UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA

2013

FACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL

BIOESTADSTICA

SIEMBRA, AISLAMIENTO, RECUENTO E IDENTIFICACIN DE E.COLIS, COLIFORMES FECALES, COLIFORMES TOTALES DE LODOS DE RAFA CITRAR

INVESTIGADORES: BUSTILLOS HUAYNATE, JHONATHAN BLCIDO FERNANDES, KELLY

LIMA-PER 2012

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SIEMBRA, AISLAMIENTO, RECUENTO E IDENTIFICACIN DE E.COLIS, COLIFORMES FECALES, COLIFORMES TOTALES DE LODOS DE RAFA CITRAR

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Los coliformes fecales, coliformes totales y E. Colis en muestras de lodos de RAFA en CITRAR estarn sobrepasando los LMP?

2. HIPTESIS Los microorganismos presentes en muestras de lodos de RAFA en CITRAR tales como coliformes totales, coliformes fecales y E. Colis exceden los estndares de LMP.

3. OBJETIVOS
A. OBJETIVO GENERAL Determinar si coliformes totales, coliformes fecales y E. Colis exceden los

parmetros estndares de LMP en muestras tomadas de lodos de RAFA en CITRAR.

B. OBJETIVOS ESPECFICOS

Determinar si coliformes totales exceden los parmetros estndares de LMP. Determinar si coliformes fecales exceden los parmetros estndares de LMP. Determinar si E. Colis exceden los parmetros estndares de LMP. Realizar Pruebas Bioqumicas para determinar la presencia de E. coli en muestras tomadas de lodos de RAFA en CITRAR.

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4. MARCO TERICO

Bacteria Coliforme:
Incluyen E. Coli y otras bacterias que se asemejan morfolgica y fisiolgicamente. Estos M.O. con frecuencia difieren entre si en caractersticas pequeas. Las bacterias coliforme suelen encontrarse en el aparto intestinal del hombre y animal. E. Coli, rara vez se encuentra fuera del intestino Las bacterias coliformes son bacilos cortos, Gram negativos que fermentan la lactosa y forman cido y gas. Son anaerobios facultativos, se multiplican a mayor rapidez a temperatura entre 30 y 37 C, crecen a grandes abundancias en medios corrientes, como caldo y agar. La colonia de E. Coli en agar E.M.B (eosina y azul de metileno) tienen 2 a 4 mm de dimetro, un centro grande de color oscuro e incluso negro, y tienen brillo verde metlico cuando se observan con luz refleja. Se han creado otras pruebas para diferenciar tipos de bacterias coliformes, suelen emplearse 4 y se han juntado sus iniciales en la palabra nemotcnica IMViC (Indol, Rojo Metilo (R.M.), Borges Proskauer (V:P) y utilizada de citrato. La reaccin de IMViC de algunas bacterias coliformes como E.coli ++ --, significa que el M:O: produce Indol y es positivo al rojo metilo y negativo al V.P.

Determinacin de Coliformes Totales y Fecales:

Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaz de fermentar la lactosa a 44 C en vez de 37 C como lo hacen los totales. Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en heces estn formados por Escherichia Coli y ciertas especies de Klebsiella. Ya que los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la presencia de contaminacin fecal. stos ltimos se denominan termotolerantes por su capacidad de soportar temperaturas ms elevadas. Esta es la caracterstica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales. La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotrmicos es favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia 3|Pgina

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orgnica, pH, humedad Desde hace mucho tiempo se han utilizado como indicador ideal de contaminacin fecal. Su presencia se interpreta como una indicacin de que los organismos patgenos pueden estar presentes y su ausencia indica que el agua se halla exenta de organismos productores de enfermedades.

Anlisis sanitario del H2O

El diagnostico de las colonias coliformes en la muestra de H2O se basa en la capacidad de dicho M:O: para producir gas a partir de la lactosa.

Filtracin
Es un medio eficaz de eliminar M.O. y otras sustancias de suspensin del H2O.

Cloracin
Es el mtodo ms eficaz de hacer potable el H2O. La cantidad de cloro que se agrega depende del grado de contaminacin del abasto hdrico y su contenido de sustancias orgnicas. El cloro mata la mayor parte de las bacterias no esporgenas. El H2O clorada, en consecuencia no siempre es estril, pero suele brindar seguridad para consumo por el ser humano. Recuento de Coliformes en Filtro de Membranas (Mtodo): Se hace pasar parte de la muestra por una membrana de filtracin de acetatos de celulosa con poros y dimetro tal capte la bacteria, en tanto que permita el paso libre del H2O. La membrana de filtracin se coloca aspticamente en una caja de Petri en un cojincillo absorbente saturado con una sal nutritiva P. Ej., caldo M. Endo, se incuba a 24 C durante 24 horas. Despus se examina la membrana con microscopio de poca potencia y se cuentan las colonias verdes violceos con resplandor metlico, si considera que son bacterias coliformes.

