UNIVERSIDADE PAULISTA UNIP

APS: TCNICA DE PCR RFLP. USOS E APLICAES NA BIOMEDICINA. VANTAGENS E DESVANTAGEM DA TCNICA.

MANAUS / AM 2013

UNIVERSIDADE PAULISTA UNIP CURSO: BIOMEDICINA

BIOLOGIA MOLECULAR

PROFESSOR: ANDR LUIZ WILLERDING

] ACADEMICOS: ANA BEATRIZ RA RA: B180668 DEBORA SOMBRA ARAJO : A977BC1 GILCILENE BERNARDO RA: B0027D2 JOERLY OLIVEIRA RA: B002EI5 ROSEANE NUNES. RA: B970EF7 TSSIA MIRANDA RA: B0839J6

MANAUS/ AM 2013

Sumario

1.0 2.0

Introduo______________________________________________ 1 PCR __________________________________________________2

2.3 Objetivo __________________________________________________3 2.2 Aplicaes de tcnica de PCR na biomedicina ____________________4 2.3 Reagentes da PCR _________________________________________5 2.4 Aplicaes ________________________________________________8 2.4 Desnaturao ______________________________________________9 2.4 Hidridizao ______________________________________________10 2.5 Final do primeiro ciclo de PCR ________________________________11 2.6 PCR em tempo real ________________________________________12 2.7 Vantagens e Desvantagens da Tcnica de PCR _________________13

3.0 RFLP ____________________________________________________14 3.1 Mtodo RFLP _____________________________________________15 3.2 Aplicaes________________________________________________16 4.0 Concluso ________________________________________________17 5.0 Referncia Bibliografica______________________________________19

1.0 Introduo

A histria da gentica mdica foi revolucionada pelo trabalho de Watson e Crick, em 1953, onde foi proposta a estrutura de dupla hlice de DNA. Durante os ltimos 20 anos a tecnologia do DNA recombinante tem vindo a desenvolver tcnicas muito poderosas e sensveis que so usadas no estudo e na identificao de anomalias moleculares. O objectivo deste trabalho abordar tcnicas de anlise de DNA, Polymerase Chain Reaction (PCR), eRestriction Fragment Length

Polymorfism (RFLP), , que permitam, de certa forma, a iden tificao de genes relacionados com doenas genticas especficas, abrindo a possibilidade de diagnstico. Muitas tcnicas utilizadas na anlise de molculas de DNA requerem que a sequncia esteja disponvel em grandes quantidades para viabilizar a realizao de diversos experimentos. A possibilidade de se criar inmeras cpias de uma molcula de DNA em laboratrio otimiza este trabalho, uma vez que a molcula em questo no precisa ser extrada diretamente do organismo ao qual pertence. A tecnologia de anlise de DNA possibilitou o diagnstico de inmeras doenas genticas. Neste momento, desempenha um papel crescente na pesquisa e diagnstico deste tipo de patologias. Muitas vezes, o diagnstico de uma doena no requer somente o uso de uma tcnica, mas sim a conjugao de vrias, visto existir complementaridade entre elas. O aumento de conhecimento e o desenvolvimento da tcnica tm vindo a ser explorados e rapidamente transferidos para os laboratrios clnicos. Porm, a difuso e a transferncia destas formas de tecnologia necessitam do desenvolvimento de protocolos e da equao dos problemas ticos associados.

1 2.0 PCR A PCR (Reao de Polimerizao em Cadeia) uma metodologia que se baseia na amplificao exponencial seletiva de uma quantidade reduzida de DNA de uma nica clula. Esta tcnica revolucionou o mundo cientfico e as suas aplicaes so imensas: usada no diagnstico mdico, mapeamento

gentico, deteco de doenas hereditrias, clonagem de genes, testes de paternidade, identificao de impresses digitais genticas De fato, a PCR revolucionou vrias reas como a Biologia Molecular, Patologia, Farmcia, Botnica, Medicina Forense e valeu o prmio Nobel, em 1993, a Kary Mullis. 2.1 Objetivo O objetivo da PCR produzir uma quantidade aprecivel de um segmento especfico de DNA a partir de uma quantidade mnima. O DNA molde sofre uma amplificao controlada por enzimas, obtendo-se milhes de cpias do fragmento de DNA de interesse. O molde pode ser qualquer forma de DNA de cadeia dupla, como o DNA genmico: pode usar-se uma gota de sangue, um fio de cabelo, uma clula do epitlio oral, um blastmero...

