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Diagnstico de laboratorio de

CRYPTOSPORIDIOSIS INTESTINAL
Curso No. 8008-C

LIBRO DE TRABAJO DE AUTO-APRENDIZAJE DIAGNSTICO DE LABORATORIO DE CRYPTOSPORIDIOSIS* Curso No. 8008-C

Dr.P.H Sandra L. Bullock-Iacullo. Sucursal de desarrollo de mtodo de laboratorio Divisin de entrenamiento Oficina de Programas de entrenamiento y laboratorio *Nota: Pese a que este manual se desarroll originalmente para ser utilizado con los especimenes que se otorgaban para los ejercicios, la informacin que se da en este libro de trabajo es til, an sin estos especimenes de trabajo. Los estudiantes pueden realizar los procedimientos utilizando testigos de su propio laboratorio y materiales de compaas comerciales. Mayo 1988

U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Public Health Service Centros para el control y prevencin de enfermedades Atlanta, Georgia 30333

*Actualizado de la versin impresa original en Dic 2000. i

RECONOCIMIENTO

Deseo expresar un agradecimiento especial al Sr. Richard Green y al Sr. Don Howard por su fotomicrografa experta, a la Sra. Sara Cote por su ayuda en la preparacin de las ilustraciones, a la Sra. June Sumpter por corregir el manuscrito pacientemente y a la Sra. Shirley Holmes cuya magia en la computadora produjo la versin final de este manual.

Dr. P.H. Sandra L. Bullock-Iacullo.

El uso de nombres de marcas es nicamente para identificacin y no constituye un aval del Public Health Services o del US. Department of Health and Human Services.

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DIAGNSTICO DE LABORATORIO DE CRYPTOSPORIDIOSIS INTESTINAL Instrucciones previstas: auto-estudio. Nivel intermedio. La instruccin se limita al diagnstico de laboratorio; las referencias para la informacin clnica se enumeran en la ltima seccin de este libro de trabajo. La instruccin est dirigida hacia su uso en un ambiente de prctica de parasitologa en el laboratorio. SE PROPONE PARA LAS SIGUIENTES PERSONAS: Tcnicos de laboratorio con suficiente experiencia en parasitologa diagnstica que puedan identificar correctamente quistes de Giardia lamblia (sin. Giardia intestinalis) en frotis directos con solucin salina, laminillas teidas con lugol y tricrmica. Con las instrucciones escritas y el equipo y materiales necesarios, los tcnicos de laboratorio sern capaces de realizar la tincin cido-resistente y la tcnica de concentracin con formalina-acetato de etilo. TIEMPO REQUERIDO PARA COMPLETAR EL PAQUETE DE ESTUDIO: Aproximadamente 6 horas, tomando en consideracin que el equipo y materiales estn listos para usarse. MATERIALES QUE SE PROVEEN EN EL PAQUETE DE ESTUDIO: 1. Libro de trabajo 2. Seis viales con heces en formol (un testigo positivo y cinco desconocidos **) MATERIALES Y EQUIPO NECESARIOS: 1. Microscopio binocular equipado con el equivalente a una lmpara de halgeno de 20 watts, con objetivos de 40 X y 100X con aceite de inmersin, un filtro azul para luz de da y un ocular micromtrico calibrado. 2. Aceite de inmersin. 3. Laminillas de vidrio para microscopio, 76 x 50 mm, aproximadamente 20. 4. Cubreobjetos, grosor #1, 22 x 22 mm, aproximadamente 20. 5. Formol neutral buferado al 10%, aproximadamente 100 ml (la misma que para la tcnica de concentracin; ver instrucciones de preparacin en la pgina 14). 6. Solucin de lugol Dobell y O'Conner, aproximadamente 10 ml, fresco (ver instrucciones de preparacin en la pgina 14). 7. Aplicadores de madera, aproximadamente 40. 8. Pipetas Pasteur con bulbos de hule, aproximadamente 20. **No se ofrece en la versin del libro de trabajo en CD-ROM. 1

9. Materiales y soluciones para hacer la tcnica de concentracin de formalinaacetato de etilo (ver las instrucciones en la pgina 15). 10. Materiales y soluciones para hacer las tcnicas de tincin modificada de Kinyoun o cido-resistente de auramina O ambas (ver instrucciones en las pginas 18 y 21). OBJETIVOS: Al completar este programa de estudio y ofreciendo todos los materiales y el libro de estudio necesarios, los participantes sern capaces de: 1. Describir la morfologa de los oocistos de Cryptosporidium en frotis directo con preparaciones de solucin salina y solucin de lugol, y las preparaciones con tincin tricrmica y cido-resistente. 2. Describir los tipos de especimenes fecales que tienen ms probabilidades de contener oocistos y cules deben ser examinados rutinariamente para la presencia de oocistos. 3. Realizar la tcnica de concentracin de formalina-acetato de etilo en una muestra fecal que contenga oocistos y que se demuestre la presencia de estos al microscopio en un frotis fecal teido con solucin de lugol. 4. Utilizando el concentrado del #3 descrito arriba, realizar la tcnica modificada de Kinyoun o cido-resistente de auramina O ambas y demostrar la presencia de oocistos al microscopio. Para evaluar la realizacin de los objetivos de arriba, los participantes elaborarn pruebas en los oocistos de Cryptosporidium de los cinco viales de contenido desconocido del paquete de estudio. Los participantes deben informar sobre la presencia o ausencia de oocistos en cada muestra. Se considerar como desempeo satisfactorio (80%) cuando se ofrezcan reportes correctos para cuatro de las cinco muestras. NOTA IMPORTANTE ACERCA DE Isospora belli: Aunque este programa de estudio se enfoca especficamente al diagnstico de laboratorio de los oocistos de Cryptosporidium, los procedimientos que se han dado, especialmente la tincin cido-resistente, pueden ser utilizados para el diagnstico de los oocistos de Isospora belli. La informacin adicional acerca de los oocistos de Isospora belli sobre la tincin cido-resistente, se da con cada tcnica de tincin y se ofrece en la seccin del libro de trabajo (seccin azul). Referencias para la informacin clnica de Cryptosporidium, se incluyen tambin en la ltima seccin del libro de trabajo. * No se incluye en la versin en CD de este libro de trabajo. 2

