Elementos Requeridos para Un Diagnóstico de Laboratorio - Engormix

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Elementos requeridos para un diagnstico de Laboratorio

Publicado el: 21/06/2010 Autor/es: MVZ MC Juan Carlos Valladares de la Cruz, Asesora Avcola Independiente. Nuevo Len, Mxico Imprimir (11966) (8)
Diagnstico de laboratorio y su importancia en campo: Dra. Maria Luisa Morales De: Mara Luisa Sandro Morales
El Lab oratorio de Diagnstico es un recurso esencial para el manejo adecuado de una empresa avcola, ya que proporciona una gran cantidad de informacin que puede incrementar de manera significativa la eficiencia productiva de la empresa. Los mtodos de diagnstico disponib les en la actualidad pueden detectar lesiones microscpicas, cantidades mnimas de anticuerpos, toxinas, residuos qumicos, microorganismos, antgenos o cidos nucleicos las aves, insumos o en el medio amb iente, lo que permite controlar de manera eficiente la sanidad y la productividad de las aves y la calidad e inocuidad de los productos avcolas. El ob jetivo de esta presentacin es analizar las tcnicas y los criterios de interpretacin de los resultados de lab oratorio para el diagnstico de las enfermedades de las aves de produccin comercial. INTRODUCCION: El incremento en la tecnificacin de la industria avcola moderna ha modificado los sistemas de produccin, manejo y alimentacin de las aves destinadas a la produccin comercial, para hacer a sta industria ms eficiente y competitiva. La modernizacin se ha debido a la integracin de grandes compaas de produccin y a la globalizacin de la economa y la comercializacin de los productos agropecuarios. Factores inherentes a temas como la seguridad alimentaria, la proteccin al medio ambiente, el cuidado del bienestar animal y las restricciones en el uso de antibiticos en la alimentacin animal han modificado las caractersticas de los sistemas de Produccin. La industria avcola ha generado la necesidad de una metodologa de diagnstico precisa, confiable, rpida, oportuna e integral. Un Diagnstico Integral es un procedimiento mediante el cual se analizan todos los factores involucrados en la presentacin de una o varias enfermedades, incluyendo: 1) factores inherentes a las aves afectadas como edad, sexo, funcin zootcnica, estado de produccin, signos lesiones, respuesta a las terapias; 2) posibles agentes involucrados como agentes infecciosos, toxinas, antimetabolitos, deficiencias o imbalances nutricionales, factores genticos o hereditarios y 3) las condiciones medioambientales en las que se presenta el cuadro, incluyendo a la regin o zona donde se encuentra la explotacin, la situacin epidemiolgica de la misma con respecto a las enfermedades de las aves, los antecedentes sanitarios de la explotacin, el clima, la estacin del ao, las condiciones de produccin como humedad, temperatura, ventilacin interna de las casetas, el manejo de las aves, los sistemas de bioseguridad y control de enfermedades en la granja, los programas de vacunacin, las terapias de prevencin y/o tratamiento de las aves, los programas de nutricin y alimentacin, as como los parmetros productivos de la explotacin (Figura 1)
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Figura 1.- Factores a considerar para la obtencin de un Diagnstico Integral en aves de produccin comercial.
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Los sistemas de diagnstico en aves comerciales estn enfocados a la deteccin de las enfermedades que afectan la salud y la productividad de las aves, a la deteccin de los padecimientos que afectan la calidad de los productos avcolas y a la deteccin de los agentes que afectan a la salud de los consumidores. La interpretacin correcta de un resultado de laboratorio permite evaluar de manera oportuna las medidas de bioseguridad, manejo, nutricin y sanidad utilizadas. Por medio del laboratorio se puede determinar el estado de salud de una parvada, detectar problemas sanitarios subclnicos e inaparentes, evaluar la eficacia de los programas de inmunizacin, cuantificar el grado de microbismo ambiental y evaluar la calidad de los insumos y de los productos obtenidos.
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1.- RECOMENDACIONES PARA EL USO DEL LABORATORIO DE DIAGNOSTICO Para que los resultados de los estudios de laboratorio sean tiles, los anlisis deben estar incluidos dentro de un programa de trabajo constante y permanente como parte del sistema de produccin. El uso constante del laboratorio permite crear un historial de pruebas y resultados cuya interpretacin es ms fcil y adecuada; la interpretacin de un solo grupo de resultados es difcil y puede conducir a conclusiones errneas. En ocasiones los cambios en el comportamiento de las parvadas tras un cambio de manejo, del calendario de vacunacin o de un tratamiento se establecen en forma gradual y progresiva y no de manera drstica e inmediata y esto slo podr ser detectado en el laboratorio mediante estudios seriados.
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CARACTERISTICAS DE UN LABORATORIO DE PRUEBAS. Un laboratorio de pruebas debe contar con instalaciones adecuadas que permitan el establecimiento de medidas de contencin y bioseguridad que eviten la contaminacin entre el medio ambiente y el laboratorio, para evitar que este se contamine del exterior o bien que se vuelva un foco de contaminacin al medio ambiente; las instalaciones deben garantizar la seguridad del personal y debe prevenir la contaminacin cruzada entre las muestras. El Laboratorio debe de contar con una plantilla de personal capacitado, constante y suficiente para la realizacin de las pruebas y para minimizar las variaciones atribuibles a la realizacin del procedimiento. El laboratorio debe de contar con equipos e instrumentos de medicin confiable y suficiente, que este sujeto a un programa permanente de mantenimiento y calibracin, con patrones de medicin adecuados para garantizar la trazabilidad de las mediciones. El Laboratorio debe tener definida su poltica de Calidad y todas sus polticas y procedimientos deben estar documentadas en un Manual de Calidad, un Manual de Procedimientos Tcnicos y un Manual de Aseguramiento de Calidad y debe poseer toda la evidencia documental que sustente que el sistema de calidad se est llevando adecuadamente. En Mxico los laboratorios de diagnstico en materia zoosanitaria deben contar con una autorizacin oficial para su funcionamiento de acuerdo a la NOM-003-ZOO1994: Criterios para la operacin de laboratorio de pruebas aprobado en materia zoosanitaria. Es preferible usar el mismo laboratorio y que se usen las mismas tcnicas, los mismos reactivos y personal constante para minimizar los errores atribuidos a los procedimientos utilizados. CARACTERISTICAS DE LAS PRUEBAS DE LABORATORIO Las tcnicas usadas en un Laboratorio de Diagnstico de Enfermedades de las Aves deben estar estandarizadas, cientficamente validadas y universalmente aceptadas, considerando su sensibilidad, especificidad, repetitividad y reproducibilidad. La Validacin de una Prueba es un proceso que sirve para determinar si la prueba es adecuada para un uso particular. Un anlisis validado genera, de manera consistente, resultados que identifican a animales como positivos o negativos a la presencia de un analito o de un proceso particular (ej. presencia de anticuerpos o induracin de la piel), y por inferencia, la prueba predice adecuadamente el estado de infeccin de un animal, con un grado predeterminado de certeza estadstica. El proceso de validacin de un anlisis debe ser continuo durante el perodo en el que la prueba se utiliza y puede requerir ajustes en las condiciones de realizacin conforme la prueba se va utilizando de manera masiva. Es importante hacer notar que existen muchas pruebas de laboratorio tradicionales que son usadas ampliamente y que nunca han sido sujetas a un proceso completo de validacin. Las variables que pueden afectar el resultado de una prueba de laboratorio pueden ser atribuidas a: 1) caractersticas de la muestra (la cual es producto de la interaccin agente-hospedador), 2) caractersticas del ensayo (factores fsicos, qumicos, biolgicos y/o tcnicos de la prueba) y 3) caractersticas del resultado de la prueba para predecir con exactitud el estado del hospedador con respecto al analito evaluado. La sensibilidad diagnstica de una prueba es la capacidad que tiene sta para detectar los casos positivos an a un nivel mnimo; una prueba altamente sensible no deber dar resultados falsos negativos (resultados negativos a partir de muestras positivas). La especificidad diagnstica de la prueba es la capacidad que tiene sta para detectar los casos negativos y distinguirlos de los positivos; una prueba altamente especfica no debe dar resultados falsos positivos (resultados positivos a partir de muestras negativas). La sensibilidad y especificidad de cada tcnica no necesariamente estn correlacionadas entre s, existen pruebas muy sensibles y poco especficas muy especficas y poco sensibles. La repetitividad de la prueba se refiere a su capacidad de dar resultados similares en las mismas muestras; mientras que la reproducibilidad se refiere a la capacidad de la prueba de dar resultados similares en diferentes laboratorios. Generalmente las tcnicas de laboratorio deben tener ndices de repetitividad y reproducibilidad mayores al 95% bajo condiciones similares de realizacin. La prevalencia de la enfermedad es el otro factor que afecta la precisin de un resultado de laboratorio, la validacin de una prueba diagnstica se aplica a una poblacin donde se ha conocido la prevalencia de la enfermedad. Las pruebas de Laboratorio adems deben ser prcticas, accesibles y no ser demasiado costosas; las ventajas que se obtienen con su uso deben ser superiores al costo de los anlisis. Los resultados de las pruebas deben ser relevantes y de preferencia deben ser cuantificables para poder ser analizados de forma comparativa. Una consideracin importante se refiere al usuario del Laboratorio de Diagnstico; El Mdico Veterinario, propietario y/o, administrador debe estar convencido de la importancia y la utilidad del uso de las pruebas de Laboratorio. El usuario del Laboratorio debe estar consciente de que los resultados de las pruebas tienen
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que ser interpretados racionalmente.
