.
2 FIN
4.6 Clculos y resultados
4.6.1 porcentaje de fibra insoluble en la muestra
(A C) = Peso del resido
(E C) = Peso de las cenizas
FI = Fibra insoluble
100 * Muestra de Peso cenizas) las de peso - residuo de (Peso FI % =
41 Terminados los 30 minutos filtrar a travs del crisol gooch
Despus se lava el residuo dos veces con 10 ml de alcohol y tres con 10 ml ter etlico
Secar el crisol y su contenido durante 1 hora en una estufa a 110 C, Enfriar en desecador y pesar (A).
Calcinar el crisol en una mufla a 550 C durante 1 hora, Enfriar en el desecador y pesar (E).
6.5 Procedimiento para la determinacin de pectina
1. OBJETIVO 2. ALCANCE 3. DEFINICIONES 3.1 ABREVIATURAS EMPLEADAS 4. CONTENIDO 4.1 DESCRIPCIN GENERAL DEL MTODO 4.2 RECOLECCIN Y PRESERVACIN DE LA MUESTRA 4.3 DESCRIPCIN DE MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS 4.4 NORMAS DE SEGURIDAD Y PRECAUCIONES 4.5 FLUJOGRAMAS 4.6 CALCULOS Y RESULTADOS
42 1. OBJETIVO Establecer el procedimiento para cuantificar la pectina en productos alimenticios para el Laboratorio de Anlisis de Aguas y Alimentos de la Universidad Tecnolgica de Pereira.
2. ALCANCE Este procedimiento se aplica a todas las muestras de alimentos a base de frutas las cuales son la fuente de fibra (suplementos, jugos, y cualquier alimento que contenga pulpa de frutas, o que se produzca a partir de frutas como naranja, limn, pera, manzana, grosellas y ciruelas) sometidas al ensayo de pectina en el Laboratorio de Anlisis de Aguas y Alimentos de la Universidad Tecnolgica de Pereira.
3. DEFINICIONES Pectina: Esta formada por cidos poligaracturonicos, cuyos grupos carboxlicos estn esterificados en parte con metanol. Las pectinas se hallan en las paredes celulares, combinadas con celulosa. La pectosa de la que se deriva la pectina, abunda en los frutos agrios, manzanas, peras, grosellas y ciruelas. La principal fuente para la fabricacin de pectina es la manzana exprimida (bagazo).
3.1 ABREVIATURAS EMPLEADAS PC : Pectato clcico
4. CONTENIDO
4.1 DESCRIPCIN GENERAL DEL MTODO
4.1.1 Fundamento: Las pectinas se solubilizan en agua caliente, para su posterior precipitacin con una solucin de cloruro de calcio anhidro en medio acido.
43 4.1.2 Principio: Las pectinas en la clula se mantienen unidas por fuerzas de van der waals relativamente fuertes y por en laces inicos (Ca 2+ ). Estas pueden separarse por hidrlisis suave u otros medios, transformndose en pectinas solubles, cuando se adiciona cloruro de calcio a estas pectinas solubles se precipitan en forma de pectato clcico.
4.2 RECOLECCIN Y PRESERVACIN DE LA MUESTRA Llegada la muestra al laboratorio el material seco se pulveriza para obtener partculas de igual tamao. Despus de homogeneizar la muestra se empaca en bolsa de polietileno con cierre hermtico y se rotula.
4.3 DESCRIPCIN DE MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS
4.3.1 Materiales Vaso de precipitado de 1000 ml Vaso de precipitado de 600ml Matraz volumtrico de 500 ml Matraz volumtrico de 100 ml Pipeta volumtrica de 50 ml Pipeta volumtrica de 25 ml Pipeta volumtrica de 10 ml Vidrio de reloj Crisol Embudo Buchner Esptula Desecador Papel filtro (Wathman No. 4 u otro similar)
44 FIN 4.3.2 Reactivos Acido actico 1 N.
Cloruro de calcio 1.0 N aprox.
Hidrxido de Sodio. Solucin al 10 % P/V
4.3.3 Equipos
Placa de Agitacin Magntica Estufa a 110 v Bomba de vacio Estufa Mufla
4.4 NORMAS DE SEGURIDAD Y PRECAUCIONES Utilizar guantes y proteccin facial para manipular el cido actico concentrado, trabajar con este acido en lo posible bajo cabina extractora.