MEDIDAS DE SEGURIDAD: Las muestras fecales en este programa de estudio estn conservadas en formol neutro buferado al 10% y lo ms seguro es que no sean infecciosas**. Sin embargo, TODOS LOS ESPECIMENES, especialmente los especimenes sin conservadores, deben ser tratados como infecciosos capaces de transmitir infecciones de importancia. Las heces pueden contener virus, bacterias, protozoarios e incluso algunos helmintos, los cuales son inmediatamente infecciosos. Por favor siga de cerca las medidas de seguridad de su laboratorio para manejar y muestrear los especimenes mdicos. Las siguientes referencias pueden ser tiles para conocer las medidas de seguridad y pruebas en especimenes mdicos: Centros de Control de Enfermedades. Recommendations for prevention of HIV transmission in health-care settings. . Morbidity and Mortality Weekly Report (MMWR), 1987;36(2S) :3S-18S. Miller BM, Groschel DHM, Richardson JH, et al., editores. Laboratory safety: principles and practices. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1986:372. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Protection of laboratory workers from infectious disease transmitted by blood and tissue; proposed guideline. Villanova, PA: NCCLS, 1987; NCCLS Documento M29-P. Richardson JH, Barkley WE, editores. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. 1s ed. Atlanta, GA: Centros de Control de Enfermedades-Institutos Nacionales de Salud, PHS, HHS, 1984; HHS publicacin no. (CDC) 86-8395. ** No se ofrecen en la versin del libro de trabajo en CD-ROM.

Cryptosporidium: MORFOLOGA Y DETECCIN El diagnstico de laboratorio de cryptosporidiosis usualmente requiere de un mayor esfuerzo que para otros parsitos intestinales. El oocisto, que es la etapa diagnstica en coccidias, son muy pequeos e incoloros y no se detectan fcilmente en los exmenes de rutina. Muy frecuentemente, se requiere de procedimientos especiales (un examen microscpico meticuloso en un aumento mayor o tcnicas de tincin diferentes), para hacer una identificacin positiva de estos oocistos tan pequeos. Este programa de auto-aprendizaje provee instrucciones y prcticas para obtener la experiencia visual para detectar desde un nmero reducido, hasta un gran nmero de oocistos en un espcimen dado, adems de que provee los protocolos e instrucciones para las tinciones especiales.

Usted debera ahora ESTUDIAR ahora la informacin en las siguientes pginas sobre la morfologa y la deteccin de oocistos. Una vez que tenga una imagen mental clara de cmo se ven los oocistos y en qu especimenes es ms factible que los encuentre, vaya a la siguiente seccin del libro de trabajo y siga las instrucciones y PRACTIQUE, PRACTIQUE, PRACTIQUE. A travs de la PRCTICA usted ser competente y obtendr la confianza para detectar eficientemente oocistos en muestras fecales.

Muchos procedimientos publicados se utilizan para la recuperacin y deteccin de oocistos. Aquellos que se escogieron aqu, parecen ser los ms exitosos y ms econmicos para la mayora de los laboratorios.

MORFOLOGA DEL OOCISTO: Su rango de tamao es de 4-6 m; la mayora son de 5-6 m. Su forma es usualmente esfrica, rara vez oval. Es inmvil. La pared del oocisto es muy delgada y de apariencia delicada. Los oocistos maduros contienen 4 esporozotos desnudos (no presenta esporoquistes) y un solo cuerpo residualobscuro. Los esporozotos son altamente refrctiles a la luz. Variaciones que se observan en el microscopio ptico de campo claro: En infecciones agudas, se excreta frecuentemente un nmero grande de lo que parecen oocistos inmaduros. Estas formas presentan las caractersticas descritas arriba con la excepcin que los esporozotos individuales no se observan. En cambio, el material que da lugar a los esporozotos se observa sin divisin y se sujeta a la pared del oocistos, dando la impresin de una dona o media luna pequea y muy refrctil. Los cuerpos residuales son generalmente grandes y visibles en estas formas. La pared del oocisto se puede ver pero es muy delgada y frecuentemente se colapsa unilateralmente. En infecciones que se estn resolviendo y en infecciones crnicas, los oocistos presentan una morfologa tpica, sin embargo no todos los esporozotos son visibles en los oocistos. Adems de que generalmente hay un nmero significativamente menor de oocistos presentes. Apariencia de los oocistos en diferentes tipos de preparaciones: SOLUCIN SALINA: La morfologa es como se describe anteriormente. La caracterstica ms notable es que a un aumento de 400 X los oocistos son ms refrctiles que las estructuras similares en tamao y forma que la rodean. En aumento con el objetivo 1000 X con aceite de inmersin, se observan muchas, aunque no todas, de las estructuras antes descritas. Con una observacin cuidadosa, los oocistos se pueden diferenciar de levaduras comunes con base a la forma, grosor de la pared celular, y la apariencia de los contenidos internos. Las levaduras son ovales, con pared celular gruesa y su citoplasma est lleno de grnulos oscuros. 5

SOLUCIN DE LUGOL DE DOBELL Y O'CONNER: Los oocistos tpicamente no se tien con lugol, pero permanecen claros y muy refrctiles a la luz, an cuando se les deje en la solucin por un largo perodo. Las levaduras rpidamente se tien de un color caf-amarillento y por lo tanto se distinguen fcilmente de los oocistos. Generalmente el aumento 400 X es suficiente para ver la diferencia. NOTA 1: Una levadura degenerada (levadura "fantasma") consiste en una pared celular gruesa y escaso contenido interno que no acepta la tincin de lugol. El examen en aumento de 1000 X mostrar una pared gruesa en la levadura sin teir. Algunos oocistos atpicamente aceptarn la tincin de lugol en un tiempo relativamente corto; algunos la aceptan en pocos minutos despus del contacto. La causa es desconocida, por lo que los especimenes deben examinarse tan pronto se sometan a la solucin de lugol.