Um ciclo de PCR consiste em trs fases: desnaturao do DNA molde (a 95C), ligao (annealing) dosprimers (a 64C) e polimeriza o do DNA (a 72C). Na 1 etapa faz-se a separao das cadeias de dupla hlice de DNA atravs do calor. Esta separao essencial para que, na 2 fase, dois primers de oligonucletidos se liguem s sequncias dos pares de bases complementares da cadeia molde. Estes primers so desenhados e sintetizados de modo a ligarem-se s extremidades opostas de cada uma das cadeias de DNA molde que se pretende amplificar. Os primers servem, portanto, de ponto de partida para a replicao de DNA e, na ltima etapa, faz2 se a sua extenso. A enzima responsvel por esta polimerizao a DNA polimerase termo-estvel (Taq), tendo sido isolada a partir da bactria termoflica Thermus aquaticus que vive em elevadas temperaturas. essencial que a enzima usada seja estvel ao calor, uma vez que os ciclos de PCR tm lugar a temperaturas situadas entre os 64C e 95C. Para executar este ciclo

usa-se um termociclador, que faz variar de forma rigorosa o tempo e a temperatura ao longo do ciclo. Normalmente so repetidos cerca de 30 ciclos, o que demora apenas algumas horas. Assim, duas novas cadeias so sintetizadas a partir da cadeia molde em cada ciclo completo de PCR logo d-se um crescimento exponencial, havendo ao fim de n ciclos 2n vezes mais cpias do que no incio. O segredo do sucesso da PCR reside na capacidade que ela tem de amplificar uma sequncia precisa de DNA aliada sua simplicidade, rigor, elevada sensibilidade e especificidade. No necessrio isolar o DNA que se pretende amplificar (mesmo que se encontre misturado com DNA de outras espcies), uma vez que a especificidade da PCR dada pelos primers. uma tcnica rpida, barata e segura. Contudo, a PCR tambm tem limitaes, como a necessidade de conhecer a sequncia de DNA a amplificar para que possam ser sintetizados primers especficos. Outras desvantagens so a relativa facilidade com que ocorre contaminao da amostra por DNA estranho (uma vez que se trata de uma tcnica muito sensvel) e a limitada extenso da sequncia que possvel amplificar ( difcil aplicar a PCR a sequncias maiores do que 5kb). Pode tambm ocorrer incorporao errnea de bases durante a replicao. Os resultados da PCR so teis no diagnstico, prognstico, determinao da terapia a ser utilizada, e at mesmo na avaliao da susceptibilidade a doenas. A PCR frequentemente utilizada na deteco de polimorfismos, mutaes pontuais e infeco por microrganismos bacterianos ou virais antes da exteriorizao patolgica da sua presena. particularmente importante na deteco do SIDA, pois consegue detectar o vrus HIV nas primeiras semanas aps a infeco e mais rapidamente do que o mtodo normalmente utilizado, o teste ELISA. A PCR procura diretamente pelo DNA do vrus enquanto que o teste ELISA mais indireto, pois procura anticorpos que o organismo possa ter produzido contra o vrus. Outro exemplo de aplicao da PCR no DPI (diagnstico pr-implantatrio) e no DPN (diagnstico pr-natal).

3 A PCR pode ser usada em DPN em idades gestacionais to precoces como as 9 semanas, permitindo, por exemplo, a deteco de clulas de um feto masculino em circulao no sangue materno, ainda que exista em quantidades muito reduzidas, e averiguar a compatibilidade entre o grupo sanguneo da me e do feto. Permite ainda a deteco de vrias anormalidades

cromossmicas como a trissomia 21. Este exame ao diagnosticar previamente certas doenas possibilita que os pais e equipa de sade decidam antecipadamente a melhor atitude a tomar em relao a cada caso.

