Analyse dchantillons alimentaires pour la prsence dorganismes gntiquement modifis

Module 4 Extraction et purification de lADN

M. Somma

WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION REGIONALBRO FR EUROPA

ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE

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Table des matires Module 4 Extraction et purification dADN

INTRODUCTION METHODES DEXTRACTION METHODES DE PURIFICATION METHODE DEXTRACTION ET DE PURIFICATION AU CTAB QUANTIFICATION DE LADN PAR SPECTROPHOTOMETRIE PRINCIPES DE LA DETERMINATION SPECTROPHOTOMETRIQUE DE LADN DETERMINATION DE LA CONCENTRATION EN ACIDES NUCLEIQUES EXPERIENCE REFERENCES

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Introduction
Lextraction et la purification des acides nucliques sont les premires tapes dans la plupart des tudes de biologie molculaire et dans toutes les techniques dADN recombinant. Lobjectif des mthodes dextraction des acides nucliques dans le cas prsent est dobtenir des acides nucliques purifis, tirs de sources diverses, afin de pouvoir mener une analyse spcifique de dtection dOGM en utilisant la raction de polymrisation en chane (PCR). La qualit et la puret des acides nucliques comptent parmi les facteurs les plus critiques pour lanalyse PCR. Afin dobtenir des acides nucliques hautement purifis exempts de tout contaminant visibles, des mthodes dextraction adquates devraient tre appliques. Les contaminants susceptibles dinhiber la raction PCR sont numrs dans le Tableau 1. Afin dviter un rsultat faux-ngatif du fait de la prsence dinhibiteurs de PCR dans lchantillon, il est vivement recommand de raliser une exprience de contrle visant tester linhibition de la PCR. On recourt gnralement cette fin une analyse PCR spcifique pour les vgtaux (eucaryotes ou chloroplastes) ou spcifique lespce. Tableau 1. Quelques inhibiteurs de la PCR Inhibiteur SDS Phnol thanol Isopropanol Actate de sodium Chlorure de sodium EDTA Hmoglobine Hparine Ure Mlange de ractifs Concentration inhibitrice > 0,005% > 0,2% > 1% > 1% > 5 mM > 25 mM > 0,5 mM > 1 mg/ml > 0,15 i.m/ml > 20 mM > 15%

Vu quil existe une grande diversit de mthodes dextraction et de purification des acides nucliques, le choix de la technique la plus adquate repose gnralement sur les critres suivants : Lacide nuclique cible, Lorganisme source, Le matriel de dpart (tissu, feuille, graine, matriel transform, etc.), Les rsultats escompts (rendement, puret, temps de purification requis, etc.),

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Lapplication en aval (PCR, clonage, tiquetage, transfert dADN, RT-PCR, synthse dADNc, etc.)

Les principes de certaines des mthodologies les plus utilises aujourdhui pour extraire et purifier des acides nucliques sont dcrits dans les sections suivantes.

Mthodes dextraction
Lextraction dacides nucliques dun matriau biologique requiert la lyse cellulaire, linactivation des nuclases cellulaires et la sparation de lacide nuclique souhait de dbris cellulaires. La procdure de lyse idale est souvent un compromis de techniques et doit tre suffisamment rigoureuse pour briser le matriau de dpart complexe (par exemple, le tissu), mais suffisamment douce pour prserver lacide nuclique cible. Les procdures de lyse courantes sont les suivantes : le rupture mcanique (ex. : broyage ou lyse hypotonique), le traitement chimique (ex.: lyse dtergente, agents chaotropiques, rduction des thiols) et la digestion enzymatique (ex.: protinase K). La rupture de la membrane et linactivation des nuclases intracellulaires peuvent tre combines. titre dexemple, une solution simple peut contenir des dtergents pour solubiliser les membranes cellulaires et des sels chaotropiques puissants pour inactiver les enzymes intracellulaires. Aprs la lyse cellulaire et linactivation du nuclase, les dbris cellulaires peuvent tre aisment retirs par filtrage ou par prcipitation.

Mthodes de purification
Les mthodes de purification des acides nucliques issus dextraits cellulaires sont gnralement des combinaisons de deux ou plusieurs des techniques suivantes : extraction/prcipitation, chromatographie, centrifugation et sparation par affinit.

Une brve description de ces techniques sera donne dans les paragraphes suivants (Zimmermann et al., 1998).

