LIC TM JUAN JOSE VELASQUEZ ALVARADO

VIROLOGIA
UNIVERSIDAD ALAS PERUANAS

Los 6 pasos que se utilizan para establecer que una enfermedad es producida por un virus son: 1. Aislamiento del virus a partir del huesped enfermo 2. Cultivo del virus en la celula huesped 3. Prueba de filtrabilidad (para excluir patogenos grandes) 4. Produccion de una enfermedad comparable cuando el virus cultivado se inocula en animales de experimentacion de la misma especie que el huesped original o en huespedes relacionados 5. Nuevo aislamiento del mismo virus a partir del huesped infectado experimentalmente. 6. Deteccion de una respuesta inmunitaria especifica contra el virus

CULTIVO DE LOS VIRUS EN EL LABORATORIO

Los virus crecer en un sistema husped, como animales, huevos embrionados o cultivos de tejidos (clulas). Algunos virus solo se desarrollan en animales. Los ratones, las ratas algodoneras, los conejos, y los cobayos, se usan para cultivos de virus. A veces los nicos modelos animales disponibles para el desarrollo de virus humanos son los monos. El desarrollo de los virus en animales es muy costoso por ello el mtodo preferido es el cultivo celular. Los cultivos celulares proporcionan el mtodo mas verstil para desarrollar y estudiar los virus.

CAMPANAS DE FLUJO LAMINAR

El pilar de las instalaciones virolgicas es la campana de bioseguridad de flujo laminar vertical. Estas instalaciones deben mantenerse muy limpias y a resguardo de corrientes de aire que transporten polvo, esporas y bacterias que pueden contaminar los cultivos. El aire limpio (manejo estril), es fundamental en estas instalaciones. Las campanas de bioseguridad proporcionan aire limpio en el rea de trabajo y proveen un flujo constante de aire hacia fuera de esta , para impedir que entre el aire de la habitacin. El aire que fluye hacia el exterior de la campana suspende y elimina los contaminantes que el personal introduce en el rea de trabajo. La parte mas importante de la campana de flujo laminar es el filtro de alta eficiencia para la retencin de bacterias. Una vez que el aire paso a travs de un prefiltro que retiene los contaminantes de mayor tamao (como las pelusas y el polvo) es canalizado a tarves del filtro de alta eficiencia para el control de particulas suspendidas (HEPA) , que elimina del aire el 99.97% de las particulas de 0.3 um o mayores.

Los virus causan varios cambios morfologicos comunes en las celulas que infectan, los efectos citopaticos son cambios visuales en el huesped que se deben a la infeccion viral. Los efectos citopaticos como la formacion de cuerpos de inclusion y la hemadsorcion son muy comunes y sirve para reconocer las celulas infectadas por virus. Los efectos citopaticos inducidos por virus se pueden examinar con microscopio de luz invertida de baja potencia. Se buscan redondeamiento y contraccion de las celulas, aumento de la refractibildad, fusion o formacion de sincitios, agregacion, perdida de la adherencia y lisis o muerte celular.

Los efectos citopaticos se producen como resultado de:

Ingreso del virus en el huesped (paso a traves de la membrana plasmatica) Inhibicion de la transcripcion celular o estimulacion de la actividad RNA polimerasa celular. interacciones del virus con las vias de procesamiento del RNA. interacciones del virus con el aparato de traduccion. respuestas del huesped a la infeccion viral.
No todos los virus causan efectos citopaticos, por tal razon deben usarse otros metodos para detectar las infecciones virales.

CUERPOS DE INCLUSION Son anormalidades intracelulares sutiles que solo tienen lugar en las celulas infectadas. Estos granulos intracelulares son los sitios visibles de la replicacion o ensamblaje viral. La presencia de un tipo especifico de cuerpo de inclusion puede ser indicativo o diagnostico de una infeccion viral determinada. Para ser visulizados en las celulas infectadas se fijan a la placa de cultivo, se tien con un colorante como la eosina, y se observa al microscopio optico. Los poxvirus, los paramixovirus, los reovirus, el virus de la rabia, los herpesvirus, los adenovirus, y los parvovirus inducen la formacion de cuerpos de inclusion visibles en las celulas

HEMADSORCION
Se emplea para detectar la presencia de virus unidos a los eritrocitos. El fenomeno se produce cuando los eritrocitos de un huesped infectado se unen al virus. Si se tiene un virus en solucion y se agregan eritrocitos, el virus pude interactuar con las celulas sanguineas y formar una estructura reticular como consecuencia de la aglutinacion de los eritrocitos. Esto se denomina HEMADSORCION. Los ensayos de hemadsorcion y de hemaglutinacion pueden ser utiles para detectar virus que producen poco o ningun efecto citopatico.