2.2 Aplicaes de tcnica de PCR na biomedicina A tcnica da PCR permite que um fragmento especfico da molcula de DNA seja amplificado milhares de vezes em apenas algumas horas. Esta tcnica revolucionou as pesquisas em biologia molecular, pois at ento demorava-se muito tempo para a amplificao do DNA. A partir da PCR possvel obter-se cpias de uma parte do material gentico em quantidade suficiente que permita detectar e analisar a sequncia que alvo do estudo. A reao pode ser corporada a uma procura por uma nica pessoa em uma grande cidade e clon-la ao ponto de poder povoar toda a cidade. A reao explora funo natural da enzima chamada taq-polimerases, extrada da bactria Thermus aquaticus, que uma enzima termoestvel, fato de imensa importncia uma vez que a reao processa em ciclos de diferentes temperaturas, como ser dito mais adiante. Este processo de amplificao do DNA foi inventado por Kary Mullis em 1983 e a primeira amplificao deita foi a da betaglobulina humana. Desde ento, houve um aumento exponencial no nmero de publicaes cientficas que relatavam utilizar a tcnica de PCR em experimentos, passando de 3 publicaes em 1986 para 1700 em 1990. Esta descoberta condecorou Kary Mullis com o prmio Nobel de Qumica dez anos aps sua inveno. O fato central que faz o PCR to til qye todo organismo vivo possui sequncias de nucleotdeos no DNA que so nicas e especficas para cada espcie. Esta reao permite a amplificao de qualquer sequncia de DNA coletada de amostras de materiais biolgicos como sangue, urina, outros fludos corporais, cabelo e fragmentos teciduais. Amostras de microorganismos, clulas vegetais ou animais mesmo que com milhares de anos, tambm podem ser detectadas pela PCR.

4 Para a execuo da tcnica da PCR preciso que se tenha conhecimento prvio da sequncia do cido nuclico que se deseja amplificar, dita sequncia alvo. A partir disto, desenham-se dois iniciadores (primers) para dar a partida ao processo de sntese em um local especfico. Um primer serve para sintetizar a sequncia alvo no sentido 5-3. O primer uma pequena

sequncia de nucleotdeos que hibridiza no incio da sequncia de DNA que ser replicada (sintetizada). Etapas do processo: Extrao do DNA da amostra que se pretende estudar purificao do DNA ; Preparao de uma mistura chamada Master Mix, que conter todas as substncias necessrias sntese de novas cpias de DNA; Incubao em um termociclador, que o aparelho responsvel pela execuo de todos os ciclos da reao aquecendo e resfriando o/os tubo/s; Eletroforese em gel de poliacrilamida dos produtos da PCR; 2.3 Reagentes da PCR: Soluo tampo para se garantir pH e concentraes inicas adequadas reao; Deoxinucleosdeos trifosfatos ( dATP, dGTP, dCTP, dTTP) que atuam como tijolos na construo das molculas de DNA; Os primers; A Taq-polimerase H2O Mg+2 para optimizar a reao ( nem sempre usado). O DNA extrado da amostra; Alguns adjuvantes quando necessrio;A reao em si os ciclos: Existem trs fases bsicas ou ciclos para cada reao de PCR. Cada ciclo contm um ou mais passos e duas variveis em cada passo: a temperatura e a durao. Etapa e desnaturao inicial: consiste de um nico passo de desnaturao a 94 C por 5 minutos. Dificilmente altera-se esta etapa. O bojo da PCR toma local neste ciclo, que subdividido em trs: 1-Etapa de anelamento; este o passo que habilita os primers a anelar a fita simples desnaturada. O tempo necessrio para anelamento de 30- 45 segundas. 5 2-Etapa de extenso. neste passo que a Taq polimerase age para estender o molde. Regularmente ela realizada a temperatura de 72 (a atividade enzimtica tima de 76 79 C), dificilmente altera-se a temperatura de 72. Uma regra para se estimar a extenso do tempo a de que para cada 1000 nucleotdeos atribumos 1 minuto. Outra formula popular calcular 60 bases por segundo.