4.5 PROCEDIMIENTO DE ENSAYO 4.5.1 Preparacin de reactivos 4.5.1.1 Solucin de Acido Actico 1 N
45 Medir 30 ml de acido actico glacial Transferir a un matraz volumtrico de 500 ml y completar a volumen con agua
Inicio FIN FIN 4.5.1.2 Solucin de Cloruro de calcio 1.0 N aprox.
4.5.1.3 Solucin de Hidrxido de Sodio 10% P/V
4.5.2 Anlisis de la muestra Se recomienda antes de empezar el anlisis tarar un papel filtro (Wathman No. 4 u otro similar), secar por 2 horas a 100 o C y utilizar un crisol, Desecar y pesar el conjunto anotar este peso como (P 1 ).
46 Disolver 27.5 g de CaCl 2 anhidro en una porcin de agua Transferir a un matraz volumtrico de 500 ml y completar a volumen con agua
Inicio Disolver 10 g de NaOH en una porcin de agua en bao de hielo
Inicio Transferir a un matraz volumtrico de 100 ml y completar a volumen con agua
Pasar a un vaso de precipitados de 1000 ml con 400 ml de agua. Traspasar cuantitativamente a un matraz volumtrico de 500 ml. Dejar enfriar y completar a volumen.
Hervir por una hora remplazando el agua perdida por evaporacin. 1 Agitar bien y filtrar a travs de un papel filtro seco (Wathman No. 4 u otro similar), recibir el filtrado en un erlenmeyer de 500 ml.
Tomar una alcuota de 100 ml, en un vaso de precipitados de 600 ml
Diluir con 300 ml de agua
Introducir una barra de agitacin magntica y llevar a una placa
Aadir 10 ml de solucin de hidrxido de sodio, agitar constantemente
Pesar de 20 a 50 g de muestra
47 Dejar en reposo durante la noche.
Aadir 50 ml de acido actico, con agitacin y dejar en reposo 5 minutos
Aadir 25 cm 3 de solucin de cloruro clcico, con agitacin.
Calentar a ebullicin y dejar hervir por un minuto
Filtrar la solucin a travs del papel previamente tarado.
Pasar el precipitado en el papel de filtro al crisol original. Secar durante la noche a 100 C . Enfriar en el desecador y pesar (P).
FIN 1
48 4.6 Clculos y resultados
4.6.1 porcentaje de pectato calcico en la muestra
(P P 1 ) = Peso del pectato clcico en 100 ml de solucin
(P P 1 ) x5 = Peso del pectato clcico en 500 ml inciales
PC = Pectato clcico
100 * Muestra de Peso ) 5 * P1) - (P ( PC % =
49 7. DISCUSIN GENERAL
7.1 Comparacin entre los datos de fibra insoluble obtenidos en el laboratorio y los datos de la literatura.
Haciendo una comparacin entre el porcentaje de fibra insoluble obtenido mediante los dos mtodos propuestos, y el porcentaje obtenido mediante la utilizacin del equipo (tablas 1 y 2), se encuentra que hay un alejamiento significativo entre el dato obtenido con los mtodos de los libros y el dato obtenido por medio del equipo.
El segundo mtodo para fibra insoluble propuesto en el libro Anlisis de los alimentos. (fundamentos, mtodos, aplicaciones). Matissek, schnepel, steiner (16), resulto ser menos exacto puesto que el dato de porcentaje obtenido mediante su utilizacin, se alejo demasiado del dato de porcentaje obtenido mediante el equipo.
Los datos obtenidos mediante los dos mtodos son reproducibles por que las desviaciones estndar encontradas en ambos son menores que 1, pero se puede decir que el mtodo en el que se encontro mas reproducibilidad fue el primer mtodo propuesto en el libro Anlisis de alimentos Ins Bernal de Ramrez (6). Teniendo en cuenta que de los dos mtodos fue el que presento la menor desviacin estndar. Como tambin maneja el mismo principio que el equipo (FIBERTEC SYSTEM M1020 Hot Extractor TECATOR), utilizado en el laboratorio de suelos, se escoge para mejorarlo y repetir los ensayos.