2.- PROCEDIMIENTOS DE MUESTREO En el caso de las aves de produccin comercial, debido a la gran cantidad de animales que son explotados de manera simultnea en espacios relativamente pequeos, los procedimientos de anlisis de la informacin tienen ciertas particularidades. La medicina que se practica se clasifica como Medicina de Poblaciones, usualmente se muestrea una proporcin muy reducida de la poblacin total a estudiar y los resultados obtenidos en esa pequea proporcin de muestras se infiere que son vlidos para toda la poblacin, por lo tanto la representatividad de las muestras se convierte en un factor esencial para la confiabilidad de los resultados. El primer factor que determina la validez de un resultado de Laboratorio es la representatividad de las muestras seleccionadas. Los resultados obtenidos con las pruebas de Laboratorio nicamente representan las caractersticas de las muestras sometidas a su anlisis. Estos resultados pueden o no representar el estado general de una parvada o de un lote de ingredientes o alimentos, dependiendo de la precisin con la que las muestras fueron seleccionadas. En ocasiones se tiene la impresin que la variacin en los resultados depende de la variacin analtica de las pruebas o de errores en su realizacin por parte del Laboratorio y esto puede no ser correcto. La variabilidad analtica (variabilidad de la prueba) no es la principal fuente de error en un resultado de Laboratorio; la variabilidad ms importante en los resultados de Laboratorio se debe a errores en las tcnicas de muestreo. Los tipos de muestreo utilizados con mayor frecuencia en la Industria Avcola son el Muestreo Confirmatorio y el Muestreo Exploratorio. 1. Muestreo Confirmatorio: es el muestreo que se realiza para confirmar y/o descartar un Diagnstico Clnico. Cuando las aves son muestreadas para confirmar un diagnstico clnico, es usual obtener las muestras de un "porcentaje representativo del problema" seleccionando aves con el cuadro clnico desarrollado; Los resultados obtenidos sern vlidos para las aves seleccionadas en ese momento en particular y la validez de los resultados depende de la representatividad de los animales muestreados. En el caso de las aves es necesario conocer a profundidad la historia natural de la enfermedad que se desea detectar, incluyendo los ndices de morbilidad y mortalidad, as como el curso y la duracin del proceso, para determinar el momento ms adecuado para realizar la toma de las muestras, por ejemplo, en el caso de las enfermedades infecciosas, el aislamiento del agente causal es ms probable en los estados iniciales de la enfermedad, mientras que la demostracin de la respuesta serolgica hacia dicho agente requerir de un muestreo en los estados avanzados de la misma o en perodo de convalecencia, es muy frecuente que se requieran por lo menos dos muestreos serolgicos consecutivos con un intervalos de 10 a 15 das para demostrar la seroconversin o el incremento en los ttulos de anticuerpos contra un agente en particular. Este tipo de muestreo puede ser aplicable a muestras de diverso origen, como los insumos e ingredientes usados en la fabricacin de los alimentos o bien para determinar la calidad y la inocuidad de los productos avcolas, como carne, huevo o subproductos. 2.-Muestreo Exploratorio: es el muestreo que se realiza sin que existan evidencias detectables de la presencia de un problema en particular. El objetivo de dicho muestreo es la deteccin de problemas antes de que estos se manifiesten, y usualmente son utilizados para conocer de manera permanente el estado sanitario de las aves, alimentos, ingredientes, insumos o productos y subproductos. Debido a que no existen indicios que orienten la seleccin de las muestras, el muestreo exploratorio es un proceso complicado. La literatura cientfica menciona que para garantizar la representatividad de las muestras colectadas, la seleccin de estas debe ser completamente al azar. El tamao y nmero de muestras colectadas dependen del tipo de muestras y de los exmenes de laboratorio que se desean realizar. En el caso de las enfermedades infecciosas, el nmero de muestras requeridas depende de la prevalencia esperada de la enfermedad en cuestin en una zona determinada. En el caso de los ingredientes y de los alimentos, el tamao y el nmero de muestras depende del volumen total del material para muestrear. En el caso de la industria avcola, es comn utilizar este tipo de Muestreos Exploratorios, para realizar exmenes de laboratorio rutinarios y preestablecidos, estos exmenes se conocen como "Monitoreos" (del ingls: "monitoring": revisin, inspeccin) y tienen como objetivo principal evaluar de manera permanente el estado de salud general de la parvada. Su uso continuo incrementa la posibilidad de la deteccin temprana de un problema, con lo que se pueden establecer medidas correctivas rpidamente. Estos estudios se pueden realizar a partir de muestras de aves vivas seleccionadas especficamente para tal fin, de la mortalidad, del alimento, los insumos del equipo y de las instalaciones en general (Figura 2).
Figura 2.- Ejemplos de diferentes procedimientos de muestreo Para la evaluacin de un programa de Sanidad Avcola no es necesario hacer un monitoreo extensivo a un gran nmero de animales, pero s es muy importante que las aves a analizar sean representativas del
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estado general de la parvada. La metodologa del muestreo debe ser constante. La seleccin de las aves a muestrear debe ser completamente aleatoria, para garantizar la representatividad del estado general de la parvada. Generalmente un nmero de entre 10 y 20 aves de las mismas caractersticas son suficientes para obtener resultados confiables. Entre mayor sea el nmero de muestras la representatividad ser mayor pero los costos de la evaluacin se incrementan proporcionalmente. Existen Monitoreos serolgicos, microbiolgicos, parasitolgicos, patolgicos qumicos, con objetivos muy particulares en cada caso. Existen tambin "Monitoreos Integrales" que evalan en cada muestreo una serie de parmetros en varias pruebas. Los Monitoreos serolgicos y microbiolgicos has sido esenciales para el funcionamiento de las campaas Oficiales para el Control y la Erradicacin de la Influenza Aviar, la Enfermedad de Newcastle y la Salmonelosis Aviar en nuestro pas. Los Monitoreos de Laboratorio para evaluar los programas de Sanidad Avcola pueden variar en el tipo y nmero de muestras colectadas, as como en los tipos de pruebas que se realicen en cada caso, son adaptables a las necesidades particulares de cada empresa. Una consideracin importante en los programas de Monitoreo de Laboratorio es la frecuencia del procedimiento. No existen reglas que determinen cual es la periodicidad del muestreo que puedan aplicarse en todos los casos. Cada empresa debe establecer un criterio propio de acuerdo a sus necesidades y posibilidades. Sin embargo, se debe recorda r que la eficacia del procedimiento depende de su ejecucin y evaluacin constantes. En el caso de los Monitoreos Integrales de aves vivas, un criterio importante es establecer la edad de las aves a muestrear, ya que los resultados obtenidos y su interpretacin varan dependiendo de la edad y de la funcin zootcnica de aves analizadas.