3- Etapa de desnaturao: A desnaturao da molcula de DNA formado serve como molde para o prximo ciclo. Ela realizada a temperatura de 93-94C. Nesta temperatura a enzima tem uma meia vida de cerca de 1 hora. Estes trs passos so repetidos 30- 40 vezes em particular para anlises de digesto. Se os ciclos excederem esta quantidade eles podero introduzir mutaes com a Taq polimerase. Etapa de extenso final. Isto feito com um nico ciclo em dois passos: um passo de anelamento o qual idntico ao passo de anelamento na segunda etapa de PCR ( mesmo tempo e mesma temperatura). O segundo a de extenso longa temperatura idntica ao passo de extenso longa temperatura idntica ao passo de extenso, porm com durao de 3-5 minutos (72C) por 5 minutos. Isto habilita toda amplificao semi- iniciada a se completar.

Diferentes aplicaes da PCR: Estudo do padro de expresso gnica (transcritos raros) Seleo de clones recombinantes Sequenciamento direto de produtos amplificados Deteco de mutaes em genes especficos Estudos diagnsticos de doenas infecciosas, deteco de bactrias, vrus e protozorios parasitas Diagnstico pr-natal em caso de risco Elucidao de relaes evolutivas entre espcies, utilizando material arqueolgico

Grande valia na Medicina Forense (impresso digital de DNA)

2.4 Aplicaes Sua principal aplicao em situaes onde a quantidade de DNA disponvel reduzida. Em teoria, possvel amplificar qualquer DNA. Uma das principais aplicaes da PCR na medicina forense, onde pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime (pedaos de cabelo que contenham bulbo, gotas de sangue ou saliva, pedaos de plo ou at mesmo a minscula quantidade de DNA deixada em uma impresso digital) so amplificadas para serem analisadas pelo mtodo de fingerprinting. O PCR tambm rotineiramente utilizado em procedimentos cientficos de Biologia Molecular como amplificao para gerar mutagnese, deteco de mutaes ou preparao de fragmentos de DNA para clonagem (insero em plasmdeo, por exemplo) como tambm pode ser utilizado para identificao de patgenos que esto presentes em amostras como por a exemplo identificao de agentes como Cndida sp, Chlamydia trachomatis, HPV Vrus do papiloma humano e seus gentipos, HIV Vrus da Hepatite B. etc A PCR tambm utilizada na paleontologia para o sequenciamento gnico de animais pr-histricos.

8 O mtodo de PCR consiste nos seguintes passos 1 passo- Desnaturao:

A temperatura elevada (geralmente >90C) separa a cadeia dupla de ADN em dois filamentos, sendo este processo conhecido como desnaturao. Os dois filamentos ou cadeias de DNA so mantidos juntos por ligaes de hidrognio que, por serem relativamente fracas, quebram-se a altas temperaturas, ao passo que as ligaes entre as molculas de fosfato e desoxirribose, por serem ligaes covalentes mais fortes, permanecem intactas. 2 passo- Hibridizao ou Anelamento:

O objetivo da PCR no replicar a cadeia inteira de DNA, mas apenas replicar a sequncia de interesse (normalmente com tamanhos entre 100 e 600 pares de bases) Os iniciadores (ou primers) marcam as extremidades da sequncia alvo: estes iniciadores so curtas sequncias sintticas de nucleotdeos, entre 20 e 30 bases.

Numa reao de PCR so includos dois primers, um para cada cadeia simples de DNA que foi produzida durante o passo de desnaturao. 9 O incio da sequncia de DNA alvo marcada pelos primers que se ligam (hibridizam) com a sequncia complementar. Temperatura de annealing ou hibridizao: normalmente encontra-se entre 40 C e 65 C, dependendo do comprimento dos primers e da sua sequncia. A escolha criteriosa desta temperatura permite que estas sequncias iniciadores se liguem sequncia alvo com elevada especificidade.

3 passo- Extenso:

Aps a ligao dos primers ou iniciadores s sequncias complementares de DNA, a temperatura eleva-se a aproximadamente 72 C e a enzima Taq polimerase replica a cadeia de DNA. A Taq polimerase uma polimerase de DNA termo-estvel recombinante do organismo Thermus aquaticus, que, ao contrrio de outras polimerases, se mantm ativa a temperaturas elevadas. O processo de sntese iniciado numa zona com cadeia dupla (onde esto ligados os primers), incorporando os nucleotdeos complementares sequncia alvo e utilizando os dNTPs em soluo. A extenso inicia-se sempre no extremo 3 do primer, criando uma cadeia dupla a partir de cada uma das cadeias simples. A Taq polimerase sintetiza exclusivamente na direo 5 para 3.