H2O potable
Sea limpia, fresca, sin olores o sabores desagradables o que causen rechazo de quien lo consume y sin sustancias qumicas o M.O. nocivos. Ventajas del uso de Filtro de membrana para las H2O: 1. Rapidez en la obtencin de resultados 2. Ahorro de manos de obra, medios, materiales de vidrios, y coste de los materiales si el filtro se lava y se vuelve a utilizar. 4|Pgina

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3. Pueden exponerse los organismos a medio de enriquecimiento muy fcilmente durante un corto tiempo y a una temperatura conveniente.

Inconvenientes de Uso
1. No hay indicacin de formacin de gas (algunas H2O tienen gran cantidad de organismos fermentadores de la lactosa sin produccin de gas capaces de crecer en el medio). 2. La filtracin por membrana es inadecuada para H2O con mucha turbidez y bajos recuentos, porque el filtro llega a obturarse antes de que pase agua suficiente. 3. Cantidades grandes de organismos no coliformes capaces de crecer en el medio pueden interferir en el crecimiento de los coliformes.

Qu es la Escherichia Coli?
Es tambin conocida por su nombre, E. coli, es quizs el organismo procariota ms estudiado por el ser humano. Se trata de una enterobacteria que se encuentra generalmente en los intestinos animales, y por ende en las aguas negras, pero se lo puede encontrar en todos lados, dado que es un organismo generalizado. Fue descrita por primera vez en 1885 por Theodore von Escherich, bacterilogo alemn, quien la denomin Bacterium coli. Posteriormente la taxonoma le adjudic el nombre de Escherichia coli, en honor a su descubridor. sta y otras bacterias son necesarias para el funcionamiento correcto del proceso digestivo, adems de producir las vitaminas B y K. Es un bacilo que reacciona negativamente a la tincin de Gram (gramnegativo), es anaerobio facultativo, mvil por flagelos peritricos (que rodean su cuerpo), no forma esporas, es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa y su prueba de IMVIC es ++--.

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Habitad natural Se trata de una bacteria con diversas variantes. Normalmente vive en el intestino del hombre y de los animales y no suele causar ningn tipo de problema, es ms, es necesaria para el funcionamiento correcto del proceso digestivo. Sin embargo, algunas cepas por intercambio de material gentico, han adquirido la capacidad de causar infecciones y provocar diarreas sangrantes. Patogenia La bacteria puede afectar a todo tipo de poblacin pero los nios y los ancianos en los que pueden tener peores consecuencias. En el caso de los nios, porque tienen el sistema inmunitario ms inmaduro y en el de los ancianos porque su organismo est ms deteriorado, aclara la doctora Bartolomeu. Si la persona infectada no tiene una higiene personal ptima y toca algn objeto o alimento que luego otra persona se lleva a la boca, se puede contagiar. En el caso de los nios la transmisin es ms fcil porque actan ms por contacto y la prevencin es ms difcil de controlar. La doctora Rosa Bartolomeu advierte que hemos de tener en cuenta que la dosis infectiva en el caso de esta bacteria es muy baja, lo que hace ms fcil su propagacin.

Prevenir infecciones La higiene es la nica defensa para prevenir las infecciones alimentarias. Evitar el consumo de leche no pasteurizada sobre todo por parte de nios y ancianos, y de carne poco hecha. Los nios deberan mantenerse lejos de ambientes contaminados de heces de animales. No baarse en aguas dulces y en cuanto a verduras y frutas, tienen que ser lavadas con atencin. No es necesario que sean eliminadas de las dietas, los pepinos incluso pueden ser ingeridos. La bacteria no es resistente al calor, es decir, que cociendo bien los vegetales o cocinando bien la carne prevenimos la infeccin. Tambin lavndolos bien. Desafortunadamente, no existe una cura especfica, el tratamiento antibitico que se usa para las gastroeinteritis normales no es eficaz. En algunos casos incluso puede verse empeorada porque aumente la liberacin de las toxinas perjudiciales que produce la bacteria, como dice la doctora Bartolomeu. Se usan terapias como la rehidratacin por diarrea y la dilisis para limitar el dao renal.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA FACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL BIOESTADSTICA Clasificacin

Escherichia coli enteropatognica (ECEP) Esta cepa causa diarrea en humanos, conejos, perros y caballos, al igual que la enterotoxignica, pero la etiologa y los mecanismos moleculares de colonizacin son diferentes. Carece de fimbrias y no produce las toxinas ST y LT, pero utilizan la protena intimina, una adhesina, para adherirse a las clulas intestinales. Este virotipo posee una serie de factores de virulencia que son similares a los que se encuentran en Shigella, como la toxina shiga. La adherencia a la mucosa intestinal causa una reordenacin de la actina en la clula hospedante, que induce una deformacin significativa. Estas bacterias son moderadamente invasivas: penetran en las clulas hospedadoras provocando una respuesta inflamatoria. La causa principal de diarrea en los afectados por esta cepa son seguramente los cambios provocados en la estructura de las clulas intestinales.

