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Artculos
cido desoxirribonucleico Replicacin de ADN Secuenciacin de ADN 1 30 39
Referencias
Fuentes y contribuyentes del artculo Fuentes de imagen, Licencias y contribuyentes 54 55
Licencias de artculos
Licencia 57
cido desoxirribonucleico
cido desoxirribonucleico
El cido desoxirribonucleico, abreviado como ADN, es un cido nucleico que contiene instrucciones genticas usadas en el desarrollo y funcionamiento de todos los organismos vivos conocidos y algunos virus, y es responsable de su transmisin hereditaria. El papel principal de la molcula de ADN es el almacenamiento a largo plazo de informacin. Muchas veces, el ADN es comparado con un plano o una receta, o un cdigo, ya que contiene las instrucciones necesarias para construir otros componentes de las clulas, como las protenas y las molculas de ARN. Los segmentos de ADN que llevan esta informacin gentica son llamados genes, pero las otras secuencias de ADN tienen propsitos estructurales o toman parte en la regulacin del uso de esta informacin gentica.
Situacin del ADN dentro de una clula eucariota. Desde el punto de vista qumico, el ADN es un polmero de nucletidos, es decir, un polinucletido. Un polmero es un compuesto formado por muchas unidades simples conectadas entre s, como si fuera un largo tren formado por vagones. En el ADN, cada vagn es un nucletido, y cada nucletido, a su vez, est formado por un azcar (la desoxirribosa), una base nitrogenada (que puede ser adeninaA, timinaT, citosinaC o guaninaG) y un grupo fosfato que acta como enganche de cada vagn con el siguiente. Lo que distingue a un vagn (nucletido) de otro es, entonces, la base nitrogenada, y por ello la secuencia del ADN se especifica nombrando slo la secuencia de sus bases. La disposicin secuencial de estas cuatro bases a lo largo de la cadena (el ordenamiento de los cuatro tipos de vagones a lo largo de todo el tren) es la que codifica la informacin gentica: por ejemplo, una secuencia de ADN puede ser ATGCTAGATCGC... En los organismos vivos, el ADN se presenta como una doble cadena de nucletidos, en la que las dos hebras estn unidas entre s por unas conexiones denominadas puentes de hidrgeno.[1]
Para que la informacin que contiene el ADN pueda ser utilizada por la maquinaria celular, debe copiarse en primer lugar en unos trenes de nucletidos, ms cortos y con unas unidades diferentes, llamados ARN. Las molculas de ARN se copian exactamente del ADN mediante un proceso denominado transcripcin. Una vez procesadas en el ncleo celular, las molculas de ARN pueden salir al citoplasma para su utilizacin posterior. La informacin contenida en el ARN se interpreta usando el cdigo gentico, que especifica la secuencia de los aminocidos de las protenas, segn una correspondencia de un triplete de nucletidos (codn) para cada aminocido. Esto es, la informacin gentica (esencialmente: qu protenas se van a producir en cada momento del ciclo de vida de una clula) se halla codificada en las secuencias de nucletidos del ADN y debe traducirse para poder funcionar. Tal traduccin se realiza usando el cdigo gentico a modo de diccionario. El diccionario "secuencia de
cido desoxirribonucleico nucletido-secuencia de aminocidos" permite el ensamblado de largas cadenas de aminocidos (las protenas) en el citoplasma de la clula. Por ejemplo, en el caso de la secuencia de ADN indicada antes (ATGCTAGATCGC...), la ARN polimerasa utilizara como molde la cadena complementaria de dicha secuencia de ADN (que sera TAC-GAT-CTA-GCG-...) para transcribir una molcula de ARNm que se leera AUG-CUA-GAU-CGC-... ; el ARNm resultante, utilizando el cdigo gentico, se traducira como la secuencia de aminocidos metionina-leucina-cido asprtico-arginina-... Las secuencias de ADN que constituyen la unidad fundamental, fsica y funcional de la herencia se denominan genes. Cada gen contiene una parte que se transcribe a ARN y otra que se encarga de definir cundo y dnde deben expresarse. La informacin contenida en los genes (gentica) se emplea para generar ARN y protenas, que son los componentes bsicos de las clulas, los "ladrillos" que se utilizan para la construccin de los orgnulos u organelos celulares, entre otras funciones. Dentro de las clulas, el ADN est organizado en estructuras llamadas cromosomas que, durante el ciclo celular, se duplican antes de que la clula se divida. Los organismos eucariotas (por ejemplo, animales, plantas, y hongos) almacenan la mayor parte de su ADN dentro del ncleo celular y una mnima parte en elementos celulares llamados mitocondrias, y en los plastos y los centros organizadores de microtbulos o centrolos, en caso de tenerlos; los organismos procariotas (bacterias y arqueas) lo almacenan en el citoplasma de la clula, y, por ltimo, los virus ADN lo hacen en el interior de la cpsida de naturaleza proteica. Existen multitud de protenas, como por ejemplo las histonas y los factores de transcripcin, que se unen al ADN dotndolo de una estructura tridimensional determinada y regulando su expresin. Los factores de transcripcin reconocen secuencias reguladoras del ADN y especifican la pauta de transcripcin de los genes. El material gentico completo de una dotacin cromosmica se denomina genoma y, con pequeas variaciones, es caracterstico de cada especie.
Historia de la gentica
El ADN lo aisl por primera vez, durante el invierno de 1869, el mdico suizo Friedrich Miescher mientras trabajaba en la Universidad de Tubinga. Miescher realizaba experimentos acerca de la composicin qumica del pus de vendas quirrgicas desechadas cuando not un precipitado de una sustancia desconocida que caracteriz qumicamente ms tarde.[2] Lo llam nuclena, debido a que lo haba extrado a partir de ncleos celulares. Se necesitaron casi 70 aos de investigacin para poder identificar los componentes y la estructura de los cidos nucleicos. En 1919 Phoebus Levene identific que un nucletido est formado por una base nitrogenada, un azcar y un fosfato. Levene sugiri que el ADN generaba una estructura con forma de solenoide (muelle) con unidades de nucletidos unidos a travs de los grupos fosfato. En 1930 Levene y su maestro Albrecht Kossel probaron que la nuclena de Miescher es un cido desoxirribonucleico (ADN) formado por cuatro Friedrich Miescher, bilogo y mdico suizo bases nitrogenadas (citosina (C), timina (T), adenina (A) y guanina (1844-1895). (G)), el azcar desoxirribosa y un grupo fosfato, y que, en su estructura bsica, el nucletido est compuesto por un azcar unido a la base y al fosfato.[3] Sin embargo, Levene pensaba que la cadena era corta y que las bases se repetan en un orden fijo. En 1937 William Astbury produjo el primer patrn de difraccin de rayos X que mostraba que el ADN tena una estructura regular.
cido desoxirribonucleico
La funcin biolgica del ADN comenz a dilucidarse en 1928, con una serie bsica de experimentos de la gentica moderna realizados por Frederick Griffith, quien estaba trabajando con cepas "lisas" (S) o "rugosas" (R) de la bacteria Pneumococcus (causante de la neumona), segn la presencia (S) o no (R) de una cpsula azucarada, que es la que confiere virulencia (vase tambin experimento de Griffith). La inyeccin de neumococos S vivos en ratones produce la muerte de stos, y Griffith observ que, si inyectaba ratones con neumococos R vivos o con neumococos S muertos por calor, los ratones no moran. Sin embargo, si inyectaba a la vez neumococos R vivos y neumococos Maclyn McCarty con Francis Crick y James D Watson. S muertos, los ratones moran, y en su sangre se podan aislar neumococos S vivos. Como las bacterias muertas no pudieron haberse multiplicado dentro del ratn, Griffith razon que deba producirse algn tipo de cambio o transformacin de un tipo bacteriano a otro por medio de una transferencia de alguna sustancia activa, que denomin principio transformante. Esta sustancia proporcionaba la capacidad a los neumococos R de producir una cpsula azucarada y transformarse as en virulentas. En los siguientes 15 aos, estos experimentos iniciales se replicaron mezclando distintos tipos de cepas bacterianas muertas por el calor con otras vivas, tanto en ratones (in vivo) como en tubos de ensayo (in vitro). La bsqueda del factor transformante que era capaz de hacer virulentas a cepas que inicialmente no lo eran continu hasta 1944, ao en el cual Oswald Avery, Colin MacLeod y Maclyn McCarty realizaron un experimento hoy clsico. Estos investigadores extrajeron la fraccin activa (el factor transformante) y, mediante anlisis qumicos, enzimticos y serolgicos, observaron que no contena protenas, ni lpidos no ligados, ni polisacridos activos, sino que estaba constituido principalmente por "una forma viscosa de cido desoxirribonucleico altamente polimerizado", es decir, ADN. El ADN extrado de las cepas bacterianas S muertas por el calor lo mezclaron "in vitro" con cepas R vivas: el resultado fue que se formaron colonias bacterianas S, por lo que se concluy inequvocamente que el factor o principio transformante era el ADN. A pesar de que la identificacin del ADN como principio transformante an tard varios aos en ser universalmente aceptada, este descubrimiento fue decisivo en el conocimiento de la base molecular de la herencia, y constituye el nacimiento de la gentica molecular. Finalmente, el papel exclusivo del ADN en la heredabilidad fue confirmado en 1952 mediante los experimentos de Alfred Hershey y Martha Chase, en los cuales comprobaron que el fago T2 transmita su informacin gentica en su ADN, pero no en su protena (vase tambin experimento de Hershey y Chase). En cuanto a la caracterizacin qumica de la molcula, en 1940 Chargaff realiz algunos experimentos que le sirvieron para establecer las proporciones de las bases nitrogenadas en el ADN. Descubri que las proporciones de purinas eran idnticas a las de pirimidinas, la "equimolecularidad" de las bases ([A]=[T], [G]=[C]) y el hecho de que la cantidad de G+C en una determinada molcula de ADN no siempre es igual a la cantidad de A+T y puede variar desde el 36 hasta el 70 por ciento del contenido total. Con toda esta informacin y junto con los datos de difraccin de rayos X proporcionados por Rosalind Franklin, James Watson y Francis Crick propusieron en 1953 el modelo de la doble hlice de ADN para representar la estructura tridimensional del polmero. En una serie de cinco artculos en el mismo nmero de Nature se public la evidencia experimental que apoyaba el modelo de Watson y Crick.[4] De stos, el artculo de Franklin y Raymond Gosling fue la primera publicacin con datos de difraccin de rayos X que apoyaba el modelo de Watson y Crick,[5] y en ese mismo nmero de Nature tambin apareca un artculo sobre la estructura del ADN de Maurice Wilkins y sus colaboradores. Watson, Crick y Wilkins recibieron conjuntamente, en 1962, despus de la muerte de Rosalind Franklin, el Premio Nobel en Fisiologa o Medicina.[6] Sin embargo, el debate contina sobre quin debera recibir crdito por el descubrimiento.
cido desoxirribonucleico
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Componentes
Estructura de soporte: La estructura de soporte de una hebra de ADN est formada por unidades alternas de grupos fosfato y azcar (desoxirribosa). El azcar en el ADN es una pentosa, concretamente, la desoxirribosa. cido fosfrico: Su frmula qumica es H3PO4. Cada nucletido puede contener uno (monofosfato: AMP), dos (difosfato: ADP) o tres (trifosfato: ATP) grupos de cido fosfrico, aunque como monmeros constituyentes de los cidos nucleicos slo aparecen en forma de nuclesidos monofosfato. Desoxirribosa: Es un monosacrido de 5 tomos de carbono (una pentosa) derivado de la ribosa, que forma parte de la estructura de nucletidos del ADN. Su frmula es C5H10O4. Una de las principales diferencias entre el ADN y el ARN es el azcar, pues en el ARN la 2-desoxirribosa del ADN es reemplazada por una pentosa alternativa, la ribosa. Las molculas de azcar se unen entre s a travs de grupos fosfato, que forman enlaces fosfodister entre los tomos de carbono tercero (3, tres prima) y quinto (5, cinco prima) de dos anillos adyacentes de azcar. La formacin de enlaces asimtricos implica que cada hebra de ADN tiene una direccin. En una doble hlice, la direccin de los nucletidos en una hebra (3 5) es opuesta a la direccin en la otra hebra (5 3). Esta Enlace fosfodister. El grupo fosfato (PO43-) une el carbono organizacin de las hebras de ADN se denomina 5' del azcar de un nuclesido con el carbono 3' del antiparalela; son cadenas paralelas, pero con direcciones siguiente. opuestas. De la misma manera, los extremos asimtricos de las hebras de ADN se denominan extremo 5 (cinco prima) y extremo 3 (tres prima), respectivamente. Bases nitrogenadas: Las cuatro bases nitrogenadas mayoritarias que se encuentran en el ADN son la adenina (A), la citosina (C), la guanina (G) y la timina (T). Cada una de estas cuatro bases est unida al armazn de azcar-fosfato a travs del azcar para formar el nucletido completo (base-azcar-fosfato). Las bases son compuestos heterocclicos y aromticos con dos o ms tomos de nitrgeno, y, dentro de las bases mayoritarias, se clasifican en dos grupos: las bases pricas o purinas (adenina y guanina), derivadas de la purina y formadas por dos anillos unidos entre s, y las bases pirimidnicas o bases pirimdicas o pirimidinas (citosina y timina), derivadas de la pirimidina y con un solo anillo. En los cidos nucleicos existe una quinta base pirimidnica, denominada uracilo (U), que normalmente ocupa el lugar de la timina en el ARN y difiere de sta en que carece de un grupo metilo en su anillo. El uracilo no se encuentra habitualmente en el ADN, slo aparece raramente como un producto residual de la degradacin de la citosina por procesos de desaminacin oxidativa.