NOTA 2:

TINCIN TRICRMICA: Los oocistos generalmente no se tien con tincin tricrmica y aparecen como huecos en el fondo fecal. Sin embargo, ocasionalmente algunas cepas de oocistos adquieren un color de rosa a rojo pero NO SE RECOMIENDA EL USO DE TINCIN TRICRMICA PARA EL DIAGNSTICO DE OOCISTOS DE Cryptosporidium. TINCIN CIDO-RESISTENTE MODIFICADA DE KINYOUN: Los oocistos de Cryptosporidium son alcohol cido-resistentes y adquieren un color rojo-oscuro con la tincin. La mayora se observan como bolas, pequeas y slidas. Algunas veces, solo los esporozotos dentro del oocistos maduro retienen la tincin y por lo tanto aparecen como cuatro pequeas salchichas juntas. El encontrar estas formas que contienen esporozotos confirma que estas estructuras son oocistos. Muchas levaduras y otras estructuras adquieren la coloracin de la tincin de contraste, generalmente verde o azul. TINCIN CIDO-RESISTENTE DE AURAMINA O: Esta es una tincin fluorescente y requiere de un microscopio de fluorescencia. Aqu los oocistos cido-resistentes adquieren un color naranja-amarillento brillante y se observan como un cuerno slido o con apariencia de crter. Algunas veces se pueden observar esporozotos individuales. Los materiales que no son cido-resistentes o parcialmente cido-resistentes fluorescentes adquieren un color plido. La mayora de las levaduras no se tien.

DETECCIN DE OOCISTOS: Tipos de heces: Recuerde que las heces estn clasificadas con base a la consistencia:
FORMADA SUAVE SUELTA ACUOSA

En cryptosporidiosis aguda (frecuente en nios inmunocomprometidos), por lo general en cuanto ms lquida sea la evacuacin, mayor nmero de oocistos. Frecuentemente las evacuaciones acuosas y sueltas que contienen un gran nmero de oocistos son de color claro, (ej. amarillo plido, caf o verde) y se ven homogneas. Las heces suaves usualmente contienen menos oocistos. Las heces formadas contienen muy pocos oocistos. En infecciones crnicas (usualmente en personas inmunocomprometidas, como las que tienen sndrome de inmunodeficiencia adquirida), los oocistos presentan un rango de muchos a escasos, an en heces lquidas. Todas las muestras de heces de personas que se sabe o se sospecha estn inmunocomprometidas deben examinarse para oocistos de Cryptosporidium. Sistema sugerido para recuperar y detectar oocistos: Los oocistos se pueden recuperar de heces frescas sin conservantes o de heces conservadas con formol neutral buferada al 10% (es importante que est buferada para una concentracin de oocistos efectiva), fijador MIF, fijador SAF, o fijador PVA. Puesto que la preservacin con formol permite que los oocistos se tian mejor con el lugol o las tinciones cido-resistentes, se recomienda su uso de rutina. Adems, puesto que los oocistos de Cryptosporidium son infecciosos al ser excretados, la preservacin con formol antes del examen probablemente reduce la posibilidad de transmisin de la infeccin. Todas las muestras de heces del programa de estudio estn conservadas en formol neutral buferado al 10%. Cuando se reciben especimenes con la solicitud de un examen de rutina para parsitos, el primer paso es determinar la consistencia de las heces cuando se eliminan. Si el espcimen no est conservado, esto se hace fcilmente al ver las heces y compararlas con las imgenes arriba. Si el espcimen est conservado, el envase o la solicitud deben estar marcados con la consistencia original de la muestra. Aunque el saber cul es la consistencia de la muestra no es imperativo para el examen, aumenta la eficacia del trabajo. No es necesario y es poco prctico realizar un procedimiento especial para cada espcimen. Como se explic anteriormente, la cantidad de oocistos que se pueden obtener de una muestra formada es muy escasa. 8

Como rutina, todos los especimenes sin formar o acuosos, y aquellas personas que son o se sospecha que estn inmunocomprometidas, deben ser revisados para oocistos de Cryptosporidium. As mismo, todos los especimenes con una solicitud especial para Cryptosporidium, se deben examinar, sin importar la consistencia de las heces. La experiencia de aquellos que hacen los exmenes determinarn hasta que grado y cmo se van a analizar estos especimenes. Algunos laboratorios revisan visualmente con lugol todos los especimenes candidatos y usan tincin (es) cido-resistente(s) para confirmar aquellos especimenes sospechosos y/o para tener un registro permanente de los especimenes positivos. Otros laboratorios realizan como rutina la tincin cido-resistente en todos los especimenes. Esto, por supuesto, requiere ms tiempo y energa pero reduce la probabilidad de perder aquellos especimenes con pocos oocistos. Cada laboratorio debe evaluar sus propias capacidades y recursos, y es usualmente la poblacin de pacientes la que decide cul es el sistema ms apropiado. Sin importar el sistema de deteccin que ha seleccionado el laboratorio, todos los especimenes deben ser concentrados antes de ser examinados al microscopio. Aunque hay tcnicas especiales para concentrar oocistos, se ha demostrado que la tcnica mas popular para concentrar muestras fecales para parsitos es la de la formalina-acetato de etilo (FAE), que tambin concentra oocistos de Cryptosporidium. Por eso, la formalina-acetato de etilo, es la tcnica que recomendamos y utilizamos en este programa de estudio. Despus de la concentracin, el sedimento resultante puede ser examinado por una, dos o una combinacin de tres diferentes tcnicas. Estas son: 1. Examen microscopio meticuloso con un gran aumento, usando la solucin de lugol de Dobell and O'Conner. 2. Tincin cido-resistente modificada de Kinyoun. 3. Tincin cido-resistente de auramina O. Cada tcnica es ms til que otras en determinadas circunstancias. Para crear una rutina, por ej. el examen con lugol para heces sueltas o acuosas, es el mtodo ms fcil y econmico, pero requiere de una gran experiencia y no es tan sensible como otros. Si la experiencia de los tcnicos de laboratorio es limitada, debern realizar la tincin cido-resistente en estos especimenes para poder detectar de pocos a escasos oocistos. Para otros especimenes, que no estn en el examen de rutina, se requiere la tincin cido-resistente. La tincin modificada de Kinyoun es fcil y deja un registro permanente, pero no es tan confiable como la tincin de auramina O para teir oocistos. Adems es ms difcil detectar a los oocistos cuando son escasos en preparaciones con Kinyoun que con auramina O. 9