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2.5 Final do primeiro ciclo de PCR:

No final do primeiro ciclo da PCR, encontramos duas novas cadeias de DNA idnticas original. Ponto final: O DNA polimerase no reconhece o final da sequncia. Assim, as novas cadeias sintetizadas tm o seu incio definido pelo primer, mas a sua extremidade 3 no est definida, podendo haver fragmentos de diferentes tamanhos. No entanto, no ciclo seguinte, esta cadeia vai servir de molde sntese de uma nova cadeia, limitando o primer a outra extremidade da cadeia. A cadeia de DNA, sintetizada a partir deste molde, ter ento o comprimento definido, com os limites definidos pelos primers. Estas cadeias denominam-se Amplicons. De acordo com a cintica , o PCR dividido em: Fase de screening- ciclos iniciais. Os primers procuram o template de DNA com as sequncias que lhe so complementares ( os primers esto em considervel excesso em relao ao template). Fase intermediria- o processo de amplificao est ocorrendo, levando ao acmulo exponncial do fragmento de DNA. O pareamento do primer com a sequncia complementar j est bem facilitada, pois j existem cpias das sequncias-alvo.

11 Fase tardia ou de plat a amplificao j sub tima devido a limitao dos reagentes e a competio dos produtos gerados com os primers disponveis.

N de ciclos

N de amplicons/cpias por alvo 2 4 8 16 32 64 1,048.576 1,073.741.824

1 2 3 4 5 6 20 30

Causas do plat perda da atividade de enzima. -todas as enzimas disponveis esto ocupadas com a sntese de DNA. -gasto de reagentes (especialmente primers, mas tambm dNtPs). 2.6 PCR em tempo real .

A PCR em tempo real associa a metodologia de PCR a um sistema de deteco e quantificao de fluorescncia produzida durante os ciclos de amplificao. A metodologia permite a deteco, quantificao e amplificao de DNA em uma nica etapa, agilizando a obteno de resultados e minimizando o risco decorrente de possveis contaminaes.

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Para realizao do PCR em tempo real, utilizamos um termociclador a um detector de fluorescncia capaz de medir a luz fluorescente de uma reao de amplificao. A metodologia utiliza os mesmos reagentes de uma PCR convencional acrescido de fluorocromos intercalados em cadeias de DNA ou presentes em sondas de hibridizao especficas. O PCR em tempo real, apresenta maior reprodutibilidade, sensibilidade e preciso comparado ao PCR convencional, alm de reproduzir resultados quantitativos, enquanto o PCR convencional reproduz resultados qualitativos. Cintica de amplificao: Fase geomtrica: caracteriza-se por apresentar alta preciso na duplicao do nmero de molculas das reaes. Fase Linear: a taxa de produo de novas cadeias de DNA via PCR passa gradualmente de uma progresso geomtrica para uma progresso linear. Fase plat: a eficincia de amplificao cai diagnosticamente para nveis insignificante com baixa ou nenhuma produo de novas cadeias de DNA. 2. .7 Vantagens e Desvantagem da tcnica. A reao em cadeia da polimerase (PCR) uma tcnica fundamental nos laboratrios atuais, que revolucionou a deteco de RNA e DNA. Recentemente, uma nova tcnica designada PCR em tempo real, evoluiu da tcnica de PCR convencional, com o objetivo de minimizar as suas numerosas limitaes. Esta tcnica, tambm conhecida como PCR Quantitativa ou PCR em tempo real Quantitativa um mtodo de quantificao e amplificao