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Timina: En el cdigo gentico se representa con la letra T. Es un derivado pirimidnico con un grupo oxo en las posiciones 2 y 4, y un grupo metil en la posicin 5. Forma el nuclesido timidina (siempre desoxitimidina, ya que slo aparece en el ADN) y el nucletido timidilato o timidina monofosfato (dTMP). En el ADN, la timina siempre se empareja con la adenina de la cadena complementaria mediante 2 puentes de hidrgeno, T=A. Su frmula qumica es C5H6N2O2 y su nomenclatura 2, 4-dioxo, 5-metilpirimidina.
Citosina: En el cdigo gentico se representa con la letra C. Es un derivado pirimidnico, con un grupo amino en posicin 4 y un grupo oxo en posicin 2. Forma el nuclesido citidina (desoxicitidina en el ADN) y el nucletido citidilato o (desoxi)citidina monofosfato (dCMP en el ADN, CMP en el ARN). La citosina siempre se empareja en el ADN con la guanina de la cadena complementaria mediante un triple enlace, CG. Su frmula qumica es C4H5N3O y su nomenclatura 2-oxo, 4 aminopirimidina. Su masa molecular es de 111,10 unidades de masa atmica. La citosina se descubri en 1894, al aislarla del tejido del timo de carnero.
Citosina: 2-oxo, 4-aminopirimidina.
Adenina: En el cdigo gentico se representa con la letra A. Es un derivado de la purina con un grupo amino en la posicin 6. Forma el nuclesido adenosina (desoxiadenosina en el ADN) y el nucletido adenilato o (desoxi)adenosina monofosfato (dAMP, AMP). En el ADN siempre se empareja con la timina de la cadena complementaria mediante 2 puentes de hidrgeno, A=T. Su frmula qumica es C5H5N5 y su nomenclatura 6-aminopurina. La adenina, junto con la timina, fue descubierta en 1885 por el mdico alemn Albrecht Kossel.
Adenina: 6-aminopurina.
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7 Guanina: En el cdigo gentico se representa con la letra G. Es un derivado prico con un grupo oxo en la posicin 6 y un grupo amino en la posicin 2. Forma el nuclesido (desoxi)guanosina y el nucletido guanilato o (desoxi)guanosina monofosfato (dGMP, GMP). La guanina siempre se empareja en el ADN con la citosina de la cadena complementaria mediante tres enlaces de hidrgeno, GC. Su frmula qumica es C5H5N5O y su nomenclatura 6-oxo, 2-aminopurina.
Tambin existen otras bases nitrogenadas (las llamadas bases nitrogenadas minoritarias), derivadas de forma natural o sinttica de alguna otra base mayoritaria. Lo son por ejemplo la hipoxantina, relativamente abundante en el tRNA, o la cafena, ambas derivadas de la adenina; otras, como el aciclovir, derivadas de la guanina, son anlogos sintticos usados en terapia antiviral; otras, como una de las derivadas del uracilo, son antitumorales. Las bases nitrogenadas tienen una serie de caractersticas que les confieren unas propiedades determinadas. Una caracterstica importante es su carcter aromtico, consecuencia de la presencia en el anillo de dobles enlaces en posicin conjugada. Ello les confiere la capacidad de absorber luz en la zona ultravioleta del espectro en torno a los 260 nm, lo cual puede aprovecharse para determinar el coeficiente de extincin del ADN y hallar la concentracin existente de los cidos nucleicos. Otra de sus caractersticas es que presentan tautomera o isomera de grupos funcionales, debido a que un tomo de hidrgeno unido a otro tomo puede migrar a una posicin vecina; en las bases nitrogenadas se dan dos tipos de tautomeras: tautomera lactama-lactima, donde el hidrgeno migra del nitrgeno al oxgeno del grupo oxo (forma lactama) y viceversa (forma lactima), y tautomera imina-amina primaria, donde el hidrgeno puede estar formando el grupo amina (forma amina primaria) o migrar al nitrgeno adyacente (forma imina). La adenina slo puede presentar tautomera amina-imina, la timina y el uracilo muestran tautomera doble lactama-lactima, y la guanina y citosina pueden presentar ambas. Por otro lado, y aunque se trate de molculas apolares, las bases nitrogenadas presentan suficiente carcter polar como para establecer puentes de hidrgeno, ya que tienen tomos muy electronegativos (nitrgeno y oxgeno) que presentan carga parcial negativa, y tomos de hidrgeno con carga parcial positiva, de manera que se forman dipolos que permiten que se formen estos enlaces dbiles. Se estima que el genoma humano haploide tiene alrededor de 3.000 millones de pares de bases. Para indicar el tamao de las molculas de ADN se indica el nmero de pares de bases, y como derivados hay dos unidades de medida muy utilizadas, la kilobase (kb), que equivale a 1.000 pares de bases, y la megabase (Mb), que equivale a un milln de pares de bases.
Apareamiento de bases
La dble hlice de ADN se mantiene estable mediante la formacin de puentes de hidrgeno entre las bases asociadas a cada una de las dos hebras. Para la formacin de un enlace de hidrgeno una de las bases debe presentar un "donador" de hidrgenos con un tomo de hidrgeno con carga parcial positiva (-NH2 o -NH) y la otra base debe presentar un grupo "aceptor" de hidrgenos con un tomo cargado electronegativamente (C=O o N). Los puentes de hidrgeno son uniones ms dbiles que los tpicos enlaces qumicos covalentes, como los que conectan los tomos en cada hebra de ADN, pero ms fuertes
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que interacciones hidrfobas individuales, enlaces de Van der Waals, etc. Como los puentes de hidrgeno no son enlaces covalentes, pueden romperse y formarse de nuevo de forma relativamente sencilla. Por esta razn, las dos hebras de la doble hlice pueden separarse como una cremallera, bien por fuerza mecnica o por alta temperatura. La doble hlice se estabiliza adems por el efecto hidrofbico y el apilamiento, que no se ven influidos por la secuencia de bases del ADN.
Cada tipo de base en una hebra forma un enlace nicamente con un tipo de base en la otra hebra, lo que se denomina complementariedad de las bases. As, las purinas forman enlaces con las pirimidinas, de forma que A se enlaza slo con T, y C slo con G. La organizacin de dos nucletidos apareados a lo largo de la doble hlice se denomina apareamiento de bases. Este emparejamiento corresponde a la observacin ya realizada por Erwin Chargaff (1905-2002),[11] que mostr que la cantidad de adenina era muy similar a la cantidad de timina, y que la cantidad de citosina era igual a la cantidad de guanina en el ADN. Como resultado de esta complementariedad, toda la informacin contenida en la secuencia de doble hebra de la hlice de ADN est duplicada en cada hebra, lo cual es fundamental durante el proceso de replicacin del ADN. En efecto, esta interaccin reversible y especfica entre pares de bases complementarias es crtica para todas las funciones del ADN en los organismos vivos. Como se ha indicado anteriormente, los dos tipos de pares de bases forman un nmero diferente de enlaces de hidrgeno: A=T forman dos puentes de hidrgeno, y CG forman tres puentes de hidrgeno (ver imgenes). El par de bases GC es por tanto ms fuerte que el par de bases AT. Como consecuencia, tanto el porcentaje de pares de bases GC como la longitud total de la doble hlice de ADN determinan la fuerza de la asociacin entre las dos hebras de ADN. Las dobles hlices largas de ADN con alto contenido en GC tienen hebras que interaccionan ms fuertemente que las dobles hlices cortas con alto contenido en AT. Por esta razn, las zonas de la doble hlice de ADN que necesitan separarse fcilmente tienden a tener un alto contenido en AT, como por ejemplo la secuencia TATAAT de la caja de Pribnow de algunos promotores. En el laboratorio, la fuerza de esta interaccin puede medirse buscando la temperatura requerida para romper los puentes de hidrgeno, la temperatura de fusin (tambin denominado valor Tm, del ingls melting temperature). Cuando todas las pares de bases en una doble hlice se funden, las hebras se separan en solucin en dos hebras completamente independientes. Estas molculas de ADN de hebra simple no tienen una nica forma comn, sino que algunas conformaciones son ms estables que otras.
Un par A=T con dos puentes de hidrgeno. Los puentes de hidrgeno se muestran como lneas discontinuas.
cido desoxirribonucleico Otros tipos de pares de bases Existen diferentes tipos de pares de bases que se pueden formar segn el modo como se forman los puentes de hidrgeno. Los que se observan en la doble hlice de ADN son los llamados pares de bases Watson-Crick, pero tambin existen otros posibles pares de bases, como los denominados Hoogsteen y Wobble u oscilante, que pueden aparecer en circunstancias particulares. Adems, para cada tipo existe a su vez el mismo par reverso, es decir, el que se da si se gira la base pirimidnica 180 sobre su eje. Watson-Crick (pares de bases de la doble hlice): los grupos de la base prica que intervienen en el enlace de hidrgeno son los que corresponden a las posiciones 1 y 6 (N aceptor y -NH2 donador si la purina es una A) y los grupos de la base pirimidnica, los que se encuentran en las posiciones 3 y 4 (-NH donador y C=O aceptor si la pirimidina es una T). En el par de bases Watson-Crick reverso participaran los grupos de las posiciones 2 y 3 de la base pirimidnica (ver imgenes). Hoogsteen: en este caso cambian los grupos de la base prica, que ofrece una cara diferente (posiciones 6 y 7) y que forman enlaces con los grupos de las pirimidinas de las posiciones 3 y 4 (como en Watson-Crick). Tambin puede haber Hoogsteen reversos. Con este tipo de enlace pueden unirse A=U (Hoogsteen y Hoogsteen reverso) y A=C (Hoogsteen reverso).
Par de bases A=T de tipo Watson-Crick. En azul el donador de hidrgenos y en rojo el aceptor.
Par de bases A=T de tipo Watson-Crick reverso. En azul el donador de hidrgenos y en rojo el aceptor. Ntese que la pirimidina ha sufrido un giro de 180 sobre el eje del carbono 6.
Wobble u oscilante: este tipo de enlace permite que se unan guanina y citosina con un doble enlace (G=T). La base prica (G) forma enlace con los grupos de las posiciones 1 y 6 (como en Watson-Crick) y la pirimidina (T) con los grupos de las posiciones 2 y 3. Este tipo de enlace no funcionara con A=C, ya que quedaran enfrentados los 2 aceptores y los 2 donadores, y slo se podra dar en el caso inverso. Encontramos pares de bases de tipo oscilante en el ARN, durante el apareamiento de codn y anticodn. Con este tipo de enlace pueden unirse G=U (oscilante y oscilante reverso) y A=C (oscilante reverso). En total, en su forma tautomrica mayoritaria, existen 28 posibles pares de bases nitrogenadas: 10 posibles pares de bases purina-pirimidina (2 pares Watson-Crick y 2 Watson Crick reverso, 1 par Hoogsteen y 2 pares Hoogsteen reverso, 1 par oscilante y 2 pares oscilante reverso), 7 pares homo purina-purina (A=A, G=G), 4 pares A=G y 7 pares
cido desoxirribonucleico pirimidina-pirimidina. Esto sin contar con los pares de bases que pueden formarse si tambin tenemos en cuenta las otras formas tautomricas minoritarias de las bases nitrogenadas; stos, adems, pueden ser responsables de mutaciones puntuales por sustitucin de tipo transicin.
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Estructura
El ADN es una molcula bicatenaria, es decir, est formada por dos cadenas dispuestas de forma antiparalela y con las bases nitrogenadas enfrentadas. En su estructura tridimensional, se distinguen distintos niveles:[12][13] 1. Estructura primaria: Secuencia de nucletidos encadenados. Es en estas cadenas donde se encuentra la informacin gentica, y dado que el esqueleto es el mismo para todos, la diferencia de la informacin radica en la distinta secuencia de bases nitrogenadas. Esta secuencia presenta un cdigo, que determina una informacin u otra, segn el orden de las bases. 2. Estructura secundaria: Es una estructura en doble hlice. Permite explicar el almacenamiento de la informacin gentica y el mecanismo de duplicacin del ADN. Fue postulada por Watson y Crick, basndose en la difraccin de rayos X que haban realizado Franklin y Wilkins, y en la equivalencia de bases de Chargaff, segn la cual la suma de adeninas ms guaninas es igual a la suma de timinas ms citosinas. Es una cadena doble, dextrgira o levgira, segn el tipo de ADN. Ambas cadenas son complementarias, pues la adenina y la guanina de una cadena se unen, respectivamente, a la timina y la citosina de la otra. Ambas cadenas son antiparalelas, pues el extremo 3 de una se enfrenta al extremo 5 de la homloga. Existen tres modelos de ADN. El ADN de tipo B es el ms abundante y es el que tiene la estructura descrita por Watson y Crick. 3. Estructura terciaria: Se refiere a cmo se almacena el ADN en un espacio reducido, para formar los cromosomas. Vara segn se trate de organismos procariotas o eucariotas: 1. En procariotas el ADN se pliega como una sper-hlice, generalmente en forma circular y asociada a una pequea cantidad de protenas. Lo mismo ocurre en orgnulos celulares como las mitocondrias y en los cloroplastos. 2. En eucariotas, dado que la cantidad de ADN de cada cromosoma es muy grande, el empaquetamiento ha de ser ms complejo y compacto; para ello se necesita la presencia de protenas, como las histonas y otras protenas de naturaleza no histnica (en los espermatozoides estas protenas son las protaminas). 4. Estructura cuaternaria: La cromatina presente en el ncleo tiene un grosor de 300 , pues la fibra de cromatina de 100 se enrolla formando una fibra de cromatina de 300 . El enrollamiento de los nucleosomas recibe el nombre de solenoide. Dichos solenoides se enrollan formando la cromatina del ncleo interfsico de la clula eucariota. Cuando la clula entra en divisin, el ADN se compacta ms, formando as los cromosomas.
cido desoxirribonucleico Estructuras en doble hlice El ADN existe en muchas conformaciones. Sin embargo, en organismos vivos slo se han observado las conformaciones ADN-A, ADN-B y ADN-Z. La conformacin que adopta el ADN depende de su secuencia, la cantidad y direccin de superenrollamiento que presenta, la presencia de modificaciones qumicas en las bases y las condiciones de la solucin, tales como la concentracin de iones de metales y poliaminas. De las tres conformaciones, la forma "B" es la ms comn en las condiciones existentes en las clulas. Las dos dobles hlices alternativas del ADN difieren en su geometra y dimensiones.
