AO DE LA INVERSIN PARA EL DESARROLLO RURAL Y LA SEGURIDAD ALIMENTARIA AO INTERNACIONAL DE LA QUINUA

UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE BIOLOGIA MICROBIOLOGIA

INTEGRANTE: Gisela Maraza Cho !e So)ia Palo*i)o E)ri !e E,he-arr.a CURSO: Fi/o0a/olo1.a TEMA: DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES VIRALES 2 VIROIDES EN PLANTAS GRADO: C!ar/o$ II se*es/re "#$%&''( "#$%&''+ "#$%&

TACNA 3 PERU &"4%

DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES VIRALES 2 VIROIDES EN PLANTAS

CARACTERISTICAS

Los virus son patgenos muy pequeos que pueden ser observados slo con el microscopio electrnico. Su tamao se expresa en nanmetros - nm (1 nanmetro = 0.000001 mm . Son tan pequeos que la punta de un lapicero puede contener 1!00 part"culas virales.

Los virus son agentes in#ecciosos compuestos de una o varias mol$culas de %cido nucleico (&'( o &)( de cadena sencilla o doble cubiertas por una o varias capas de prote"na o lipoprote"na capaces de replicarse en las c$lulas de un *ospedante susceptible.

La traduccin del genoma (para producir prote"nas o transcripcin y replicacin (para producir m%s %cido nucleico ocurre dentro de las c$lulas del *ospedante usando su +maquinaria, metablica.

-iroides. .roviene de la unin de la palabra latina +virus, que signi#ica veneno y del su#i/o +oid, que signi#ica imper#ecto o incompleto. & di#erencia de los virus0 los viroides son mol$culas de %cido ribonucleico (&)( de cadena sencilla que ocasionan en#ermedades en varias especies de plantas. Sus genomas son de 123 a 401 nucletidos de &)( circular de cadena sencilla5 adem%s0 no codi#ican prote"nas.

TIPOS DE TRANSMISION DE VIRUS

E) la )a/!raleza los -ir!s se /ras*i/e) 0or:

6 Siembra de tub$rculos-semilla obtenidos de plantas en#ermas0 6 -ectores (especialmente %#idos 0 y 6 7ontacto o mec%nicamente

E) los /ra5a6os e70eri*e)/ales es *!8 i*0or/a)/e la /ra)s*isi9) *e,:)i,a; 0ero 0ara los -ir!s !e )o se /ras*i/e) *e,:)i,a*e)/e es ,o*<) !/ilizar el i)6er/o=

METODO DE DIAGNOSTICO EN VIROLOGIA VEGETAL 8n la mayor"a de los estudios de virus de plantas0 es esencial poder establecer un diagnstico acertado0 esto implica tener las *erramientas para reconocer la en#ermedad e identi#icar de manera precisa el (los virus que la causa(n . .or tal ra9n0 es necesario establecer t$cnicas de diagnstico altamente e#icientes0 r%pidas y econmicas para el estudio de la epidemiologia de la en#ermedad viral0 evaluar la e#iciencia de los m$todos de mane/o o para garanti9ar que las plantas y las semillas est%n libres de virus. & continuacin se describen brevemente los principales m$todos empleados para el diagnstico de virus en plantas.