Escherichia coli enterotoxignica (ECET) Se parece mucho a Vibrio cholerae, se adhiere a la mucosa del intestino delgado, no la invade, y elabora toxinas que producen diarrea. No hay cambios histolgicos en las clulas de la mucosa y muy poca inflamacin. Produce diarrea no sanguinolenta en nios y adultos, sobre todo en pases en vas de desarrollo, aunque los desarrollados tambin se ven afectados. Emplea varias toxinas, incluyendo la enterotoxina resistente al calor y la enterotoxina termolbil. Escherichia coli enteroinvasiva (ECEI) Es inmvil, no fermenta la lactosa. Invade el epitelio intestinal causando diarrea sanguinolenta en nios y adultos. Libera el calcio en grandes cantidades impidiendo la solidificacin sea, produciendo artritis y en algunos casos arterioesclerosis. Es una de las E. coli que causa ms dao debido a la invasin que produce en el epitelio intestinal. Escherichia coli enterohemorrgica o verotoxignica (ECEH) Estas bacterias producen una toxina citotxica para clulas Vero de cultivo de similaridad estructural a la toxina producida por Shigella dysenteriae. Las STEC producen verotoxinas que actan en el colon. Sus sntomas son: primero colitis hemorrgica, luego sndrome urmico hemoltico (lo anterior ms afeccin del rin, posible entrada en coma y muerte), y por ltimo, prpura trombocitopnica trombtica (lo de antes ms afeccin del sistema nervioso 7|Pgina

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central). Esta cepa no fermenta el sorbitol y posee un fago, donde se encuentran codificadas las verotoxinas, tambin llamadas "Toxinas Shiga", no posee una fimbria formadora de mechones, en vez de esto posee una fimbria polar larga que usa para adherencia. Escherichia coli enteroagregativa o enteroadherente (ECEA) Slo encontrada en humanos. Son llamadas enteroagregativas porque tienen fimbrias con las que aglutinan clulas en los cultivos de tejidos. Se unen a la mucosa intestinal causando diarrea acuosa sin fiebre. No son invasivas. Producen hemolisina y una enterotoxina ST similar a la de las enterotoxignicas. Escherichia coli de adherencia difusa (ECAD) Se adhiere a la totalidad de la superficie de las clulas epiteliales y habitualmente causa enfermedad en nios inmunolgicamente no desarrollados o malnutridos. No se ha demostrado que pueda causar diarrea en nios mayores de un ao de edad, ni en adultos y ancianos.

Determinacin mediante pruebas bioqumicas

Las pruebas bioqumicas consisten en distintos test qumicos aplicados a medios biolgicos, los cuales, conocida su reaccin, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes. Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una va metablica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no. Para realizar las pruebas bioqumicas se dispone de mltiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio.

Pruebas bioqumicas IMViC

Agar Citrato La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono es una prueba til en la identificacin de enterobacterias. La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.

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Indol El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica importante para la identificacin de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol est basada en la formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del pdimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano. Rojo Metilo Una de las caractersticas taxonmicas que se utilizan para identificar los diferentes gneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporcin de productos de fermentacin que se originan por la fermentacin de la glucosa. Se conocen 2 tipos generales: La fermentacin cidomixta y la fermentacin del 2,3 butanodiol. En la fermentacin cido mixta se forman fundamentalmente lctico, actico y succnico, adems de etanol, H2 y CO2. En la va del butanodiol se forman cantidades menores de cido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2. El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la produccin de cidos por la va de fermentacin cido mixta. Vogues Proskauer En la prueba de Voges-Proskauer se determina la va de fermentacin del butanodiol descripta en la prueba de rojo de metilo. El acetil-metil-carbinol (o acetona) es un producto intermediario en la produccin de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxgeno la acetona es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA FACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL BIOESTADSTICA 5. IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIN Cuando los residuos fecales no son tratados adecuadamente, pueden pasar al suelo o al agua y de ah a plantas y animales, aportando una gran cantidad de microorganismos que por su origen podran ser patgenos para el hombre. Esa contaminacin es habitual como consecuencia de una prctica, la fertilizacin de las cosechas con aguas residuales. Por eso es importante realizar el control microbiolgico tomando como base las bacterias indicadoras de contaminacin de residuos fecales como son los coliformes totales, coliformes fecales y la escherichia coli tomando muestras del lodo de rafa de las lagunas de tratamiento de aguas residuales CITRAR. Por tanto se tiene que establecer los criterios de calidad que han de reunir las aguas residuales antes de ser evacuadas en un sistema receptor y dotar de unos criterios de calidad que nos garanticen el mantenimiento de condiciones ambientales naturales que permitan preservar el equilibrio autorregulador de los ecosistemas. 6. METODOLOGA

Se elaboro el diagnostico de la situacin y se formularon los objetivos.

