Instituto De Hidrologa, Meteorologa y Estudios Ambientales

Programa de fsicoqumica ambiental

PROTOCOLO
ESTANDARIZACION DE MTODOS ANALTICOS
(\\Amigo\pso\Instructivos\Protocolo Validacion V 2.0.doc)
Elaborado por:
Gustavo Alfonso Coy
Qumico
Revisado y Actualizado:
Comit de calidad analtica, noviembre 10 de 1999
Aprobado:
Comit de calidad analtica, noviembre 17 de 1999
Bogot, noviembre de 1999
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Protocolo - Estandarizacin de mtodos analticos
1. INTRODUCCIN
La estandarizacin de un mtodo analtico es un proceso riguroso que dependiendo
de la tcnica analtica a la que pertenezca el mtodo, la matriz, el analito, la cantidad
de parmetros de estandarizacin, y de la logstica empleada para su desarrollo,
puede requerir de un tiempo mas o menos considerable (en algunos casos puede
superar los seis meses).
En el presente documento se presenta un procedimiento de estandarizacin que se
puede considerar como abreviado pero que incluye los parmetros fundamentales para
que un mtodo analtico una vez montado pueda empezar a reportar datos con adecuado
y comprobable grado de confanza. El mtodo as estandarizado debe ser sometido a
un seguimiento sistemtico por medio de cartas o grfcas de control de calidad y con
ensayos particularmente diseados con el propsito de ajustar los puntos dbiles
o los que no han quedado cubiertos en sta estandarizacin. Con el procedimiento
propuesto la precisin se da en trminos de repetibilidad y una vez logrado ste
objetivo, se puede desarrollar lo concerniente a la reproducibilidad entre analistas
y luego entre laboratorios.
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2. OBJETIVO
Mediante la aplicacin del protocolo de estandarizacin se desea obtener en forma
experimental y para las condiciones particulares del Laboratorio, los valores de los parmetros
que servirn como criterios de confanza del mtodo analtico; estos parmetros son: exactitud,
precisin, linealidad, lmite de deteccin, sensibilidad, y porcentaje de recuperacin.
Se espera adems obtener informacin o complementar la existente en lo relacionado
con: Interferencias, limitaciones, tiempo de vida til de la muestra para el analito de
inters, tiempo de anlisis y costo del anlisis.
3. DEFINICIONES
EXACTITUD: Es el grado de aproximacin entre el valor obtenido experimentalmente y el valor
real o aceptado; normalmente se expresa en trminos de error. Se tendrn como referencia los
PATRONES preparados en el laboratorio, y por lo menos un patrn externo CERTIFICADO.
La concentracin de estos patrones deber estar localizada dentro del rango de aplicacin del
mtodo. La exactitud expresada como el porcentaje de error, se calcula por:
PRECISIN: Indica el grado de concordancia entre los resultados obtenidos para rplicas
de una misma muestra, aplicando el mismo procedimiento experimental bajo condiciones
prefjadas. Usualmente se expresa en trminos de la DESVIACIN ESTNDAR (s). Otra
forma de expresar la precisin es la Desviacin Estndar Relativa o COEFICIENTE
DE VARIACIN (CV), que se calcula:
La Repetibilidad es una medida de la precisin de datos obtenidos por un solo operador
trabajando siempre en las mismas condiciones (equipos, materiales y reactivos). La
Reproducibilidad es una medida de la precisin de los datos obtenidos entre dos o ms
analistas y/o laboratorios que utilizan el mismo mtodo y similares condiciones.
LMITE DE DETECCIN: La mayora de criterios coinciden en que el lmite de deteccin
se defne a partir de la ms pequea cantidad detectable por encima del ruido de un
procedimiento y dentro de un lmite declarado de aceptacin; este ltimo se establece
de modo que las probabilidades de que se presenten errores de tipo I (falso positivo) y
II (falso negativo) sean razonablemente pequeas. La prctica comn identifca varios
lmites de deteccin, cada uno con un propsito defnido, pero para fnes prcticos se
tomar el LMITE DE DETECCIN DEL MTODO (LDM), como la concentracin mnima
que puede ser medida con una exactitud y una precisin aceptables.
Lmite de deteccin instrumental (LDI): concentracin de analito que produce una seal
superior a cinco veces la relacin seal/ruido del instrumento; se ha establecido en
1,645 veces el valor s de los anlisis de blancos. Resulta muy til para valorar la
concentracin de analito o la cantidad de un extracto necesaria para producir una
seal que permita calcular un LDM estimado.