El porcentaje obtenido despus de mejorar el primer mtodo y repetir los ensayos, (tabla 3), se acerca demasiado al porcentaje obtenido con el equipo, lo que indica que el mtodo fue mas exacto, tambin la desviacin estndar disminuyo en comparacin con la que se haba obtenido primero, lo que indica que hubo mayor reproducibilidad en los datos.
50 7.2 Comparacin entre los datos de pectina obtenidos en el laboratorio y los datos de la literatura.
Se encontr que el dato obtenido mediante el primero de los dos mtodos propuestos en el libro Anlisis de alimentos. (Ins Bernal de Ramrez)(6). Para determinacin de pectina, se alejo significativamente del dato de fibra soluble reportada en la tabla de contenido del producto (tabla 4). La precipitacin etanolica puede precipitar otros compuestos (31). por esto el dato obtenido fue mayor.
La cantidad de pectina determinada mediante el segundo de los dos mtodos propuestos en el libro Anlisis de alimentos. (Ins Bernal de Ramrez)(6). Para determinacin de pectina, fue menor a la cantidad de fibra soluble reportada en la tabla de contenido del producto (tabla 5). posiblemente la pectina no sea el cien por ciento de la fibra soluble ya que esta aparte de pectina tambin se conforma de otras sustancias como gomas, muclagos y otra serie de sustancias como agar, goma guar, utilizados en la industria alimentara.
Las desviaciones estndar encontradas mediante ambos mtodos son menores que 1, indicando la reproducibilidad de los datos, pero se puede decir que el mtodo en el que se encontro mas reproducibilidad fue el segundo por que tuvo la menor desviacin estndar.
El mtodo que resulto mejor para la determinacin de pectina fue el segundo de los dos mtodos propuestos en el libro Anlisis de alimentos. (Ins Bernal de Ramrez)(6). En el que se utiliza cloruro de calcio para precipitar la pectina en forma de pectato clcico.
51 7.3 Comparacin entre los datos de fibra soluble e insoluble obtenidos en el laboratorio para productos comerciales y los datos de la literatura.
Las cantidades de fibra soluble e insoluble determinadas a los productos comerciales mediante los dos mtodos escogidos, no coincidieron con las cantidades reportadas en la tabla de contenido de los productos.
Los datos de fibra soluble e insoluble tienen desviaciones estndar menores que 1, indicando nuevamente que los datos son reproducibles, para la fibra insoluble los datos mostrados en las tablas de contenido de los productos posiblemente se determinaron por mtodos diferentes al utilizado en este trabajo, por otra parte como la pectina en muchos casos no es el 100% de la fibra soluble, por eso se determinan cantidades menores a las reportadas como fibra soluble en las tablas de contenido de los productos.
52 CONCLUSIONES
1. Se determin fibra en las muestras por mtodos diferentes y se encontr que las cantidades no son las mismas. 2. Despus de hacer una comparacin entre las medias de los datos obtenidos en el laboratorio y los datos de la literatura, se encuentra como ms exacto el primer mtodo para fibra insoluble por que hubo un acercamiento significativo entre el dato experimental y el dato real.
3. Se encontr reproducibilidad en todos los mtodos por que las desviaciones estndar encontradas fueron menores que 1.
4. Despus de evaluar exactitud y reproducibilidad se encontr que el mejor mtodo para determinar fibra insoluble fue el primero y para determinar pectina el mejor fue el segundo.
5. Cuando se mejoro el primer mtodo para determinacin de fibra insoluble, se encontraron datos reproducibles y ms cercanos a los reportados por el equipo del laboratorio de suelos, esto es porque los dos mtodos trabajan bajo el mismo principio.
6. Se compararon los datos de pectina obtenidos con los dos mtodos, y se encontr que la cantidad obtenida mediante el primer mtodo fue mayor que la obtenida con el segundo mtodo, aunque los datos obtenidos por ambos mtodos son reproducibles se escoge el segundo mtodo, que determina pectina en forma de pectato clcico, porque en el primer mtodo la precipitacin etanolica puede precipitar otros compuestos diferentes a la pectina.
7. Al comparar los datos de pectina obtenidos con el segundo mtodo, con los datos de fibra soluble reportados en la tabla de contenido de los productos, se encuentra que las cantidades de las tablas son mayores, esto es por que en muchos casos la pectina no es el 100 % de la fibra soluble en un alimento.
