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ADN recombinante

Diagrama de ADN ligado. Esta secuencia pertenece a un gen de la hemoglobina humana. El ADN recombinante, o ADN recombinado, es una molcula de ADN artificial formada de manera deliberada in vitro por la unin de secuencias de ADN provenientes de dos organismos de especies diferentes que normalmente no se encuentran juntos. Al introducirse este ADN recombinante en un organismo, se produce una modificacin gentica que permite la adicin de un nuevo ADN al organismo, conllevando a la modificacin de rasgos existentes o la expresin de nuevos rasgos. La produccin de una protena no presente en un organismo determinado y producidas a partir de ADN recombinante, se llaman protenas recombinantes. El ADN recombinante es resultado del uso de diversas tcnicas que los bilogos moleculares utilizan para manipular las molculas de ADN y difiere de la recombinacin gentica que ocurre sin intervencin dentro de la clula. El proceso consiste en tomar una molcula de ADN de un organismo, sea virus, planta o una bacteria y en el laboratorio manipularla y ponerla de nuevo dentro de otro organismo. Esto se puede hacer para estudiar la expresin de un gen, para producir protenas en el tratamiento de una enfermedad gentica, vacunas o con fines econmicos y cientficos.

ONTENIDOS ADN RECOMBINANTE O CLONACIN CELULAR

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La tcnica del ADN recombinante se utiliza en estudios sobre la regulacin de la expresin gnica, en la regulacin de la produccin comercial de sntesis de protenas como la Insulina o la hormona del crecimiento, en el desarrollo de organismos transgnicos y en la amplificacin del ADN, es decir, en obtener un gran nmero de copias de un gen determinado. En este ltimo caso, existe una tcnica mejor, denominada con las siglas PCR. La tcnica consiste en introducir el gen seleccionado en el interior de un vector y ste, a su vez, dentro de una clula, denominada clula anfitriona. Aprovechando la maquinaria celular, el gen se expresa, sintetizndose as la protena codificada en el gen. Adems, al dividirse la clula, las nuevas clulas formadas contienen ese gen que tambin sintetizan esa protena. Se genera un grupo celular que contiene un genoma distinto. Las etapas en la produccin de ADN recombinante son las siguientes:
1. Preparacin de la secuencia del ADN para su clonacin 2. Preparacin de un vector de clonacin 3. Formacin del ADN recombinante 4. Introduccin del ADN recombinante en una clula anfitriona 5. Propagacin del cultivo 6. Deteccin y seleccin de clones recombinantes

1. Preparacin de la secuencia del ADN para su clonacin

Es la parte esencial del proceso, ya que el ADN debe separarse y concentrarse.

Partimos de clulas con ncleo, que deben ser lisadas (rotas). Las protenas estructurales, enzimas, ARN y restos moleculares deben separarse del ADN. El ADN obtenido se concentra y se fragmenta por accin de las enzimas de restriccin. Se asla el ADN que se desea clonar, por ejemplo, mediante cromatografa lquida o por centrifugacin. Si el ADN debe expresarse hay que aadir los segmentos reguladores de la expresin gnica.

2. Preparacin de un vector de clonacin

El vector es el portador de la secuencia de ADN que se desea clonar. Un vector debe presentar las siguientes caractersticas:

Una pequea secuencia de ADN fcil de aislar, como, por ejemplo, un plsmido. Contener distintos puntos de ataque a enzimas de restriccin y que sean conocidos. Poder ser incluido en la clula anfitriona con facilidad. Replicarse de forma independiente al ADN de la clula anfitriona. Poseer un gen marcador con el que puedan identificarse . y seleccionar las clulas clonadas. Un ejemplo de marcador puede ser la resistencia a un antibitico.

Las etapas del proceso consisten en:


1. Cortar el vector con enzim as de restric cin, las misma s enzim as que se utilizar on para cortar el ADN que se quiere inserta r. 2. Unir el vector y el ADN que se va a clonar media nte los llamad os extrem os cohesi vos, o pegajo sos, o escalo nados.