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La forma "A" es una espiral que gira hacia la derecha, ms amplia que la "B", con una hendidura menor superficial y ms amplia, y una hendidura mayor ms estrecha y profunda. La forma "A" ocurre en condiciones no fisiolgicas en formas deshidratadas de ADN, mientras que en la clula puede producirse en apareamientos hbridos de hebras ADN-ARN, adems de en complejos enzima-ADN. Los segmentos de ADN en los que las bases han sido modificadas por metilacin pueden sufrir cambios conformacionales mayores y adoptar la forma "Z". En este caso, las hebras giran alrededor del eje de la hlice en una espiral que gira a mano izquierda, lo opuesto a la forma "B" ms frecuente. Estas estructuras poco frecuentes pueden ser reconocidas por protenas especficas que se unen a ADN-Z y posiblemente estn implicadas en la regulacin de la transcripcin. Estructuras en cudruplex En los extremos de los cromosomas lineales existen regiones especializadas de ADN denominadas telmeros. La funcin principal de estas regiones es permitir a la clula replicar los extremos cromosmicos utilizando la enzima telomerasa, puesto que las enzimas que replican el resto del ADN no pueden copiar los extremos 3' de los cromosomas. Estas terminaciones cromosmicas especializadas tambin protegen los extremos del ADN, y evitan que los sistemas de reparacin del ADN en la clula los procesen como ADN daado que debe ser corregido. En las clulas humanas, los telmeros son largas zonas de ADN de hebra sencilla que contienen algunos miles de repeticiones de una nica secuencia TTAGGG.
Estas secuencias ricas en guanina pueden estabilizar los extremos cromosmicos mediante la formacin de estructuras de juegos apilados de unidades de cuatro bases, en lugar de los pares de bases encontrados normalmente en otras estructuras de ADN. En este caso, cuatro bases guanina forman unidades con superficie plana que se apilan una sobre otra, para formar una estructura cudruple-G estable. Estas estructuras se estabilizan formando puentes de hidrgeno entre los extremos de las bases y la quelatacin de un metal inico en el
Estructura de un ADN en cudruplex formada por repeticiones en los telmeros. La conformacin de la estructura de soporte del ADN difiere significativamente de la [14] tpica estructura en hlice.
cido desoxirribonucleico centro de cada unidad de cuatro bases. Tambin se pueden formar otras estructuras, con el juego central de cuatro bases procedente, o bien de una hebra sencilla plegada alrededor de las bases, o bien de varias hebras paralelas diferentes, de forma que cada una contribuye con una base a la estructura central. Adems de estas estructuras apiladas, los telmeros tambin forman largas estructuras en lazo, denominadas lazos telomricos o lazos-T (T-loops en ingls). En este caso, las hebras simples de ADN se enroscan sobre s mismas en un amplio crculo estabilizado por protenas que se unen a telmeros. En el extremo del lazo T, el ADN telomrico de hebra sencilla se sujeta a una regin de ADN de doble hebra porque la hebra de ADN telomrico altera la doble hlice y se aparea a una de las dos hebras. Esta estructura de triple hebra se denomina lazo de desplazamiento o lazo D (D-loop).
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Animacin de la estructura de una seccin de ADN. Las bases se encuentran horizontalmente entre las dos hebras en espiral. Versin [15] ampliada
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La anchura de la hendidura mayor implica que los extremos de las bases son ms accesibles en sta, de forma que la cantidad de grupos qumicos expuestos tambin es mayor lo cual facilita la diferenciacin entre los pares de bases A-T, T-A, C-G, G-C. Como consecuencia de ello, tambin se ver facilitado el reconocimiento de secuencias de ADN por parte de diferentes protenas sin la necesidad de abrir la doble hlice. As, protenas como los factores de transcripcin Hendiduras mayor y menor de la doble hlice. que pueden unirse a secuencias especficas, frecuentemente contactan con los laterales de las bases expuestos en la hendidura mayor. Por el contrario, los grupos qumicos que quedan expuestos en la hendidura menor son similares, de forma que el reconocimiento de los pares de bases es ms difcil; por ello se dice que la hendidura mayor contiene ms informacin que la hendidura menor.
Sentido y antisentido
Una secuencia de ADN se denomina "sentido" (en ingls, sense) si su secuencia es la misma que la secuencia de un ARN mensajero que se traduce en una protena. La secuencia de la hebra de ADN complementaria se denomina "antisentido" (antisense). En ambas hebras de ADN de la doble hlice pueden existir tanto secuencias sentido, que codifican ARNm, como antisentido, que no lo codifican. Es decir, las secuencias que codifican ARNm no estn todas presentes en una sola de las hebras, sino repartidas entre las dos hebras. Tanto en procariotas como en eucariotas se producen ARNs con secuencias antisentido, pero la funcin de esos ARNs no est completamente clara. Se ha propuesto que los ARNs antisentido estn implicados en la regulacin de la expresin gnica mediante apareamiento ARN-ARN: los ARNs antisentido se aparearan con los ARNm complementarios, bloqueando de esta forma su traduccin. En unas pocas secuencias de ADN en procariotas y eucariotas (este hecho es ms frecuente en plsmidos y virus), la distincin entre hebras sentido y antisentido es ms difusa, debido a que presentan genes superpuestos. En estos casos, algunas secuencias de ADN tienen una funcin doble, codificando una protena cuando se lee a lo largo de una hebra, y una segunda protena cuando se lee en la direccin contraria a lo largo de la otra hebra. En bacterias, esta superposicin puede estar involucrada en la regulacin de la transcripcin del gen, mientras que en virus los genes superpuestos aumentan la cantidad de informacin que puede codificarse en sus diminutos genomas.
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Superenrollamiento
El ADN puede retorcerse como una cuerda en un proceso que se denomina superenrollamiento del ADN (supercoiling, en ingls). Cuando el ADN est en un estado "relajado", una hebra normalmente gira alrededor del eje de la doble hlice una vez cada 10,4 pares de bases, pero si el ADN est retorcido las hebras pueden estar unidas ms estrechamente o ms relajadamente. Si el ADN est Estructura de molculas de ADN lineales con los extremos fijos y superenrolladas. Por retorcido en la direccin de la hlice, claridad, se ha omitido la estructura en hlice del ADN. se dice que el superenrollamiento es positivo, y las bases se mantienen juntas de forma ms estrecha. Si el ADN se retuerce en la direccin opuesta, el superenrollamiento se llama negativo, y las bases se alejan. En la naturaleza, la mayor parte del ADN tiene un ligero superenrollamiento negativo que es producido por enzimas denominadas topoisomerasas. Estas enzimas tambin son necesarias para liberar las fuerzas de torsin introducidas en las hebras de ADN durante procesos como la transcripcin y la replicacin.
Modificaciones qumicas
citosina
5-metil-citosina
timina
Estructura de la citosina con y sin el grupo metilo. Tras la desaminacin, la 5-metil-citosina tiene la misma estructura que la timina.
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El dao en el ADN inicia una respuesta que activa diferentes mecanismos de reparacin que reconocen lesiones especficas en el ADN, que son reparadas en el momento para recuperar la secuencia original del ADN. Asimismo, el dao en el ADN provoca una parada en el ciclo celular, que conlleva la alteracin de numerosos procesos fisiolgicos, que a su vez implica sntesis, transporte y degradacin de protenas (vase tambin Checkpoint de daos en el ADN). Alternativamente, si el dao genmico es demasiado grande para que pueda ser reparado, los mecanismos de control inducirn la activacin de una serie de rutas celulares que culminarn en la muerte celular.
Funciones biolgicas
Las funciones biolgicas del ADN incluyen el almacenamiento de informacin (genes y genoma), la codificacin de protenas (transcripcin y traduccin) y su autoduplicacin (replicacin del ADN) para asegurar la transmisin de la informacin a las clulas hijas durante la divisin celular.
Genes y genoma
El ADN se puede considerar como un almacn cuyo contenido es la informacin (mensaje) necesaria para construir y sostener el organismo en el que reside, la cual se transmite de generacin en generacin. El conjunto de informacin que cumple esta funcin en un organismo dado se denomina genoma, y el ADN que lo constituye, ADN genmico. El ADN genmico (que se organiza en molculas de cromatina que a su vez se ensamblan en cromosomas) se encuentra en el ncleo celular de los eucariotas, adems de pequeas cantidades en las mitocondrias y cloroplastos. En procariotas, el ADN se encuentra en un cuerpo de forma irregular denominado nucleoide.
cido desoxirribonucleico El ADN codificante La informacin gentica de un genoma est contenida en los genes, y al conjunto de toda la informacin que corresponde a un organismo se le denomina su genotipo. Un gen es una unidad de herencia y es una regin de ADN que influye en una caracterstica particular de un organismo (como el color de los ojos, por ejemplo). Los genes contienen un "marco de lectura abierto" (open reading frame) que puede transcribirse, adems de secuencias reguladoras, tales como promotores y enhancers, que controlan la transcripcin del marco de lectura abierto.
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ARN polimerasa T7 (azul) produciendo un ARNm (verde) a partir de un molde de [17] ADN (naranja).
Desde este punto de vista, las obreras de este mecanismo son las protenas. Estas pueden ser estructurales, como las protenas de los msculos, cartlagos, pelo, etc., o funcionales, como la hemoglobina o las innumerables enzimas del organismo. La funcin principal de la herencia es la especificacin de las protenas, siendo el ADN una especie de plano o receta para producirlas. La mayor parte de las veces la modificacin del ADN provocar una disfuncin proteica que dar lugar a la aparicin de alguna enfermedad. Pero en determinadas ocasiones, las modificaciones podrn provocar cambios beneficiosos que darn lugar a individuos mejor adaptados a su entorno. Las aproximadamente treinta mil protenas diferentes en el cuerpo humano estn constituidas por veinte aminocidos diferentes, y una molcula de ADN debe especificar la secuencia en que se unen dichos aminocidos. En el proceso de elaborar una protena, el ADN de un gen se lee y se transcribe a ARN. Este ARN sirve como mensajero entre el ADN y la maquinaria que elaborar las protenas y por eso recibe el nombre de ARN mensajero o ARNm. El ARN mensajero sirve de molde a la maquinaria que elabora las protenas, para que ensamble los aminocidos en el orden preciso para armar la protena. El dogma central de la biologa molecular estableca que el flujo de actividad y de informacin era: ADN ARN protena. No obstante, en la actualidad ha quedado demostrado que este "dogma" debe ser ampliado, pues se han encontrado otros flujos de informacin: en algunos organismos (virus de ARN) la informacin fluye de ARN a ADN; este proceso se conoce como "transcripcin inversa o reversa", tambin llamada "retrotranscripcin". Adems, se sabe que existen secuencias de ADN que se transcriben a ARN y son funcionales como tales, sin llegar a traducirse nunca a protena: son los ARN no codificantes, como es el caso de los ARN interferentes. El ADN no codificante El ADN del genoma de un organismo puede dividirse conceptualmente en dos: el que codifica las protenas (los genes) y el que no codifica. En muchas especies, slo una pequea fraccin del genoma codifica protenas. Por ejemplo, slo alrededor del 1,5% del genoma humano consiste en exones que codifican protenas (20.000 a 25.000 genes), mientras que ms del 90% consiste en ADN no codificante. El ADN no codificante (tambin denominado ADN basura o junk DNA) corresponde a secuencias del genoma que no generan una protena (procedentes de transposiciones, duplicaciones, translocaciones y recombinaciones de virus, etc.), incluyendo los intrones. Hasta hace poco tiempo se pensaba que el ADN no codificante no tena utilidad alguna, pero estudios recientes indican que eso es inexacto. Entre otras funciones, se postula que el llamado "ADN basura" regula la expresin diferencial de los genes. Por ejemplo, algunas secuencias tienen afinidad hacia protenas
cido desoxirribonucleico especiales que tienen la capacidad de unirse al ADN (como los homeodominios, los complejos receptores de hormonas esteroides, etc.), con un papel importante en el control de los mecanismos de trascripcin y replicacin. Estas secuencias se llaman frecuentemente "secuencias reguladoras", y los investigadores suponen que slo se ha identificado una pequea fraccin de las que realmente existen. La presencia de tanto ADN no codificante en genomas eucariticos y las diferencias en tamao del genoma entre especies representan un misterio que es conocido como el "enigma del valor de C". Recientemente, un grupo de investigadores de la Universidad de Yale ha descubierto una secuencia de ADN no codificante que sera la responsable de que los seres humanos hayan desarrollado la capacidad de agarrar y/o manipular objetos o herramientas. Por otro lado, algunas secuencias de ADN desempean un papel estructural en los cromosomas: los telmeros y centrmeros contienen pocos o ningn gen codificante de protenas, pero son importantes para estabilizar la estructura de los cromosomas. Algunos genes no codifican protenas, pero s se transcriben en ARN: ARN ribosmico, ARN de transferencia y ARN de interferencia (ARNi, que son ARN que bloquean la expresin de genes especficos). La estructura de intrones y exones de algunos genes (como los de inmunoglobulinas y protocadherinas) son importantes por permitir los cortes y empalmes alternativos del pre-ARN mensajero que hacen posible la sntesis de diferentes protenas a partir de un mismo gen (sin esta capacidad no existira el sistema inmune, por ejemplo). Algunas secuencias de ADN no codificante representan pseudogenes que tienen valor evolutivo, ya que permiten la creacin de nuevos genes con nuevas funciones. Otros ADN no codificantes proceden de la duplicacin de pequeas regiones del ADN; esto tiene mucha utilidad, ya que el rastreo de estas secuencias repetitivas permite estudios de filogenia.