METODOS PARA ESTUDIAR LOS VIRUS EN EL LABORATORIO DE INVESTIGACION

Hay 4 metodos para estudier los virus en el laboratorio: Los ensayos de placas Los metodos de punto final de la dilucion o dosis infecciosas en cultivo de tejidos.(TCID)50 Los ensayos de hemaglutinacion Los ensayos de transformaciones (ensayos de foco)

EL ENSAYO DE PLACAS

Ensayo cuantitativo que permite determinar la cantidad de virus presente en una muestra. Se infectan las monocapas celulares con diluciones seriadas (potencia 10) de un virus. Cuando la partcula viral infecta una clula se replica y la destruye lo cual origina una placa. La monocapa de clulas infectadas es cubierta con agarosa para restringir el movimiento de los virus nuevos que se liberan.de tal forma que durante la replicacion los virus nuevos solo pueden infectar a las clulas circundantes, las cuales tambin son destruidas. al cabo de varios ciclos de replicacion se forma un rea o placa de clulas muertas.las placas se visualizan mediante la tincin de las clulas con colorantes como el rojo neutro o el violeta cristal. Cada virus en el inoculo original genera un rea clara (placa) o una UNIDAD FORMADORA DE PLACA(UFP). Un ensayo en placa mide la infectividad. Es posible que las partculas virales presentes en una muestra dada no sean infecciosas. Mas especficamente un ensayo de placa mide solo el numero de partculas infecciosas en una muestra, no el numero total de partculas.

ENSAYO DE PUNTO FINAL DE LA DILUCION (TCID)50 Se usa para aquellos virus que no forman placas pero que producen efectos citopaticos en cultivos celulares. Tambin se aplica para determinar la virulencia en experimentos con animales.. Los ensayos en cultivos celulares se realizan mediante la infeccin de monocapas celulares con diluciones seriadas del virus. Despus de la incubacin se observan las clulas infectadas por la presencia de efectos citopaticos y se les clasifica como + (positivas o infectadas) o - (negativas o no infectadas)

LA RESERVA DE VIRUS CONTIENE 10 0 000 UNIDADES (TCID)50

Cuando un ensayo de punto final de la dilucin se realiza en animales estos son inoculadas con el virus y observados para establecer si se produce muerte o enfermedad

HEMADSORCION

Como hemos visto antes algunos virus tienen la capacidad de aglutinar o formar un reticulado de eritrocitos a su alrededor cuando las partculas virales estn en una concentracin suficientemente alta. Los eritrocitos aglutinados pueden distinguirse fcilmente de las clulas no aglutinadas: los eritrocitos que no estn aglutinados se desplazan libremente hacia el fondo del nicho o celdilla y forman all un botn denso, fcil de identificar. Los eritrocitos aglutinados no pueden desplazarse libremente y dan lugar a una cubierta uniforme en el fondo de la celdilla. Este ensayo es simple y permite cuantificar virus hemaglutinantes. El virus que causa la hemaglutinacin puede ser infeccioso o no infeccioso.

ENSAYOS DE TRANSFORMACION (ENSAYOS DE FOCOS)

Se emplean para determinar si un virus es capaz de transformar o inmortalizar celulas en lugar de destuilas. Este fenomeno es mas notable con los virus que inducen tumores como los retrovirus. Las caracteristicas de las celulas transformadas son
Inmortalizacion de las celulas Perdida de la inhibicion por contacto (las celulas dejan de crecer en monocapas y, por el contrario, se apilan unas sobre otras formando un foco). Independencia de anclaje (las celulas pierden la necesidad de adherirse a una superficie solida para crecer) Tumorigenicidad (capacidad de formar tumores si se les inyecta en un modelo animal.

DIANOSTICO VIROLOGICO EN EL LABORATORIO CLINICO

La calidad de la muestra recolectada y su transporte desde el paciente hasta el laboratorio limitan la capacidad del personal para realizar las pruebas diagnosticas. Algunas de estas requieren que el virus sea aislado y se desarrolle en cultivos celulares, por lo tanto las condiciones de transporte deben asegurar de que el virus ser viable. Es fundamental que la muestra recolectada sea representativo del sitio de la infeccin. Cuanto menor sea el intervalo entre la recoleccin de la muestra y su entrega al laboratorio, mayores sern las posibilidades de aislar el virus.