Se realizo la planificacin de las acciones a realizarse as como la orientacin inicial, con entrega de la gua de experimentacin, lectura, discusin de la misma, se eligi el lugar de anlisis que fue las lagunas de tratamiento CITRAR donde estn los lodos de rafa; as como tambin las pruebas a realizarse para el control microbiolgico, el cual se vio por conveniente usar la numeracin de coliformes totales, coliformes fecales por el mtodo del nmero ms probable (NMP), la numeracin de enterobacterias por el mtodo de recuento en placa y la determinacin de E. coli mediante las pruebas bioqumicas. Se busc un lugar donde realizar el anlisis del lodo de rafa CITRAR y se vio por conveniente utilizar el laboratorio de la facultad de ingeniera ambiental de la UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA. Se verifico si haba los materiales necesarios para la realizacin del proyecto. Se obtuvo las muestras del lodo de rafa de la laguna central de CITRAR Procediendo con la ejecucin del proyecto para esto se realiz la preparacin de los medios, las pruebas para coliformes totales y fecales as tambin como la prueba bioqumica para determinar la presencia de E. Coli. y se hizo registro de los resultados.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA FACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL BIOESTADSTICA Nos reunimos para realizar una reflexin terica grupal y la evaluacin sobre los resultados y debatir sobre las experiencias realizadas, analizando las conclusiones de la investigacin. Se procedi a la elaboracin del Informe. TRABAJO EXPERIMENTAL A. Preparacin de medios (agares y caldos ) Ingredientes Caldo peptona Caldo Lauril sulfato Triptona Caldo BRILA Caldo EC Agar VRBA Agar ENDO Alcohol etlico Agar nutritivo Caldo lactosado Caldo triptona Caldo MR-VP Agar citrato

Materiales Balanza, tubos de ensayo , tubos de ensayo pequeos, tubos de fermentacin o tubos DURHAM, gradillas para tubo de ensayo, pipetas de 10 ml, perilla, placas petri, inoculador o asa de siembra, mechero, rejilla, guante, erlenmeyer, esptula, probeta, piceta, papel kraft, algodn, pabilo, tijera, autoclave, ollita para la autoclave, refrigeradora. a. Preparacin de agua peptonada Se mezcla g con 130 ml de agua destilada en un erlenmeyer se licua al fuego para homogeneizarlo. Tapar el erlenmeyer con algodn, se envuelven con papel kraft, se amarran con pabilo y se lleva a la autoclave a 121 C25 PSI durante 15 min.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA FACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL BIOESTADSTICA b. Preparacin del caldo lauril sulfato triptosa Se mezcla g con 120 ml de agua destilada en un erlenmeyer se licua al fuego para homogeneizarlo. Con la ayuda de una pipeta se coloca 10 ml de caldo en 12 tubos los cuales contienen campanas Durham en su interior. Los tubos se tapan con algodn, se envuelven con papel kraft, se amarran con pabilo y se lleva a la autoclave a 121 C25 PSI por 15 min. c. Preparacin del caldo BRILA Se mezcla g con 120 ml de agua destilada en un erlenmeyer se licua al fuego para homogeneizarlo Con la ayuda de una pipeta se coloca 10 ml de caldo en 12 tubos los cuales contienen campanas Durham en su interior. Los tubos se tapan con algodn, se envuelven con papel kraft, se amarran con pabilo y se lleva a la autoclave a 121 C25 PSI por 15 min. d. Preparacin del caldo EC Se mezcla g con 120 ml de agua destilada en un erlenmeyer se licua al fuego para homogeneizarlo Con la ayuda de una pipeta se coloca 10 ml de caldo en 12 tubos los cuales contienen campanas Durham en su interior. Los tubos se tapan con algodn, se envuelven con papel kraft, se amarran con pabilo y se lleva a la autoclave a 121 C25 PSI por 15 min.