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Transcripcin y traduccin
En un gen, la secuencia de nucletidos a lo largo de una hebra de ADN se transcribe a un ARN mensajero (ARNm) y esta secuencia a su vez se traduce a una protena que un organismo es capaz de sintetizar o "expresar" en uno o varios momentos de su vida, usando la informacin de dicha secuencia. La relacin entre la secuencia de nucletidos y la secuencia de aminocidos de la protena viene determinada por el cdigo gentico, que se utiliza durante el proceso de traduccin o sntesis de protenas. La unidad codificadora del cdigo gentico es un grupo de tres nucletidos (triplete), representado por las tres letras iniciales de las bases nitrogenadas (por ej., ACT, CAG, TTT). Los tripletes del ADN se transcriben en sus bases complementarias en el ARN mensajero, y en este caso los tripletes se denominan codones (para el ejemplo anterior, UGA, GUC, AAA). En el ribosoma cada codn del ARN mensajero interacciona con una molcula de ARN de transferencia (ARNt o tRNA) que contenga el triplete complementario, denominado anticodn. Cada ARNt porta el aminocido correspondiente al codn de acuerdo con el cdigo gentico, de modo que el ribosoma va uniendo los aminocidos para formar una nueva protena de acuerdo con las "instrucciones" de la secuencia del ARNm. Existen 64 codones posibles, por lo cual corresponde ms de uno para cada aminocido (por esta duplicidad de codones se dice que el cdigo gentico es un cdigo degenerado: no es unvoco); algunos codones indican la terminacin de la sntesis, el fin de la secuencia codificante; estos codones de terminacin o codones de parada son UAA, UGA y UAG (en ingls, nonsense codons o stop codons).
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Interacciones ADN-protena
Todas las funciones del ADN dependen de sus interacciones con protenas. Estas interacciones pueden ser inespecficas, o bien la protena puede unirse de forma especfica a una nica secuencia de ADN. Tambin pueden unirse enzimas, entre las cuales son particularmente importantes las polimerasas, que copian las secuencia de bases del ADN durante la transcripcin y la replicacin.
cido desoxirribonucleico Interaccin de ADN con histonas (en blanco, arriba). Los aminocidos bsicos de estas protenas (abajo a la izquierda, en azul) se unen a los grupos cidos de los fosfatos del ADN (abajo a la derecha, en rojo). Las protenas estructurales que se unen al ADN son ejemplos bien conocidos de interacciones inespecficas ADN-protenas. En los cromosomas, el ADN se encuentra formando complejos con protenas estructurales. Estas protenas organizan el ADN en una estructura compacta denominada cromatina. En eucariotas esta estructura implica la unin del ADN a un complejo formado por pequeas protenas bsicas denominadas histonas, mientras que en procariotas estn involucradas una gran variedad de protenas. Las histonas forman un complejo de forma cilndrica denominado nucleosoma, en torno al cual se enrollan casi dos vueltas de ADN de doble hlice. Estas interacciones inespecficas quedan determinadas por la existencia de residuos bsicos en las histonas, que forman enlaces inicos con el esqueleto de azcar-fosfato del ADN y, por tanto, son en gran parte independientes de la secuencia de bases. Estos aminocidos bsicos experimentan modificaciones qumicas de metilacin, fosforilacin y acetilacin, que alteran la fuerza de la interaccin entre el ADN y las histonas, haciendo al ADN ms o menos accesible a los factores de transcripcin y por tanto modificando la tasa de transcripcin. Otras protenas que se unen a ADN de manera inespecfica en la cromatina incluyen las protenas del grupo de alta movilidad (HMG, High Mobility Group) que se unen a ADN plegado o distorsionado. Estas protenas son importantes durante el plegamiento de los nucleosomas, organizndolos en estructuras ms complejas para constituir los cromosomas durante el proceso de condensacin cromosmica. Se ha propuesto que en este proceso tambin intervendran otras protenas, formando una especie de "andamio" sobre el cual se organiza la cromatina; los principales componentes de esta estructura seran la enzima topoisomerasa II (topoIIalpha) y la condensina 13S. Sin embargo, el papel estructural de la topoIIalpha en la organizacin de los cromosomas an es discutido, ya que otros grupos argumentan que esta enzima se intercambia rpidamente tanto en los brazos cromosmicos como en los cinetocoros durante la mitosis. Interacciones especficas Un grupo bien definido de protenas que unen ADN es el conformado por las protenas que se unen especficamente a ADN monocatenario o ADN de hebra sencilla (ssDNA). En humanos, la protena A de replicacin es la mejor conocida de su familia y acta en procesos en los que la doble hlice se separa, como la replicacin del ADN, la recombinacin o la reparacin del ADN. Estas protenas parecen estabilizar el ADN monocatenario, protegindolo para evitar que forme estructuras de tallo-lazo (stem-loop) o que sea degradado por nucleasas.
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Sin embargo, otras protenas han evolucionado para unirse especficamente a secuencias particulares de ADN. La especificidad de la interaccin de las protenas con el ADN procede de los mltiples contactos con las bases de ADN, lo que les permite "leer" la secuencia del ADN. La mayora de esas interacciones con las bases ocurre en la hendidura mayor, donde las bases son ms accesibles. Las protenas especficas estudiadas con mayor detalle son las encargadas de regular la transcripcin, denominadas por ello factores de transcripcin. Cada factor de transcripcin se une a una secuencia concreta de ADN y activa o inhibe la transcripcin de los genes que presentan estas secuencias prximas a sus promotores. Los factores de transcripcin pueden efectuar esto de dos formas: En primer lugar, pueden unirse a la polimerasa de ARN responsable de la transcripcin, bien directamente o a travs de otras protenas mediadoras. De esta forma. se estabiliza la unin entre la ARN polimerasa y el promotor, lo que permite el inicio de la transcripcin. En segundo lugar, los factores de transcripcin pueden unirse a enzimas que modifican las histonas del promotor, lo que altera la accesibilidad del molde de ADN a la ARN polimerasa.
El factor de transcripcin represor del fago lambda unido a su ADN diana mediante un motivo [18] hlice-giro-hlice (helix-turn-helix).
Como los ADN diana pueden encontrarse por todo el genoma del organismo, los cambios en la actividad de un tipo de factor de transcripcin pueden afectar a miles de genes. En consecuencia, estas protenas son frecuentemente las dianas de los procesos de transduccin de seales que controlan las respuestas a cambios ambientales o diferenciacin y desarrollo celular.
cido desoxirribonucleico Las enzimas denominadas ADN ligasas pueden reunir hebras de ADN cortadas o rotas. Las ligasas son particularmente importantes en la replicacin de la hebra que sufre replicacin discontinua en el ADN, ya que unen los fragmentos cortos de ADN generados en la horquilla de replicacin para formar una copia completa del molde de ADN. Tambin se utilizan en la reparacin del ADN y en procesos de recombinacin gentica. Topoisomerasas y helicasas Las topoisomerasas son enzimas que poseen a la vez actividad nucleasa y ligasa. Estas protenas varan la cantidad de ADN superenrollado. Algunas de estas enzimas funcionan cortando la hlice de ADN y permitiendo que una seccin rote, de manera que reducen el grado de superenrollamiento. Una vez hecho esto, la enzima vuelve a unir los fragmentos de ADN. Otros tipos de enzimas son capaces de cortar una hlice de ADN y luego pasar la segunda hebra de ADN a travs de la rotura, antes de reunir las hlices. Las topoisomerasas son necesarias para muchos procesos en los que interviene el ADN, como la replicacin del ADN y la transcripcin. Las helicasas son unas protenas que pertenecen al grupo de los motores moleculares. Utilizan energa qumica almacenada en los nuclesidos trifosfatos, fundamentalmente ATP, para romper puentes de hidrgeno entre bases y separar la doble hlice de ADN en hebras simples. Estas enzimas son esenciales para la mayora de los procesos en los que las enzimas necesitan acceder a las bases del ADN. Polimerasas Las polimerasas son enzimas que sintetizan cadenas de nucletidos a partir de nuclesidos trifosfatos. La secuencia de sus productos son copias de cadenas de polinucletidos existentes, que se denominan moldes. Estas enzimas funcionan aadiendo nucletidos al grupo hidroxilo en 3' del nucletido previo en una hebra de ADN. En consecuencia, todas las polimerasas funcionan en direccin 5 --> 3. En los sitios activos de estas enzimas, el nuclesido trifosfato que se incorpora aparea su base con la correspondiente en el molde: esto permite que la polimerasa sintentice de forma precisa la hebra complementaria al molde. Las polimerasas se clasifican de acuerdo al tipo de molde que utilizan: En la replicacin del ADN, una ADN polimerasa dependiente de ADN realiza una copia de ADN a partir de una secuencia de ADN. La precisin es vital en este proceso, por lo que muchas de estas polimerasas tienen una actividad de verificacin de la lectura (proofreading). Mediante esta actividad, la polimerasa reconoce errores ocasionales en la reaccin de sntesis, debido a la falta de apareamiente entre el nucletido errneo y el molde, lo que genera un desacoplamiento (mismatch). Si se detecta un desacoplamiento, se activa una actividad exonucleasa en direccin 3 --> 5 y la base incorrecta se elimina. En la mayora de los organismos las ADN polimerasas funcionan en un gran complejo denominado replisoma, que contiene mltiples unidades accesorias, como helicasas. Las ADN polimerasas dependientes de ARN son una clase especializada de polimerasas que copian la secuencia de una hebra de ARN en ADN. Incluyen la transcriptasa inversa, que es una enzima viral implicada en la infeccin de clulas por retrovirus, y la telomerasa, que es necesaria para la replicacin de los telmeros. La telomerasa es una polimerasa inusual, porque contiene su propio molde de ARN como parte de su estructura. La transcripcin se lleva a cabo por una ARN polimerasa dependiente de ADN que copia la secuencia de una de las hebras de ADN en ARN. Para empezar a transcribir un gen, la ARN polimerasa se une a una secuencia del ADN denominada promotor, y separa las hebras del ADN. Entonces copia la secuencia del gen en un transcrito de ARN mensajero hasta que alcanza una regin de ADN denomimada terminador, donde se detiene y se separa del ADN. Como ocurre con las ADN polimerasas dependientes de ADN en humanos, la ARN polimerasa II (la enzima que transcribe la mayora de los genes del genoma humano) funciona como un gran complejo multiproteico que contiene mltiples subunidades reguladoras y accesorias.
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Recombinacin gentica
Estructura de un intermedio en unin de Holliday en la recombinacin gentica. Las cuatro hebras de ADN separadas estn coloreadas en rojo, azul, verde y amarillo.[20] Una hlice de ADN normalmente no interacciona con otros segmentos de ADN, y en las clulas humanas los diferentes cromosomas incluso ocupan reas separadas en el ncleo celular denominadas territorios cromosmicos. La separacin fsica de los diferentes cromosomas es importante para que el ADN mantenga su capacidad de funcionar como un almacn estable de informacin. Uno de los pocos momentos en los que los cromosomas interaccionan es durante el sobrecruzamiento cromosmico (chromosomal crossover), durante el cual se recombinan. El sobrecruzamiento cromosmico ocurre cuando dos hlices de ADN se rompen, se intercambian y se unen de nuevo.
La recombinacin permite a los cromosomas intercambiar informacin gentica y produce nuevas combinaciones de genes, lo que aumenta la eficiencia de la seleccin natural y puede ser importante en la evolucin rpida de nuevas protenas. Durante la profase I de la meiosis, una vez que los cromosomas homlogos estn perfectamente apareados formando estructuras llamadas bivalentes, se produce el fenmeno de sobrecruzamiento o entrecruzamiento (crossing-over), en el cual las cromtidas homlogas no hermanas (procedentes del padre y de la madre) intercambian material gentico. La recombinacin gentica resultante hace aumentar en gran medida la variacin gentica entre la descendencia de progenitores que se reproducen por va sexual. La recombinacin gentica tambin puede estar implicada en la reparacin del ADN, en particular en la respuesta celular a las roturas de doble hebra (double-strand breaks). La forma ms frecuente de sobrecruzamiento cromosmico es la recombinacin homloga, en la que los dos cromosomas implicados comparten secuencias muy similares. La recombinacin no-homloga puede ser daina para las clulas, ya que puede producir translocaciones cromosmicas y anomalas genticas. La reaccin de recombinacin est catalizada por enzimas conocidas como recombinasas, tales como RAD51. El primer paso en el proceso de recombinacin es una rotura de doble hebra, causada bien por una endonucleasa o por dao en el ADN. Posteriormente, una serie de pasos catalizados en parte por la recombinasa, conducen a la unin de las dos hlices formando al menos una unin de Holliday, en la que un segmento de una hebra simple es anillado con la hebra complementaria en la otra hlice. La unin de Holliday es una estructura de unin tetrahdrica que puede moverse a lo largo del par de cromosomas, intercambiando una hebra por otra. La reaccin de recombinacin se detiene por el corte de la unin y la reunin de los segmentos de ADN liberados.