Lmite de deteccin del mtodo (LDM): concentracin de analito que, cuando se procesa
a travs del mtodo completo, produce una seal con una probabilidad del 99% de ser
diferente del blanco. Para siete rplicas de la muestra, la media debe ser 3,14s veces
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superior al blanco, donde s es la desviacin estndar de siete muestras. Para determinar
el LDM se aade el analito al agua grado reactivo o a la matriz de inters para obtener una
concentracin (CEb ) prxima al LDM estimado; se analizan diez partes de esta solucin y se
calcula la desviacin estndar; a partir de una tabla de distribucin desigual de t, se selecciona
el valor de t para n-1 grados de libertad y un nivel de confanza del 95%:
LINEALIDAD: Se refere a la proporcionalidad entre la concentracin y la seal producida
por el instrumento y se debe verifcar si en el laboratorio se cumple el rango y tipo de
linealidad que reporta la literatura del mtodo.
SENSIBILIDAD: Es una medida del factor de respuesta del instrumento como una funcin
de la concentracin. Normalmente se mide como la pendiente de la curva de calibracin.
Como valor se puede reportar el promedio para las curvas obtenidas en los ensayos de
estandarizacin y en la medicin de muestras, indicando su desviacin estndar.
RECUPERACIN: Es la capacidad que tiene un procedimiento analtico para determinar
cuantitativamente una especie qumica que ha sido adicionada a una muestra. Se expresa
como Porcentaje (%R) y se calcula como:
donde:
Cx = concentracin promedio de las determinaciones,
CBK = concentracin del blanco, y
CA = concentracin real adicionada.
La recuperacin sobre muestras reales se calcula por:
donde:
CM = concentracin promedio de la muestra no adicionada,
CMA = medida de la concentracin en la muestra adicionada, y
CA = concentracin conocida adicionada a la muestra.
BLANCO (BK): Es un sistema fsico que no contiene muestra real y por consiguiente no
debera contener el analito de inters, pero que debe contener todos los reactivos
que se utilizan en el mtodo de anlisis, y ser sometido a las mismas condiciones y al
mismo procedimiento que las muestras reales y los estndares. En lugar de muestra,
el volumen faltante se completar con agua grado reactivo que deber tener la calidad
recomendada por el mtodo respectivo.
MUESTRA: Para este propsito, el trmino se refere a cada sistema fsico que sea sometido
al procedimiento de anlisis siguiendo el mtodo que se est estandarizando, ya sea un Blanco,
un Estndar, una Muestra Adicionada, o una Muestra Real propiamente dicha.
MUESTRA ADICIONADA: Es una muestra natural o real a la cual se le ha adicionado
una cantidad conocida del analito que se estudia . Esta adicin debe hacerse en
la forma prevista en el diseo de las condiciones de estandarizacin para que sea
reproducible.
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4. ETAPA PRELIMINAR A LA ESTANDARIZACIN
La etapa preliminar es parte integrante y pre-requisito de la estandarizacin; consiste en
una serie de pasos que permiten obtener informacin relevante y orientar el proceso de
la estandarizacin propiamente dicha.
4.1. Documentacin y montaje de la metodologa
a. Seleccin del mtodo para cada analito y por cada matriz. Debe contener los criterios
de seleccin correspondientes.
b. Creacin de un archivo fsico (carpeta) para toda la documentacin generada en
el proceso. La carpeta debe radicarse en el archivo tcnico y estar disponible para
su consulta permanente.
c. Tener y conocer el protocolo del mtodo, disponiendo de una copia de trabajo
(debe incluir bibliografa).
d. Conocimiento del fundamento fsico y qumico del mtodo y de la tcnica a la cual
pertenece ste. Se debe elaborar un resumen conciso.
e. Conocimiento exacto del funcionamiento del equipo de medicin. En lo posible se
debe tener el diagrama de fujo para el manejo del equipo o por lo menos los pasos
que se deben seguir en orden cronolgico para su adecuada operacin desde el
encendido hasta el apagado.
f. Inventario de los reactivos que se necesitan para toda la estandarizacin (identifcacin,
precauciones, calidad, cantidad, grado de pureza, conservacin del reactivo puro
y en solucin).
g. Inventario de vidriera y otros materiales necesarios, sealando las cantidades
necesarias para cada da y requerimientos para su limpieza.
h. Establecer los procedimientos para la descontaminacin y limpieza del material y
para la disposicin de los desechos.
i. Diseo de un formato para la captura de los datos, solo si los formatos existentes no se
adaptan a los requerimientos especfcos de la metodologa.
j. Verifcacin y optimizacin de las condiciones y de los parmetros instrumentales,
incluyendo curva de calibracin.
k. Defnicin del intervalo de aplicacin del mtodo, teniendo como criterios:
La informacin de la literatura (protocolo).