e. Preparacin del agar VRBA Se pesa 6.255 g de agar VRBA y se mezcla con 150ml de agua destilada en un erlenmeyer. Se pasa en el mechero para hacerlo hervir y licuar el agar hasta que se homogenice (NO SE AUTOCLAVA). Se deja enfriar 2 min luego se lleva al bao mara a 46C. f. Preparacin del agar ENDO Se pesa g de agar ENDO, se mezcla con 120 ml de agua destilada y ml de alcohol etlico en un erlenmeyer. Hervir en el mechero a ebullicin hasta para que se licue el agar (no se sobrecalienta). No se autoclave Plaquearlo en 4 placas petri.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA FACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL BIOESTADSTICA g. Preparacin del agar nutritivo Se pesa g de agar nutritivo, se mezcla con 120 ml de agua destilada en un erlenmeyer se licua para homogeneizarlo. Tapar el erlenmeyer con algodn, se envuelven con papel kraft, se amarran con pabilo y se lleva a la autoclave a 121 C25 PSI durante 15 min. Plaquearlo en 4 placas petri. h. Preparacin del caldo lactosado Se mezcla g con 80 ml de agua destilada en un erlenmeyer se licua al fuego para homogeneizarlo Con la ayuda de una pipeta se coloca 10 ml de caldo en 8 tubos los cuales contienen campanas Durham en su interior. Los tubos se tapan con algodn, se envuelven con papel kraft, se amarran con pabilo y se lleva a la autoclave a 121 C25 PSI por 15 min. i. Preparacin del agar nutritivo plano inclinado Se mezcla g con 80 ml de agua destilada en un erlenmeyer se licua al fuego para homogeneizarlo Con la ayuda de una pipeta se coloca 10 ml del agar nutritivo que se encuentra en el erlenmeyer en 8 tubos. Los tubos se tapan con algodn, se envuelven con papel kraft, se amarran con pabilo y se lleva a la autoclave a 121 C25 PSI por 15 min. Dejar se enfre inclinndolo tratando de obtener mayor cantidad de superficie inclinada.

j. Preparacin del caldo triptona Se mezcla g con 40 ml de agua destilada en un erlenmeyer se licua al fuego para homogeneizarlo Con la ayuda de una pipeta se coloca 5 ml de caldo en 8 tubos de ensayo. Los tubos se tapan con algodn, se envuelven con papel kraft, se amarran con pabilo y se lleva a la autoclave a 121 C25 PSI por 15 min. k. Preparacin del caldo MR-VP Se mezcla g con 80 ml de agua destilada en un erlenmeyer se licua al fuego para homogeneizarlo Con la ayuda de una pipeta se coloca 5 ml de caldo en 16 tubos los cuales contienen campanas Durham en su interior. Los tubos se tapan con algodn, se envuelven con papel kraft, se amarran con pabilo y se lleva a la autoclave a 121 C25 PSI por 15 min.
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA FACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL BIOESTADSTICA l. Preparacin del agar citrato plano inclinado Se pesa g de agar citrato, se mezcla con 80 ml de agua destilada en un erlenmeyer se licua para homogeneizarlo. Con la ayuda de una pipeta se coloca 10 ml del agar citrato que esta en el erlenmeyer en 8 tubos. Los tubos se tapan con algodn, se envuelven con papel kraft, se amarran con pabilo y se lleva a la autoclave a 121 C25 PSI por 15 minDejar se enfre inclinndolo tratando de obtener una gran superficie inclinada.

B. Pruebas para coliformes totales y fecales Ingredientes 10 g de lodo de rafa de citrar 90 ml de agua peptonada 15 Tubos con 9 ml de caldo Lauril sulfato Triptona que tienen dentro tubos de fermentacin. 4 tubos con 9 ml de agua peptonada. 12 tubos con 10 ml de caldo BRILA 12 tubos con 10 ml de caldo EC 4 Placas petri con agar ENDO 4 Placas petri con agar nutritivo 8 Tubos con caldo lactosado 8 Tubos con agar nutritivo en plano inclinado. Materiales Balanza, Licuadora, embudo para filtrar el lodo, tubos de ensayo , tubos de ensayo pequeos, tubos de fermentacin o tubos DURHAM, gradillas para tubo de ensayo, pipetas de 10 ml, pipetas de 1 ml, perilla, placas petri, inoculador o asa de siembra, mechero, rejilla, guante, erlenmeyer, esptula, probeta, piceta, papel kraft, algodn, pabilo, tijera, autoclave, ollita para la autoclave, bao maria.

a. Procedimiento de la dilucin Se pesa 10 g de muestra y se coloca en la licuadora con 90 ml de agua peptonada y se procede a licuar. El resultado es la dilucin 10-1, se transfiere 1 ml de la dilucin 10-1 a un tubo que contiene 9 ml de agua peptonada cuyo resultado es la dilucin 10 -2, yas sucesivamente hasta obtener la dilucin 10 -5.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA FACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL BIOESTADSTICA b. Prueba para recuento de enterobacterias Se toma 5 placas petri estriles y se les coloca la numeracin de las diluciones 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5. De las diluciones se toma 1 ml de cada uno y se coloca a cada placa, luego se agrega agar VRBA que se encuentra en el bao maria una primera capa. Para homogenizar el agar con la muestra diluida se realiza los siguientes movimientos :