La recombinacin implica la rotura y reunin de dos cromosomas homlogos (M y F) para producir dos cromosomas nuevos reorganizados (C1 y C2).
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Tcnicas comunes
El conocimiento de la estructura del ADN ha permitido el desarrollo de multitud de herramientas tecnolgicas que explotan sus propiedades fisicoqumicas para analizar su implicacin en problemas concretos: por ejemplo, desde anlisis filogeeticos para detectar similitudes entre diferentes taxones, a la caracterizacin de la variabilidad individual de un paciente en su respuesta a un determinado frmaco, pasando por un enfoque global, a nivel genmico, de cualquier caracterstica especfica en un grupo de individuos de inters. Podemos clasificar las metodologas de anlisis del ADN en aquellas que buscan su multiplicacin, ya in vivo, como la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), ya in vitro, como la clonacin, y aquellas que explotan las propiedades especficas de elementos concretos, o de genomas adecuadamente clonados. Es el caso de la secuenciacin de ADN y de la hibridacin con sondas especficas ("southern blot" y chips de ADN).
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Secuenciacin
La secuenciacin del ADN consiste en dilucidar el orden de los nucletidos de un polmero de ADN de cualquier longitud, si bien suele dirigirse hacia la determinacin de genomas completos, debido a que las tcnicas actuales permiten realizar esta secuenciacin a gran velocidad, lo cual ha sido de gran importancia para proyectos de secuenciacin a gran escala como el Proyecto Genoma Humano. Otros proyectos relacionados, en ocasiones fruto de la colaboracin de cientficos a escala mundial, han establecido la secuencia completa del ADN de muchos genomas de animales, plantas y microorganismos. El mtodo de secuenciacin de Sanger ha sido el ms empleado durante el siglo XX. Se basa en la sntesis de ADN en presencia de didesoxinuclesidos, compuestos que, a diferencia de los desoxinuclesidos normales (dNTPs), carecen de un grupo hidroxilo en su extremo 3'. Aunque los didesoxinucletidos trifosfatados (ddNTPs) pueden incorporarse a la cadena en sntesis, la carencia de un extremo 3'-OH imposibilita la generacin de un nuevo enlace fosfodister con el nuclesido siguiente; por tanto, provocan la terminacin de la sntesis. Por esta razn, el mtodo de secuenciacin tambin se denomina de terminacin de cadena. La reaccin se realiza usualmente preparando un tubo con el ADN molde, la polimerasa, un cebador, dNTPs convencionales y una pequea cantidad de ddNTPs marcados fluorescentemente en su base nitrogenada. De este modo, el ddTTP puede ir marcado en azul, el ddATP en rojo, etc. Durante la polimerizacin, se van truncando las cadenas crecientes, al azar, en distintas posiciones. Por tanto, se produce una serie de productos de distinto tamao, coincidiendo la posicin de la terminacin debido a la incorporacin del ddNTP correspondiente. Una vez terminada la reaccin, es posible correr la mezcla en una electroforesis capilar (que resuelve todos los fragmentos segn su longitud) en la cual se lee la fluorescencia para cada posicin del polmero. En nuestro ejemplo, la lectura azul-rojo-azul-azul se traducira como TATT.[22][23]
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Southern blot
El mtodo de hibridacin Southern o Southern blot (el nombre original en el idioma ingls) permite la deteccin de una secuencia de ADN en una muestra compleja o no del cido nucleico. Para ello, combina una separacin mediante masa y carga (efectuada mediante una electroforesis en gel) con una hibridacin con una sonda de cido nucleico marcada de algn modo (ya sea con radiactividad o con un compuesto qumico) que, tras varias reacciones, d lugar a la aparicin de una seal de color o fluorescencia. Dicha hibridacin se realiza tras la transferencia del ADN separado mediante la electroforesis a una membrana de filtro. Una tcnica semejante, pero en la cual no se produce la mencionada separacin electrofortica se denomina dot blot. El mtodo recibe su nombre en honor a su inventor, el bilogo ingls Edwin Southern.[25] Por analoga al mtodo Southern, se han desarrollado tcnicas semejantes que permiten la deteccin de secuencias dadas de ARN (mtodo Northern, que emplea sondas de ARN o ADN marcadas) o de protenas especficas (tcnica Western, basada en el uso de anticuerpos).
Chips de ADN
Los chips de ADN son colecciones de oligonucletidos de ADN complementario dispuestos en hileras fijadas sobre un soporte, frecuentemente de cristal. Se utilizan para el estudio de mutaciones de genes conocidos o para monitorizar la expresin gnica de una preparacin de ARN.
Aplicaciones
Ingeniera gentica
Microarray con 37.500 oligonucletidos especficos. Arriba a la izquierda se puede apreciar una regin ampliada del chip.
La investigacin sobre el ADN tiene un impacto significativo, especialmente en el mbito de la medicina, pero tambin en agricultura y ganadera (donde los objetivos son los mismos que con las tcnicas tradicionales que el hombre lleva utilizando desde hace milenios - la domesticacin, la seleccin y los cruces dirigidos - para obtener variedades de animales y plantas ms productivos). La moderna biologa y bioqumica hacen uso intensivo de la tecnologa del ADN recombinante, introduciendo genes de inters en organismos, con el objetivo de expresar una protena recombinante concreta, que puede ser: aislada para su uso posterior: por ejemplo, se pueden transformar microorganismos para convertirlos en autnticas fbricas que producen grandes cantidades de sustancias tiles, como insulina o vacunas, que posteriormente se aslan y se utilizan teraputicamente. necesaria para reemplazar la expresin de un gen endgeno daado que ha dado lugar a una patologa, lo que permitira el restablecimiento de la actividad de la protena perdida y eventualmente la recuperacin del estado fisiolgico normal, no patolgico. Este es el objetivo de la terapia gnica, uno de los campos en los que se est trabajando activamente en medicina, analizando ventajas e inconvenientes de diferentes sistemas de administracin del gen (virales y no virales) y los mecanismos de seleccin del punto de integracin de los elementos genticos (distintos para los virus y los transposones) en el genoma diana. En este caso, antes de plantearse la posibilidad de realizar una terapia gnica en una determinada patologa, es fundamental comprender el impacto del gen de inters en el desarrollo de dicha patologa, para lo cual es necesario el desarrollo de un modelo animal, eliminando o modificando dicho gen en un animal de laboratorio, mediante la tcnica knockout. Slo en el caso de que los resultados en el modelo animal sean satisfactorios se procedera a analizar la posibilidad de restablecer el gen daado mediante terapia gnica.
cido desoxirribonucleico utilizada para enriquecer un alimento: por ejemplo, la composicin de la leche (una importante fuente de protenas para el consumo humano y animal) puede modificarse mediante transgnesis, aadiendo genes exgenos y desactivando genes endgenos para mejorar su valor nutricional, reducir infecciones en las glndulas mamarias, proporcionar a los consumidores protenas antipatgenas y preparar protenas recombinantes para su uso farmacutico. til para mejorar la resistencia del organismo transformado: por ejemplo en plantas se pueden introducir genes que confieren resistencia a patgenos (virus, insectos, hongos), as como a agentes estresantes abiticos (salinidad, sequedad, metales pesados).
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Medicina forense
Los mdicos forenses pueden utilizar el ADN presente en la sangre, el semen, la piel, la saliva o el pelo en la escena de un crimen para identificar al responsable. Esta tcnica se denomina huella gentica, o tambin "perfil de ADN". Al realizar la huella gentica, se compara la longitud de secciones altamente variables de ADN repetitivo, como los microsatlites, entre personas diferentes. Este mtodo es frecuentemente muy fiable para identificar a un criminal. Sin embargo, la identificacin puede complicarse si la escena est contaminada con ADN de personas diferentes. La tcnica de la huella gentica fue desarrollada en 1984 por el genetista britnico Sir Alec Jeffreys, y fue utilizada por primera vez en medicina forense para condenar a Colin Pitchfork por los asesinatos de Narborough en 1983 y de Enderby en 1986.[26] Se puede requerir a las personas acusadas de ciertos tipos de crmenes que proporcionen una muestra de ADN para introducirlos en una base de datos. Esto ha facilitado la labor de los investigadores en la resolucin de casos antiguos, donde slo se obtuvo una muestra de ADN de la escena del crimen, en algunos casos permitiendo exonerar a un convicto. La huella gentica tambin puede utilizarse para identificar vctimas de accidentes en masa, o para realizar pruebas de consanguinidad.[27]
Bioinformtica
La bioinformtica implica la manipulacin, bsqueda y extraccin de informacin de los datos de la secuencia del ADN. El desarrollo de las tcnicas para almacenar y buscar secuencias de ADN ha generado avances en el desarrollo de software de los ordenadores, para muchas aplicaciones, especialmente algoritmos de bsqueda de frases, aprendizaje automtico y teoras de bases de datos. La bsqueda de frases o algoritmos de coincidencias, que buscan la ocurrencia de una secuencia de letras dentro de una secuencia de letras mayor, se desarroll para buscar secuencias especficas de nucletidos.[28] En otras aplicaciones como editores de textos, incluso algoritmos simples pueden funcionar, pero las secuencias de ADN pueden generar que estos algoritmos presenten un comportamiento de casi-el-peor-caso, debido al bajo nmero de caracteres. El problema relacionado del alineamiento de secuencias persigue identificar secuencias homlogas y localizar mutaciones especficas que las diferencian. Estas tcnicas, fundamentalmente el alineamiento mltiple de secuencias, se utilizan al estudiar las relaciones filogenticas y la funcin de las protenas. Las colecciones de datos que representan secuencias de ADN del tamao de un genoma, tales como las producidas por el Proyecto Genoma Humano, son difciles de usar sin anotaciones, que marcan la localizacin de los genes y los elementos reguladores en cada cromosoma. Las regiones de ADN que tienen patrones asociados con genes que codifican protenas o ARN pueden identificarse por algoritmos de localizacin de genes, lo que permite a los investigadores predecir la presencia de productos gnicos especficos en un organismo incluso antes de que haya sido aislado experimentalmente.
cido desoxirribonucleico
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Nanotecnologa de ADN
La nanotecnologa de ADN utiliza las propiedades nicas de reconocimiento molecular del ADN y otros cidos nucleicos para crear complejos ramificados auto-ensamblados con propiedades tiles. En este caso, el ADN se utiliza como un material estructural, ms que como un portador de informacin biolgica. Esto ha conducido a la creacin de lminas peridicas de dos dimensiones (ambas basadas en azulejos, as como usando el mtodo de ADN origami[29]), adems de estructuras en tres dimensiones con forma de poliedros.
La estructura de ADN de la izquierda (mostrada de forma esquemtica) se auto-ensambla en la estructura visualizada por microscopa de fuerza atmica a la derecha. La nanotecnologa de ADN es el campo que busca disear estructuras a nanoescala utilizando las propiedades de reconocimiento molecular de las molculas de ADN. Imagen de Strong, 2004. Plantilla:Doi-inline
Referencias
Notas
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cido desoxirribonucleico
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Bibliografa
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Enlaces externos
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Wikcionario tiene definiciones para cido desoxirribonucleico.Wikcionario Wikcionario tiene definiciones para ADN cromosmico.Wikcionario Wikcionario tiene definiciones para ADN recombinante.Wikcionario Wikcionario tiene definiciones para ADN nuclear.Wikcionario Wikcionario tiene definiciones para ADN mitocondrial.Wikcionario Wikcionario tiene definiciones para ADN ribosomal.Wikcionario Modelo en 3 dimensiones de la estructura del ADN (http://biomodel.uah.es/model4/dna/). Interactivo. Requiere Java. Experimento para extraer ADN (http://superciencia.com/2006/09/04/como-extraer-adn) Descifrar la vida: Grfico interactivo (http://www.el-mundo.es/especiales/2003/02/salud/genetica/ descifrar_la_vida.html) La Replicacin de ADN: caractersticas, protenas que participan y proceso (http://www.ucm.es/info/genetica/ grupod/Replicacion/Replicacion.htm) Animacin en 3D de la Replicacin de ADN (http://es.youtube.com/watch?v=49fmm2WoWBs) Proceso de extraccin de ADN (http://www.explora.cl/otros/biotec/adn.html) Uso del ADN en medicina forense (http://www.gobiernodecanarias.org/educacion/usr/ibjoa/lorente.html) Creacin del primer genoma artificial (http://www.elmundo.es/elmundo/2008/01/24/ciencia/1201194350. html) Construye una molcula de ADN (http://learn.genetics.utah.edu/es/units/basics/builddna) El mtodo de secuenciacin de Sanger (http://smcg.cifn.unam.mx/enp-unam/03-EstructuraDelGenoma/ animaciones/secuencia.swf) El misterioso elfo de Leewenhoek: el recorrido desde el microscopio hasta el ADN en el Museu Virtual Interactivo de la Gentica y el ADN (http://oliba.uoc.edu/adn/index.php?option=com_content& view=article&id=72&Itemid=175&lang=es)
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Replicacin de ADN
El proceso de replicacin de ADN es el mecanismo que permite al ADN duplicarse (es decir, sintetizar una copia idntica). De esta manera de una molcula de ADN nica, se obtienen dos o ms "clones" de la primera. Esta duplicacin del material gentico se produce de acuerdo con un mecanismo semiconservativo, lo que indica que las dos cadenas complementarias del ADN original, al separarse, sirven de molde cada una para la sntesis de una nueva cadena complementaria de la cadena molde, de forma que cada nueva doble hlice contiene una de las cadenas del ADN original. Gracias a la complementacin entre las bases que forman la secuencia de cada una de las cadenas, el ADN tiene la importante propiedad de reproducirse idnticamente, lo que permite que la informacin gentica se transmita de una clula madre a las clulas hijas y es la base de la herencia del material gentico. La molcula de ADN se abre como una cremallera por ruptura de los puentes de hidrgeno entre las bases complementarias liberndose dos hebras y la ADN polimerasa sintetiza la mitad complementaria aadiendo nucletidos que se encuentran dispersos en el ncleo. De esta forma, cada nueva molcula es idntica a la molcula de ADN inicial. La replicacin empieza en puntos determinados: los orgenes de replicacin. Las protenas iniciadoras reconocen secuencias de Replicacin de ADN. La doble hlice es nucletidos especficas en esos puntos y facilitan la fijacin de otras desenrollada y cada hebra hace de plantilla para la protenas que permitirn la separacin de las dos hebras de ADN sntesis de la nueva cadena. La ADN polimerasa aade los nucletidos complementarios a los de la formndose una horquilla de replicacin. Un gran nmero de enzimas cadena original. y protenas intervienen en el mecanismo molecular de la replicacin, formando el llamado complejo de replicacin o replisoma. Estas protenas y enzimas son homlogas en eucariotas y arqueas, pero difieren en bacterias.