3.-SELECCIN, CONSERVACIN Y ENVIO DE LAS MUESTRAS PARA ESTUDIOS DE LABORATORIO El segundo factor que determina la validez de un resultado de Laboratorio es el procedimiento para la conservacin de las muestras que sern sometidas a anlisis. Los mtodos de conservacin tienen como objetivo preservar las caractersticas fsicas, qumicas y microbiolgicas originales de las muestras, por lo menos durante el perodo comprendido entre su seleccin y su recepcin en el Laboratorio. En algunos casos estos mtodos tambin permiten la preparacin de las muestras para su procesamiento en el Laboratorio. Los mtodos de conservacin dependen del tipo de anlisis que se va a realizar y del tipo de muestra enviada; el perodo en el que las muestras conservan sus caractersticas originales tambin depende del tipo de mtodo utilizado, sin embargo, es recomendable que las muestras sean trasladadas al Laboratorio lo ms rpido posible despus de ser colectadas, preferentemente en plazo no mayor de 24 horas. Cuando se envan aves vivas para su anlisis de Laboratorio, stas deben de enviarse en contenedores adecuados para su transporte, que garanticen un trato humanitario, que no comprometan su viabilidad, que no causen lesiones y que no induzcan perodos innecesarios de tensin durante el transporte. Es importante no mezclar aves que se van a enviar a estudios diferentes, por ejemplo casos clnicos y monitoreos rutinarios, ya que se corre el riesgo de contaminacin cruzada durante el transporte. Tambin es importante enviar a las aves directamente de la granja al Laboratorio, cumpliendo con las medidas de bioseguridad que eviten que las aves transportadas representen un riesgo de contaminacin para otras aves. El envo de aves vivas al Laboratorio permite colectar muestras para diversos estudios bajo condiciones controladas y reduce la probabilidad de que dichas muestras se alteren antes de su procesamiento, sin embargo, puede ser complicado sobre todo cuando la distancia entre la granja y el Laboratorio es muy grande; El transporte de aves vivas para estudios de Laboratorio debe tambin respetar los lineamientos vigentes descritos en las Campaas para el Control y la Erradicacin de la Influenza Aviar, la Enfermedad de Newcastle presentacin Velognica y Salmonelosis Aviar. En ocasiones, debido al nmero de muestras, a la distancia entre la granja y el Laboratorio y al tipo de muestras remitidas, es ms prctico colectar las muestras en la granja y enviarlas al Laboratorio, lo cual requiere ciertas consideraciones. Uno de los errores principales es la identificacin de las muestras. El mtodo de identificacin debe ser permanente aun bajo los efectos del sistema de conservacin. Las muestras para estudios de Histopatologa deben conservarse en una solucin de formalina al 10% amortiguada, pH 7.0-7.5, con una relacin 1:10 muestra formalina. Las muestras para estudios de Serologa deben de conservarse en refrigeracin del suero, es importante no refrigerar ni congelar las muestra con cogulos sanguneos ya que se corre el riesgo de que el cogulo sufra hemlisis que interfiere con la realizacin de las pruebas. Las muestras para estudios de Microbiologa y de Biologa Molecular deben conservarse en refrigeracin en congelacin, evitando su contaminacin externa; en el caso de las muestras de hisopos, estos deben conservarse sumergidos en medio de transporte especfico para el anlisis que se desea realizar (medios selectivos, adicionados con antibiticos, etc.). Las muestras para estudios de Parasitologa deben conservarse en refrigeracin para evitar la fermentacin de la muestra; el uso de dicromato de potasio K2Cr2O7 est siendo cuestionado debido a la toxicidad de la solucin. Las muestras para estudios de Toxicologa pueden variar en su conservacin, dependiendo del estudio que se desea realizar, sin embargo, en estos casos es muy importante que los recipientes contenedores de las muestras tengan cierre hermtico para evitar contaminacin externa (Figura 3)...
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Figura 3.- Procedimientos recomendables para la conservacin y el envo de muestras para anlisis de laboratorio.
4.- TIPOS DE ANALISIS DE LABORATORIO E INTERPRETACION DE RESULTADOS Los tipos de pruebas usadas rutinariamente en un Laboratorio de Patologa Aviar son: 1.- Pruebas de Patologa: Las pruebas de patologa tienen como objetivo identificar y cuantificar las lesiones morfolgicas de los tejidos, especificando los tipos de lesiones, su distribucin, curso y grado de severidad; las pruebas ms utilizadas son las necropsias y la histopatologa. Las necropsias pueden ser realizadas tanto en el campo como en el laboratorio, pueden realizarse de aves especficamente seleccionadas y sacrificadas para tal fin o bien utilizar las aves de la mortalidad. En las necropsias se pueden identificar las lesiones macroscpicas en general y tambin se utilizan con fines ms especficos como para evaluar lesiones en distintos rganos, tal es el caso de la tcnica de J. Johnson y W. Red para evaluar las lesiones producidas por coccidias la tcnica de Rountree que sirve para la evaluacin del desarrollo del sistema inmunolgico. El resultado de la necropsia se emite como un "Diagnstico Morfolgico Post Mortem" donde las lesiones observadas son ordenadas de acuerdo a su importancia; el resultado es sugestivo de un padecimiento, aunque rara vez es concluyente a cerca de la causa de enfermedad (Figura 4). Cuando la necropsia se realiza inmediatamente despus del sacrificio las aves no presentan cambios post mortem, cuando se realiza en aves procedentes de la mortalidad natural es comn que los cadveres presenten cambios post mortem avanzados que impidan una observacin adecuada de las lesiones.
Figura 4.- Procedimiento para la realizacin de una necropsia. La histopatologa tiene como objetivo identificar y describir las lesiones microscpicas de los tejidos. Los errores ms comunes en la conservacin de las muestras incluyen: exceso en el volumen de las muestras y / o falta de volumen del fijador, derramamiento del fijador por falta de cierre hermtico en el recipiente, falta de penetracin del fijador por muestras excesivamente gruesas y refrigeracin o congelacin de la muestras, antes de fijarse o durante el proceso de fijacin. El congelamiento de las muestras cristaliza el agua intracelular causando ruptura de las membranas celulares y destruccin de los tejidos. El estudio histopatolgico usualmente ayuda a orientar el diagnstico, la interpretacin puede ser descriptiva, identificando las lesiones microscpicas de los tejidos. El resultado puede ser concluyente en algunos casos, por ejemplo, en las enfermedades neoplsicas es esencial para determinar el tipo de tumor (Enfermedad de Marek, Leucosis Linfoide, Leucosis Mieloide y Reticuloendoteliosis); en algunas enfermedades virales la presencia de cuerpos de inclusin es patognomnica, como en los casos de Viruela Aviar, Laringotraquetis Infecciosa, Hepatitis con Cuerpos de Inclusin y Sndrome de Baja de Postura; en otros casos se puede observar el agente en las lesiones, como en la coccidiosis o en la aspergilosis (Figura 5). .Finalmente en algunas ocasiones la histopatologa sirve para cuantificar el grado de dao que las aves estn teniendo en algunas enfermedades como en las micotoxicosis y en la Infeccin de la bolsa de Fabricio, donde incluso se puede determinar s las aves estn o no protegidas contra los desafos de campo; en este caso se han desarrollado varios sistemas para cuantificar el grado de lesin bursal como un sistema indicador de proteccin.