Dejar solidificar de 5 a 10 min Agregar una segunda capa 10 ml para que favorezca el crecimiento de coliformes se deja solidificar. Se lleva a la incubadora 35-37 C /24 h Se procede a realizar el recuento y se expresan los resultados en UFC (unidades formadoras de colonia)/ gr. c. Prueba presuntiva para coliformes en caldo LST De la dilucin 10 -1 transferimos 1 ml a tres tubos que contienen 10 ml de caldo lauril sulfato Triptona (LST) que tienen dentro tubos de fermentacin o campanas DURHAM. De la dilucin 10 -2 transferimos 1 ml a tres tubos que contienen 10 ml de caldo lauril sulfato Triptona (LST) que tienen dentro tubos de fermentacin o campanas DURHAM y as sucesivamente hasta la dilucin 10 -5. Los tubos se colocan en la incubadora de 35 a 37 C x 24- 48 h. Se toma la lectura de los tubos positivos donde se forma gas y acido los cuales indican que son presuntivas de coliformes. d. Prueba confirmativa para coliformes totales Se siembra de los tubos con caldo LST positivos a tubos con caldo BRILA una a dos asadas. Incubar de 35 a 37C / 24 a 48 h. Se toma la lectura de los tubos positivos donde se forma gas y acido de los cuales se pasa a sacar el NMP.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA FACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL BIOESTADSTICA e. Prueba confirmativa para coliformes fecales Se siembra de los tubos con caldo LST positivos a tubos con caldo EC una a dos asadas y se pone a la incubadora 44.5 +0.2 C / 24 - 48 h. Se observa si hay crecimiento o formacin de gas. Se toma la lectura de los tubos positivos donde se forma gas y acido de los cuales se pasa a sacar el NMP. f. Prueba presuntiva para determinar E. Coli. Luego de los tubos con caldo EC positivos se pasa de una a dos asadas a las placas petri que contiene agar ENDO por el mtodo de estras, (dividir cada placa en dos mitades, enumerarlos de cada dilucin correspondiente, en cada mitad estriar) y se incuba 24 h. a 35 - 37 C Se observan los resultados, las colonias que crecen rojas con brillo metlico son sospechosas de E. Coli. Luego de las placas petri con agar ENDO donde hubo crecimiento se pasa a las placas petri con agar nutritivo y se incuba 24 h. de 35 -37 C. De las placas con agar nutritivo donde hubo crecimiento se pasa a caldo lactosado y tambin a agar nutritivo en tubo plano inclinado y se incuba de 35 a 37 C por 24 h. De los tubos con caldo lactosado donde hubo crecimiento se procede a realizar la tincin gram. Para los tubos de ensayo con agar nutritivo plano inclinado donde hubo crecimiento se procede a realizar una prueba bioqumica. C. Prueba bioqumica para determinar la presencia de E. COLI Ingredientes Caldo Triptona, caldo MR-VP, agar citrato plano inclinado Reactivo de kovacs Rojo de metilo Reactivo naftol Reactivo KOH Tubo de ensayo con citrato plano inclinado.

Materiales 15 tubos de ensayo con tubos de, gradillas para tubo, 11 pipetas de 1 ml, mechero, asa de siembra.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA FACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL BIOESTADSTICA Procedimiento a. Caldo Triptona: incubar 35-37C x 24 h. Para prueba INDOL mediante reactivo de kovacs. Agregar 0.2-0.3 ml de reactivo de Kovacs a 5 ml de cultivo. Agitar y esperar 10 min. Prueba +: coloracin rojiza. b. Prueba de citrato de sodio: incubar 35-37C x 48 h. Agar citrato de Simmons en plano inclinado (sembrar puntura y superficie) Prueba +: medio cambia a azul Prueba - : medio permanece verde. c. Voges Proskaver: caldo MR-VP incubar 35-37C x 48h. 0.6 ml Naftol 5 % + 0.2 ml KOH 40 % por 1 ml de cultivo. Esperar 2 h. Prueba +: color rojo d. Rojo de metilo : caldo MR-VP incubar 5 das (35-37C) Agregar 5 gotas de rojo de metilo a 5 ml de cultivo. Agitar. Esperar 2 min. Prueba +: color rojo Prueba -: color amarillo

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA FACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL BIOESTADSTICA PROCESO

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

90 mlA.P.

10-110-210-3 10-410-5 1 ml 1 ml

1 ml 1 ml

1 ml

PRUEBA PRESUNTIVA

Caldo lauril sulfato Triptona

Incubadora 35-37 C / 24 - 48 h. Tubo positivo

PRUEBA CONFIRMATIVA

Caldo BRILA

Caldo EC

Incubadora 35-37 C/24-48 h. coliformes totales

Bao mara 44.5 + 0.2 C/24 h. coliformes fecales

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Caldo EC tubo positivo

Agar ENDO 35C /24 h.