Caractersticas generales
Es una cadena molecular, quiere decir que es una sustancia constituida por distintos tipos de molculas sencillas ligadas entre s para as ir formando cadenas. Es bastante largo y extremadamente delgado. Si aumentramos cien veces el tamao del ncleo celular alcanzara el tamao de la punta de un alfiler, mientras que el ADN plegado en ese mismo ncleo alcanzara la longitud de un campo de ftbol. Hay cuatro tipos de eslabones, esos son las molculas denominadas nucletidos en la cadena. Sus nombres son: cido adenlico (adenina), cido guanlico (guanina), cido citidlico (citosina) y cido timidlico (timina) y las abreviaturas, A, G, C, T, para cada una.
Replicacin de ADN
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Semiconservadora
En cada una de las molculas madres* se conserva una de las cadenas originales, y por eso se dice que la replicacin del ADN es semi conservadora. Hasta que finalmente se pudo demostrar que la replicacin es semiconservadora, se consideraron tres posibles modelos para el mecanismo de la replicacin: Semiconservadora (modelo correcto). En cada una de las molculas hijas se Tres posibles modelos de replicacin. a) Conservadora, b) Dispersora, c) conserva una de las cadenas originales. Semiconservadora (mecanismo real) Conservadora. Se sintetiza una molcula totalmente nueva, copia de la original. Dispersora, o dispersante. Las cadenas hijas constan de fragmentos de la cadena antigua y fragmentos de la nueva. El experimento de Meselson y Stahl en 1958 permiti demostrar que el mecanismo real se ajusta a la hiptesis de replicacin semiconservadora. Para ello se hicieron crecer clulas de Escherichia coli en presencia de nitrgeno-15, un istopo del nitrgeno ms pesado de lo habitual. En consecuencia, el istopo se incorpor a las cadenas de ADN que se iban sintetizando, hacindolas ms pesadas. Una vez conseguido el primer objetivo, las clulas fueron transferidas a un medio que contena nitrgeno-14, es decir, un medio ms ligero, donde continuaron su crecimiento (divisin celular, que requiere la replicacin del ADN). Se purific el ADN y se analiz mediante una centrifugacin en gradiente de cloruro de cesio, en donde hay ms densidad en el fondo del tubo que en la parte media del mismo. En la primera generacin (figura 2.b) se obtuvo una nica banda de ADN con densidad intermedia. En la segunda generacin (figura 2.c) se obtuvieron dos bandas, una con densidad ligera y otra con densidad intermedia o hbrida. En la tercera generacin se obtuvieron dos bandas, una ligera (con una abundancia del 75%) y otra intermedia (con el 25% restante). La banda intermedia o hbrida representa una molcula de ADN que contiene una cadena pesada (original) y otra ligera (recin sintetizada). Las cadenas ligeras representan una molcula de ADN en la que las dos cadenas han sido sintetizadas (no existan aun cuando las clulas se pusieron en presencia de nitrgeno-15). El hecho de que cada vez haya ms molculas ligeras y se mantenga el nmero de molculas intermedias demuestra que la replicacin del ADN es semiconservadora. Si fuera conservadora, aparecera siempre una banda pesada y el resto ligeras (figuras 1.a, 1.b, 1.c) . Si fuera dispersante slo apareceran bandas hbridas de densidad intermedia en todas las generaciones.
Experimento de Meselson y Stahl.
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El origen de replicacin
La cantidad de ADN que se puede sintetizar a partir de un nico origen de replicacin se denomina replicn o unidad funcional de replicacin. El genoma bacteriano es un replicn nico circular. En organismos eucariticos, la replicacin del ADN se inicia en mltiples orgenes a la vez (hay uno cada 20 kb aproximadamente), es decir, hay varios replicones.[1]
Los experimentos realizados por Cairns (1963) con bacterias Escherichia coli permitieron determinar la existencia de ese punto fijo u origen de replicacin a partir del cual el genoma empezaba a replicarse. Los experimentos consistan en mantener un cultivo de E. coli creciendo en un medio que contena timidina tritiada (timina marcada con tritio), de forma que el ADN quedara marcado radiactivamente pudiendo efectuarse una autorradiografa. A continuacin se observaba al microscopio. Los resultados indicaban que la replicacin en E. coli se iniciaba en un punto concreto (OriC).
Experimento de Cairns
Secuencialidad
Sueoka y Yoshikawa (1963) realizaron estudios genticos de complementacin de mutaciones que permitieron determinar que desde los orgenes la replicacin avanza de forma secuencial. Trabajaron con Bacillus subtilis porque era posible obtener cultivos sincronizados de forma que todas las clulas del cultivo estuvieran en la misma fase del ciclo celular. El mtodo consista en la conjugacin bacteriana de cepas silvestres con cepas mutantes incapaces de sintetizar determinados aminocidos. Conociendo la localizacin de los genes que codifican las protenas implicadas en la sntesis de los diferentes aminocidos en el cromosoma bacteriano, y haciendo crecer las bacterias receptoras en un "medio mnimo" (donde slo pudiesen crecer las que hubieran recibido alguno de estos genes), al extraer ADN a diferentes tiempos se observ que, tras la ltima extraccin apareca con mayor frecuencia el gen implicado en la sntesis de uno de los aminocidos (el correspondiente a la "posicin 1"), que el gen adyacente implicado en la
Replicacin de ADN sntesis de otro aminocido ("posicin 2"). De la misma forma, el gen que ocupaba la "posicin 3" apareca con menor frecuencia que el que ocupaba la "posicin 2", y as sucesivamente. Como los primeros genes en replicarse en la bacteria donadora seran los primeros en transferirse, el experimento permiti demostrar, a partir de las frecuencias relativas de los diferentes genes en las bacterias receptoras, que la replicacin sigue un orden (es secuencial).
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Bidireccionalidad
El movimiento de la horquilla es bidireccional en la mayora de los casos, es decir, a partir de un punto se sintetizan las dos cadenas en ambos sentidos. Esto ocurre en la mayora de los organismos, pero se dan excepciones en algunos procariontes debido a que los mecanismos de replicacin que tienen lugar dependen de la propia estructura de su material hereditario (si el ADN es circular, lineal, bicatenario o monocatenario). As, en casos particulares como el ADN mitocondrial, algunos plsmidos y algunos genomas monocatenarios de fagos pequeos, la replicacin se da unidireccionalmente pudiendo haber uno o dos orgenes de replicacin.
Distincin entre la replicacin unidireccional y la bidireccional mediante el recuento de copias de genes marcadores. O es el origen de replicacin y A, B, C, D, E son genes marcadores.
Replicacin de ADN
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No obstante, la replicacin se puede considerar, de forma general, bidireccional. La evidencia experimental del crecimiento bidireccional de la hebra de ADN viene dada por una tcnica basada en el marcaje radiactivo del ADN usando timidina marcada con tritio. Primero se aade timidina sin marcar y luego marcada con tritio; siguiendo el rastro de tritio se observa hacia dnde se ha replicado la molcula de ADN. Tambin se puede, mediante el recuento de copias de genes marcadores, determinar si la replicacin es unidireccional o bidireccional. Otras tcnicas se basan en medir la distancia desde los ojos de replicacin hasta los extremos de un ADN lineal (o circular convertido en lineal mediante enzimas de restriccin).
Semidiscontinua
La replicacin siempre se produce en sentido 5' 3', siendo el extremo 3'-OH libre el punto a partir del cual se produce la elongacin del ADN. Esto plantea un problema, y es que las cadenas tienen que crecer simultneamente a pesar de que son antiparalelas, es decir, que cada cadena tiene el extremo 5' enfrentado con el extremo 3' de la otra cadena. Por ello, una de las cadenas debera ser sintetizada en direccin 3' 5'. Este problema lo resolvieron los cientficos japoneses Reiji Okazaki y Tsuneko Okazaki La replicacin es semidiscontnua en la dcada de 1960, al descubrir que una de las nuevas cadenas de ADN se sintetiza en forma de trozos cortos que, en su honor, se denominan fragmentos de Okazaki. Su longitud suele variar entre 1000 y 2000 nucletidos en las bacterias y entre 100 y 400 nucletidos en eucariontes. La cadena que se sintetiza en el mismo sentido que avanza la horquilla de replicacin se denomina hebra adelantada (en ingls, leading strand, que a veces se traduce por lder o conductora) y se sintetiza de forma continua por la ADN polimerasa, mientras que la que se sintetiza en sentido contrario al avance se denomina hebra rezagada o retrasada (en ingls, lagging strand), cuya sntesis se realiza de forma discontinua teniendo que esperar a que la horquilla de replicacin avance para disponer de una cierta longitud de ADN molde.
Replicacin de ADN
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ADN Polimerasas
La ADN polimerasa es la enzima que cataliza la sntesis de la nueva cadena de ADN a partir de desoxirribonucletidos y de la molcula de ADN plantilla o molde que es la que ser replicada. La enzima copia la cadena de nucletidos de forma complementaria (A por T, C por G) para dar a cada clula hija una copia del ADN durante la replicacin.
Modo de operacin
En cada horquilla de replicacin, la ADN polimerasa y otras enzimas sintetizan dos nuevas cadenas de ADN que son complementarias respecto a las 2 cadenas originales. Durante este proceso, la ADN polimerasa reconoce una base nucleotdica no apareada de la cadena Estructura en 3D de un ADN polimerasa original y la combina con un nucletido libre que tiene la base complementaria correcta. Luego, la ADN polimerasa cataliza la formacin de nuevos enlaces covalentes que ligan el fosfato del nucletido libre entrante con el azcar del nucletido previamente agregado en la cadena hija en crecimiento. De esta forma, la ADN polimerasa sintetiza el esqueleto de azcar-fosfato de la cadena hija. Las ADN polimerasas tambin realizan otras funciones durante el proceso de replicacin. Adems de participar en la elongacin, desempean una funcin correctora y reparadora gracias a su actividad exonucleasa 3', que les confiere la capacidad de degradar el ADN partiendo de un extremo de ste. Es importante que existan estos mecanismos de correccin ya que de lo contrario los errores producidos durante la copia del ADN daran lugar a mutaciones.
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Proceso general
La helicasa rompe los puentes de hidrgeno de la doble hlice permitiendo el avance de la horquilla de replicacin. La topoisomerasa impide que el ADN se enrede debido al superenrollamiento producido por la separacin de la doble hlice. Las protenas SSB se unen a la hebra discontnua de ADN, impidiendo que sta se una consigo misma. La ADN polimerasa sintetiza la cadena complementaria de forma continua en la hebra adelantada y de forma discontnua en la hebra rezagada. La ARN primasa sintetiza el cebador de ARN necesario para la sntesis de la cadena complementaria a la cadena rezagada. La ADN ligasa une los fragmentos de Okazaki. El proceso se puede dividir en 3 fases: iniciacin, elongacin y terminacin. El cebador: son pequeas unidades de RNA que se unen a los fragmentos para que la ADN polimerasa reconozca donde debe unirse. Los cebadores los quita la pol. I y coloca bases a la cadena en crecimiento por la ligasa.