A=$ METODO BIOLOGICO

7uando los virus in#ectan las plantas0 pueden o no inducir s"ntomas. Si los s"ntomas son producidos en las 0la)/as i)>e,/a?as0 estos pueden tener un valor en el diagnstico. Los s"ntomas principales asociados a en#ermedades virales incluyen cambios en la pigmentacin normal de las plantas (mosaico0 amarillamiento0 grabado 0 cambios en el crecimiento (enanismo 0 necrosis de te/idos (para algunos virus 0 de#ormaciones y reduccin en el rendimiento. Las observaciones de la planta en su con/unto y contexto en que ocurre dic*o cambios y su an%lisis0 constituyen los primeros pasos para el diagnstico de virus La sintomatolog"a es la #uente primaria en la descripcin de las en#ermedades virales. 8l nombre de la especie de virus es principalmente tomado sobre la base del s"ntoma que causa en las plantas en la cual #ue identi#icado por primera ve9. Sin embargo0 la sintomatolog"a se constituye en el m$todo m%s insensible de diagnstico0 por cuanto solo la experiencia puede indicar cuando es conveniente usarla. 8ntre los s"ntomas comunes se presenta: Mosai,os: es una distribucin anormal de los pigmentos de cloro#ila en las *o/as0 #recuentemente asociada con la estructura de los cloroplastos. )esulta en la yuxtaposicin de varios tonos de color en la super#icie de la *o/a. -ariegacion: t"pico en #lores0 donde *ay una ausencia de antocianinas vacuolares que genera visos blancos o una acumulacin de estos pigmentos que originan tonos ro/i9os oscuros. A*arilla*ie)/o: es caracter"stico de in#ecciones virales en las cuales la part"cula se multiplica en los te/idos vasculares. La acumulacin de virus en el #loema impide el #lu/o normal de savia0 lo que crea un estado de de#iciencia que causa atro#ia de ra"ces y enanismo (ecrosis: los puntos necrticos y la coloracin ca#$ ocurren por la muerte de las c$lulas in#ectadas. &lguna necrosis pueden inducir a la muerte de la planta. La necrosis tambi$n se puede observar en #rutos o tub$rculos como es el caso de .-;-(<( Re?!,,i9) e) el ,re,i*ie)/o 8 ?e>or*a,i9): la multiplicacin del virus est% acompaada de alteraciones metablicas que producen generalmente reduccin en el vigor de las plantas in#ectadas y reduccin en su desarrollo. 8l enanismo es un s"ntoma caracter"stico de en#ermedades virales que se acompaa de *o/as pequeas y

acortamiento de entrenudos0 asi como tambi$n de la reduccin en cantidad y tamao de #lores0 #rutos y semillas. Los s"ntomas anteriormente descritos0 van acompaados a su ve9 de disminuciones en los rendimientos de los cultivos. &lgunos virus no llevan a la expresin de s"ntomas en su planta *ospedera no parecen causar detrimento de esta o pasan desapercibidos en el material de propagacin. 8n ocasiones estos virus tienen una #uente sinergismo con otros0 intensi#icando su e#ecto como es el caso. INOCULACION MECANICA Se reali9a directamente sobre la planta0 utili9ando primero un abrasivo y pasando luego la suspensin del virus0 en el tampn adecuado0 por las *o/as de la planta. Se basa en el uso de las plantas *erb%ceas que reaccionan #rente a un alto n=mero de virus di#erentes y se constituyen en plantas indicadores de la presencia de in#ecciones virales a partir de inoculaciones mec%nica. &lgunas de estas plantas son N. benthamiana, N. clevelandii, Chenopodium quinoa, C. amaranticolor0 entre otras. Las pruebas de inoculacin mec%nica deben reali9arse en plantas /venes mantenidas en ambientes controlados para asegurar la sensibilidad y reproductibilidad de los s"ntomas. >sualmente se emplea una solucin tampn a base de #os#ato para acompaar el extracto macerado de la planta in#ectada0 que se aplicara en la super#icie de las *o/as de las plantas sanas. La inoculacin mec%nica se da cuando se #rota con la savia in#ectada el te/ido sano con ayuda de alg=n material0 usualmente carborundum o celita0 que permite causar que las plantas permane9can en un ambiente controlado que #avore9ca la multiplicacin del virus y la expresin de los s"ntomas en la planta INOCULACION POR VECTORES ?ay virus que no se pueden transmitir mec%nicamente y es necesario utili9ar su vector natural. <ambi$n se puede utili9ar para regenerar virus que su#rido sucesivos pases por inoculacin mec%nica. .ara llevarla a cabo *ay que tener en cuenta si el virus es persistente o no persistente pues el tiempo que se debe estar en contacto la planta con el vector depender% de esta caracter"stica &lgunos virus no pueden ser transmitidos de #orma mec%nica0 como por e/emplo algunos de los que est%n res/ri)1i?os al >loe*a ?e las 0la)/as como los L!/eo-ir!s; Poleo-ir!s; Na)o-ir!s; entre otros. 8n este caso0 las plantas indicadoras son inoculadas con sus vectores espec"#icos0 previa alimentacin de estos en plantas sintom%ticas.