simultnea do DNA. A PCR em tempo real baseada na deteco e quantificao de um composto fluorescente (durante as primeiras fases da PCR), assentando num princpio bsico de que o aumento significativo da quantidade de produto da PCR est correlacionado com a quantidade inicial do controle. A PCR em tempo real apresenta inmeras vantagens relativamente PCR tradicional. A recolha de dados ocorre durante a fase exponencial de crescimento da PCR, sendo por tal uma anlise rpida e simples. Trata-se de uma tcnica sem influncia da amplificao no especfica, podendo a amplificao ser controlada em tempo real. O risco de contaminao baixo devido ausncia de processamento ps-PCR dos produtos resultantes. Alm do mais, esta tcnica requer apenas 3 picogramas de material, o que cerca de 1000 vezes menos material gentico face a ensaios convencionais. Finalmente, uma tcnica mais especfica, sensvel e reprodutvel. No entanto, a PCR em tempo real apresenta algumas desvantagens designadamente, o elevado custo do equipamento e as elevadas exigncias tcnicas e cientficas requeridas para o correto manuseamento e manuteno do equipamento. 13 A tcnica da PCR em tempo real pode ser aplicada tanto em utilizaes mais tradicionais da PCR como em novas aplicaes s quais a PCR convencional responde de forma pouco ou menos eficaz, em reas to diversas como, sade, forense e agricultura. As principais aplicaes esto relacionadas com a quantificao da expresso gnica, controle de qualidade e validao de ensaios, quantificao viral, deteco de agentes patognicos, toxicologia forense quantificao de danos no DNA, genotipagem, determinao pr-natal do sexo de clulas, dosagem gnica, oncologia clnica, quantificao de protenas, microbiologia, anlise e quantificao de DNA mitocondrial e de DNA nuclear, qualidade do DNA, estudo da presena de nveis de OGM nos alimentos, certificao, entre muitas outras aplicaes possveis. 3.0 RFLP RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism) uma tcnica em que os organismos podem ser diferenciados pela anlise de padres derivados da clivagem do seu DNA. Se dois organismos diferirem na distncia entre os stios de clivagem de uma endonuclease de restrio, o comprimento dos fragmentos produzidos vai diferir quando o DNA for digerido com uma enzima de restrio.

3.1 Mtodo RFLP A fim de reconhecer os locos (stios) onde ocorreram mutaes foi desenvolvida a tcnica conhecida pela sigla RFLP, do ingls Restriction

Fragment Length Polymorphism, ou Poliformismo de Comprimento de Fragmento de Restrio. Este mtodo se baseia no corte que as enzimas de restrio so capazes de fazer onde existem apenas certas seqncias especficas de nucleotdeos. Estas enzimas so uma espcie de tesoura biolgica que vo cortar o ADN em locais especficos, chamados de posies de restrio, gerando fragmentos de ADN de tamanhos diferentes e seqncias especficas.

14 Para separar os fragmentos de ADN cortados pelas enzimas de restrio, utilizase a tcnica de eletroforese, que consiste na separao das espcies de uma soluo coloidal pela influncia de um campo eltrico.

Devido ao fato das pessoas terem uma seqncia de nucleotdeos diferentes entre si, pode-se identificar uma pessoa pela evidncia deixada no local do crime a partir da comparao dos resultados obtidos pelos exames de ADN.No esquema acima, temos um suspeito que supostamente teria estuprado a vtima. 15 Em (a) temos a coleta de smen na vtima e posterior exame. Tambm feita a anlise do ADN a partir de uma amostra de sangue do suspeito. Em (b) so representadas as enzimas de restrio que tm a capacidade de cortar o ADN em lugares onde uma determinada seqncia de nucleotdeos ocorre. A tesoura simboliza as enzimas necessrias para a seleo de seqncias

especficas. Em (c) ilustra-se os pedaos de ADN separados pela eletroforese. Em (d) mostrado um padro conhecido como DNA fingerprint.