Agarnutritivo 35-37C/24h.

PRUEBA PARA COLIFORMES FECALES

Caldo lactosado (gas) 3537C/24h. GRAM

A.N. plano inclinado3537C/24h. PRUEBA BIOQUIMICA

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PRUEBAS BIOQUMICAS

Agar nutritivo

PRUEBA INVIC

INDOL (I)

ROJO DE METILO (RM)

VOGES PROSKAVER (VP)

CITRATO

Caldo triptona Incubar 37C /48 h. Echar reactivo de kovacs (0.2 - 0.3 ml) a 5 ml de cultivo despus de 10 min. se ve el resultado. Coloracin rojiza (+) produccin de indol indol (+)

Caldo MR VP Incubar 37C /5 das Echar 5 gotas de rojo de metilo a 1 ml de cultivo despus de 2 min. se ve el resultado. rojo: RM (+) amarillo: RM (-) E.Coli fermenta la glucosa PH 5.1 el color del RM cambia a amarillo

Caldo MR VP Incubar 37C /48 h. Echar: Naftol 5% (0.6 ml) KOH 40 % (0.2 ml) a 5 ml de cultivo despus de 2 h se ve el resultado. mtodo colorimtrico determina la formacin de compuesto orgnico carminol de metilo acetil prueba (+) color rosado

Agar Citrato Incubar 37C /48 h. Agar inclinado cambio de coloracin de verde a azul indicador azul de Bromo etinol

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA FACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL BIOESTADSTICA RESULTADOS Resultados del crecimiento en el caldo lauril sulfato Triptona

Dilucin Tubos +

10-1 3

10-2 3

10-3 3

10-4 2

10-5 1

10-6 0

Hubo crecimiento en todos los tubos. Resultados del crecimiento en el agar VRBA Se obtuvo crecimiento en todas las placas pero en la que se pudo contabilizar fue el de la disolucin de y se encontr 2200000 UFC/gr. Resultados del crecimiento en el caldo BRILA

Dilucin Tubos +

10-1 3

10-2 3

10-3 3

10-4 1

10-5 1

10-6 0

CT= 70000 NMP / g

Resultados del crecimiento en el caldo EC

Dilucin Tubos +

10-1 3

10-2 3

10-3 3

10-4 1

10-5 1

10-6 0

CF= 70000 NMP / g

Resultados del crecimiento en el agar ENDO

10-2

10-2

10-2

10-3

10-3

10-3

10-4

10-5

Hubo crecimiento en todas las placas

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA FACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL BIOESTADSTICA Resultados del crecimiento en el agar nutritivo

10-2

10-2

10-2

10-3

10-3

10-3

10-4

10-5

Hubo crecimiento en todas las placas

Resultados caldo lactosado Dilucin Tubo Crecimiento 10-2 I SI 10-2 II SI 10-2 III SI 10-3 I SI 10-3 II SI 10-3 III SI 10-4 I SI 10-5 I SI

Resultados de agar nutritivo plano inclinado Dilucin Tubo Crecimiento 10-2 I SI 10-2 II SI 10-2 III SI 10-3 I SI 10-3 II SI 10-3 III SI 10-4 I SI 10-5 I SI

Resultados de la prueba bioqumica (IMVIC) 10-2 + 10-2 + 10-2 + + 10-3 + + 10-3 + + 10-3 + + 10-4 + + 10-5 + + +