INJERTOS Se utili9an para virus sistem%ticos que no pueden transmitirse mec%nicamente0 cuando la planta donante y la receptora sean compatibles. 8n los casos en los que se *ace

transmisin como m$todo de diagnstico0 se utili9an una planta receptora en la que se produ9ca s"ntomas caracter"sticos0 es decir0 que actue como planta indicadora @tro tipo de indexacin ampliamente usada para la deteccin de virus o agentes in#ecciosos de etiolog"a poco no conocida0 es la en/ertacin. 8sta se da principalmente en especies #rutales y se eligen especies leosas que mani#iesten r%pidamente los s"ntomas de la en#ermedad0 lo que generalmente ocurre meses despu$s. ?ay que destacar que los s"ntomas expresados en la planta son de dos tipos0 locali9ados o restringidos a la *o/a inoculada y sist$mica. Los primeros *acen re#erencia a la reaccin #isiolgica de la planta al ingreso del virus y en ocasiones al dao ocasionado por la inoculacin0 los cuales se presenta pocos d"as despu$s de esta. 8n el segundo caso0 son s"ntomas que presentan luego que la part"cula viral comien9a a despla9arse en la planta y se expresan en te/ido di#erente al de la inoculacin. 8l diagnostico basado =nicamente en expresin de s"ntomas es insu#iciente0 debido a que los s"ntomas no solo dependen del virus y sus variantes0 sino tambi$n del genotipo del *ospedero y delas condiciones biticas y abiticas prevalentes durante la prueba.

B=$ PRUEBAS SEROL@GICAS

Las m%s comunes son: 4= Pr!e5as !e re !iere) *olA,!las i)?i,a?oras: Anmunoen9im%ticas (8LAS& 0 radioinmunoensayo0 etc. &= Pr!e5as ?e i)*!)oele,/ro*i,ros,o0.a: 8so combinado de microscop"a electrnica y serolog"a. %= Pr!e5as ?e 0re,i0i/a,i9): Bicroprecipitacin0 doble di#usin en agar0 etc '= Pr!e5as ?e a1l!/i)a,i9): L%tex sensibili9ado con anticuerpos0 aglutinacin de cloroplastos0 etc. 8LAS& es la m%s sensitiva de las tres t$cnicas serolgicas descritas0 seguida por la prueba de l%tex. La Bicroprecipitacin0 aunque es menos sensitiva0 es =til cuando no se dispone de las #acilidades de laboratorio para conducir las otras pruebas.

4= PRUEBAS BUE REBUIEREN MOLCCULAS INDICADORAS

4=4=$ PRUEBAS INMUNOENDIMETICAS FELISAG

8s el m$todo m%s r%pido y seguro de identi#icacin de virus. & pesar de que los vegetales no producen anticuerpos0 las part"culas de virus pueden actuar como ant"genos al ser inoculado el /ugo de la planta en#erma en caballos0 cone/os o cobayos. 8stos animales #orman los anticuerpos. 7on la extraccin de sangre se obtiene suero0 con el que se pueden *acer diagnsticos de identi#icacin de virus. 8sta prueba presenta las caracter"sticas de ser:

 Al/a*e)/e se)si5le R:0i?a (los resultados pueden obtenerse en pocas *oras Si*0le (pueden anali9arse varias muestras simult%neamente .o,o i)>l!e),ia?a 0or la *or>olo1.a ?el 0a/91e)o Todas estas venta/as *acen que sea la t$cnica serolgica m%s di#undida y actualmente la m%s utili9ada en los laboratorios de #itopatolog"a. 4=4=4=$ CLASIFICACI@N: Dire,/as: El ant"geno es detectado directamente por un anticuerpo espec"#ico con/ugado con una en9ima A)?ire,/as FSa)?Hi,hG: Se emplean como con/ugados anticuerpos que reaccionan con los anticuerpos de la especie animal en la que se produ/eron los espec"#icos del patgeno. Los denominados sandCic*es de doble anticuerpo (8LAS&-'&S y de doble anticuerpo indirecto (8LAS&-'&SA son las m%s utili9adas para el diagnstico rutinario de #itopatgenos. 4=4=&=$ LA PRUEBA MES USADA EN FITOVIROLOGIA: DAS- ELISA 'oble sandCic* de anticuerpos o puente de anticuerpos: DAS$ ELISA0 la que consta de las siguientes etapas: Di/acin de anticuerpos espec"#icos del agente patgeno a detectar sobre un soporte insoluble (placas utili9ado como inmuno adsorbente (tapi9ado o sensibili9ado . Lavado para eliminar los anticuerpos de#icientemente #i/ados y los no #i/ados.