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Figura 5.- Lesiones microscpicas con valor diagnstico concluyente. 2.- Pruebas de Serologa: las pruebas de serologa sirven para detectar la inmunidad humoral contra diferentes antgenos; las pruebas usualmente detectan anticuerpos sricos (de ah su nombre de Serologa) pero eventualmente pueden ser utilizadas para detectar anticuerpos en yema o en cualquier lquido corporal. Una prueba positiva indica que el ave posee anticuerpos contra el antgeno evaluado, lo que puede tener significados diversos. Las pruebas de serologa pueden ser cuantitativas o cualitativas. En las pruebas cualitativas, como la aglutinacin en placa y la inmunodifusin en gel de agar, el resultado se expresa como positivo negativo, suelen ser poco sensibles y el suero no se diluye para ser procesado. Las pruebas cuantitativas permiten detectar la cantidad de anticuerpos que hay en la muestra, en este caso los sueros se diluyen en diluciones dobles seriadas y el resultado usualmente se expresan como el "ttulo de la muestra", que indica la dilucin mayor en la que se observa una reaccin positiva, el titulo es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpos que hay en la muestra, tal es el caso de la inhibicin de la hemaglutinacin, la micro aglutinacin y la virus suero neutralizacin; el resultado se expresa como la dilucin, ej. 1:256 o su inverso ej. 256, tambin se pueden expresar en Logaritmo base 2 ej. 1:256 = Log 2 8. En otros casos, como en las pruebas de ELISA, el suero slo es diluido una vez antes de ser procesado y el titulo del mismo es calculado matemticamente haciendo una comparacin con los ttulos de los controles positivos y negativos de la prueba. Las pruebas ms comunes en avicultura son la aglutinacin en placa para Mycoplasma y Salmonella; la micro aglutinacin para S pullorum, inmunodifusin en gel de agar para Adenovirus, Encefalomielitis, Infeccin de la bolsa de Fabricio, Reovirus e Influenza Aviar; inhibicin de la hemaglutinacin para Enfermedad de Newcastle, Influenza Aviar, Sndrome de Baja de Postura, Mycoplasma, Bronquitis Infecciosa y Coriza Infecciosa; virus suero neutralizacin para Infeccin de la bolsa de Fabricio, Adenovirus Aviar, Enfermedad de Newcastle, Reovirus, y otros agentes y finalmente la tcnica de ELISA (ensayo inmunoenzimtico) que actualmente es de las ms utilizadas debido a su alta sensibilidad, facilidad de realizacin, disponibilidad de reactivos estandarizados, rapidez de los resultados y a que fcilmente se adapta a un sistema computarizado para hacer la evaluacin estadstica de los resultados, existen estuches comerciales para un gran nmero de enfermedades aviares como Enfermedad de Newcastle, Infeccin de la bolsa de Fabricio, Bronquitis Infecciosa, Reovirus, Mycoplasma gallisepticum, Mycolasma synoviae, Pasteurella multocida, Salmonella enteritidis, Encefalomielitis Aviar, Influenza Aviar, Pneumovirus Aviar, Leucosis Linfoide tipos A-B y J, Laringotraquetis Infecciosa, Anemia Infecciosa Aviar, etc. En las pruebas de ELISA el suero se diluye una sola vez, y se utiliza un antisuero marcado con una enzima, el resultado se basa en una reaccin colorimtrica que es medida con un espectrofotmetro, cuya intensidad es proporcional a la cantidad de anticuerpos de la muestra, los resultados son adems clasificados en "grupos o perfiles" en un histograma, que puede ser 3, 14 o 18 perfiles dependiendo del estuche comercial y del tipo de antgeno evaluado; la expresin grfica de los resultados facilita en gran medida su interpretacin. Generalmente en las pruebas de serologa se evala un grupo de muestras, usualmente un mnimo de 10 para que la evaluacin sea confiable y los resultados obtenidos son individuales de cada muestra. En los resultados se expresa el ttulo de cada suero; para una interpretacin adecuada de los resultados es necesario conocer el ttulo de cada suero y el promedio del grupo, generalmente expresado como media geomtrica, lo que indica el comportamiento general del grupo. En la interpretacin de los resultados tambin es necesario considerar la uniformidad de los resultados, por lo que se hace, sobre todo en las pruebas de ELISA, con un anlisis estadstico de los resultados, mostrando la media aritmtica, la media geomtrica, la desviacin estndar y el coeficiente de variacin. Los valores de las medias indican la cantidad de anticuerpos, los valores de la desviacin estndar y del coeficiente de variacin indican la uniformidad de los resultados. En general se piensa que ttulos altos con variaciones pequeas indican una proteccin adecuada y que ttulos bajos y desviaciones altas indican falta de proteccin o exposicin de campo, sin embargo en este tema las generalizaciones son difciles de establecer. La interpretacin variar dependiendo del tipo de antgeno, del tipo y edad de las aves analizadas y del calendario de vacunacin que se est utilizando. En aves recin nacidas la presencia de anticuerpos es un reflejo de los anticuerpos maternos, esto puede indicar proteccin (Infeccin de la bolsa de Fabricio, Enfermedad de Newcastle) o infeccin materna y muy probablemente infeccin de la progenie (Mycoplasma, Salmonella). En aves mayores a dos semanas la presencia de anticuerpos contra antgenos no incluidos en el programa de inmunizacin indica exposicin de campo a dicho agente y casi seguramente infeccin (Pneumovirus Aviar, Influenza Aviar, Anemia Infecciosa Aviar, Micoplasmosis, etc.); en el caso de las enfermedades donde existe un programa de vacunacin la interpretacin de los resultados de serologa es ms complicada, ya que se debe diferenciar el efecto de la vacunacin del efecto de las exposiciones de campo; las vacunaciones deben generar un ttulo de
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anticuerpos homogneo y moderado; s el promedio es muy alto y la variacin entre las muestras es excesiva los resultados sugieren proteccin inadecuada y exposicin de campo no controlada. Actualmente se han desarrollados algunos sistemas conocidos como "DIVA" que sirven para diferenciar los anticuerpos de aves vacunadas y aves infectadas. Se debe ser muy cuidadoso al evaluar el coeficiente de variacin, ya que por efectos matemticos, los ttulos muy bajos y con valores negativos en algunos de ellos resultan en coeficientes de variacin muy elevados (hasta mayores del 100%) mientras que ttulos promedio muy elevados pueden resultar con coeficientes de variacin bajos (menores al 50% an con gran variacin entre las muestras), la graficacin de los resultados de ELISA en forma de histogramas facilita en gran medida la valoracin de las variaciones entre las muestras. En algunos estuches comerciales para Anemia Infecciosa Aviar y Salmonella enteritidis se utiliza una tcnica de ELISA llamada "de competencia" o "por bloqueo" donde la cantidad de anticuerpos es inversamente proporcional a la intensidad de la reaccin colorimtrica y los valores altos indican ausencia de anticuerpos, mientras que las lecturas bajas indican la presencia de los mismos. En las pruebas de virus suero neutralizacin la evaluacin lleva implcita la capacidad del anticuerpo para neutralizar el efecto del antgeno homlogo, desafortunadamente estas pruebas son ms lentas, costosas y no permiten evaluar un gran nmero de muestras de manera simultnea. Sin embargo ninguna de las pruebas de serologa por s mismas indica grado de proteccin, todas indican el nivel de anticuerpos especficos contra un antgeno en particular, este nivel de anticuerpos debe ser racionalmente interpretado para poder decir si indica proteccin, exposicin de campo o infeccin activa. La evaluacin rutinaria y peridica del ttulo de anticuerpos deber correlacionarse con los calendarios de vacunacin, el comportamiento clnico y el desempeo productivo de la parvada para establecer los parmetros esperados de acuerdo a la edad y a la funcin zootcnica de las aves para establecer los niveles considerados "normales" e interpretar adecuadamente las variaciones de la "normalidad" como inmunidad insuficiente, exposicin de campo no controlada o enfermedad clnica aparente. Las llamadas "lneas de base" indican el nivel normal esperado de anticuerpos en una parvada a una edad determinada, permiten identificar con facilidad los cambios en el nivel de anticuerpos debidos a cambios en las vacunaciones o a exposiciones de campo y se pueden correlacionar con los objetivos de rendimiento productivo, para establecer estas lneas de base se sugiere muestrear semanalmente un mnimo de 10 parvadas. En el caso de las pruebas de serologa, es frecuente que se requiera de un muestreo seriado de la parvada para detectar seroconversin o bien, un incremento en el ttulo de anticuerpos de las aves, lo cual es muy sugestivo de una exposicin de campo hacia el agente evaluado (Figura 6).