Una vez que el ADN ha sido introducido en el vector se denomina ADN inserto, o simplemente, inserto. Los tipos de vectores que se utilizan suelen ser plsmidos, virus como el fago , cromosomas creados de forma artificial y

quimeras.

3. Formacin del ADN recombinante

En esta etapa se produce la unin covalente del vector y el ADN inserto mediante una ligasa. As se realiza el sellado de la llamada Mella, Muesca o Nick.

4. Introduccin del ADN recombinante en la clula anfitriona

Para la clonacin (replicacin del ADN recombinante) se necesita la maquinaria celular. Por ello, hay que introducir el ADN recombinante en una clula anfitriona. Los tipos de clulas anfitrionas son:

Clulas bacterianas: son las ms utilizadas, ya que tienen una alta velocidad de replicacin, un bajo coste de mantenimiento de las colonias y son fcilmente manipulables. Clulas eucariotas: aunque las clulas eucariotas son, en general, difciles de mantener se usan levaduras y clulas tumorales: o Levaduras: se utilizan en procesos relacionados con la investigacin de la expresin y la regulacin gnica y la sntesis de protenas eucariotas. o Clulas tumorales: apropiadas en procesos de clonacin, ya que la velocidad de replicacin es muy alta y se mantienen los caracteres sin producirse cambios, pues son muy estables.

Los mtodos para la introduccin del ADN recombinante facilitan la entrada de grandes fragmentos de ADN, puesto que la membrana celular es selectiva y no permitira la penetracin de grandes molculas.

Si deseas aprender ms sobre los mtodos utilizados para la introduccin del ADN recombinate, pulsa sobre el siguiente enlace de ampliacin. Ampliacin sobre los mtodos de introduccin de ADN recombinante Cuando hayas estudiado la pgina de ampliacin de contenidos puedes repasar con ayuda de la actividad 4!

Actividad 4

5. Propagacin del cultivo

Se induce la divisin de clulas anfitrionas, de forma que se producen tambin copias de ADN recombinante y, por ello, la clonacin. Primero se efecta una siembra en placas Petri con agar como medio de cultivo. Se dejan crecer las colonias. Cada una de ellas ser seleccionada y transferida a distintos medios lquidos, donde seguir aumentando el nmero de individuos de la colonia.

6. Deteccin y seleccin de los clones recombinantes

En los procesos de clonacin se utiliza un gran nmero de clulas. Al final del proceso se hace necesario separar las clulas que contienen ADN recombinante de las que no lo contienen. La deteccin y la seleccin de colonias se realiza en los medios de cultivo. En los procesos de clonacin se obtienen clulas anfitrionas que no han incluido el vector, clulas recombinantes, es decir, que han incluido el vector con el ADN para recombinar, y clulas anfitrionas con vector que no lleva el ADN inserto. Los mtodos para detectar y seleccionar son:

Mtodo de hibridacin: se utiliza una sonda marcada que hibrida con el ADN recombinante o con el ARN mensajero que se transcribe a partir de l. Mtodo inmunolgico: se detecta la protena codificada en el ADN recombinante mediante anticuerpos especficos. Mtodos genticos: que, a su vez, pueden ser: o Insercin del vector y el ADN recombinante en un gen de la clula anfitriona que queda desactivado. Por ejemplo, si la colonia no produce enzima lactasa, es que el ADN recombinante se encuentra dentro del ADN bacteriano en ese gen. o Vector con genes de resistencia a un antibitico: en el medio se agrega el antibitico y slo crecer aquella colonia que sea resistente a l, por tanto, que porte el ADN. o Colonias con defectos nutricionales: se utilizan clulas anfitrionas mutantes que no puedan sintetizar, por ejemplo, un aminocido. Para que la colonia sobreviva, el aminocido debe ser aadido al medio de cultivo. Empleando un vector que lleve el gen correcto para la sntesis de dicho aminocido, haciendo crecer las colonias celulares en medios carentes de l slo crecern las bacterias que lleven el ADN inserto.

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