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Extraction/Prcipitation
Lextraction par solvants est souvent utilise pour liminer les contaminants dacides nucliques. titre dexemple, une combinaison de phnol et de chloroforme sert frquemment supprimer les protines. La prcipitation par lisopropanol ou lthanol est gnralement utilise pour concentrer les acides nucliques. Si la quantit dacides nucliques cibles est faible, un vhicule inerte (tel que le glycogne) peut tre ajout au mlange afin daccrotre lefficacit de la prcipitation. Dautres mthodes de prcipitation des acides nucliques incluent la prcipitation slective laide de fortes concentrations de sel ( relargage ) ou la prcipitation de protines en utilisant les changements au niveau du pH.

Chromatographie
Les mthodes chromatographiques peuvent utiliser diffrentes techniques de sparation, telles que la filtration sur gel, lchange dions, ladsorption slective ou la liaison par affinit. La filtration sur gel exploite les proprits du tamisage molculaire de particules de gel poreuses. Une matrice avec des pores dune taille dfinie permet aux petites molcules de traverser les pores par diffusion, tandis que les plus grosses molcules sont exclues et lues. Les molcules sont donc lues afin de diminuer la taille molculaire. La chromatographie par change dions est une autre technique qui a recours linteraction lectrostatique entre une molcule cible et un groupe fonctionnel sur la matrice colonne. Les acides nucliques (polyanions linaires forte charge ngative) peuvent tre lus des colonnes dchange dions grce de simples tampons de sel. Dans la chromatographie par adsorption, les acides nucliques sont fixs slectivement par adsorption sur des silices ou du verre en prsence de certains sels (ex. : des sels chaotropiques), alors que dautres molcules biologiques ne se fixent pas. Un tampon ou une eau faible en sels peut ensuite luer les acides nucliques et produire ainsi un chantillon utiliser directement dans des applications en aval.

Centrifugation
La centrifugation slective est une mthode de purification puissante. titre dexemple, lultracentrifugation isopycnique en gradients de CsCl des forces g leves a t longtemps utilise pour la purification de plasmides. La centrifugation est souvent combine une autre mthode. Un exemple dune telle utilisation est la chromatographie colonne rotative qui combine la filtration sur gel et la centrifugation afin de dbarrasser lADN ou lARN des contaminants de plus petit

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format (sels, nuclotides, etc.), pour lchange de tampon ou pour la slection de taille. Certaines procdures combinent ladsorption slective sur matrice chromatographique (cf. paragraphe ci-dessus Chromatographie ) llution centrifuge pour purifier slectivement un type dacide nuclique.

Sparation par affinit

Ces dernires annes, un nombre croissant de mthodes de purification ont combin limmobilisation par affinit dacides nucliques la sparation magntique. titre dexemple, des poly(A) + mARN peuvent tre lis des particules magntiques revtues de streptavidine par des oligo(dT) marqus la biotine et le complexe de particules peut tre extrait de la solution (et des contaminants non lis) laide dun aimant. Cette technique phase solide simplifie la purification de lacide nuclique, tant donn quelle peut remplacer plusieurs tapes de la centrifugation, de lextraction organique et de la sparation de phase par une opration de sparation magntique unique et rapide.

Mthode dextraction et de purification au CTAB

labor pour la premire fois par Murray et Thompson en 1980 (Murray et Thompson, 1980), le protocole du test au ctyltrimthylammonium bromure (CTAB) a t publi ultrieurement, et plus prcisment en 1987, par Wagner et ses collgues (Wagner et al., 1987). La mthode convient pour lextraction et la purification dADN de vgtaux et daliments tirs des vgtaux et convient particulirement pour la suppression des polysaccharides et des composs polyphnoliques qui affectent la puret de lADN et donc la qualit. Cette procdure a t largement applique dans la gntique molculaire des vgtaux et a dj t teste dans des essais de validation dans le but de dtecter les OGM (Lipp et al., 1999; 2001). Plusieurs autres variantes ont t labores dans le but dadapter la mthode une vaste plage de matrices alimentaires brutes et transformes (Hupfer et al., 1998; Hotzel et al., 1999; Meyer et al., 1997; Poms et al., 2001).