3.2 Aplicaes Com o aumento da informao da sequncia gentica um grande nmero de doenas genticas podem ser determinadas atravs da anlise do RFLP: 1) A anemia falciforme uma doena gentica em que ambos os genes no paciente substituem um T por um A na posio do meio do codo 6. Isto converte o codo GAG (para o glutamato) ao codo GTG (para a valina) e elimina e sequncia reconhecida (CTGAGG que comum aos codes 5, 6 e 7) e cortada por uma das enzimas de restrio. Quando o gene normal (beta a) digerido com uma enzima de restrio e os fragmentos so separados por electroforese a sonda liga-se a um pequeno fragmento (entre as setas vermelhas). Quando o gene doente (beta s) a enzima no pode cort-lo neste stio, ento a sonda liga-se a um fragmento muito maior (Fig. 3). Neste exemplo, uma mudana de um nico nucleotdio produz o RFLP. Isto uma causa comum de RFLPs e estes polimorfismos so actualmente referidos como SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms).

16 2) A fibrose cstica (FC) uma doena hereditria que faz certas glndulas produzirem secrees anormais, resultando disso vrios sintomas, os mais importantes afectando o trato digestivo e os pulmes. A FC uma doena recessiva, pelo que qualquer pessoa com FC deve ser homozigtica para os alelos da doena. Se os progenitores requererem aconselhamento gentico recorre-se anlise de RFLP que realizada ao seu DNA. Os RFLPs para a FC so conhecidos, portanto fcil determinar se uma pessoa homozigtica normal, heterozigtica portadora ou homozigtica com FC (Fig. 4).

1) As mutaes que causam a maior parte das doenas genticas humanas so mais variadas do que a nica mutao associada anemia falciforme. 2) Existem muitas doenas que resultam de vrios genes mutantes trabalhando juntos para produzir o fentipo da doena. 3) Ainda existem doenas genticas para as quais o gene ainda no foi descoberto. At o gene poder ser localizado, clonado e sequenciado nenhuma sonda pode ser feita para o detectar directamente.

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4.0 Concluso A tecnologia de anlise de DNA possibilitou o diagnstico de inmeras doenas genticas. Neste momento, desempenha um papel crescente na pesquisa e diagnstico deste tipo de patologias a reao em cadeia da polimerase (PCR) uma tcnica fundamental nos laboratrios atuais, que revolucionou a deteco de RNA e DNA. a PCR uma das tcnicas mais comuns utilizadas em laboratrios de pesquisas mdicas e biolgicas para diversas tarefas, como o

sequenciamento de genes e diagnstico de doenas hereditrias, identificao de fingerprint gentico (usado em testes de paternidade e na medicina forense), deteco de diagnstico de doenas infecciosas e criao de organismos transgnicos. O objetivo da PCR produzir uma quantidade aprecivel de um segmento especfico de DNA a partir de uma quantidade mnima. O DNA molde sofre uma amplificao controlada por enzimas, obtendo-se milhes de cpias do fragmento de DNA de interesse. O molde pode ser qualquer forma de DNA de cadeia dupla, como o DNA genmico, pode usar-se uma gota de sangue, um fio de cabelo, uma clula do epitlio oral, um blastmero Por RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) entende -se, em uma traduo livre do termo, o polimorfismo no comprimento de fragmentos obtidos por corte da fita dupla de DNA. Tal polimorfismo evidenciado pela fragmentao do DNA atravs do uso de enzimas de restrio e observado por hibridizao destes fragmentos com sequncias homlogas de DNA marcadas com radioatividade ou compostos que desencadeiam uma reao de luminescncia. Para que polimorfismo seja detectado, necessrio que as sequncias de nucleotdeos nas fitas de DNA de dois ou mais indivduos comparados sejam distintas. Como a diferena em sequncias de nucleotdeos ao longo da fita de DNA de indivduos distintos potencialmente enorme, a deteco destas diferenas abre perspectivas relevantes ao estudo do genoma, naturalmente com implicaes em diversas reas de gentica.Com o aumento da informao da sequncia gentica um grande nmero de doenas genticas podem ser determinadas atravs da anlise do RFLP:

18 .05 Referncias Bibliogrficas .

medicina.med.up.pt bcm trabalhos www.cefetsp.br edu tsi site 7-

5 tecnicasdeanalisede trabalhos ... met rpl.html

dna.doc

http://blog.cca.ufscar.br/lamam/files/2010/07/apostilacurso_molecular.pdf ria.ua.pt Departamento de iologia O - Dissertaes de mestrado

www.sobiologia.com.br conteudos iotecnologia PCR.php

it.wikipedia.org wiki RFLP

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