Auramina O es una prueba bastante sensible y fcil de hacer, pero se requiere de microscopio de fluorescencia para examinar las muestras, y a veces hay restos pequeos que se parecen a los oocistos. Para disminuir el riesgo de confundir los restos con oocistos, el tcnico de laboratorio debe revisar, por otro mtodo cualquier espcimen que tenga de pocas a escasas estructuras parecidas a los oocistos que no presenten esporozotos internos. La otra tcnica debe evidenciar suficientes caractersticas de los oocistos para permitir una identificacin positiva.

EL PRACTICAR CADA TCNICA LE AYUDAR A DECIDIR CUAL UTILIZAR EN SU LABORATORIO, AS QUE PASE A LA SIGUIENTE SECCIN DEL PROGRAMA DE ESTUDIO Y PRACTIQUE, PRACTIQUE, PRACTIQUE.

**Nota: Este ejercicio de auto-aprendizaje se public antes del uso de la tcnica de antgenos marcados con fluorescena para diagnosticar Cryptosporidium.

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EJERCICIOS DE ESTUDIO ASEGRESE DE TENER TODOS LOS MATERIALES Y EL EQUIPO LISTOS PARA USARSE. NO OLVIDE LOS MATERIALES PARA EL EJERCICIO DE CONCENTRACIN Y TEIDO. 1. Prepare las laminillas sin teir y teidas con lugol a partir de la muestra positiva usando el procedimiento siguiente: a. Identifique apropiadamente una laminilla 76 x 50 mm. b. Utilice la pipeta Pasteur, coloque de 1/3 a 1/2 de gota (una gota completa es mucho) de solucin salina a un lado de la laminilla y una

cantidad similar de solucin de lugol en el otro lado c. Agite bien el vial con el espcimen, y usando una pipeta Pasteur

limpia, coloque de 1/3 a 1/2 de gota del testigo positivo a un lado del diluyente. d. Utilizando la esquina del cubreobjetos, mezcle la solucin salina y el espcimen y coloque el cubreobjetos encima de la mezcla. e. Utilizando un segundo cubreobjetos, repita el procedimiento anterior con el lado de lugol-espcimen. Estas preparaciones deben ser suficientemente delgadas. Puede usted voltear el portaobjetos hacia abajo y el cubreobjetos se mantendr en su lugar. Si esto no es posible intntelo de nuevo con cantidades menores de diluyente y espcimen. f. Las orillas de estas preparaciones se pueden sellar con una mezcla 1:1 de vaselina:parafina derretidas, para prevenir la desecacin durante algunas horas. El sellado tambin permite estabilizar el material para ser observado con aceite de inmersin. Sin embargo, como usted observar sus preparaciones de inmediato y stas son delgadas el sellado no es esencial. 11

2. Observe cuidadosamente el espcimen en lugol a un aumento de 400 X. Durante la observacin debe usted rotar el micromtrico casi continuamente. Al hacer esto usted podr ser capaz de ver claramente objetos altamente refrctiles de 5 m aproximadamente, que contrastan con el fondo amarillo. Enfoque claramente para localizar uno, colquelo en el centro del campo y cambie al objetivo 100X con aceite de inmersin. A este aumento (1000 X), usted debera poder ver los detalles internos. Si usted puede observar una pared celular delgada, esporozotos y cuerpos residuales, est usted viendo oocistos de Cryptosporidium. Compare con la fotografa de la seccin anterior del libro de trabajo. Observe varios para adquirir un rango de variabilidad. 3. Despus de observar varios oocistos en las preparaciones con lugol, observe las preparaciones con solucin salina. Aunque no se detecta fcilmente a los oocistos en solucin salina, el ejercicio tiene el propsito de obligar a que sus ojos observen la caracterstica refraccin. Cuando domine usted la deteccin observando la refraccin, podr usted detectar exitosamente oocistos en frotis directos. Asegrese de observar a los organismos con los aumentos 400 X y 1000 X. 4. Ahora regrese a la preparacin con lugol y PRACTIQUE, PRACTIQUE, PRACTIQUE. 5. Siguiendo las instrucciones de la pgina 17, realice la tcnica de concentracin de formalina-acetato de etilo en un testigo positivo. Al final del procedimiento, asegrese de drenar todo el fluido del sedimento y retire todos los restos de acetato de etilo de la pared del tubo. Cualquier residuo de acetato de etilo puede hacer que el material se disperse en la laminilla y resultar en una mala preparacin. Despus de quitar el fluido, agregue 2-4 gotas de formol neutral al 10% y mezcle bien con una pipeta Pasteur limpia. Para prevenir la evaporacin tape el tubo. Finalmente, prepare las preparaciones con solucin salina y lugol y observe los oocistos al microscopio bajo los aumentos 400 X y1000 X. Note que se observa un mayor nmero de oocistos por campo que en el frotis directo del espcimen; la tcnica de formalina-acetato de etilo concentra los organismos. 6. Usando el mismo sedimento para la tcnica de formalina-acetato de etilo, realice cualquiera de las tcnicas de tincin cido-resistente descritas en las pginas 18 y 21. Usted seleccionar la tcnica (s) apropiada (s) para su laboratorio. Compare los oocistos teidos con las imgenes de la pgina 7. 7. Cuando complete los ejercicios de arriba y sienta confianza en la deteccin de oocistos, pruebe los cinco especimenes desconocidos que se le dieron en el paquete de estudio. Use la tcnica, o una combinacin de tcnicas que utilizar posteriormente en su laboratorio. 8. Registre los resultados de cada espcimen en la parte posterior del libro de trabajo. Por favor siga las instrucciones descritas en la forma de la cuantificacin de organismos; tambin siga las instrucciones en el formulario provisto en cuanto al doblado y envo por correo con la direccin incluida. 12

El completar exitosamente el programa de estudio, por ejemplo cuatro de los cinco especimenes desconocidos correctos, le otorga 0.6 unidades CDC de educacin continua

No se aplica para la versin en CD de este libro de trabajo.