El inters especfco (ambiental).
Los ensayos preliminares en el Laboratorio.
El intervalo de aplicacin va desde la mnima cantidad detectable (LDI) hasta la
concentracin que se podra leer con la mxima dilucin posible aceptable de acuerdo con
las condiciones fsicoqumicas de la muestra (en general no debe ser mayor de 1:10).
l. Disear el plan y un procedimiento detallado para la preparacin y anlisis de reactivos,
estndares, muestras y muestras adicionadas de acuerdo con el tiempo de vida til de
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Protocolo - Estandarizacin de mtodos analticos
cada uno y la estabilidad del analito. Este plan deber ser presentado para su auditora
analtica previo al inicio del proceso y tiene como objetivo establecer el lmite de deteccin
(LDI y LDM), la sensibilidad, la linealidad y dems variables bsicas del mtodo.
4.2. Parte experimental o de mediciones (Prevalidacin)
Antes de iniciar el proceso de estandarizacin se debe establecer por mediciones
programadas:
Lmite de deteccin instrumental
Lmite de deteccin del mtodo
Intervalo lineal del mtodo
Linealidad
Sensibilidad
Variables instrumentales o metodolgicas particulares del Laboratorio que puedan
afectar el proceso de medicin
5. PROCEDIMIENTO DE ESTANDARIZACIN (VALIDACIN)
5.1. Parte experimental o de mediciones
Antes de iniciar las mediciones, el analista debe garantizar que el mtodo est montado
y que el equipo funciona en condiciones ptimas para la lectura de muestras. La parte
experimental consiste en la corrida de las muestras y el registro de los resultados para cada
grupo diario de ENSAYOS (Ensayo No 1, Ensayo No 2, ... Ensayo No 7). En total se deben
correr un mnimo de 7 ensayos en das diferentes que pueden ser continuos o alternos, con
una diferencia mxima de 3 das entre un ensayo y otro (viernes - lunes).
El grupo bsico de muestras a correr en cada ensayo es:
BK (Blanco de reactivos y procedimiento)
E.b (Estndar de concentracin baja, que nos permita calcular el LDM)
E.m (Estndar de concentracin media; aprox. El 50% del rango)
E.a (Estndar de concentracin alta; aprox. El 90% del rango)
M1 (Muestra natural para ver efectos de la matriz real, concentracin <50% del rango)
M2 (Muestra natural para ver efectos de la matriz real, concentracin >>M1)
M1A.b (M1 adicionada con un nivel bajo, mximo el 30% del valor de M1)
M1A.a (M1 adicionada con un nivel alto, mnimo el 50% del valor de M1)
Mc (Muestra o estndar certificado). Se sugiere utilizarlo en el ltimo o los dos
ltimos ensayos.
Este grupo bsico de muestras se debe correr mnimo por duplicado para un total de
16 datos diarios (18, si hay estndares certifcados). En esta etapa o de corrida de los
ensayos es donde se obtienen todos los datos primarios y requiere que en su ejecucin
se cumplan ciertas condiciones mnimas:
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Cada grupo de muestras se analiza en el mismo da corriendo todas las muestras
en forma paralela.
Es recomendable que el proceso se inicie siempre a la misma hora y lo sufcientemente
temprano para que se pueda cumplir con el anlisis de todas las muestras, teniendo
en cuenta que pueden ocurrir imprevistos.
Todo el material de vidrio deber ser lavado previamente de acuerdo con el
procedimiento establecido en el Laboratorio para cada uso y deber ser sometido a la
revisin o control de calidad correspondiente.
Es recomendable que el procedimiento sea efectuado por un profesional Qumico
o con la supervisin del mismo.
El formato de captura de datos se deber diligenciar en el mismo momento en
que se obtienen los datos (no transcribir, copiar, etc.). Las cifras erradas se deben
corregir inmediatamente dejando constancia por parte del analista en forma clara
en que consisti el error.
5.2. Anlisis estadstico de los resultados
Utilizando las frmulas presentadas en las defniciones, calcular:
Rechazo de datos. Calcular el estadstico T para los valores extremos de cada grupo
(mximo y mnimo), de la siguiente manera:
Ordenar los datos de menor a mayor: [xbajo, x2, x3, ....xalto]
Calcular xprom y s
Calcular T como: T = (xalto - xprom)/s para un valor alto; T = (xprom - xbajo)/s
para un valor bajo
Si el T calculado es mayor que el T de tablas (para un nivel de confanza del 95%
y n mediciones), el dato se rechaza. De acuerdo con el tamao pequeo de las
poblaciones que se van a manejar, se pueden rechazar como mximo dos datos; si
la aplicacin del criterio de rechazo da positiva para ms de dos datos, el ensayo
debera repetirse.