Figura 6.- Incremento en el ttulo de anticuerpos contra Bronquitis Infecciosa, indicando exposicin de campo hacia el virus. 3.- Pruebas de Parasitologa: Las pruebas de parasitologa identifican el tipo y el nmero de parsitos existentes en las aves, ya sea externos y/o internos. Las tcnicas utilizadas en avicultura son flotacin, McMaster y observacin microscpica. Su aplicacin depende de la funcin zootcnica de las aves a analizar. Para la deteccin y cuantificacin de los endoparsitos ms frecuentes de las aves domsticas la muestra de eleccin es de heces. Las evacuaciones de las aves pueden consistir en heces fecales y heces cecales; las heces fecales son eliminadas junto con los desechos del tracto urinario. En el anlisis de las evacuaciones aviares es necesario conocer el tipo de evacuacin, sus caractersticas fsicas como color y consistencia, la cantidad de lquido de las excretas y la presencia de materiales extraos, como sangre o restos de alimento semi digerido o no digerido. El anlisis ms frecuente es para la deteccin de coccidias por la tcnica de McMaster. Si las muestras son remitidas al Laboratorio inmediatamente despus de su coleccin es recomendable enviarlas en condiciones de refrigeracin sin ningn otro conservador adicional. En el caso del pollo de engorda la parasitosis ms importante es la coccidiosis y en la mayora de las empresas se utiliza un programa continuo de control de la enfermedad, basndose en el uso de medicamentos preventivos y/o vacunas. La prueba ms usada es la de McMaster y debe incluir adems la diferenciacin de las especies de Eimeria involucradas, las que se identifican con criterios morfolgicos convencionales (Figura 7). La prueba detecta al parsito es su fase de oocisto y puede realizarse a partir de heces, contenido cecal o cama. Las muestras de heces reflejan la cantidad de coccidias que los pollos estn eliminando en ese momento, se requiere de una tcnica de muestreo constante en un programa permanente; se prefiere usar muestras de heces frescas colectadas a todo lo largo de la caseta y las muestras suelen trabajarse por caseta; es importante no mezclar nuestras de aves de diferentes edades ya que la eliminacin de oocistos puede variar enormemente de una semana a otra; un control intensivo requiere de un muestreo semanal por lo menos desde la 2 o 3 semana de edad. Los resultados se emiten como el nmero de oocistos por gramo de muestra (o/gh), especificando adems el porcentaje de cada especie. Bajo un programa de uso continuo de anticoccidianos en el alimento, un conteo de 0 a 5,000 o/gh se considera normal, un conteo entre 6,000 y 70,000 o/gh no indica riesgo de brote s el conteo de la semana anterior no tiene marcadas variaciones con relacin al presente; los conteos cercanos a 100,000 o/gh indican riesgo inminente de brote clnico, las heces pueden estar acuosas u manchadas con sangre y el grado de pigmentacin se ver afectado en un 5-10%; los conteos superiores a 100,000 indican brote de la enfermedad. Hay que tomar en cuenta algunas consideraciones en la interpretacin de estos resultados. E acervulina se es la coccidia de replicacin ms abundante y los conteos generalmente son ms altos que los de E tenella, por otro lado E mxima es de replicacin escasa y puede generar problemas con conteos superiores a 10,000; la eliminacin masiva de oocistos ocurre entre 4 y 7 das despus de que se desarrollaron las lesiones intestinales ms severas; los conteos en cama no reflejan la cantidad de oocistos
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eliminados en un momento determinado, generalmente los oocistos estn esporulados y la diferenciacin de especies es ms difcil y una cantidad excesiva de amoniaco en la cama puede destruirlos. El contenido cecal es una muestra adecuada pero refleja slo lo que est ocurriendo en el ave muestreada. En el caso de las reproductoras, el uso de las vacunas es comn y el alimento no contiene coccidiostatos, es importante analizar la eliminacin de oocistos una y dos semanas despus de la vacunacin; en aves mayores de 12 semanas los problemas ms frecuentes se asocian a E necatrix. En aves de vida prolongada, como reproductoras y gallinas de postura, es posible encontrar infestacin por cestodos y nematodos cuyos huevos se pueden detectar en heces por la prueba de flotacin, aunque la evaluacin del grado de parasitosis es ms confiable si se observa la cantidad de parsitos adultos a la necropsia. Con los ectoparsitos la situacin es similar, estos se identifican morfolgicamente con el microscopio y el grado de infestacin puede interpretarse como leve, moderado o severo dependiendo del nmero de parsitos y de los signos que provoquen en las aves.
Figura 7: Ejemplo de una evaluacin semanal del programa de control de coccidiosis durante 12 aos por medio de la prueba de McMaster en heces 4.- Pruebas de Microbiologa: estas pruebas detectan bacterias, hongos o virus, ya sea por medio de su aislamiento, identificacin y tipificacin o bien por la demostracin de sus antgenos; usualmente se realizan a partir de tejidos de aves seleccionadas especficamente para tal fin, pero tambin se pueden hacer estudios a partir de alimento, agua, ingredientes, cama, instalaciones, equipo, etc. Los mtodos ms utilizados para la conservacin son la refrigeracin y la congelacin, particularmente en aquellas muestras que por su naturaleza posean una flora bacteriana normal, ya que el sobre crecimiento de dicha flora puede inhibir el crecimiento de los agentes patgenos. El aislamiento bacteriano o mictico requiere de muestras en refrigeracin mientras que para el aislamiento viral la congelacin es el mtodo ms recomendable; en este caso, el uso de sustancias crio protectoras, como la glicerina, puede prolongar la vida til de las muestras. Existen medios de cultivo especialmente diseados para la conservacin y el transporte de las muestras y en algunos casos tiene propiedades de inhibicin de microorganismos comensales y propiedades selectivas de proteccin para algunos microorganismos, particularmente bacterianos. El hecho de que algunas muestras de tejidos que se utilizan para el aislamiento microbiolgico pueden contener cantidades importantes de bacterias saprfitas, restos celulares, anticuerpos, enzimas, ndices extremos de pH o algunas otras sustancias que inhiben el crecimiento de algunos microorganismos patgenos, en ocasiones es ms prctico colectar la muestra mediante la utilizacin de un hisopo estril y luego conservar este en un medio de transporte adecuado. Por ejemplo, las muestras para aislamiento de Salmonella pueden ser adecuadamente conservadas en medios de transporte como agua peptonada o selectivos como el caldo tetrationato o el caldo selenito. Las muestras para aislamiento viral son conservadas adecuadamente en un medio protector como el caldo triptosa de fosfato adicionado de un amortiguador para evitar cambios bruscos de pH, la adicin de una mezcla de antibiticos de amplio espectro evita la contaminacin bacteriana de la muestra. Adems de la utilizacin de los medios de conservacin, las muestras deben ser transportadas en refrigeracin. El error ms comn en el envo de muestras para estudios microbiolgicos es la contaminacin bacteriana de las muestras, el origen de esta contaminacin est influenciado por la tcnica de muestreo y por la conservacin inadecuada de las muestras en cuanto a la temperatura en el transporte. El aislamiento de un microorganismo a partir de una muestra implica que este esta viable ("vivo") en dicha muestra (Figura 8). Sin embargo, la interpretacin de las pruebas de aislamiento microbiano deben ser interpretadas con cautela. El aislamiento de un microorganismo no implica necesariamente su papel como patgeno en un proceso de enfermedad, puede eventualmente tratarse de flora saprofita o un agente vacunal. El microorganismo aislado puede requerir de una tipificacin posterior, como una tipificacin antignica, la demostracin de factores de virulencia, etc. As mismo, la falta aislamiento del microorganismo no implica necesariamente que ste no sea la causa de la enfermedad, En bacteriologa se usan medios enriquecidos y selectivos artificiales, pruebas bioqumicas y en algunos casos identificacin por medio de antisueros. Los resultados se expresan como gnero y especie bacteriana aislada y en ocasiones su cantidad relativa (crecimiento abundante, moderado o escaso). La interpretacin de estos resultados depende del tipo de ave analizada, el tipo de bacteria aislada y el rgano o tejido donde se aisl la bacteria. En condiciones ideales todas las muestras deben ser negativas a Salmonella pullorum, Salmonella gallinarum y Salmonella enteritidis, en todos los tipos de aves (progenitoras, reproductoras, postura, engorda), en ingredientes, alimentos, agua, cama e instalaciones, particularmente de la planta incubadora y de la planta de procesamiento. Una caracterstica de calidad de las aves recin nacidas es la bacteriologa del saco vitelino y la micologa del pulmn, que deberan de ser estriles, ocasionalmente se aslan coliformes y cocos de saco vitelino as como Aspergillus y Penicillium de pulmn, lo que refleja la higiene de la planta incubadora y eventualmente la salud de las reproductoras. Salvo el tracto digestivo y la piel, el resto de los tejidos aviares en condiciones normales debe ser bacteriolgicamente estril, as que el aislamiento bacteriano a partir de cualquier rgano fuera del tracto digestivo es relevante, particularmente si la bacteria aislada es causa conocida de enfermedad, como en los casos de Escherichia coli, Salmonella sp, Avibacterium (Haemphilus) paragallinarum, Pasteurella multocida, Ornitobacterium rhinotracheale y