Iniciacin
Mediante consumo de ATP en direccin a la horquilla de replicacin, es decir, en direccin 5' 3' en la hebra rezagada y 3' 5' en la hebra adelantada,la helicasa acta rompiendo los puentes de hidrgeno que mantienen unida la doble hlice. El siguiente conjunto de protenas reclutadas son las denominadas protenas SSB (single-stranded DNA binding proteins, protenas ligantes de ADN monocatenario) encargadas de la estabilizacin del ADN monocatenario generado por la accin de las helicasas, impidiendo as que el ADN se renaturalice o forme de nuevo la doble hlice, de manera que pueda servir de molde. Estas protenas se unen de forma cooperativa, por lo que su unin al DNA conforme avanza la helicasa es rpida. Por otro lado, conforme las helicasas van avanzando se van generando superenrollamientos en la doble cadena de ADN por delante de la horquilla y si stos no fueran eliminados, llegado a un punto el replisoma ya no podra seguir avanzando. Las topoisomerasas son las enzimas encargadas de eliminar los superenrollamientos cortando una o las dos cadenas de ADN y pasndolas a travs de la rotura realizada, sellando a continuacin la brecha.
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Elongacin
En el siguiente paso, la holoenzima ADN Pol III cataliza la sntesis de las nuevas cadenas aadiendo nucletidos sobre el molde. Esta sntesis se da bidireccionalmente desde cada origen, con dos horquillas de replicacin que avanzan en sentido opuesto. Cuando el avance de dos horquillas adyacentes las lleva a encontrarse, es decir, cuando dos burbujas se tocan, se fusionan, y cuando todas se han fusionado todo el cromosoma ha quedado replicado. Puesto que la holoenzima ADN Pol III necesita de un extremo 3'-OH libre, es necesario que una ARN primasa catalice la formacin de un fragmento corto especfico de ARN llamado cebador, que determinar el punto por donde la ADN polimerasa comienza a aadir nucletidos. As, durante la sntesis, en cada horquilla de replicacin se van formando dos copias nuevas a partir del cebador sintetizado en cada una de las dos hebras de ADN que se separaron en la fase de iniciacin, pero debido a la unidireccionalidad de la actividad polimerasa de la ADN Pol III, que slo es capaz de sintetizar en sentido 5 3', la replicacin slo puede ser continua en la hebra adelantada; en la hebra rezagada es discontinua, dando lugar a los fragmentos de Okazaki.
La mitad del dmero de la holoenzima ADN Pol III sintetiza la hebra adelantada y la otra mitad la hebra rezagada. La elongacion de la hebra rezagada ocurre por medio del modelo del trombn.
Enzimas que participan en la replicacin de E. coli: helicasa, protenas SSB, topoisomerasa, ARN primasa, Holoenzima ADN Pol III
Replicacin de ADN
38 En la hebra rezagada, cuando la ADN Pol III hace contacto con el extremo de otro fragmento de Okazaki contiguo, el cebador de ARN de ste es eliminado y los dos fragmentos de Okazaki de ADN recin sintetizado son unidos. Una vez se han juntado todos se completa la doble hlice de ADN. La eliminacin de cebadores tambin se da en la hebra conductora, de sntesis continua, pero debido a que en sta hay un solo cebador es un proceso que slo tiene lugar una vez, mientras que en la hebra rezagada se dar tantas veces como fragmentos de Okazaki haya. En la eliminacin del fragmento de Okazaki (tambin denominado iniciador, cebador o primer) intervienen dos enzimas: por un lado la ADN Pol I, que va eliminando el ARN con su actividad exonucleasa 5' 3' y simultneamente rellenando con ADN mediante su actividad polimerasa 5' 3' (proceso denominado nick-traslation). Al final queda rotura (o "mella") entre el extremo 3'-OH libre y el fosfato 5' de la cadena sintetizada; por ltimo, la ADN ligasa sella esa rotura catalizando la reaccin de condensacin entre el grupo fosfato y el OH de la desoxirribosa del nucletido contiguo, completando el enlace fosfodister; para ello, es preciso hidrolizar una molcula de ATP. Nota: diversos autores difieren en los enzimas implicados en esta etapa. Para algunos no es la propia ADN Pol I la que rellena el hueco tras eliminar el primer, sino que lo hace la ADN Pol III (la misma que polimeriza el resto de la cadena). Del mismo modo, algunos autores siguen empleando el trmino ribonucleasa o (RNasa) para referirse a la ADN Pol I en esta etapa, ya que hasta hace poco se desconoca que la propia ADN Pol I tena la capacidad exonucleasa 5' 3, y se pensaba que esto lo realizaba otro enzima, que reciba este nombre genrico.
Hebra rezagada: sntesis de cebadores, unin de fragmentos de Okazaki y eliminacin de los cebadores
Enzimas que participan en la eliminacin de cebadores y unin de los fragmentos de Okazaki. El cebador de ARN est pintado en azul y el ADN que lo reemplaza en naranja
Referencias
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Replicacin de ADN
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Bibliografa
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Enlaces externos
Replicacin del ADN con audio en espaol (http://www.youtube.com/watch?v=-EGKrYdQEHQ) Visualizacin molecular del ADN: Replicacin de ADN (http://es.youtube.com/watch?v=49fmm2WoWBs) Animacin sobre la replicacin en E. coli (http://portales.educared.net/wikiEducared/index. php?title=Replicacin) Animacin interactiva: enzimas que participan en la replicacin del ADN (http://www.uam.es/personal_pdi/ ciencias/jhermoso/ch08_replication.html) Varias animaciones de la replicacin (http://biomodel.uah.es/biomodel-misc/anim/inicio.htm#replic)
Secuenciacin de ADN
La secuenciacin de ADN es un conjunto de mtodos y tcnicas bioqumicas cuya finalidad es la determinacin del orden de los nucletidos (A, C, G y T) en un oligonucletido de ADN. La secuencia de ADN constituye la informacin gentica heredable del ncleo celular, los plsmidos, la mitocondria y cloroplastos (En plantas) que forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos. As pues, determinar la secuencia de ADN es til en el estudio de la investigacin bsica de los procesos biolgicos fundamentales, as como en campos aplicados, como la investigacin forense. El desarrollo de la secuenciacin del ADN ha acelerado significativamente la investigacin y los descubrimientos en biologa. Las tcnicas actuales permiten realizar esta secuenciacin a gran velocidad, lo cual ha sido de gran importancia para proyectos de secuenciacin a gran escala como el Proyecto Genoma Humano. Otros proyectos relacionados, en ocasiones fruto de la colaboracin de cientficos a escala mundial, han establecido la secuencia completa de ADN de muchos genomas de animales, plantas y microorganismos.
Los inicios
Durante treinta aos la mayor parte de la secuenciacin de ADN se llev a cabo con el mtodo de terminacin de la cadena desarrollado por Frederick Grfico de una secuencia de ADN obtenido por electroforesis capilar (electroferograma). Sanger y colaboradores, incluyendo al reconocido biologo de la universidad de Stanford, J. Navarro, en 1975.[1][2] Antes del desarrollo de mtodos rpidos de secuenciacin del ADN a principios de los 70 por Sanger en Inglaterra y Walter Gilbert y Allan Maxam en Harvard,[3] se utilizaban varios mtodos de laboratorio. Por ejemplo, en 1973[4] Gilbert y Maxam publicaron una secuencia de 24 pares de bases utilizando un mtodo conocido como "de punto corrido" (wandering spot). La secuenciacin del ARN, que por razones tcnicas es ms sencilla de llevar a cabo que la del ADN, se desarroll con anterioridad a la del ADN. El mayor hito en la secuenciacin del ARN, que data de la era previa al ADN recombinante, es la secuencia del primer gen completo y del genoma completo del Bacterifago MS2, identificado y publicado por Walter Fiers y colaboradores de la Universidad de Gante.[5][6]
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Secuenciacin de Maxam-Gilbert
En 1976-1977, Allan Maxam y Walter Gilbert desarrollaron un mtodo para secuenciar ADN basado en la modificacin qumica del ADN y posterior escisin en bases especficas Aunque Maxam y Gilber publicaron su secuenciacin qumica dos aos antes del trascendental artculo de Sanger y Coulson sobre su mtodo de secuenciacin "ms-menos",[7][8] la secuenciacin de Maxam y Gilbert rpidamente se hizo ms popular hasta que se pudo utilizar ADN directamente, mientras que el mtodo inicial de Sanger requera que cada comienzo de lectura fuera clonado para producir un ADN de cadena simple. No obstante, con el desarrollo y mejora del mtodo de terminacin de la cadena (ver ms adelante), la secuenciacin de Maxam y Gilbert ha quedado en desuso debido a su complejidad tcnica, el uso extensivo de productos qumicos peligrosos y dificultades para escalarla. Adems, a diferencia del mtodo de terminacin de la cadena, los reactivos que se usan en el mtodo de Maxam y Gilbert no se pueden adaptar para utilizarse en un kit biolgico estndar. En resumen, el mtodo requiere marcaje radiactivo en uno de los extremos y la purificacin del fragmento de ADN que se desea secuenciar. El tratamiento qumico genera rupturas en una pequea proporcin de uno o dos de los cuatro nucletidos en cada una de las cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T). Los agentes qumicos utilizados en cada caso son: DMS (G), cido frmico (A+G), hidrazina (C+T) e hidrazina ms sales (C).De ese modo se genera una serie de fragmentos marcados a partir del final marcado radiactivamente hasta el primer lugar de "corte" en cada molcula. Los fragmentos posteriormente se separan por tamao mediante electroforesis en gel, separando los productos de las cuatro reacciones en cuatro carreras distintas, pero una al lado de la otra. El gel utilizado presenta condiciones desnaturalizantes, y un contenido en poliacrilamida que vara entre un 6 y un 20%. Para visualizar los fragmentos generados en cada reaccin, se hace una autoradiografa del mismo, lo que proporciona una imagen de una serie de bandas oscuras correspondientes a los fragmentos marcados con el radioistopo, a partir de las cuales se puede inferir la secuencia. Conocido en ocasiones como "secuenciacin qumica", este mtodo se origin en el estudio de las interacciones entre ADN y protenas (huella gentica), estructura de los cidos nucleicos y modificaciones epigenticas del ADN, y es en estos campos donde an tiene aplicaciones importantes.
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42 Existen algunas variaciones tcnicas del mtodo de secuenciacin de terminacin de la cadena. En un mtodo, los framentos de ADN son marcados con nucletidos marcados con fsforo radiactivo. Como alternativa se puede utilizar un cebador marcado en el extremo 5' mediante un colorante fluorescente. Se siguen necesitando cuatro reacciones, pero los fragmentos de ADN marcados con colorantes se pueden leer utilizando un sistema ptico, lo que facilita un anlisis ms rpido y econmico y su automatizacin. Esta variante se conoce como "secuenciacin mediante colorantes acoplados al cebador" (dye-primer sequencing). El ltimo avance de L Hood y colaboradores[9][10] desarrollando ddNTPs y cebadores con marcaje fluorescente seala el marco para una secuenciacin de ADN automatizada y de alto rendimiento.
Los fragmentos de ADN se pueden marcar utilizando radiactividad o fluorescencia en el cebador (1), en la nueva cadena de ADN con dNTP marcado, o con un ddNTP marcado.
Los diferentes mtodos de terminacin de la cadena han simplificado en gran medida la cantidad de trabajo y planificacin necesaria para la secuenciacin de ADN. Por ejemplo, el kit "Sequenase" de la casa USB Biochemicals, basado en el mtodo de terminacin de la cadena contiene la mayora de los reactivos necesarios para la secuenciacin, pre-divididos en alcuotas y listos para usar. Se pueden dar algunos problemas de secuenciacin con el mtodo de Sanger, como uniones no especficas del cebador al ADN, que afectan a la correcta interpretacin de la secuencia de ADN. Adems tambin puede afectar a la fidelidad de la secuencia obtenida estructuras secundarias internas de la cadena de ADN molde o ARN que pueda actuar de cebador al azar. Otros contaminantes que pueden afectar a la reaccin son el ADN exgeno o inhibidores de la ADN polimerasa.
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Secuenciacin de ADN el ADN desnaturalizado y as permitir una conversin completa por bisulfito. Por otra parte tambin se ha propuesto que embebiendo el ADN en gel de agarosa se incrementa el grado de separacin debido a que se mantienen las cadenas separadas. -Degradacin del ADN durante el tratamiento con bisulfito: Es una de las limitaciones ms importantes de este mtodo y tiene lugar paralelamente a la conversin. Para que se produzca una total conversin son necesarias una serie de condiciones tales como largos tiempos de incubacin, temperatura elevada y altas concentraciones de bisulfito. Estas condiciones en su conjunto pueden promover la degradacin del ADN en una proporcin elevada. Esto puede suponer un grave problema si partimos de muestras con una baja concentracin de ADN o de muestras tomadas post-mortem, adems dicha degradacin dar lugar a pequeas roturas al azar a lo largo de la cadena de ADN lo que puede dar lugar a errores durante la amplificacin por PCR. -Desulfonacin incompleta de los residuos de pirimidina: Una inadecuada alcalinizacin de la solucin puede tener como consecuencia una incompleta desulfonacin de los residuos de pirimidina, lo cual a su vez puede afectar negativamente a las polimerasas de ADN, las cuales sern incapaces de replicar la cadena molde.Esta situacin se puede evitar monitorizando el pH de la solucin asegurando as que se produzca una desulfonacin completa.