8. Los datos obtenidos de fibra insoluble determinada a productos comerciales nuevamente fueron reproducibles, pero no se acercaron a los datos reportados en las tablas de contenido de dichos productos, esto es por que el mtodo utilizado en este trabajo puede ser diferente al utilizado en los laboratorios donde analizan los productos.
53 9. Solo se determino pectina en los productos comerciales con fibra a base de frutas que es donde esta abunda, los datos obtenidos igualmente fueron reproducibles, en los cereales quizs la pectina presente no sea suficiente para ser determinada por el mtodo utilizado en este trabajo.
10. Para el producto hit vital la cantidad de pectina obtenida se acerco mucho a la cantidad reportada de fibra en la tabla de contenido, teniendo en cuenta que el producto proviene de pulpa de fruta se puede concluir que la mayor parte de la cantidad reportada de fibra en la tabla de contenido del producto es pectina.
54 RECOMENDACIONES
Es importante en el tratamiento de la muestra, desengrasarla mediante una extraccin tipo soxhlet para evitar interferencias en el momento de filtrar.
Teniendo en cuenta que estos son los primeros analisis comparativos de la fibra realizados en esta universidad, es importante continuar con la investigacin en la determinacin de la fraccin fibra soluble puesto que en este trabajo solo se determino el contenido en pectina y en la fibra soluble tambin pueden haber gomas y agar. Como en algunas tablas de contenido la fibra dietara se encuentra como fibra dietara insoluble y fibra dietara total, se recomienda realizar otra investigacin con un mtodo gravimtrico enzimtico para determinar fibra dietara total, para esto se recomienda buscar los metodos propuestos por la AOAC (association of official analytical chemist).
55 ANEXOS
ANEXO 1
REACTIVOS UTILIZADOS EN LA INVESTIGACIN
REACTIVOS
CANTIDAD Acido sulfrico 98 % 18 ml Hidrxido de sodio 38 g Acido clorhdrico 38 % 303 ml Etanol 96 % 1700 ml Alcohol amlico 10 ml ter etlico 600 ml Acido tricloroacetico 25 g Acido actico 70 % 880 ml Acido ntrico 65 % 124 ml Acido actico glacial 30 ml amoniaco 20 ml Cloruro de calcio anhidro 13.75 g Tabla 13. Reactivos utilizados en la investigacin
56 ANEXO 2
MATERIALES Y EQUIPOS UTILIZADOS EN LA INVESTIGACIN
-Equipo de extraccin tipo soxhlet
-Matraz erlemeyer de 1.000 ml
-Manta
-Embudo Buchner
-Tela de algodn
-Papel filtro adecuado
-Equipo de filtracin al vaco
-Mufla
-Crisol
-Mechero Bunsen
-Condensador para reflujo
-Matraz fondo plano apropiado para la digestin a reflujo
-Embudo de vidrio
-Papel de filtro libre de cenizas
-Pesa sustancias
-Papel indicador de Ph
-Vasos de precipitado de 250 cm 3
-Probeta graduada
-Vidrio de reloj
-Vasos de precipitados de 800 cm 3
-matraz volumtrico de 500 cm 3
57 ANEXO 3
DETERMINACIN FOTOMTRICA DEL CONTENIDO EN PECTINA
Aplicaciones:
- alimentos en general
Fundamento:
Las pectinas se aislan del alimento por precipitacin con metanol, extrayndose el residuo restante con hidrxido sodico diluido. Tras la adicin de carbazol y de acido sulfrico al extracto, se forma tras varias etapas sucesivas (acido 5-formilpiromcico,2,5-diformilfurano) un producto de condensacin rojo-anaranjado que se mide fotomtricamente a 525 nm (el mximo de absorcin a 525 nm se mantiene estable durante dos horas).