ALMACENAMIENTO Y RECOLECCION DE MUESTRAS BIOLOGICAS PARA ESTUDIOS VIROLOGICOS

INFECCIONES DEL TRACTO RESPIRATORIO (p. ej. Adenovirus, virus de la gripe, enterovirus, rinovirus, RSV, coronavirus del SARS, virus de la rubeola) : lavados nasales y bronquiales, hisopados de sauces y nasal, y esputo. INFECCIONES OCULARES (adenovirus, enterovirus, herpes simple) : hisopados y raspados de fauces y conjuntiva. INFECCIONES DEL TUBO DIGESTIVO (reovirus, rotavirus, virus Norwalk, norovirus): material fecal e hisopados rectales. ERUPCION VESICULAR (coxackie, HSV, VZV): liquido vesicular, raspado cutneo. EXANTEMA MACULOPAPULAR (adenovirus y enterovirus):material fecal e hisopados de fauces y rectal. Un exantema maculopapular es generalmente un rea extensa eritematosa con ppulas pequeas y confluentes.

SISTEMA NERVIOSO CENTRAL MENINGITIS ASEPTICA Y ENCEFALITIS (enterovirus, virus de la rabia, arbovirus, HSV, CMV,virus de la parotiditis y del sarampion) : material fecal, tejido, saliva, biopsia cerebral,y LCR. GENITAL (como el HSV) : liquido o hisopado de las vesiculas. VIAS URINARIAS (adenovirus, CMV) : orina TRANSMISION SANGUINEA (HIV, HCV, HBV, HTLV) : sangre Si las muestras pueden ser procesadas en pocos dias , se las almacena generalmente en el refrigerador (4-8 *C). Si deben guardarse para su recuperacion en una fecha posterior, es mejor conservar las que potencialmente contienen virus a 70 *C o menos

LOS 3 ENFOQUES GENERALES PARA EL DIAGNOSTICO DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES VIRALES

1. Deteccion directa de los componentes virales en las celulas liquidos corporales o tejidos infectados ( microscopia electronica,o tincion inmunofluorescente). 2. Aislamiento viral ( genealmente em cultivos celulares, seguido de metodos basados en acidos nucleicos, como la reaccion de la cadena polimerasa PCR- ). 3. Serologia (demostracion de anticuerpos IgM , la clase de anticuerpos que se produciria solo transitoriamente despues de la infecciono recoleccion y analisis de sueros agudos y de convalecientes para detectar un incremento de 4 vecdes en el titulo de IgG.

DETECCION DIRECTA

Entre los metodos de deteccion directa tenemos a la microscopia electronica que permite visualizar las particulas virales contenidas en una muestra clinica. La mofologia de la particula hace posible clasificar al virus. Es un metodo rapido, consiste en un procedimiento simple de tincion negativa, util para examinar virus que no pueden desarrollarse en cultivos celulares. Dentro de sus desventajas tenemos que no es un metodo sensible, pues debe haber en 1 ml de muestra al menos 10 000 000 de virus para poder visualizarlos. Ademas se requiere de un microscopista experto y el microscopio electronico es muy costoso. Los rotavirus, coronavirus, astrovirus, virus de la Hepatitis A, y adenovirus han sido identificados de este modo.

Otro mtodo para detectar partculas virales es la INMUNOELECTROMICROSCOPIA, se agregan anticuerpos especficos a fin de concentrar el numero de partculas en una muestra. Los complejos antgenos anticuerpos se concentran por centrifugacin, despus la muestra se tie negativamente y se observa . En varios protocolos se usan molculas de anticuerpo marcado con marcadores electrodensos, como el oro coloidal , para mejorar la visualizacin de la reaccin entre el virus y el anticuerpo.

Los antigenos virales dentro de las clulas o en su superficie son detectables mediante inmunoflorescencia, se usan tejidos fijados o congelados que se preparan sobre un portaobjeto ( los cultivos de tejidos tambin pueden desarrollarse sobre portaobjetos de vidrio). Se deja que anticuerpos especficos contra el virus , los cuales contienen una marca fluorescente unida a la regin Fc, reacciona con la muestra que contiene el virus. Los anticuerpos que no se unieron se eliminan mediante lavado y la muestra se observa con microscopio de fluorescencia

AISLAMIENTO VIRAL
Para el aislamiento de los virus a partir de muestras clinicas se usan una variedad de metodos y sistemas huesped. Los virus pueden desarrollarse en huevos embrionados , animales de laboratorio, como ratones recien nacidos, y cultivos celulares en monocapas o en suspension. La calidad de la muestra es importante para las tecnicas de aislamiento viral. Para aislar un virus la muestra clinica se inocula en aquellos cultivos celulares que son mas sensibles al virus que se presume esta en la muestra. Los cultivos inoculados se evaluan a diario para determina la presencia de efectos citopaticos y se compara con cultivos no inoculados. Cuando un 50% de la monocapa muestra efectos citopaticos, este puede analizarse con inmunofluorescencia, hemadsorcion, ensayo de interferencia y otras tecnicas como el PCR y ensayos para detectar actividad enzimatica especifica, como la transcriptasa reversa.