Principes de la mthode au CTAB : lyse, extraction et prcipitation

Des cellules vgtales peuvent tre lyses en utilisant le dtergent ionique ctyltrimthylammonium bromure (CTAB), qui forme un complexe insoluble avec les acides nucliques dans un environnement faible teneur en sels. Dans ces

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conditions,

les

polysaccharides,

les

composs

phnoliques

et

les

autres

contaminants restent dans le liquide surnageant et peuvent tre lavs. Le complexe dADN est solubilis en levant la concentration en sels et prcipit avec de lthanol ou de lisopropanol. Nous dcrirons dans cette partie les principes des trois principales tapes, savoir la lyse de la membrane cellulaire, lextraction de lADN gnomique et sa prcipitation. Lyse de la membrane cellulaire : comme nous lavons mentionn prcdemment, la premire tape de lextraction dADN est la rupture de la cellule et de la membrane nuclaire. cette fin, lchantillon homognis est tout dabord trait avec le tampon dextraction contenant de lEDTA, du Tris/HCl et du CTAB. Toutes les membranes biologiques ont une structure gnrale commune comprenant des molcules de lipide et de protines maintenues ensemble par des interactions non covalentes.

Figure 1. Reprsentation simplifie des membranes cellulaires1 Comme le montre la Figure 1, les molcules de lipides sont agences sous forme de double couche continue dans laquelle les molcules de protine sont dissoutes . Les extrmits des molcules de lipides se composent de ttes hydrophiles et de queues hydrophobes. Dans la mthode au CTAB, la lyse de la membrane est accomplie par le dtergent (CTAB) contenu dans le tampon dextraction. Comme la composition des lipides et celle du dtergent sont semblables, le composant CTAB du tampon dextraction a pour fonction de piger les lipides qui constituent la cellule et la membrane nuclique. Le mcanisme de solubilisation des lipides en utilisant un dtergent est illustr dans la Figure 2.

Les illustrations reprises sur cette page et sur les pages suivantes ont t mises disposition par le Genetic Science Learning Center de luniversit dUtah, http://gslc.genetics.utah.edu.

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Figure 2. Solubilisation des lipides La Figure 3 montre comment le dtergent pige les lipides et les protines, autorisant ainsi la libration de lADN gnomique, lorsque la membrane cellulaire est expose au tampon dextraction au CTAB. Dans une concentration salique (NaCl) spcifique, le dtergent forme un complexe insoluble avec les acides nucliques. LEDTA est un composant de chlation qui lie le magnsium, entre autres mtaux. Le magnsium est un cofacteur pour la DNAse. En liant le Mg lEDTA, lactivit de la DNAse prsente est diminue. La combinaison Tris/HCl donne la solution une capacit dattnuation du pH (un pH faible ou un pH lev endommage lADN). Il est important de souligner qutant donn le risque de dgradation aise des acides nucliques ce stade de la purification, le temps coul entre lhomognisation de lchantillon et lajout de la solution tampon au CTAB devrait tre limit. La purification de lADN est ralise ds que la cellule et les membranes de lorganelle (comme celles qui entourent les mitochondries et les chloroplastes) sont spares.

Figure 3 : rupture de la membrane cellulaire et extraction de lADN gnomique Extraction : dans cette phase, les polysaccharides, les composs phnoliques, les protines et les autres lysats cellulaires dissous dans la solution aqueuse sont spars du complexe acide nuclique / CTAB. Llimination des polysaccharides, ainsi que des composs phnoliques est particulirement importante en raison de leur capacit inhiber un grand nombre de ractions enzymatiques. Dans une concentration faible teneur en sels (< 0,5 M NaCl), les contaminants du complexe

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dacide nuclique ne prcipitent pas et peuvent tre enlevs par lextraction hors de la solution aqueuse au moyen de chloroforme. Ce dernier dnature les protines et facilite la sparation des phases aqueuses et organiques. Normalement, la phase aqueuse constitue la phase suprieure. Mais si la phase aqueuse est dense, en raison de sa concentration en sels (> 0,5 M), elle constituera la phase infrieure. Lacide nuclique aura, en outre, tendance se dissoudre dans la phase organique si le pH de la solution aqueuse na pas t quilibr comme il se doit une valeur de pH comprise entre 7,8 et 8,0. Au besoin, lextraction au chloroforme est rpt deux ou trois fois afin denlever compltement les impurets de la couche aqueuse. Pour parvenir la meilleure rcupration possible de lacide nuclique, une rtroextraction de la phase organique peut tre ralise laide dune solution aqueuse qui est ajoute ensuite lextrait prcdent. Une fois que le complexe dacide nuclique a t purifi, la dernire tape de la procdure peut tre accomplie. Il sagit de la prcipitation. Prcipitation : ce stade final, lacide nuclique est libr du dtergent. cette fin, la solution aqueuse est tout dabord traite laide dune solution de prcipitation compose dun mlange de CTAB et de NaCl concentration leve (> 0,8 M NaCl). Le sel est indispensable la formation dun prcipit dacide nuclique. Lactate de sodium peut tre prfr au NaCl pour sa capacit de tamponnage. Dans ces conditions, le dtergent, qui est plus soluble dans lalcool que dans leau, peut tre lu, tandis que lacide nuclique prcipite. Le traitement successif par 70% dthanol permet une purification ou lution supplmentaire des sels rsiduels.