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Staphylococcus aureus. En aves mayores se recomiendan estudios bacteriolgicos del tracto respiratorio (trquea, pulmn, sacos areos) donde se pueden aislar Escherichia coli y organismos similares con relativa frecuencia y pueden representar los organismos complicantes de las enfermedades virales respiratorias aunque la literatura no los reconozca como patgenos primarios, como Gallibacterium anatis (Pasteurella haemolytica), Bordetella avium y algunos cocos gram positivos. En las plantas de procesamiento el inters principal es el aislamiento de bacterias potencialmente patgenas para el consumidor, como Escherichia coli, Salmonella sp, Campylobacter sp, Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus. Las pruebas de virologa ms frecuentemente usadas en avicultura utilizan el aislamiento en embrin de pollo, para virus como Influenza Aviar, Enfermedad de Newcastle, Bronquitis Infecciosa, Laringotraquetis Infecciosa y Viruela Aviar; la presencia de anticuerpos en embriones de parvadas que no son libres de patgenos especficos (LPE SPF por sus siglas en ingles) puede dificultar el aislamiento viral en embrin, particularmente en los casos de Adenovirus, Reovirus e Infeccin de la bolsa de Fabricio. Existe tambin el sistema de cultivos celulares primarios, lneas celulares establecidas o cultivo de rganos para cierto tipo de virus de crecimiento difcil. Las pruebas de aislamiento viral usualmente se realizan a partir de tejidos de aves seleccionadas para tal fin, pero tambin pueden realizarse a partir de hisopos traqueales o cloacales, alimento, equipo o instalaciones. El aislamiento viral de algn agente en parvadas que no se vacunaron contra dicho agente usualmente es de elevado valor diagnstico (salvo en el caso de algunos Reovirus, Enterovirus y Adenovirus no patgenos); en parvadas vacunadas en condiciones normales el virus vacunal desaparece en un perodo de 8 das, s el aislamiento es positivo despus de ste perodo es probable que el aislamiento sea den virus de campo y/o que la cepa vacunal no ha podido ser controlada por la parvada. Es necesario identificar y tipificar los aislamientos virales para conocer el serotipo y/o subtipo de virus aislado, generalmente este proceso se hace con pruebas de virus suero neutralizacin utilizando antisueros mono especficos monoclonales y posteriormente usando embriones de pollo o cultivos celulares; en el caso de los aislamientos del virus de la Enfermedad de Newcastle, por ejemplo, es necesaria la caracterizacin del aislamiento mediante las pruebas de tiempo de mortalidad embrionaria, ndice de patogenicidad intracerebral en pollos de un da e ndice de patogenicidad intravenosa en pollos de 6 semanas. En general, para la mayora de los virus aviares es difcil de determinar s el virus aislado tiene o no un origen vacunal. En la Figura 8 se presentan algunos ejemplos de los resultados de aislamiento de microorganismos.
Figura 8: Ejemplos de los resultados de aislamiento viral, aislamiento bacteriano y aislamiento micolgico. Es posible detectar la presencia de microorganismos sin que se lleve a cabo su aislamiento, demostrando sus antgenos en tejidos, improntas, lquidos corporales o macerados de rganos. La presencia de antgenos puede realizarse con antisueros especficos marcados con sustancias que despus pueden ser visualizadas en un microscopio, como en los casos de la inmunofluorescencia y la inmunoperoxidasa (Figura 9); estas tcnicas son cualitativas y la especificidad de los antisueros utilizados permite identificar con certeza subtipos antignicos o cepas variantes, como en los casos de Bronquitis Infecciosa e Infeccin de la bolsa de Fabricio. Existe una tcnica de ELISA llamada "de captura" que detecta antgenos a partir de muestras de lquidos corporales o de macerado de rganos, como la deteccin del antgeno p-27 de los virus del grupo Leucosis - Sarcoma o de los antgenos del virus de la Infeccin de la bolsa de Fabricio.
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Figura 9: Deteccin de antgenos en las muestras por Inmunoperoxidasa (A) y por Inmunofluorescencia (B) RELACION ENTRE VARIAS PRUEBAS: AISLAMIENTO MICROBOLOGICO Y SEROLOGIA Existen ocasiones en que los resultados de dos pruebas para la deteccin de un mismo agente no son concordantes, estos es especialmente frecuente entre las pruebas de aislamiento microbiolgico y las pruebas de serologa. En los estados iniciales de la enfermedad (7 das) es mas factible obtener un aislamiento microbiano y no detectar presencia de anticuerpos en las mismas aves; conforme transcurre la enfermedad (despus de 14 das) es mas probable detectar seroconversin y la probabilidad de obtener un aislamiento microbiano se reduce, ya que la concentracin del microorganismo en los tejidos tiende a disminuir. Existe un perodo crtico, conocido como "periodo de ventana" donde es muy probable que tanto las pruebas de aislamiento microbiano como las pruebas de serologa sean negativas, en animales realmente infectados (Figura 10). Es en estos casos donde es vital conocer la naturaleza de la enfermedad y la etapa de la infeccin en la que las muestras son obtenidas para interpretar los resultados con precisin.
Figura 10: Relacin entre el aislamiento del agente y la deteccin de serologa positiva en un proceso de enfermedad. 5.- Pruebas de Biologa Molecular: Los mtodos ms modernos para la deteccin de patgenos aviares utilizan la tecnologa de la biologa molecular y se basan en la deteccin del material gentico (cido desoxirbonuleco DNA y/ cido ribonucleco o RNA) del agente. Para poder realizar la identificacin se requiere tener una cantidad suficiente de material gentico, la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en ingles) permite amplificar la cantidad de DNA hasta niveles detectables, posteriormente la identificacin especfica del material gentico se puede realizar por diferentes tcnicas. Estas tcnicas se basan en la deteccin de una porcin altamente especfica del genoma de los microorganismos. Las ventajas de estas tcnicas incluyen su rapidez, su alta sensibilidad y la posibilidad de tipificacin de los microorganismos. Las desventajas de estas tcnicas incluyen su costo, su elevado nivel de tecnologa, la complejidad en la conservacin de las muestras, y el requerir del conocimiento previo del material gentico de los microorganismos. Con estas tcnicas no pueden determinar la viabilidad del microorganismo detectado. Existen pruebas para la deteccin y pruebas para la tipificacin de los microorganismos. Las pruebas de deteccin incluyen PCR, RT-PCR, PCR en Tiempo Real y PCR Anidada. En las pruebas clsicas de PCR, un fragmento conocido del DNA se amplifica e identifica. La identificacin se realiza por tamao y peso molecular en geles de agarosa teidos con bromuro de etdio; se han desarrollado sistemas de deteccin para una gran cantidad de agentes infecciosos como los virus de la Enfermedad de Marek, Laringotraqueitis Infecciosa y Adenovirus Aviar (Figura 11). La identificacin del fragmento de DNA amplificado tambin puede hacerse por hibridacin con una sonda marcada fcilmente identificable ("dot-blot"), por ejemplo para Mycoplasma. En la prueba de RT-PCR el genoma de los virus RNA es convertido en DNA con una enzima Retrotranscriptasa (RT), para posteriormente ser amplificado, por ejemplo, para Influenza Aviar, Enfermedad de Newcastle, Bronquitis Infecciosa, Infeccin de la bolsa de
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Fabricio y Reovirus. En la Prueba de PCR en Tiempo Real, la prueba es cuantitativa, tiene mayor sensibilidad y la deteccin de los fragmentos amplificados es inmediata, sin el uso del paso de separacin e identificacin en geles de Agarosa, por ejemplo para el virus de Influenza Aviar. La prueba de PCR Anidada ("nested" PCR nPCR) es una doble prueba de PCR, donde la segunda reaccin de PCR usa como patrn el producto amplificado de la primera reaccin de PCR ("amplicn"), lo que aumenta la sensibilidad y puede hacer la prueba cuantitativa; la prueba de PCR Anidada puede utilizarse para tipificar algunos virus y se ha utilizado para la deteccin del Pneumovirus Aviar y para la identificacin de los subtipos A y B del mismo.