&dicin de la muestra ob/eto de estudio (extracto vegetal bruto . 8l agente patgeno (ant"geno si est% presente0 reaccionar% con sus anticuerpos espec"#icos quedando #i/ado a la placa. Lavado para eliminar los restos de la muestra no #i/ados y los ant"genos que no *ayan reaccionado.

&dicin del mismo anticuerpo espec"#ico (1 con/ugado o marcado con una en9ima. 8stos anticuerpos marcados reaccionar%n all" donde exista el ant"geno previamente insolubili9ado. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados con la en9ima que no *ayan reaccionado.

 &dicin del sustrato sobre el cual sea capa9 de actuar la en9ima marcadora. Lectura de las placas a simple vista o con un color"metro a la longitud de onda apropiada seg=n el producto #inal coloreado.

4=4=%=$ I)*!)oi*0resi9)$ELISA
'entro de las t$cnicas inmunoen9im%ticas sobre soportes slidos se *a descrito tambi$n la Anmunoimpresin 8LAS& (AA.-8LAS& para la deteccin de 7<-. 8sta t$cnica se basa en los mismos principios que el 8LAS&: 8l ant"geno se une a una membrana de nitrocelulosa o nylon0 con a#inidad por las prote"nas0 al presionar un corte de material vegetal sobre $sta. La deteccin se reali9a directa o indirectamente utili9ando anticuerpos. 8ste procedimiento o#rece la gran venta/a de no tener que reali9ar extractos0 con lo que se ampl"a el n=mero de muestras que se va a procesar0 se eliminan los problemas de contaminacin entre muestras y la posibilidad de liberar in*ibidores vegetales.

 La AA.-8LAS& es un m$todo sencillo0 que permite la separacin temporal de los procesos de toma y an%lisis de muestras0 debido a que las membranas impresas se pueden conservar por largos per"odos0 con resultados de alta con#iabilidad0 e#iciencia y correlacin con el 8LAS&. 8stas venta/as *an conducido a que en la actualidad su uso se *aya extendido a muc*os modelos virus-*ospedante. La AA.-8LAS& resulta ideal para el diagnstico rutinario en viveros y empresas agr"colas0 por lo que *a sido empleada como sistema de diagnstico en varios pa"ses. &=$ PRUEBAS DE INMUNOELECTROMICROSCOPIA <$cnicas que se emplean para visuali9ar part"culas virales mediante la reaccin con su respectivo anticuerpo a trav$s del microscopio electrnico. 1 A8B: Los virus son atrapados en una re/illa previamente sensibili9ada con anticuerpos espec"#icos. 7on esto el )<*ero ?e 0ar/.,!las por re/illas es 1"=""" -e,es s!0erior al #i/ado en una re/illa sin sensibili9ar. 1 '87@)&7AE(: 7onsiste en colocar sobre las part"culas el antisuero espec"#ico. 8l resultado se visuali9a como un *alo alrededor del virus. 8s un m$todo muy r%pido que a*0li>i,a la -is!aliza,i9) de las part"culas. 2 A8B F '87@)&7A@(: los virus atrapados sobre una re/illa previamente sensibili9ada0 son luego cubiertos con el anticuerpo espec"#ico. %=$ PRUEBAS DE PRECIPITACI@N >na gota de antisuero se me9cla con una gota de /ugo de planta clari#icado. 'espu$s de cierto tiempo0 con ayuda de un microscopio con campo oscuro0 se puede observar una #loculacin. La #loculacin ocurre con las muestras in#ectadas pero no con las sanas. '=$ PRUEBAS DE AGLUTINACI@N Similar a la microprecipitacin. La sensibilidad de la prueba se aumenta al ad*erir las pequeas mol$culas de anticuerpos a las es#eras relativamente grandes de l%tex antes de reali9ar la prueba. (8l l%tex es una macromol$cula de poliestireno >na gota de l%tex sensibili9ado con anticuerpos se me9cla con una gota del /ugo de la planta que est% en prueba. Si el /ugo contiene virus0 ocurre la #loculacin del l%tex.