Aparatos y materiales:
- espectrofotmetro - cubetas de vidrio (d = 1 cm) - centrifuga y vasos de 50 ml - bao de agua con termostato para mantener la temperatura a 85C - Pipeta automtica de 500l - Pipetas volumtricas de 1ml, 5ml, 6ml, 10ml, 15ml, 20ml y 50ml - Matraces de 100ml y 1.000ml - Probeta de 25ml - Tubos de ensayo de unos 20ml - Embudo de unos 7cm y filtro de pliegues - Varilla de vidrio
Reactivos:
- Carbazol C 12 H 9 N sublimado - Acido galacturnico monohidratado C 6 H 10 O 7 . H 2 O Se seca con P 2 O 5 a 20C - Etanol 96% (vol) (purificado): Se calientan 1.000 ml de etanol 96% Vol con 4 g de polvo de cinc y 2 ml de cido sulfrico a reflujo durante 24 h, se destila y se vuelve a destilar a travs de 4 g de polvo de cinc y 4 g de hidrxido potasico - Etanol 63%: Se mezclan 100 ml de agua destilada. Con 200 ml de etanol destilado 96% (Vol) - Disolucin de hidrxido sodico 1 mol/l - cido sulfrico 98% (d = 1.84) (no debe dar reaccin de color con la disolucin de carbazol) - Disolucin etanolica de carbazol 0.1%:
58 Se mezclan 0.1 g de carbazol con etanol 96% (Vol) destilado en un matraz de 100 ml y se enrasa. - Disolucin madre (c = 100 mg/l) de anhdrido galacturnico (GA): Se mezcla 120.5 mg de cido galacturnico monohidratado en un matraz de 1.000 ml con 0.5 ml de disolucin de hidrxido sodico (1 mol/l), se enrasa con agua destilada; se mezcla y se deja reposar durante la noche - Disolucin patrn de GA (c = 10 a 70 g/l): Se pipetean 10-70 ml de la disolucin madre de anhidro galacturnico a un matraz de 100 ml y se enraza con agua
Determinacin:
a) Aislamiento de las pectinas
o Se calientan 15 ml de zumo o 4,0 g del alimento conteniendo pectinas en un vaso de centrifuga de 50 ml con unos 12 ml de agua dest. Y 12 ml de etanol 96% (Vol) caliente destilado (75C; cuidado: al calentar: el etanol se inflama fcilmente!) hasta un volumen aproximado de 40 ml y se mantiene en un bao de agua a 85C durante 10 min. o El precipitado se agita ocasionalmente con una varilla de vidrio (enjuagarla con etanol) y finalmente se completa el volumen hasta 50 ml con etanol. Despus de centrifugar (15 min) y decantar, el sobrenadante se desecha.
b) Extraccin de las pectinas totales
o El precipitado obtenido se pasa con ayuda de agua dest. a un matraz de 100 ml, se mezcla con 5 ml de disolucin de hidrxido sodico (1 mol/l), se enrasa con agua destilada. o se mezcla bien y se filtra despus de invertir ocasionalmente el matraz despus de 15 minutos.
c) Reaccin de color
o Se pipetean en dos tubos de ensayo de a 1 ml de filtrado obtenido. o A uno de ellos se aaden 0,5 ml de etanol 96% (Vol) (= disolucin patrn) y al otro 0,5 ml de la disolucin de carbazol (= disolucin problema). o En ambos vasos se aaden, a la vez que se agita, 6 ml de cido sulfrico (98%), debe realizarse en 7 segundos, para alcanzar en las disoluciones una temperatura de 85C. o Los tubos de ensayo se colocan inmediatamente en un bao de agua (85C), se enfran despus a temperatura ambiente en el plazo de 15 min y finalmente se lleva a cabo la fotometria de la disolucin problema frente a la disolucin patrn.
59 d) Curva patrn
o Para trazar la curva patrn se tratan y miden fotomtricamente las disoluciones patrn GA (c = 10 a 70 g/l) segn las condiciones descritas en c).
Clculos:
El contenido en pectinas P se expresa en GA/l zumo o en GA/Kg de alimento con pectina y se calcula como sigue:
Para zumo: P(mg GA/l) = G
. 100 / 15
Para un alimento con pectinas: P(mg GA/Kg) = G
. 100 / 4
G g de cido galacturnico monohidratado/ml filtrado (tomado a partir de la curva de calibrado) 100 factor de conversin a Kg o l de muestra y mg de pectina (GA) 15 muestra de zumo en ml 4 muestra de alimento con pectinas en g
60 ANEXO 4 ANALISIS DE FIBRA DIETARIA TOTAL EN ALIMENTOS
Reactivos Bufer de fosfato de sodio pH 6.0 HC1 0.2 M HC1 5 M HC1 0.01 M Na 8H 5M NaOH 1.0 M Etanol 76% Acetona R. A.