Figura 11: Prueba de deteccin por PCR y separacin de los segmentos amplificados en gel de agarosa teidos con bromuro de etidio, la identificacin de los fragmentos se hace por peso molecular. Las pruebas de tipificacin molecular son capaces, adems de identificar al microorganismo, de tipificarlo y clasificarlo. En la prueba del Anlisis del Polimorfismo de la Longitud de los Fragmentos de Restriccin (PCR-RFLP), el DNA amplificado es cortado con diferentes enzimas de restriccin y el patrn de los cortes se compara con un patrn conocido de un agente en particular, esta tcnica ha sido muy utilizada para identificar las cepas variantes de los virus de Bronquitis Infecciosa e Infeccin de la bolsa de Fabricio. En la prueba de Anlisis de DNA Polimorfo Ampliado al Azar (PCR-RAPD) el DNA es ampliado en pequeos fragmentos que tambin son separados por electroforesis para obtener un patrn de bandas que se compara con un patrn conocido; se utiliza para microorganismos con DNA ms complejo, por ejemplo, para diferenciar M gallisepticum de M synoviae. La secuenciacin gentica es la prueba ms especfica, En esta prueba el material gentico es amplificado y posteriormente es analizado para identificar el orden de los nucletidos que lo componen, utilizando nucletidos marcados con fluoro cromos. Posteriormente estas secuencias son comparadas con secuencias conocidas del microorganismo para determinar qu grado de similitud gentica existe entre ellos y as poder clasificar al microorganismo identificado; generalmente la comparacin se hace con secuencias conocidas publicadas en Internet, como el banco de secuencias NCBI (National Center for Biothecnology Information). Que permiten comparar la secuencia obtenida con secuencias de todo el mundo de manera rpida y sencilla (Figura 12). Para realizar estas comparaciones es necesario el uso de programas bio- informticos que comparan y agrupan estas secuencias en funcin de sus similitudes. La forma grfica ms sencilla de representar las similitudes de todas las cepas comparadas es un rbol filogentico (Figura 13).
Figura 12: Secuenciacin de la regin hipervariable del gene de la Protena VP-2 del Virus de la infeccin de la Bolsa de Fabricio para la clasificacin de las cepas del virus
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Figura 13: Relacin filogentica de aislamientos del virus de Bronquitis Infecciosa por comparacin de las secuencias del gene S-1 5. Pruebas de Bromatologa y Anlisis Qumicos: un programa de Sanidad Avcola debe incluir el control de la calidad de los alimentos y de los ingredientes usados en su elaboracin; este control tambin debe ser peridico y constante. Cada empresa deber fijar sus propios parmetros de calidad que debern ser respetados en la planta de alimentos (Figura 14). Es importante la seleccin adecuada de las muestras para anlisis, as como su volumen. Un muestreo representativo implica la coleccin de varias muestras en forma seriada; posteriormente todas las muestras son mezcladas y homogeneizadas y se colecta una sub muestra, pudindose repetir el proceso hasta reducir la muestra hasta un volumen adecuado para el anlisis, que puede requerir de unos cuantos gramos de muestra final. El anlisis bromatolgico usualmente incluye los porcentajes de protena cruda, grasa cruda, cenizas, humedad, elementos libres de nitrgeno, calcio, fsforo y sal y los resultados obtenidos en el anlisis del alimento deben coincidir con los valores tericos formulados para cada racin; las pruebas de mezclado se hacen con un componente de la racin de baja concentracin, como cenizas, cloruros, fsforo o algn aditivo o medicamento, el coeficiente de variacin en la concentracin del componente deber ser inferior al 10%. En el caso de los granos, se deben especificar sus caractersticas para ser utilizados, el porcentaje de humedad deber ser menor al 14%, un peso especfico de 0.76-0.78, el porcentaje de grano quebrado debe ser m enor al 3% y el porcentaje de impurezas debe ser menor al 1%; adems la muestra debe estar libre de contaminacin con plaga viva y en el caso del sorgo, la cantidad de taninos debe ser menor a 0.6%.
Figura 14: Determinacin de la concentracin de protena y del perfil de aminocidos con el Sistema de Espectroscopia de Reflactancia del Infrarrojo Cercano (NIR). 6.- Pruebas de Toxicologa: Los anlisis toxicolgicos se utilizan para garantizar la inocuidad de los ingredientes para la fabricacin de alimentos, en los alimentos para las aves y en los productos avcolas destinados al consumo humano, particularmente carne de pollo y huevo. Existe una gran cantidad de anlisis toxicolgicos que pueden detectar concentraciones muy pequeas de residuos txicos, del orden de picogramos o nanogramos, como las espectrometras de masas, la espectrometra infrarroja y la espectrometra de absorcin atmica, as como las cromatografas de gases y de lquidos de alta resolucin. Con el uso de estas tcnicas se obtiene mayor sensibilidad, mayor precisin y mayor repetitividad, para garantizar la inocuidad alimentaria y las exigencias del comercio internacional. Son especialmente importantes para la deteccin de micotoxinas, metales pesados, dioxinas, hormonales, beta agonistas y residuos de antibiticos, para que los productos agropecuarios puedan cumplir con las especificaciones descritas en el Codex Alimentarious para la comercializacin internacional de los mismos. Un factor de calidad importante es la concentracin de micotoxinas y debido a que la concentracin de las mismas puede ser muy variable dentro de un mismo lote, se requiere de un sistema de muestreo y mezclado de las muestras que garantice la representatividad de los resultados. Las tcnicas actuales para el "monitoreo" de micotoxinas en granos y alimentos incluyen el uso de columnas de inmunoafinidad y fluorometra, ELISA y cromatografa en capa fina o cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC por sus siglas en ingls) (Figura 15). El establecimiento de los valores mximos permitidos para cada micotoxina es un asunto que an es motivo de controversia y nicamente existe legislacin oficial para aflatoxinas, por lo que tambin en este caso cada empresa, por medio de anlisis constantes y secuenciales, deber establecer sus propios parmetros de acuerdo a sus necesidades y posibilidades; para sorgo y maz se han sugerido los siguientes valores como mximos permisibles en una muestra: 20 ppb de aflatoxina total, 100 ppb de ochratoxina total, 150 ppb de Toxina T-2, 500 ppb de Zearalenona, 1500 ppb de Vomitoxina (DON) y negativo a la presencia de esclerocios por flotacin y de alcaloides de Ergotamina en prueba cualitativa.
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Figura 15: Deteccin de aflatoxinas con la tcnica de Cromatografa de Liquidos de Alta Resolucin (HPLC)
SISTEMA DE ASEGURAMIENTO DE CALIDAD Todos los laboratorios deben de contar con un Sistema de Aseguramiento de Calidad que constate la confiabilidad de los resultados, incluyendo Polticas de Calidad, Control de Calidad en insumos, equipos y procesos, uso de patrones de referencia y trazabilidad de los sistemas de medicin y procedimientos de reconfirmacin de resultados. Puede haber discrepancias entre los resultados obtenidos y los esperados, eventualmente pueden presentarse errores en los anlisis. El procedimiento de reconfirmacin de resultados tiene cuatro pasos que pueden realizarse de manera secuencial o simultanea, y son los siguientes: a) Repeticin del anlisis con la misma muestra y la misma tcnica. b) Realizacin del anlisis con la misma muestra y con una tcnica alternativa (confirmatoria) c) Realizacin del anlisis con la misma tcnica y con muestras nuevas (usualmente se incrementa el nmero de muestras) d) Realizacin del anlisis con una tcnica alternativa y con muestras nuevas (usualmente se incrementa el nmero de muestras). No existe ninguna prueba que sea 100% infalible. Los errores en un resultado pueden ser atribuidos a los procedimientos del anlisis, a las caractersticas de la muestra o al sistema de muestreo utilizado. La mayora de los investigadores coinciden en sealas que el procedimiento de muestreo es el factor ms importante que afecta la confiabilidad de un resultado de laboratorio. Un Resultado Falso Negativo, es decir, un resultado errneamente negativo en una muestra positiva puede ser debido a los siguientes factores: La prueba usada tiene una sensibilidad baja; error en el tiempo de muestreo (un muestreo precoz o un muestreo tardo); muestra no representativa: nmero inadecuado de muestras, seleccin inadecuada de las muestras; concentracin baja del agente en la muestra; inactivacin del agente en la muestra. Un Resultado Falso Positivo, es decir, un resultado errneamente positivo en una muestra negativa puede ser debido a los siguientes factores: La prueba usada tiene una especificidad baja; contaminacin cruzada de la muestra durante el muestreo; contaminacin cruzada entre las muestras; contaminacin de la muestra en el laboratorio; reacciones cruzadas por agentes similares; reacciones inespecficas.