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TCNICAS Y REFERENCIAS I. Preparacin de la solucin de lugol de Dobell y O'Connor Prepare mensualmente una cantidad fresca: Yodo (cristales en polvo) Yoduro de potasio Agua destilada 1 gm 2 gm 100 ml

Disuelva el yoduro de potasio en agua. Agregue los cristales de yodo y agite cuidadosamente. Puede ser que los cristales no se disuelvan completamente, la solucin deber adquirir un color caf-rojizo o de t fuerte. Decante en una botella mbar con gotero u otro tipo de botella mbar. Ya que la mayora de los laboratorios no utilizan toda la solucin en un mes, se sugiere el siguiente procedimiento. 1. Prepare 500 ml de yoduro de potasio al 2% (10 g en 500 ml de agua destilada). 2. Guarde la solucin base de yoduro de potasio en una botella mbar con tapn de vidrio. Se mantendr por varios meses. Vierta una pequea cantidad (20-30 ml) en un matraz o vaso de precipitado y agregue cristales de yodo (aproximadamente 0.2-0.3 g; la cantidad exacta no es importante) agite hasta que la solucin adquiera el color apropiado. Renuvela cada mes. II. Preparacin de formol neutral buferado al 10% La preparacin comercial de formaldehdo tiene aproximadamente una concentracin de 40% por volumen, lo que significa que 10% de formol es cerca de 4% de formaldehdo. Na2HPO4 NaH2PO4 Formaldehdo Agua (de la llave o destilada) 6.10 g 0.15 g 800 .0 ml 7,200.0 ml

Mezcle el formaldehdo y el agua. Agregue las sales buferadas y mezcle bien. Se hacen 8 litros de formol neutral al 10%. sta solucin se mantiene indefinidamente.

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III. Tcnica de concentracin de formol-acetato de etilo A. Materiales y soluciones necesarios: 1. Vasos de papel pequeos (100 a 120 ml) (PARA ESPECIMENES FRESCOS SOLAMENTE) 2. Aplicadores de madera 3. Copas de papel cnicas con el pice cortado embudos pequeos 4. Gasa o tela de cedazo del #50 5. Tubos para centrfuga (15 ml, vidrio o polipropileno) 6. Tapones para tubos de centrfuga 7. Centrfuga 8. Pizetas para agua y formalina-acetato de etilo. La botella de acetato de etilo requiere un tapn. 9. Reloj o cronmetro 10. Hisopos de algodn (no estriles) 11. Pipetas Pasteur con bulbos 12. Laminillas de vidrio para microscopio de 76 x 50 mm 13. Cubreobjetos de grosor #1, 22 x 22 mm 14. Agua de la llave 15. Acetato de etilo, grado certificado 16. Formol neutral buferado al 10%. Ver la frmula de preparacin en la pgina 14. B. Tcnica para especimenes en fresco 1. Mezcle bien una porcin de las heces del tamao aproximado de una canica con agua suficiente para hacer una suspensin de tal manera que 10 ml de sta resulte en un ml de sedimento posterior a la centrifugacin. La suspensin se puede preparar en un vaso pequeo de papel. 2. Pase por el colador aproximadamente 9 ml de la suspensin a travs del pequeo embudo con dos capas simples de gasa o una capa de cedazo. Para conservar materiales de vidrio, se puede sustituir el embudo con un vaso cnico de papel sin pice. 3. Centrifugue a 500 x g por 10 minutos. Decante el sobrenadante. Debe quedar un 1 ml de sedimento. Si la cantidad es mucho mayor o mucho menor, ajuste a la cantidad adecuada con los siguientes mtodos: a. Cantidad excesiva. Resuspenda el sedimento en agua y elimine una porcin. Por ejemplo, si la cantidad es el doble de la deseada, elimine la mitad de la suspensin. Agregue agua para tener un nivel de fluido de 10 ml y centrifugue nuevamente. 15

b. Cantidad escasa. Vierta el sobrenadante y cuele una segunda porcin de la suspensin original de heces en el tubo. La cantidad por colar puede determinarse por el sedimento, si es aproximadamente la mitad de lo necesario, cuele otros 10 ml en el tubo. Centrifugue nuevamente. No es necesario tener la cantidad exacta de sedimento en el tubo, pero la cantidad debe ser aproximada a lo indicado anteriormente. Si la cantidad de sedimento es demasiada o muy poca puede resultar en una concentracin ineficiente. 4. Resuspenda el sedimento en agua fresca, centrifugue, y decante como antes. 5. Agregue 9 ml de formol neutral al 10% al sedimento, mezcle bien, y permita que repose por 5 minutos o ms. En este punto, la mezcla debe ser cerrada y guardarse hasta ms tarde. 6. Agregue 4 ml de acetato de etilo, tape el tubo y mezcle vigorosamente cuando menos por 30 segundos, manteniendo el tubo invertido. Retire el tapn cuidadosamente. 7. Centrifugue a 500 x g por 10 minutos. Se obtendrn cuatro capas: (1) capa de acetato de etilo, (2) tapn de deshechos, (3) capa de formol, y (4) sedimento. 8. Libere el tapn de deshecho desde los lados del tubo introduciendo un aplicador y decante las tres capas superiores. Antes de regresar el tubo a la posicin vertical, utilice un hisopo para limpiar los desechos y trazas de acetato de etilo de las paredes del tubo para evitar que se sedimenten. La presencia de acetato de etilo en el sedimento final puede causar problemas para elaborar un frotis directo adecuado. 9. Con una pipeta, agregue el doble de la cantidad de formol neutral al 10% que la cantidad final de sedimento. Por ejemplo, si se tiene 0.2 ml de sedimento final, agregue 0.4 ml de formol. Tenga cuidado de no agregar mucho, de lo contrario el espcimen estar muy diluido como para hacer una preparacin satisfactoria. Una vez agregado el formol, el tubo se debe tapar y se puede guardar por algn tiempo (meses). Desde luego que no se debe permitir que el sedimento se seque.