C=$ MCTODOS BASADOS EN EL USO DE ECIDOS NUCLEICOS

>na venta/a de los m$todos basados en el uso de %cidos nucleicos es por tanto0 la alta precisin que o#recen para la deteccin viral as" como su uso simult%neo para la

caracteri9acin gen$tica de los virus ba/o estudio e incluso de su interaccin con el *ospedero. Hi5ri?iza,i9) *ole,!lar 8l principio de estas t$cnicas se basa en la #i/acin de pequeas cantidades de extractos de plantas (<issue-printing o de %cidos nucleicos totales ('ot-blot en membranas de nylon o nitrocelulosa0 que son reconocidos por sondas marcadas radioactivamente o por sondas no isotpicas. 8l resultado se monitorea por el cambio de coloracin que se observa en la membrana (deteccin colorim$trica o sobre una pel"cula de deteccin (m$todos radioactivos quimioluminiscentes . ?ibridi9acin 'ot-blot: esta prueba es #iable0 r%pida y #%cil de desarrollar0 se presenta como una alternativa al uso de la t$cnica de 8LAS& convencional0 cuando no se cuentan con anticuerpos espec"#icos para un virus de inter$s o cuando los costos de $stos son muy altos. Tissue-printing: 8l procedimiento es r%pido0 sensible y simple (no utili9a extraccin de virus 0 es econmico por que no requiere de equipo especiali9ado0 adem%s es apropiado para evaluar un alto n=mero de muestras por d"a. 8studia aspectos relacionados con la locali9acin y movimiento entre c$lulas y a trav$s de los *aces vasculares (B%s y .allas0 133! . TA,)i,as 5asa?as e) PCR= Se #undamentan en la ampli#icacin exponencial de una secuencia de %cidos nucleicos que es #lanqueada por un par de cebadores0 los cuales son usados por una polimerasa termo estable de &'( para la #ormacin de las nuevas cadenas. La t$cnica consta de m=ltiples ciclos (usualmente 2! a 40 en los cuales *ay desnaturali9acin de &'( de doble cadena0 anillamiento de los cebadores (oligonucleotidos de 1G a 2! bases 0 extensin (polimeri9acin y nuevamente desnaturali9acin. 8sto permite la deteccin precisa de una secuencia viral y posterior secuenciacin para caracteri9arla con exactitud. 8n el caso de los virus de &)( es necesario un paso anterior a la .7)0 en el cual se pasa el &)( a su *omlogo de &'(0 denominado &'( copia (&'(c . 8ste proceso es reali9ado por una en9ima transcriptasa reversa de or"gen viral. Los m$todos basados en .7) permiten una mayor sensibilidad que las pruebas mencionadas anteriormente0 debido a que una pequea secuencia es ampli#icada millones de veces0 posibilit%ndose su visuali9acin como bandas a trav$s de electro#oresis en geles. PCR e) /ie*0o real 8sta metodolog"a permite monitorear la acumulacin en tiempo real de los productos de .7) para cada ciclo durante toda la reaccin. La t$cnica no requiere correr las muestras en gel de electro#oresis ya que la in#ormacin requerida se obtiene en las gr%#icas del monitoreo de la reaccin. 8s m%s r%pida0 espec"#ica y sensible que una .7) convencional0 adem%s de ser un m$todo cuantitativo al suministrar in#ormacin de la cantidad de producto ampli#icado0 previa generacin de una curva de calibracin.

8l uso de .7) en tiempo real viene extendi$ndose ampliamente en el campo de la #itopatolog"a0 permitiendo identi#icar virus y otros patgenos que a#ectan las plantas. 8s un m$todo de diagnstico e identi#icacin evaluado en patgenos cuarentenarios como el viroide de la papa (.S<-d y en virus de gran importancia econmica como Tomato spotted wilt virus (<SH- y .-;-(<(.