RECOMENDACIONES FINALES Use el Laboratorio de manera preestablecida, peridica y rutinaria Correlacione los resultados con los antecedentes sanitarios y epidemiolgicos de la empresa; con el comportamiento clnico y productivo de las aves; con las medidas de bioseguridad, manejo, alimentacin y nutricin utilizadas y con la calidad gentica de las aves. Forme un banco de informacin de resultados y establezca los "parmetros normales o esperados" de acuerdo a las caractersticas de la explotacin. Evale peridicamente los programas de Sanidad Avcola utilizados en su empresa. Use el Laboratorio cuando lo considere necesario. Seleccione, tome y conserve las muestras para anlisis de acuerdo a las recomendaciones de su Laboratorio. BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA 1) - A Lab oratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens, Fourth Edition, 1998. Edited b y D. Swaine, J. Glisson, M. Jackwood, J. Pearson and W. Reed. Pub lished b y The American Association of Avian Pathologist, University of Pennsylvania, USA. 2) - Avian Histopathology, Third Edition, 2008. Edited b y O. Fletcher. Pub lished b y the American Association of Avian Pathologist, University of Pennsylvania, USA, 3)- Diseases of Poultry, eleventh edition 2003, editor in Chief Y.M. Saif, Iowa State Press, USA 4) - Grain Inspection Handb ook. U. S. Department of Agriculture. Grain Inspection, Packers and Stockyards Administration. Federal Grain Inspection Service, 1997. 5) - Long, P., B. Millard, L. Joyner and C. Norton: A guide to lab oratory techniques used in the study and diagnosis of avian coccidiosis. Folia Veterinaria. Latina VI: 200-217, 1976 6) - Manual de Procedimientos Tcnicos de Lab oratorio, 5 Edicin 2007. Editado por MVZ J.C. Valladares, 2007, Lab oratorio de Control de Calidad y Patologa Aviar, PAPSA, 7) - NCCLS. Performance Standars for Antimicrob ial disk and Dilution Susceptib ility Test for Bacteria Isolated from Animals; Approved Standard. NCCLS Document M31A (ISBN 156238-37739), 1999. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087 USA. 8). NOM-003-ZOO-1994. Criterios para la operacin de lab oratorio de prueb as aprob ado en materia zoosanitaria. 9)- NOM-056-ZOO-1995, Especificaciones tcnicas para las prueb as diagnsticas que realicen los lab oratorios de prueb as aprob ados en materia zoosanitaria.
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10) - Officials Methods of Analysis of A.O.A.C. International, 17 Ed.2002. Edited b y Dr. William Horwitz. AOAC International, USA 11) - OIE Manual of Diagnostic Test and and vaccines of terrestrial Animals 5TH Edition, 2004 12)- Tejada, I.: Control de Calidad y anlisis de alimentos para animales, Ed. Trillas. Mxico, 1992. 13) - United States Pharmacopeia, the National Formulary, USP 27 NF22, 2004 the United States Pharmacopeial Convention, Inc, USA PRESENTADO EN EL CURSO DE INTEGRACION DEL DIAGNOSTICO EN LA INDUSTRIA AVICOLA Y CURSO DE PATOLOGIA COMPARADA DE AVES COMERCIALES Y ESPECIES NO CONVENCIONALES DE LA ASOCIACION NACIONAL DE ESPECIALISTAS EN CIENCIAS AVICOLAS DE MEXICO (ANECA) EL 02-02-2009
Autor/es
Juan Carlos Valladares
Mexico, Mxico Medico Veterinario Zootecnista, Maestro en Cie
(11966)
(8) Smithfield Beef Group - MOPAC
Francisco A Gomez
Dallas, Texas, Estados Unidos de Amrica Mdico Veterinario Zootecnista
Re: Elementos requeridos para un diagnstico de Laboratorio
22/06/2010 | Juan Carlos te felicito por el articulo y por hacer notar la importancia del uso del laboratorio de diagnostico en nuestra profesion, esta manera de trabajar demuestra el profesionalismo y la etica de un buen MVZ, debemos usar todas las herramientas disponibles para diagnosticar y tomar las desiciones necesarias para prevenir, erradicar o evitar la propagacion de las enfermedadez infecciosas o virus dentro del sector agricola de produccion animal
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Hector Montilla
Guayaquil, Guayas, Ecuador Mdico Veterinario
22/06/2010 | Felicitaciones por el articulo, tengo casi 15 aos de experiencia en Laboratorio de Diagnstico de Patologa Aviar en la empresa privada y considero que ha hecho una muy buena explicacin de la importancia de nuestro trabajo para la industria avcola, le agradezco su contribucin al respecto. Slds. cordiales,
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Julio Castrelln
Ciudad de Panama, Panama, Panam Bioqumico
Grupo Melo
23/06/2010 | Excelente articulo, bastante detallado de lo importante que es el Laboratorio de diagnstico para Confirmar o detectar algn problema de salud sanitaria en las aves. Mis sinceras felicitaciones, y se que muchos que lean este articulo aprenderan algo nuevo y de utilidad de l.
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Irisjustacara
Maracay, Aragua, Venezuela Mdico Veterinario
23/06/2010 | Excelente articulo,ha resaltado en forma resumida y completa las actividades
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que en forma continua realizamos en el area de diagnostico a nivel de empresa .sin dejar atras la importancia de cada uno de los analisis realizados. Saludos
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Danilo Jose Agudelo

San Jose de Cucuta, Norte de Santander, C Ing. Zootecnista
01/07/2010 | Felicitaciones a el autor de el artculo, ya que est muy completo y leyendolo detenidamente, aclara muchas dudas siempre es de gran ayuda el laboratorio, especialmente en la serologia y titulos de anticuerpos para evaluar el estado sanitario y de defensas de la parvada, para poder lograr planear unos planes vacunales mas exactos me gustara comentaramas sobre el coeficiente de variacion, para determinar la uniformidad serolgica de el lote si es respuesta vacunal de campo. Muchas gracias, Danilo Agudelo
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Delida Barboza
Venezuela
03/07/2010 | Realmente DR. le felicito por tan explcito artculo en el cual se resume la labor que realizamos los Laboratorios de Diagnosticos y se le da la importancia requerida como Herramienta para el Control de Enfermedades zoosanitarias desde todos los puntos de vista, bacteriano, micologico, viral, perfiles serologicos , auditorias de incubadoras, ananlisis moleculares, entre otras. Dios permita que muchos Tcnicos profesionales puedan leer este articulo para que se le de el valor al Diagnstico en las operaciones avicolas y se den cuenta que mas que un gasto es una gran inversin.
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Jenny Pinto Higashi

Arequipa, Arequipa, Per Bilogo Contactar Profesional Re: Elementos requeridos para un diagnstico de Laboratorio
Rico Pollo
13/07/2010 | Para felicitarle por el importante artculo, en el que realza la herramienta de ayuda para los profesionales de la produccion ,como es el trabajo de los laboratorios y que pueden analizar los resultados, las tendencias y tomar sus desiciones mejor encaminadas.
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Josaffat Galaz
Tepatitlan de Morelos, Jalisco, Mxico Mdico Veterinario Zootecnista
21/07/2011 | Muchas gracias por su articulo, me parece muy interesante, y me gustara preguntar a usted y a los compaeros foristas, desde el punto de vista practico, para hacer un anlisis de Sndrome de Baja Postura (EDS) Cul es su recomendacin para elegir la mejor prueba de laboratorio y por qu? Apreciara mucho sus comentarios. Gracias
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Elementos Requeridos para Un Diagnóstico de Laboratorio - Engormix

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Elementos requeridos para un diagnstico de Laboratorio - Engormix

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Elementos requeridos para un diagnstico de Laboratorio

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Re: Elementos requeridos para un diagnstico de Laboratorio

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Re: Elementos requeridos para un diagnstico de Laboratorio

23/06/2010 | Excelente articulo,ha resaltado en forma resumida y completa las actividades

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Danilo Jose Agudelo

Re: Elementos requeridos para un diagnstico de Laboratorio

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Jenny Pinto Higashi

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