Los ensayos de interferencia se emplean para detectar virus que no causan efectos citopaticos visiblesen los cultivos celulares pero que pueden detectarse por su capacidad de INTERFERIR con el desarrollo de un segundo virus que se agrego al mismo cultivo. Esto se conoce como FENOMENO DE INTERFERENCIA. el ensayo de interferencia se usa para la deteccion del virus de la rubeola. El virus de la rubeola no ocasiona efectos citopaticos en las celulas de rion de mono verde africano. Las celulas se incuban durante 10 dias y despues se le reinfectan o enfrenta con un segundo virus, como el ecovirus 11.se analiza en paralelo cultivos de control que no estan infectados con el virus de la rubeola. Al cabo de 2 dias no se observan efectos citopaticos en las celulas coinfectadas, pero si los hay en las celulas inhibioinfectadas con el ecovirus 11. por lo tanto el virus de la rubeola interfirio o inhibio el desarrollo del ecovirus11.

Kary Mullis concibio la tecnologia del PCR en 1983. este metodo se utilizo para replicar el DNA mediante una DNA polimerasa termoestable en un tubo de ensayo. La tecnologia de la PCR y de la transcripcion inversa seguida de PCR (RT-PCR ), alcanzaron un uso generalizado en los laboratorios clinico. Estos son metodos sensibles que se aplican para detectar los acidos nucleicos de los virus . En algunos casos la PCR puede realizarse directamente sobre las muestras clinicas. En oras situaciones el virus de la muestra se desarrolla en cultivos celulares y se aislan los acidos nucleicos de estos cultivoso de los viriones purificados y luego se los usa en las reacciones de PCR o RT-PCR. Los productos de PCR son sometidos a electroforesis en un gel de agarosa y se analizan los fragmentos de la PCR, algunas veces el DNA tambien es digerido con enzimas de restricciony los fragmentos se analizan de acuerdo a su patron electroforetico en un proceso llamado analisis del polimorfismo de la longitud de fragmentos de restriccion (RFLP).

SEROLOGIA VIRAL Los mtodos serolgicos son especialmente tiles para identificar virus de difcil desarrollo en cultivos celulares y virus que causan enfermedades de curso lento. El suero del paciente sirve para:

Identificar cepas virales (serotipos) Evaluar el curso de una infeccin Determinar si una infeccin es aguda o crnica La deteccin de anticuerpos contra un virus es una determinacin INDIRECTA de la infeccin viral.

ENSAYOS INMOSORBENTES LIGADOS A ENZIMAS (ELISA)

Estos tambien se conocen como ensayos enzimaticos (EIA) o Western inmunoblots se usan rutinariamente en el laboratorio de diagnostico para detectar antigenos virales en las muestras clinicas y para identificar o cuantificar anticuerpos antivirales en el suero. Se basan en la union de los anticuerpos a sus antigenos y en la deteccion de esta reaccion mediante anticuerpos comerciales conjugados con una enzima activa. La enzima recciona con el sustrato y produce un cambio de color.la observacion y la medicion del color determinan el resultado de la prueba.

ELISA PARA HIV

El ELISA es un metodo muy sensible y reaccionara incluso cuando solo 1 o 2 anticuerpos se hallen en la muestra de suero. Si la prueba de ELISA es reactiva o positiva, se repite. Si la segunda prueba tambien es positiva debe confirmarse el estado HIV positivo mediante Western inmunoblot. Asi los ELISA se usan para evaluar la presencia de virus y anticuerpos en las muestras de sueros de los pacientes. El western blot se volvio un procedimiento importante para detectar las infecciones por HIV, HTLV-1, HTLV-2, y las hepatitis virales. Aunque los ELISA son muy sensibles y altamente especificos, se producen reacciones falso positivos, debido a las reacciones cruzadas de los anticuerpos. Se requiere evaluaciones repetidas y una prueba de confirmacion mediante otro ensayo: WESTERN BLOT.

WESTERN BLOT
Consiste basicamente en la separacion de las proteinas virales ( a partir de viriones purificados que hay en el comercio) a traves de un gel de acrilamida. Este procedimiento se denomina ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA-SDS o SDS-PAGE (SDS es el dodecil sulfato de sodio), un detergente fuerte que desnaturaliza las proteinas. Durante la migracion a traves del gel de poliacrilamida , las proteinas se separan segn su tamao ( en este proceso la carga tambien es fundamental, ya que el SDS cargado negativamente cubre las proteinas y le otorga a estas la misma proporcion de masa y carga). Es caracteristico que las proteinas pequeas migren a traves del gel de poliacrilamida mas rapidamente que las proteinas grandes. Una vez que las proteinas han sido separadas, se les transfiere a nitrocelulosa conservando el mismo patron tal cual se encontraba en el gel. Las proteinas se unen a la nitrocelulosa, que despues se corta en tiras y se pone en contacto con el suero del paciente, o sueros positivos y negativos, como controles.