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10. Con una pipeta Pasteur, mezcle el sedimento y el formol y haga las preparaciones con lugol y frotis sin teir como acostumbre para su examen microscpico. C. Tcnica para conservar especimenes en formol 1. Mezcle bien o revuelva el espcimen en formol. 2. De acuerdo a la densidad del espcimen, cuele una cantidad suficiente a travs de dos capas de gasa simple o una capa de cedazo obtenga en un tubo de centrifuga la cantidad adecuada de sedimento como se indica abajo. Usualmente es suficiente de 2 a 3 ml de heces a no ser que la suspensin est muy diluida. 3. Agregue agua de la llave hasta tener 9 ml de suspensin, mezcle bien, y centrifugue a 500 x g por 10 minutos. 4. Decante el sobrenadante. La cantidad de sedimento debe ser aproximadamente de 0.5 ml. Si la cantidad es poca o mucha, ajuste la cantidad siguiendo el mismo mtodo descrito en el paso 3 para especimenes frescos. En aquellos especimenes conservados en formol estos se han aclarado en algn grado, y aclararn ms principalmente por el acetato de etilo. De tal manera que la reduccin del sedimento es menor que en heces frescas y la cantidad inicial debe ser menor. 5. Agregue 9 ml de 10% formol neutral al sedimento y mezcle bien. 6. Agregue 4 ml de acetato de etilo, tape el tubo, mezcle en posicin invertida por 30 segundos. Retire el tapn cuidadosamente. 7. Centrifugue a 500 x g por 10 minutos. Se obtendrn 4 capas. Ver la descripcin en el paso 7 para especimenes frescos. 8. Libere el tapn de deshechos de los lados del tubo por medio de un aplicador y decante cuidadosamente las tres capas superiores. Antes de regresar el tubo a la posicin vertical, utilice el hisopo para limpiar los desechos y todos los restos de acetato de etilo de las paredes del tubo para prevenir que se sedimente. La presencia de acetato de etilo en el sedimento final puede causar problemas para elaborar un frotis directo adecuado.

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9.

Con una pipeta, agregue el doble de la cantidad de formol neutral al 10% que la cantidad final de sedimento. Por ejemplo, si se tiene 0.2 ml de sedimento final, agregue 0.4 ml de formol. Tenga cuidado de no agregar mucho, de lo contrario el espcimen estar muy diluido como para hacer una preparacin satisfactoria. Una vez agregado el formol, el tubo se debe tapar y se puede guardar por algn tiempo (meses). Desde luego que no se debe permitir que el sedimento se seque.

10. Con una pipeta Pasteur, mezcle el sedimento y el formol y haga las preparaciones con lugol y frotis sin teir como acostumbre para su examen microscpico. Ver la pgina 11. IV. Tincin cido-resistente modificada de Kinyoun para oocistos Cryptosporidium* en muestras de heces

Las tinciones cido-resistentes son tiles para distinguir los oocistos de Cryptosporidium de otros organismos que se encuentran en las heces, particularmente levaduras. Los oocistos son cido-resistentes y retienen el color rojo de la tincin de carbol-fucsina despus de la decoloracin cida. Puesto que muchas levaduras no son cido-resistentes, se decoloran al someterlas al decolorante cido, por lo que adquieren la tincin de contraste. La tcnica que se presenta aqu es un mtodo modificado en fro adaptado por Marilyn S. Bartlett, del Departamento de Microbiologa/Patologa del Centro Mdico de la Universidad de Indiana, basado en la tincin cido-resistente de Kinyoun modificada para Nocardia. *Esta tcnica puede utilizarse tambin para teir oocistos de Isospora belli A. Materiales y soluciones necesarias: 1. Laminillas de vidrio, 76 x 26 mm 2. Pipetas Pasteur con bulbos 3. Vasos de Coplin, con capacidad de 50 ml 4. Pinzas para manipular las laminillas 5. Reloj o cronmetro 6. Papel secador 7. Medio para montar laminillas 8. Cubreobjetos, de espesor #1, 22 x 22 mm 9. Microscopio (descripcin en la pgina 1) 10. Agua corriente de la llave (chorro suave) 11. Alcohol metlico absoluto

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12. Tincin cido-resistente: Carbol-fucsina modificada Kinyoun a. Tincin comercial: Carbol-fucsina modificada Kinyoun Frmula, EMDS/Harleco #7645X b. Preparacin: Fucsina bsica, ndice de color No.42510 Alcohol etlico, 95% Fenol, lquido Agua destilada 4g 20 ml 8 ml 100 ml

Se coloca el colorante de fucsina bsica en un matraz Erlenmeyer de 500 a 1,000 ml. Se agrega el alcohol lentamente, mezclando constantemente para disolver el polvo. (La fucsina bsica tiende a hervir cuando se agrega el alcohol; es importante agregar el alcohol lentamente y mezclar constantemente.) Agregar el fenol y el agua a la solucin colorante. Mezcle bien. Guarde en una botella con tapa de rosca. 13. 50% Alcohol etlico Alcohol etlico Agua destilada 50 ml 45 ml

Mezcle bien. Guarde en una botella de vidrio con tapn de vidrio. 14. Decolorante cido cido sulfrico, concentrado Alcohol etlico, 95% 10 ml 90 ml