INDOL MR VP CITRATO

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA FACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL BIOESTADSTICA 7. ANLISIS E INTERPRETACIN DE RESULTADOS DISCUSIN Una vez realizado el anlisis en caldo LST, es evidente que en la muestra ha habido un alto crecimiento microbiano, esto debido al lodo del RAFA, tal como se plante en la hiptesis se pretenda conocer la numeracin de coliformes en NMP/g, es decir se tena previo conocimiento de que tipo de agua se trataba debido a que el agua a tratar es proveniente de los hacentamientos humanos alrededor de la UNI,. Es por ello que en todas las diluciones se han obtenido muestras, es decir de los 3 tubos que se sembr todas dieron positivas, esto en un anlisis presuntivo. En cuanto al anlisis confirmativo de los resultados del caldo Brila podemos afirmar que por el NMP muy probablemente sea 7000 NMP/ gr de coliformes totales. Los resultados del caldo EC con el NMP es 7000 NMP/ gr. En la reaccin de Indol 5 tubos presentaron resultado positivo, mientras que slo uno fue negativo, es decir, existe un 75 % de posibilidad que la muestra analizada presente sea un Indol positivo, esto debido a que en la prueba de Indol, existe degradacin de triptfano, esta habilidad slo la poseen ciertos microorganismos de romper el indol de este aminocido Indol, y est demostrado que la escherichia coli es un Indol Positivo, pero adems de ella existen otros microorganismos con este tipo de resultados tales como aeromonas hydrophilia, bacillus y dems , por lo que el afirmar que se trate de escherichia coli sera una conclusin muy pronta. En la prueba de Rojo de Metilo, slo se registr 37.5% positivo, lo que demuestra la poca probabilidad de encontrarnos ante la presencia de escherichia coli, adems esto demustra la baja posibilidad de encontrarnos con un microorganismo con reacciones positivas ante el rojo de metilo. La reaccin en VP, present un 100% que se trate de VP negativo, por lo tanto es definitivo que es cada vez ms probable que se trate de Escherichia Coli, dado que esta es negativa, mientras que la coloracin en los 2 tubos se debi a la oxidacin del acetilmetil carbinol a diacetilo a deiacetilo el cual reacciona con la peptona del medio para dar un color rojo. En la prueba de Agar Citrato, el 25% muestras presentaron resultado nefativo, esto se debe a que los microorganismos de muestra utilizaron el citrato como nica fuente de carbono y compuestos amoniacales como nica fuente de nitrgeno en su metabolismo, provocando una alcalinizacin del medio, por lo

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA FACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL BIOESTADSTICA tanto es definitivo que para la prueba realizada de IMViC el resultado esperado fue de (+ + - -) y esto se dio en dos tubos el de 10-4 y 10-5. Es importante que en todas las pruebas realizadas, en la prueba Indol y rojo de metilo debe ser positiva y la prueba citrato y Voges Proskaver deben ser negativos, slo cuando estos resultados se den de manera simultnea podremos afirmar que se trata de Escherichia Coli tal como ocurri en el laboratorio realizado. 8. RECOMENDACIONES Preparar adecuadamente los medios de cultivo. Es importante llevar un procedimiento ordenado de los pasos a realizar, siguiendo estrictamente el diagrama de flujo para el laboratorio realizado. Para agilizar el trabajo es importante que se tenga preparado con anterioridad los materiales de laboratorio para no incomodar Estar pendientes del tiempo de incubacin de cada proceso. Trabajar en condiciones aspticas y de esterilizacin. Realizar una buena distribucin del trabajo en equipo en laboratorio. Al momento de pesar la muestra de preferencia coger la parte ms suave para de ese modo puede licuarse adecuadamente con el agua peptonada y se pueda realizar buenas disoluciones seriadas. En ocasiones es recomendable que cuando se trabaje con prueba de VP, pueden no desarrollar el color rojo en la superficie mediante el revelado por la metodologa descrita. En estos casos se recomienda calentar el medio de cultivo para favorecer el desarrollo de color rojo. Es importante respetar el tiempo que debe tomar el tiempo de incubacin para cada prueba a realizar de lo contrario podran obtenerse resultados errneos al momento de realizar una prueba. Colocar la cantidad necesaria de reactiva para realizar cada prueba indicadora. 9. CONCLUSIONES De la muestra analizada de los lodos de la laguna del RAFA de CITRAR se pudo concluir que presenta coliformes, y esto debido a la presencia de gas observada en los tubos de Durham en los caldos. Se encontr que en la placa de agar VRVA con disolucin de se encontr 2200000 UFC/gr lo que demuestra que la muestra estaba muy contaminada. Los coliformes totales son 70000 NMP/ gr Los coliformes fecales son 70000 NMP/ gr

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA FACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL BIOESTADSTICA La importancia de los medios selectivos inhibidores de ciertos microorganismos, favorecen el crecimiento de los microorganismos objetivos. La importancia del anlisis presuntivo radica en ser como un anlisis filtro, por ello es de importancia porque indica que posiblemente exista cierto tipo de microorganismos. La prueba analizada SI contiene escherichia coli, esto qued demostrado por las pruebas de IMViC. La muestra analizada presenta otro tipo de microorganismos con propiedades parecidas a las de la escherichia coli, de ah la importancia de realizar una diversidad de pruebas bioqumicas para que nuestra conclusin no sea contraproducente con la realidad. Es importante que en las pruebas INVIC sus resultados sean estrictamente ++-, de lo contrario no se trata de Escherichia Coli.

10. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS http://es.scribd.com/doc/8267591/Cuantificacion-de-Coliformes-Por-ElMetodo-Del-Numero-mAs-Probable-y-de-Mesofilicos-En Biologa de los microorganismos. BROOK http://www.joseacortes.com/microbiologia/pruebasbioq/citrato.htm

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA FACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL BIOESTADSTICA 11. ANEXOS

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA FACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL BIOESTADSTICA

Reglamento de la Calidad del Agua para Consumo Humano

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