Quantification de lADN par spectrophotomtrie

LADN, lARN, les oligonuclotides et mme les mononuclotides peuvent tre mesurs directement dans des solutions aqueuses sous forme dilue ou non dilue en mesurant labsorption A (galement dfinie comme tat la densit optique, DO) en lumire ultraviolette (mais aussi dans le spectre visible). Si lchantillon est pur (autrement dit, sil ne contient pas de quantit significative de contaminants tels que des protines, du phnol ou de lagarose), la mesure spectrophotomtrique de la quantit de rayons ultraviolets absorbs par les bases est une opration facile et prcise. Lidal pour cette mthode sont des tampons aqueux faibles concentrations ioniques (par exemple, un tampon TE). La concentration dacides nucliques est gnralement dtermine par une mesure effectue 260 nm contre un chantillon appel blanc . Linterfrence par des contaminants se reconnat par

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calcul dun ratio . Les protines absorbant 280 nm, le ratio A260/A280 est utilis pour estimer la puret de lacide nuclique. LADN pur devrait avoir un ratio denviron 1,8, tandis que lARN pur devrait avoir une valeur denviron 2,0. Labsorption 230 nm reflte la contamination de lchantillon par des substances telles que les hydrates de carbone, les peptides, les phnols ou les composs aromatiques. Dans le cas dchantillons purs, le ratio A260/A230 devrait tre denviron 2,2. Une mthode alternative, en loccurrence la mthode de la plaque dagarose au bromure dthidium, est utile lorsquon ne dispose que de faibles quantits dacide nuclique. La quantit dacide nuclique peut tre estime par comparaison une gamme de concentrations en utilisant lintensit de la fluorescence mise par le bromure dthidium lorsque celui-ci est irradi par la lumire UV.

Principes de la dtermination spectrophotomtrique de lADN

Un spectrophotomtre utilise la transmission de la lumire travers une solution pour dterminer la concentration dun solut lintrieur de la solution. Lappareil fonctionne suivant un principe simple dans lequel de la lumire dune longueur donde connue traverse un chantillon et o la quantit dnergie lumineuse transmise est mesure laide dune cellule photolectrique place de lautre ct de lchantillon. Comme le montre la Figure 4, la conception du spectrophotomtre simple faisceau implique lutilisation dune source lumineuse, dun prisme, dun support dchantillon et dune cellule photolectrique. Les mcanismes lectriques ou mcanismes adquats pour contrler lintensit dclairage, la longueur donde et la conversion dnergie reue au niveau de la cellule photolectrique diverses tensions sont relis chacun des composants. La fluctuation des tensions saffiche ensuite sur une chelle exprime en mtres ou est enregistre sur un ordinateur laide dune connexion en vue dun examen ultrieur.

Figure 4. Reprsentation schmatique de la transmission lumineuse

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Toutes les molcules absorbent de lnergie radiante une longueur donde spcifique partir de laquelle il est possible dextrapoler la concentration dun solut lintrieur dune solution. Selon la loi de Beer-Lambert, il existe une relation linaire entre labsorption A (galement appele densit optique, DO) et la concentration de la macromolcule qui est donne par lquation suivante : A = OD = lc, (1)