Enzimas Pepsina: 200 FIP U/g Merck No.7190. Pesar 10.0 g. y disolver en agua destilada. Llevar a un volumen final de 100 ml. Pancreatina: Fluka AG No. 76190 Pesar 10.0 g y disolver en agua destilada. Llevar a un volumen final de 100 ml. Termamyl 120 L NOVO Celita 545, Fluka AG.
Equipo Crisoles de vidrio para filtracin con vidrio sinterizado Porosidad media (40 60 um) Equipo para filtrar a vaco Bao de Mara a 40 grados Centgrados Bao de Mara a 90 grados Centgrados
61 Potencimetro Micropipetas 100 y de 1000 Vasos de precipitados Agitador magntico
Procedimiento La determinacin de cada una de las fracciones de fibra dietaria en los diferentes alimentos debe hacerse al menos por duplicado con el fin de cuantificar el contenido de protena bruta y cenizas que permanece en el residuo y poder obtener los valores de fibra dietaria corregidos. Simultneamente se determina el residuo que dejan los reactivos utilizados en el anlisis, para lo cual se procede a efectuar una serie de anlisis sin adicionar la muestra (blanco). a. Preparacin de los crisoles para filtrar Para cada determinacin se requiere un crisol. Lavar los crisoles, secarlos a 105 grados Centgrados y pesarlos
b. Digestin de las muestras Pesar 1.0000 g de muestra para cada determinacin en un vaso de precipitados y adicionar 25 ml. de buffer de fosfatos y 100 _1 de Termamyl. Mezclar usando preferiblemente un agitador magntico. Cubrir los vasos con papel de aluminio y colocarlos en un bao de mara 90 grados C (agua hirviendo) durante 20 minutos. Adicionar 20 ml. De HC1 0.2 M y esperar hasta que el contenido del vaso llegue a temperatura ambiente, ajustar pH de solucin a 1.5 con HC1 5M. A cada muestra adicionar 1.0 ml. de solucin de pepsina y colocar en un bao de mara a 40 grados C. durante 1 hora con agitacin continua y suave. Retirar las muestras del bao, adicionar 1.0 ml de NaOH 5 M y ajustar el pH a 6.8.
62 Agregar 1.0 ml de solucin de pancreatina a cada muestra e incubar nuevamente a 40 grados C. durante 1 hora con agitacin contnua y suave Retirar las muestras del bao y ajustar el pH a 4.5.
c. Fibra dietaria total Terminada la digestin de las muestras, adicionar agua hasta llevar a un volumen de 100 ml. agregando posteriormente 400 ml. de etanol del 95% precalentado a 60 grados C. Dejar en reposo durante 1 hora y luego filtrar al vaco. Lavar el residuo inicialmente con 15 ml de etanol al 75% y luego con 10 ml de acetona. d. Correccin de los valores de fibra Para valorar el contenido de cenizas, se coloca uno de los crisoles en una mufla a 530 grados C. al menos por 4 horas. La cantidad de protena en la muestra se calcula por el mtodo de Kjeldahl para lo cual se transfiere el residuo del otro crisol a un matraz de digestin. e. Clculos
Muestra Peso de la muesra en miligramos Fibra ano corregida en miligramos (A) Peso (Crisol + celita + residuo) - Peso (crisol + celita) Ceniza no corregida en miligramos (B) Peso (crisol + celita + ceniza) - peso (crisol + celita) % Ceniza en la muestra (C) (B/A) x 100 Protena no corregida en miligramos (D) ml. de HCl X N del HCl X 14.007 X 6.25
63 % protena en la muestra (E): (D/A) X 100
Blanco Residuo de fibra en el blanco (G) Peso (crisol + celita + residuo) peso (crisol + celita) Ceniza en el blanco en miligramos (H) Peso (crisol + celita + ceniza) Peso (crisol + celita) % Ceniza en el blanco (1) (H/G) X 100 Protena en el blanco en miligramos (L) Ml de HCl X N del HCl X 14.007 x 6.25 % Protena en el blanco (M) (L/G) X 100
Blanco corregido G ((M + 1) / 100) x G
% de fibra dietaria en la muestra A [ (C+E)/100 x A] blanco corregido _____________________________________ X 100 Peso de la muestra
64 BIBLIOGRAFIA
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11. Enciclopedia mdica en espaol, Fibra soluble e insoluble, disponible en la pagina: http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/esp_imagepages/19531. Htm
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