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Pirosecuenciacin
La pirosecuenciacin es un mtodo de secuenciacin de ADN en tiempo real basado en la liberacin de los pirofosfatos (PPi) que tiene lugar en la reaccin de polimerizacin del ADN a partir de sus dNTPs. Inicialmente, esta metodologa se empleaba para monitorizar de forma continua la actividad de la ADN-polimerasa. Frente a otras tcnicas de secuenciacin, esta variante no requiere correr en un gel los fragmentos de ADN generados en la reaccin de polimerizacin, ni marcadores fluorescentes o ddNTPs (dideoxinucletidos). Este mtodo requiere de la preparacin de una molcula monocatenaria de ADN a la cual se hbrida un pequeo cebador. Igualmente, la pirosecuenciacin requiere de los 4 dNTPs, la polimerasa de ADN, as como tres enzimas: sulfurilasa (y el sustrato adenosina 5'- fosfosulfato o APS), luciferasa (y el sustrato luciferina)y apirasa. A medida que la reaccin transcurra, se ir sintetizando la cadena complementaria e iremos obteniendo una serie de picos de seal en el pirograma que nos permitirn determinar la secuencia. El proceso ocurre en ciclos sucesivos de tres pasos: En el primero de ellos, se aade al medio de reaccin uno de los 4 dNTPs el cual, si es el complementario a la base de la hebra molde que toca copiar, ser procesado en la reaccin de polimerizacin e incorporado a la cadena en extensin por la ADN-polimerasa, liberando un PPi. Dicho PPi es posteriormente convertido a ATP al reaccionar con una molcula de adenosina 5-fosfosulfato por medio de la ATP-sulforilasa. Finalmente, tiene lugar la emisin de radiacin como consecuencia de la oxidacin de la luciferina a oxiluciferina catalizada por la luciferasa de lucirnaga, consumiendo el ATP generado en la reaccin anterior. Si el dNTP que ha sido aadido al medio de reaccin no es el complementario al que ocupa la posicin que toca copiar, ste es degradado por una enzima llamada apirasa antes de que se aada el siguiente dNTP. Esto ltimo permite eliminar el exceso de dNTP, ya que de no ser ste complementario y permanecer en el medio, al aadir posteriormente la base complementaria a la cadena en extensin, no sera posible discenir si la emisin de luz detectada se debe a la incorporacin de uno u otro nucletido. El nmero medio de fotones emitidos por cadena molde es proporcional al nmero de nucletidos incorporados a la cadena, siendo esta relacin lineal nicamente para un nmero bajo de incorporaciones. La radiacin emitida es captada por una cmara acoplada a un sistema de cargas, el cual representa la seal en forma de pico en el pirograma. As vemos que la informacin de la secuencia se representa en el pirograma en la que la altura de los picos refleja la cantidad de nucletidos incorporada: picos de mayor altura indicarn que se ha incorporado el mismo nucletido varias veces, esto es, que en la cadena de ADN dicho nucletido se encuentra varias veces repetido de manera
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La secuenciacin a gran escala persigue la secuenciacin de fragmentos muy grandes de ADN. Incluso los genomas bacterianos relativamente pequeos constan de miles de nucletidos y slo el Cromosoma 1 humano consta de 246 millones de bases. As pues, algunos enfoques abordan el problema cortando (con enzimas de restriccin) o cizallando (mediante fuerzas mecnicas) fragmentos grandes para obtener otros ms pequeos. El ADN fragmentado se clona en un Vector de ADN, normalmente un cromosoma artificial bacteriano (BAC) y amplificado en Escherichia coli. El ADN amplificado se puede purificar entonces a partir de las clulas bacterianas (Una desventaja de los clones bacterianos para el secuenciado es que algunas secuencias de ADN pueden ser inherentemente inclonables en todas las lneas bacterianas disponibles debido al efecto deletreo de la secuencia clonada en la bacteria hospedadora u otros efectos). Estos fragmentos cortos de ADN purificados a partir de colonias bacterianas individuales se secuencian completamente y se ensamblan El ADN genmico se fragmenta en trozos al azar y se clonan en una computacionalmente en una secuencia larga y contigua biblioteca bacteriana. El ADN de los clones bacterianos individuales identificando las secuencias que se solapan entre ellas se secuencia y la secuencia se ensambla observando las regiones solapantes. (Click para ampliar) (por secuenciacin por fuerza bruta o "shotgun"). Este mtodo no requiere informacin preexistente sobre la secuencia de ADN y a menudo se la conoce como secuenciacin de novo. Los intervalos entre las secuencias ensambladas se pueden rellenar mediante paseos de cebadores, a menudo mediante pasos de sub-clonado (o secuenciacin a base de transposones dependiendo del tamao del resto de regin que quede por secuenciar). Todas estas estrategias implican efectuar muchas lecturas menores del ADN por alguno de los mtodos anteriores y posteriormente ensamblarlos en secuencias contiguas. Las diferentes estrategias tienen diferentes inconvenientes en cuanto a velocidad y exactitud. El mtodo de secuenciacin por fuerza bruta es el ms prctico para secuenciar genomas grandes, pero su proceso de ensamblaje es complejo y potencialmente proclive al error -en particular en presencia de repeticin de secuencias. Debido a esto, el ensamblaje del genoma humano no est literalmente completo las secuencias repetitivas de los centrmeros, telmeros y otras partes del cromosoma quedan como huecos en el ensamblaje del genoma. A pesar de contar con solo el 93% del genoma ensamblado, el Proyecto Genoma Humano se declar completado porque la definicin de secuencia del genoma humano se limit a la secuencia eucromtica (completa al 99% en aquel momento), para excluir esas regiones repetitivas intratables.[13]
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El genoma humano tiene una longitud de unos 3000 millones de pares de bases;[14] si la longitud media de cada fragmento es de 500 bases, llevara un mnimo de seis millones de fragmentos secuenciar el genoma humano (sin tener en cuenta el solapamiento, es decir si fuera posible hacerlo de una sola vez). Mantener el control de un nmero tan elevado de secuencias presenta desafos significativos que solo se pueden abordar mediante el desarrollo y la coordinacin de varios algoritmos de procedimiento y computacin, tales como el desarrollo y mantenimiento eficientes de bases de datos. Se utiliza la Resecuenciacin o secuenciacin marcada para determinar un cambio en la secuencia de ADN a partir de la secuencia "de referencia". A menudo se efecta utilizando la PCR para amplificar la regin de inters (se necesita una secuencia de ADN preexistente para disear los cebadores de ADN). La resecuenciacin realiza tres pasos, la extraccin del ADN o ARN del tejido biolgico, la amplificacin del ARN o ADN (habitualmente por PCR) y despus la secuenciacin. La secuencia resultante se compara con la de referencia o con una muestra normal para detectar mutaciones.
Pasos para la resecuenciacin. Preparacin de la muestra:Extraccin del cido nucleico. Preparacin del molde:Amplificacin y preparacin de una pequea regin de la regin objetivo. (Click para ampliar)
Secuenciacin de ADN mtodo para la amplificacin clonal in vitro es la "PCR de puente", en la que los fragmentos se amplifican a partir de los cebadores unidos a una superficie slida, desarrollados y usados por Solexa (de la que ahora es propietaria la empresa Illumina). Estos mtodos producen ambos muchas localizaciones fsicamente aisladas que contienen cada una muchas copias de un solo fragmento. El mtodo con una nica molcula desarrollado por el laboratorio de Stephen Quake (y ms tarde comercializado por Helicos) se salta este paso de amplificacin, fijando directamente las molculas de ADN a una superficie.[16] Secuenciacin paralelizada Una vez que las secuencias clonales de ADN se localizan fsicamente en posiciones separadas de la superficie, se pueden utilizar varios mtodos de secuenciacin para determinar las secuencias de ADN de todas las localizaciones en paralelo. La "secuenciacin por sntesis", como en la popular secuenciacin electrofortica con terminador marcado con colorante, usa el proceso de sntesis de ADN por ADN polimerasa para identificar las bases presentes en la molcula complementaria de ADN. Los mtodos de terminador reversible (usados por Illumina y Helicos) utilizan versiones reversibles de terminadores marcados con colorante, aadiendo un nucletido cada vez, y detectando la fluorescencia correspondiente a esa posicin y removiendo posteriormente el grupo de bloqueo para permitir la polimerizacin de otro nucletido. La Pirosecuenciacin (utilizada por 454) tambin usa la polimerizacin del ADN para aadir nucletidos, aadiendo cada vez un tipo diferente y despus detectando y cuantificando el nmero de nucletidos aadidos a una determinada localizacin a travs de la luz emitida por la liberacin de los pirofosfatos unidos a ellos. La "secuenciacin por ligacin" es otro mtodo enzimtico de secuenciacin que emplea una ADN ligasa en lugar de una polimerasa para identificar la secuencia objetivo.[17] Se usa en el mtodo polony y en la tecnologa SOLiD que ofrece Applied Biosystems. Este mtodo utiliza un reservorio de todos los oligonucletidos posibles de una longitud dada, marcados de acuerdo con la posicin secuenciada. Los oligonucletidos se templan y ligan; el ligamiento preferente de las ADN ligasas por su secuencia especfica produce una seal correspondiente a la secuencia complementaria en esa posicin concreta.
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Secuenciacin de ADN De nuevo, la placa se trata con una solucin que elimina el fluorforo de los nucletidos incorporados. A continuacin, el proceso se repite aadiendo una nueva solucin con la polimerasa y un nucletido diferente (por ejemplo la timina), e igualmente con la guanina y la citosina. La magnitud de la tcnica radica en que, simultneamente se estn secuenciando millones de fragmentos distintos de ADN; proceso que podemos seguir al mismo tiempo gracias a las imgenes captadas por la cmara. Un software analiza dichas imgenes y reconstruye las secuencias de cada fragmento, las cuales deben ser ensambladas posteriormente por programas informticos.
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1993 El trust Wellcome y MRC crean el Centro Sanger, cerca de Cambridge, Reino Unido. La base de datos GenBank se traslada de Los lamos (DOE) al NCBI (NIH).
Secuenciacin de ADN 1995 Venter, Fraser y Smith publican la primera secuencia de un organismo de vida libre, Haemophilus influenzae (tamao del genoma: 1.8 Mbase). Richard Mathies y colaboradores escriben un artculo sobre los marcajes colorantes en la secuenciacin (PNAS, Mayo). Michael Reeve y Carl Fuller, polimerasa termoestable para la secuenciacin. 1996 Los socios internacionales del Proyecto Genoma Humano acuerdan publicar los datos de secuenciacin en bases de datos pblicas en 24 horas. Un consorcio internacional publica la secuencia del genoma de la levadura S. cerevisiae (tamao del genoma 12.1 Mbases). Yoshihide Hayashizaki en el RIKEN completa el primer juego de cDNAs de longitud completa de ratn. ABI presenta un sistema de electroforesis capiar, el analizador de secuencias ABI310. 1997 Blattner, Plunkett y colaboradores. publican la secuencia de E. coli (Tamao genmico 5 Mb) 1998 Phil Green y Brent Ewing de la Universidad de Washington publican phred para interpretar los datos de secuenciacin(en uso desde 1995). Venter funda una nueva compaa, Celera; Secuenciar el genoma humano en 3 aos con un coste de $300m. Applied Biosystems presenta la mquina de secuenciacin capilar 3700. Wellcome dobla su financiacin al Proyecto Genoma humano hasta $330 million para llegar a 1/3 de la secuencia. Objetivos del NIH y el DOE: Obtener un "borrador de trabajo" del genoma humano para 2001. Sulston, Waterston y otros finalizan la secuencia de C. elegans (tamao del genoma de 97Mb). 1999 El NIH cambia la fecha de finalizacin del borrador a la primavera de 2000. NIH lanza el proyecto de secuenciacin del genoma del ratn. Primera secuencia del cromosoma humano 22 publicada. 2000 Celera y colaboradores secuencian la mosca de la fruta Drosophila melanogaster (Tamao del genoma 180Mb) - lo que supone la validacin del mtodo de Venter de secuenciacin por fuerza bruta. El consorcio Proyecto Genoma Humano y Celera debaten sobre aspectos relacionados a la publicacin de datos. El consorcio Proyecto Genoma Humano publica la secuencia del cromosoma 21.[24] HGP y Celera anuncian conjuntamente los borradores de trabajo de la secuencia del genoma humano y prometen una publicacin conjunta. Las estimaciones del nmero de genes del genoma humano se sitan entre 35.000 y 120.000. El consorcio internacional completa la primera secuencia de una planta, Arabidopsis thaliana (Tamao del genoma 125 Mb). 2001 El Proyecto Genoma Humano publica el borrador de la secuencia del genoma humano en Nature el 15 de febrero. Celera publica la secuencia del genoma humano. 2005 420,000 secuencias VariantSEQr de cebadores de resecuenciacin humanas publicadas en la nueva base de datos NCBI Probe. 2007 Por primera vez se secuencia un grupo de especies estrechamente relacionadas. Se secuencian 12 Drosoflidos (mosca de la fruta), haciendo despegar la era de la filogenmica. Craig Venter publica su genoma diploide completo: el primer genoma humano en ser completamente secuenciado.[25]
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Referencias
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Enlaces externos
Tecnologa bsica para el marcaje del ADN con tomos pesados para imgenes directas usando la microscopa electrnica de transmisin y la secuenciacin de cadenas de ms de 10.000 pares de bases por imagen capturada: Tecnologa de marcaje con nmero Z alto (http://zsgenetics.com/application/GenSeq/fundamentals.html). Plataforma de secuenciacin de ADN Millegen (http://www.millegen.com) Secuenciacin de ADN: Animacin de una reaccin por terminador marcado por tincin (http://www.jgi.doe. gov/education/how/how30minflash.html) Premio X de Archon (http://www.genomics.xprize.org) - competicin de 10 millones de $ para una tecnologa de secuenciacin rpida y barata. DNA Baser (http://www.dnabaser.com/lands/secuenciacion y analisis de ADN.html) - programa para el montaje automtico y manual de la secuencia de ADN
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