o est gal au coefficient dextinction molaire, c indique la concentration et l reprsente la longueur de parcours de la cuvette. Les protines et les acides nucliques absorbent la lumire dans la plage des ultraviolets dans des longueurs donde comprises entre 210 et 300 nm. Comme expliqu prcdemment, labsorbance maximale de solutions ADN et ARN est fixe 260 nm, tandis que labsorbance maximale de solutions base de protines est de 280 nm. Ds lors, tant les solutions dADN que les solutions dARN absorbent partiellement la lumire 280 nm, tandis que les solutions de protines labsorbent partiellement 260 nm. Le ratio entre les valeurs 260 nm et 280 nm (A260/A280) fournit une estimation du degr de puret des acides nucliques. Des prparations pures dADN et dARN ont des valeurs A260/A280 de 1,8 et 2,0 respectivement. Sur une longueur de parcours de 10 mm avec une longueur donde de 260 nm, labsorption A = 1 correspond environ 50 g/ml de dsADN, environ 37 g/ml de ssADN, 40 g/ml dARN ou environ 30 g/ml doligonuclotides. En cas de contamination par une protine, le rapport A260/A280 sera nettement infrieur aux valeurs donnes ci-dessus et une quantification prcise de la quantit dacide nuclique ne pourra tre envisage. Il est important de prciser ici que des impurets dans les solutions dADN provoqus par lARN ne peuvent tre identifies de manire fiable par la spectrophotomtrie. Une absorbance de 325 nm peut tre utilise pour indiquer la prsence de dbris dans la solution ou rvler que la cuvette elle-mme est sale.

Dtermination de la concentration en acides nucliques

Choix de la cuvette : la quantit de solution dacide nuclique utilise pour mesurer labsorbance A dpend de la capacit de la cuvette. Pour tre adquate, la cuvette devrait tre slectionne en fonction du taux de concentration de lchantillon, du facteur de dilution et du volume dchantillon disponible. Dans la majorit des procdures utilises pour dtecter les OGM, le volume dADN gnomique recueilli se situe entre 50 et 100 l. Plusieurs types de cuvette microvolume, dune capacit

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comprise entre 5 et 70 l, sont utiliss pour la quantification spectroscopique de petits volumes dacides nucliques. Rglage : afin de calibrer le spectrophotomtre, il est essentiel de : slectionner la longueur de chemin optique de la cuve, choisir le bon facteur (faire une slection entre dsADN, ssADN, ARN), mesurer une solution vierge (rfrence) constitue soit deau, soit dune solution tampon (A260 = 0), veiller ce que la rfrence rgle soit renouvele priodiquement, mesurer une quantit connue dacide nuclique pur afin de contrler la fiabilit de la rfrence fixe. Mesure dun chantillon inconnu : en fonction de la capacit de la cuvette utilise, des quantits spcifiques de solution dADN sont utilises afin dvaluer la concentration (par exemple, pour une cuvette dune capacit infrieure 0,2 ml, on dilue 5 l dADN dans 195 l deau). Aprs talonnage du spectrophotomtre et de la solution dacide nuclique ajouter, la cuvette est bouchonne, la solution est mlange et labsorbance est mesure. Afin de rduire les erreurs de pipetage, la mesure devrait tre rpte au minimum deux fois en utilisant chaque fois 5 l de la solution dADN au minimum. Des valeurs A260 infrieures 0,02 ou comprises entre 1 et 1,5 (en fonction de linstrument utilis) ne sont pas recommandes en raison du risque dune marge derreur leve. La concentration c dun acide nuclique spcifique prsent dans une solution se calcule laide des quations suivantes : ADN monobrin: ADN double brin: ARN monobrin Oligonuclotide: c(pmol/l) = A260/0,027 c(pmol/l) = A260/0,020 c(pmol/l) = A260/0,025 c(pmol/l) = A260100/1,5NA+0,71NC+1,20NG + 0,84NT

o A260 dsigne labsorbance mesure 260 nm. Un exemple de valeurs dabsorbance dADN dans un ris de veau (calf thymus) hautement purifi en suspension dans un tampon de TNE (1x) en partant du principe que lADN de rfrence est dsADN o A260 = 1 pour 50 g/ml dans une cuvette dune longueur de parcours de 10 mm est illustr dans le Tableau 2. La concentration nominale de lADN tait de 25 g/ml.

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Tableau 2. Valeur dabsorbance de lADN de ris de veau hautement purifi dans un tampon de TNE (1x) Longueur donde 325 280 260 230 Absorbance 0,01 0,28 0,56 0,30 A260/A280 2,0 Conc. (g/ml) 28 -

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Exprience
Matriel REMARQUE Tout le matriel utilis doit tre strilis avant son utilisation et tout rsidu dADN doit tre limin. Afin dviter toute contamination, il est recommand dutiliser des embouts de pipette striles avec barrire arosol.