Mezcle el cido con el alcohol. Guarde en una botella de vidrio con tapn de vidrio. 15. Tincin de contraste: Verde malaquita Verde malaquita, ndice de color No. 42000. Agua destilada 3g 100 ml

Disuelva el colorante en agua. Guarde en una botella de vidrio con tapn de vidrio. 19

B. Tcnica: 1. Haga un frotis delgado de una muestra de heces en una laminilla de 76 x 26 mm. El frotis puede hacerse de heces frescas, sin conservar o de heces conservadas con formol neutral al 5% o 10%. Los frotis hechos del sedimento despus de la concentracin de formalina-acetato de etilo puede dar un buen nmero de oocistos. 2. Deje secar el frotis al aire a temperatura ambiente, o puede acelerar el proceso de secado incubando a 37-42 C. 3. Fije el frotis con alcohol metlico absoluto por 30 segundos. Mantenga la laminilla inclinada, utilizando una pizeta o gotero, permita que el alcohol bae la laminilla, O sumerja la laminilla en un vaso de Coplin con alcohol metlico. Permita secar. 4. Coloque la laminilla en la tincin de carbol-fucsina (en vaso de Coplin) por 5 minutos a temperatura ambiente. 5. Enjuague brevemente en agua corriente de la llave. 6. Enjuague con alcohol etlico al 50% alcohol etlico (en vaso de Coplin) por 5 segundos agitando suavemente. 7. Enjuague brevemente en agua corriente de la llave. 8. Decolore con alcohol H2SO4 al 10% (en vaso de Coplin) por 1-2 minutos. Ajuste el tiempo dependiendo del grosor del frotis. 9. Enjuague en agua corriente de la llave. 10. Sumerja la laminilla en la tincin de verde malaquita por 2 minutos. 11. Enjuague brevemente en agua corriente de la llave. 12. Seque perfectamente limpiando la parte de atrs de la laminilla y suavemente golpeando el frente. 13. Cubra con el cubreobjetos del #1 utilizando un medio para montar adecuado. 14. Examine con el microscopio de campo brillante en aumento de 400 X y 1000 X. Los oocistos de Cryptosporidium se tien de rojo. A veces se pueden observar esporozotos individuales teidos de rosa a rojo dentro de la pared del oocisto o en grupos de cuatro sin una pared del oocisto. Los oocistos de Isospora belli tambin se tien, pero no por completo. La masa germinal dentro del oocisto se tie de rojo y aunque la pared no se tie, a veces se precipita la tincin alrededor, delineando la estructura total. Frecuentemente, la pared del oocisto se colapsa, pero en presencia de otros oocistos, el parsito todava se puede reconocer.

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V.

Tincin cido-resistente de Auramina O para oocistos de Cryptosporidium* en heces.

Desde la demostracin de que los oocistos de Cryptosporidium son naturalmente cido-resistentes, se ha utilizado una variedad de tinciones cidoresistentes para distinguir las coccidias de levaduras, otros protozoarios y la materia fecal normal. sta tcnica emplea auramina O, un tinte utilizado para tincin general y procedimientos de microscopa fluorescente. Esta es una autntica tincin cido-resistente y no se debe confundir con el procedimiento de anticuerpos fluorescentes (FA). Es una adaptacin del procedimiento de auramina O utilizado para detectar Mycobacterium spp. en algunos laboratorios clnicos. *Esta tcnica tambin es efectiva para teir oocistos de Isospora belli. A. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Materiales y soluciones necesarias: Laminillas de vidrio para microscopio, 76 x 26 mm Pipetas Pasteur con bulbos Platina caliente elctrica a 65 C (PARA ESPECIMENES FRESCOS) Incubadora a 37-42 C (PARA ESPECIMENES EN FORMOL) Tren de tincin Pinzas para manipular laminillas. Reloj o cronmetro Microscopio de fluorescencia con un filtro de excitacin BG-12 y un filtro de barrera OG-l, o un sistema equivalente. 9. Agua de la llave 10. Alcohol metlico absoluto 11. Tincin cido-resistente Auramina O, ndice de color No. 41000 Alcohol etlico, 95% Fenol, cristales Agua destilada 0.1 g 10.0 ml 3.0 gm 87.0 ml

Disuelva la auramina O en alcohol etlico. Disuelva los cristales de fenol en agua. Mezcle las dos soluciones juntas. Guarde en una botella oscura. 1. Decolorante cido cido hidroclorhdrico, concentrado Alcohol etlico 70% Agregue con cuidado el cido al alcohol. Tincin de contraste Permanganato de potasio Agua destilada Disuelva el permanganato de potasio en agua. 21 0.5 ml 100.0 ml 0.5 g 100.0 ml

2.

B.

Tcnica:

1. Prepare un frotis delgado de la muestra fecal en una laminilla 76 x 26 mm. El frotis se puede hacer a partir de heces frescas, sin conservar o de heces en 5% y10% de formol neutral. Los frotis hechos del sedimento despus de la concentracin de formalinaacetato de etilo puede dar un buen nmero de oocistos. Los frotis hechos de muestras de heces sin conservar se deben fijar con calor por lo menos una hora a 65 C en la platina caliente. Los frotis conservados con formol pueden fijarse con calor a 37-42 C hasta que el frotis se seca o puede ser secado al aire por 2-3 horas. 2. Fije todos los frotis con alcohol metlico absoluto por 30 segundos. Deje secar. 3. Coloque la laminilla en el tren de tincin e inunde con auramina O por 15-20 minutos a temperatura ambiente. Asegrese que la tincin cubra el frotis. 4. Enjuague con agua y elimine el exceso de agua. 5. Cubra el frotis con alcohol cido y decolore por 2 minutos. 6. Enjuague con agua y elimine el exceso de agua. 7. Inunde la laminilla con la tincin de contraste, permanganato de potasio por 2 minutos. 8. Enjuague el frotis, elimine el exceso de agua y seque al aire. 9. Examine el frotis en el microscopio de fluorescencia observando detalladamente con el objetivo 20-25 X y observe crticamente con el objetivo 40-63 X. Los oocistos de Cryptosporidium se tien de naranja-amarillento, donde los materiales que no son cido-resistentes o son parcialmente cido-resistentes se observan plidos, con un color menos brillante. Los oocistos de Isospora belli se tien de manera parecida a los oocistos de Cryptosporidium en cuanto a color e intensidad, pero desde luego, muestran su morfologa tpica de la especie en relacin con el tamao, forma y contenidos internos.