Precisin. Calcular la desviacin estndar (s), el coefciente de variacin (CV) y el
lmite de confanza del 95% (LC95) para cada muestra tomando todos los datos de
los 7 ensayos (14 datos).
Exactitud. Calcular para cada estndar y para el patrn certifcado el porcentaje de
error relativo en cada determinacin. Determinar para cada tipo de muestra el valor
promedio de error relativo.
Porcentaje de Recuperacin. Calcular el %R para cada nivel de concentracin adicionado.
Reportar indicando la recuperacin para estndares y la recuperacin para muestras
reales. Se debe reportar la recuperacin media, el rango de %R y su desviacin
estndar.
5.3. Elaboracin y presentacin de documentos
Como resultado de la estandarizacin se deben presentar tres documentos:
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Protocolo - Estandarizacin de mtodos analticos
Protocolo de validacin: El presente documento se toma como referencia para la
estandarizacin de los diferentes mtodos haciendo los ajustes correspondientes para
las caractersticas particulares de cada analito y de la tcnica utilizada.
Carpeta de soporte tcnico: Contiene todos los documentos originales producidos
durante el proceso de estandarizacin, las notas y observaciones del analista, hojas
de captura de datos, clculos, y dems informacin que permita la revisin del proceso
y/o su replicacin por otro analista o por otro laboratorio.
Parmetros de estandarizacin: Son los resultados fnales del proceso, expresados
en forma clara y de acuerdo con las convenciones que se utilicen por la literatura
especializada en el tema.
6. BIBLIOGRAFA
Quality assurance in the National Water Quality Laboratory; Canada Centre for Island
Waters, Burlington, Ontario. 2. Ed.,1986.
Standard Methods for the examination of water and wastewater, 19th Edition ,1995.
Programa de Garanta de calidad. Grupo de Salud Ambiental. Instituto Nacional de Salud,
Santa Fe de Bogot, D. C., 1994 (sin publicar).
Memorias del curso Anlisis Instrumental, Universidad Nacional de Colombia, Santaf
de Bogot, D.C., Enero de 1997.
Informacin escrita suministrada por el Qumico Guillermo Corts, contratista del
IDEAM, mayo de 1998.
Elaborado por:
Gustavo Alfonso Coy, Q
20 de mayo de 1998
Corregido y actualizado por:
Blanca Moreno, Q
Guillermo Corts, Q
Gustavo Alfonso, Q
Jeremas Gmez, Qf
12 de octubre de 1999
Aprobado en la sesin del Comit de Calidad Analtica del 17 de noviembre de 1999:
Blanca Moreno Gustavo Alfonso
Jeremas Gmez Guillermo Corts
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7. ANEXO. TABLAS DE VALORES ESTADSTICOS
Tabla 1. Valores crticos T para rechazo de datos
n 95% n 95% n 95%
3 1,15 14 2,37 25 2,66
4 1,46 15 2,41 26 2,67
5 1,67 16 2,44 27 2,69
6 1,82 17 2,47 28 2,71
7 1,94 18 2,50 29 2,72
8 2,03 19 2,53 30 2,74
9 2,11 20 2,56 40 2,87
10 2,18 21 2,58 50 2,96
11 2,24 22 2,6 60 3,03
12 2,29 23 2,62 100 3,21
13 2,33 24 2,64
Tabla 2. Valores de la distribucin t para calcular LC 95 %
gl 95% gl 95% gl 95% gl 95%
1 12,71 11 2,20 21 2,08 50 2,01
2 4,30 12 2,18 22 2,07 1,96
3 3,18 13 2,16 23 2,07
4 2,78 14 2,14 24 2,06
5 2,57 15 2,13 25 2,06
6 2,45 16 2,12 26 2,06
7 2,36 17 2,11 27 2,05
8 2,31 18 2,10 28 2,05
9 2,26 19 2,09 29 2,05
10 2,23 20 2,09 30 2,04
Tabla 3. Valores de la distribucin t (99%) para calcular LDM
gl 99% gl 99% gl 99% gl 99%
1 31,82 11 2,72 21 2,52 40 2,42
2 6,96 12 2,68 22 2,51 50 2,40
3 4,54 13 2,65 23 2,50 60 2,39
4 3,75 14 2,62 24 2,49 70 2,38
5 3,36 15 2,60 25 2,48 80 2,37
6 3,14 16 2,58 26 2,48 90 2,37
7 3,00 17 2,57 27 2,47 100 2,36
8 2,90 18 2,55 28 2,47 2,33
9 2,82 19 2,54 29 2,46
10 2,76 20 2,53 30 2,46