Instruments rducteurs tels quune lame de scalpel strile ou un mortier Bain-marie ou bloc chauffant Microcentrifugeuse Micropipettes Mixer Vortex Tubes de 1,5 ml pour microcentrifugeuse Plateaux de pesage ou quivalents Spatules Une balance dune prcision de 0,01 g Tigettes Rack pour tubes de microcentrifugeuse Facultatif: dessiccateur sous vide pour scher les culots dADN

Ractifs REMARQUE Tous les produits chimiques devraient tre de qualit de biologie molculaire. Leau dionise et les tampons devraient tre striliss lautoclave avant leur utilisation. Tous les produits chimiques devraient, en outre, tre exempts dADN et dADNase.

Bromure de ctyltrimthylammonium (CTAB) Chloroforme Isopropanol Na2EDTA thanol NaCl

CAS 124-03-8

CAS 6381-92-6

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Protinase K RNAse A Hydrochlorure de tris(hydroxymthyl)aminomthane (Tris-HCl) Eau dionise strile

Tampon au CTAB 20 g/l CTAB 1,4 M NaCl 0,1 M Tris-HCl 20 mM Na2EDTA Ajoutez 100 ml deau dionise. Ajustez le pH 8,0 en ajoutant 1M NaOH. Compltez pour obtenir 200 ml et strilisez. Conservez le tampon 4C pendant maximum 6 mois. 4g 16,4 g 3,5 g 1, g

Solution de prcipitation au CTAB 5 g/l CTAB 0,04 M NaCl Ajoutez 100 ml deau dionise. Ajustez le pH 8,0 en ajoutant 1M NaOH. Compltez pour obtenir 200 ml et strilisez. Conservez le tampon 4C pendant maximum 6 mois. 1g 0,5 g

NaCl 1,2 M Dissolvez 7,0 g de NaCl dans 100 ml deau dionise. Strilisez et conservez temprature ambiante.

Solution dthanol 70 % (v/v) Mlangez 70 ml dthanol pur 30 ml deau dionise strile. RNase A 10 mg/ml Conservation -20 C

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Protinase K 20 mg/ml Conservation -20 C

Procdure La procdure requiert des conditions striles. La contamination peut tre vite durant la prparation des chantillons en utilisant un quipement usage unique et des solutions de dcontamination et en vitant la formation de poussires. Transfrez 100 mg dun chantillon homogne dans un tube strile de 1,5 ml pour microcentrifugeuse. Ajoutez 300 l deau dionise strile et mlangez avec une tigette Ajoutez 500 l de tampon au CTAB et mlangez avec une tigette. Ajoutez 20 l de protinase K (20 mg/ml), mlangez et placez dans un incubateur 65C pendant 30 90 minutes
* *

Ajoutez 20 l de RNAse A (10 mg/ml), mlangez et laissez incuber 65C pendant 5 10 minutes

Centrifugez pendant 10 minutes environ 16 000 xg. Transfrez le liquide surnageant dans un tube pour microcentrifugeuse contenant 500 l de chloroforme. Mlangez pendant 30 secondes. Centrifugez pendant 10 minutes 16 000 xg jusquau moment o la sparation de phase se produit. Transfrez 500 l de la couche suprieure dans un nouveau tube de microcentrifugation contenant 500 l de chloroforme et mlangez. Centrifugez pendant 5 minutes 16 000 xg. Transfrez la couche suprieure dans un nouveau tube de microcentrifugation. Ajoutez 2 volumes de solution de prcipitation au CTAB et mlangez par pipetage. Laissez incuber pendant 60 minutes temprature ambiante. Centrifugez pendant 5 minutes 16 000 xg. Jeter le liquide surnageant.

Ces tapes facultatives supplmentaires sont dsormais reprises communment dans la mthode dextraction au CTAB afin damliorer le rendement de lADN gnomique partir de matrices trs complexes.

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Dissolvez le prcipit dans 350 l NaCl (1,2 M). Ajoutez 350 l de chloroforme et mlangez pendant 30 secondes. Centrifugez pendant 10 minutes 16 000 xg jusqu ce que la sparation de phase se produise. Transfrez la couche suprieure dans un nouveau tube de microcentrifugation. Ajoutez 0,6 volume disopropanol et mlangez. Centrifugez pendant 10 minutes 16 000 xg. Jetez le liquide surnageant. Ajoutez 500 l de solution dthanol 70% et mlangez dlicatement. Centrifugez pendant 10 minutes 16 000 xg. Jeter le liquide surnageant. Schez les culots et redissolvez lADN dans 100 l deau strile dionise.

La solution dADN peut tre conserve au rfrigrateur pendant deux semaines au maximum ou au conglateur -20 C pendant des priodes plus longues.

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Rfrences
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