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DIAGNSTICO DE LABORATORIO DE CRYPTOSPORIDIOSIS INTESTINAL

ACTUALIZACIN ENERO 1991*

*Actualizacin de la versin impresa original de 2001.

ACERCA DEL ORGANISMO

1. Desde que se imprimi ste libro de trabajo, la especie denominada parvum ha sido aceptada en su generalidad para identificar al Cryptosporidium recuperado de humano, ej. Cryptosporidium parvum. 2. Se agreg el diagrama del ciclo biolgico de Cryptosporidium. Las siguientes definiciones pueden ayudar a la comprensin del ciclo: a. Oocistos- es el organismo enquistado producto de la fertilizacin del macrogameto y microgameto. b. Esporozoto- es un organismo delgado, en forma de huso que es el estadio infectante de los parsitos esporozoto. c. Esporogonia- la parte sexual del ciclo biolgico de los parsitos esporozoto en donde el cigoto enquistado (oocisto) sufre mltiples divisiones, dando lugar a los esporozotos. d. Esquizontes- es el estadio de desarrollo de los parsitos esporozoto despus que el ncleo del trofozoto se divide en varios ncleos de tamao menor. e. Esquizogonia- la parte asexual del ciclo biolgico que resulta de la formacin de merozotos. f. Merozoto- el final del estadio de esquizogonia (reproduccin asexual), que es capaz de infectar clulas del mismo husped. g. Gametogenesis- el desarrollo de clulas sexuales masculinas y femeninas o gametos. h. Microgametocito- el gametocito macho que produce microgametos. i. Macrogametocito- el gametocito hembra que madura en un macrogameto. j. El cigoto es la clula que resulta de la unin de los gametos masculino y femenino, es el huevo fertilizado. 3. La fotografa del extremo superior derecho de la pgina 7 no est completa. Le estructura en la mitad superior est ligeramente hacia la derecha del centro de este oocisto maduro, y los esporozotos se detectan en un examen cuidadoso. Las levaduras en gemacin estn en la mitad inferior ligeramente hacia la izquierda del centro.

ACERCA DE LAS TCNICAS 1. Aunque la mayora de las levaduras no son cido-resistentes y toman el color de la tincin de contraste en los procesos cidos-resistentes, se pueden encontrar ocasionalmente levaduras que son cido-resistentes. Si no se observan cuidadosamente se pueden confundir con oocistos de Cryptosporidium parvum. Las caractersticas diferenciales entre los oocistos de Cryptosporidium, es que estos contienen esporozotos mientras que las levaduras no. En las preparaciones cido-resistentes, observe cuidadosamente la presencia de esporozotos (salchichas rosadas) en aquellos organismos sospechosos de ser oocistos. Si encuentran esporozotos, aunque sean pocos en algunos oocistos, puede usted hacer una identificacin positiva de Cryptosporidium. Las instrucciones para la tcnica cido-resistente indican que se debe realizar un frotis delgado a partir de las heces concentradas. Un frotis "delgado" es cuestin de juicio, generalmente significa ms delgado que el frotis directo para el examen de heces concentradas. No significa que sea tan delgado que se cuestione si la preparacin est en la laminilla. La materia fecal debe ser visible. Otras tinciones tiles para detectar oocistos de Cryptosporidium incluyen la tcnica cido-resistente de Ziehl-Neelsen, la tincin fluorescente de auramina-rodamina y la tcnica de safranina-azul de metileno. Cualquiera de estas se pueden utilizar adems de este libro de entrenamiento, si esto acelera el proceso de aprendizaje. Las tcnicas que se presentan en el libro de trabajo representan aquellas que son confiables, fciles de utilizar y econmicas. Cualquiera que sea la tcnica, asegrese de que sea capaz de detectar esporozotos individuales en algunos de los oocistos teidos. Una prueba comercial que detecta oocistos de Cryptosporidium con anticuerpos monoclonales/fluorescencia directa informa una sensibilidad de 100% y una especificidad de 100%. Sin embargo, se requiere de un microscopio de fluorescencia y el costo por prueba es relativamente ms elevado que los otros mtodos que se han ofrecido aqu. Los oocistos de Cryptosporidium han sido recuperados de otros rganos adems de las heces como: biopsias de pulmn, esputo, vesicular biliar, aspirado duodenal y otros especimenes directa o indirectamente asociados con el tracto gastro-intestinal. La deteccin de oocistos en estos especimenes se puede realizar utilizando tcnicas similares a las que se han ofrecido en este paquete, las instrucciones especficas para dichas tcnicas no estn contempladas aqu. Existen pruebas comerciales para detectar coproantgenos de oocistos de Cryptosporidium.

2.

3.

4.

5.

6.

CICLO BIOLGICO de Cryptosporidium spp.

ES Q UI

ZO GO NI A

Trofozoto de segunda generaci n

Esquizontes maduros de segunda generacin (4 merozotos)

Merozoto libre

Merozoto libre

Esq ui zont es mad uros d e p ri mera generaci n con 8 merozot os Macrogametocito

Microgametocito

AM G EN G O ET IS ES

Esquizontes (inmaduros) tempranos

Microgameto

Macrogameto

Cigoto

HUM ANO *
Trofozoto Oocisto inmaduro

ESPOROGONIA

Se adhiere a la superficie de la c lula epit elial Esporozoto Ingerido

Oocisto maduro en heces Oocistos maduros (4 esporozotos) (estadio infectante) (est ad i o d i agn st i co)

AM BI ENTE EXTERNO

*Probable desarrollo (basado en estudios en animales y exmenes de tejido de biopsia intestinal humano en el microscopio electrnico).

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