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PROGRAMA INSTITUCIONAL DE INICIAO CIENTFICA RELATRIO FINAL DE ATIVIDADES (AGOSTO/2009 A SETEMBRO/2010)

Avaliao antioxidante e quantificao de fenlicos totais das fraes de clorofrmio e acetato de etila resultantes da partio do extrato etanlico bruto do caroo de abacate (persea americana mill.)

MAIRA LIZA TENREIRO Profa. Dra. Isabel Craveiro Moreira

PIBIC/ FUNDAO ARAUCRIA

CAMPUS Londrina, agosto/2010.

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1 -TTULO- Avaliao antioxidante e quantificao de fenlicos totais das fraes de clorofrmio e acetato de etila resultantes da partio do extrato etanlico bruto do caroo de abacate (persea americana mill.) 2 - RESUMO

A busca por alimentos que possuam ao antioxidante uma prtica cada vez mais comum em grupos de pesquisas da atualidade, decorrente da grande preocupao com a sade humana devido a ao dos radicais livres. O abacate (Persea Americana Mill.) um alimento rico em vitamina E, gorduras monoinsaturadas, sais minerais e antioxidantes, onde o caroo do abacate apresenta em mdia 25% do peso do fruto, constituindo assim uma fonte muito interessante para estudos cientficos e tecnolgicos, com o intuito de aproveitar ao mximo esse alimento. Com base nesses interesses o objetivo do trabalho a avaliao da ao antioxidante e a determinao e quantificao de compostos fenlicos das fraes de clorofrmio e acetato de etila resultantes da partio do extrato etanlico bruto do caroo de abacate. Os mtodos utilizados so os de seqestro de radicais livres com DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazila) e o mtodo colorimtrico de Folin-Ciocalteau.

Palavras-chaves: partio do extrato etanlico do caroo do abacate, Persea Americana Mill, ao antioxidante, DPPH.

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3. INTRODUO

Os radicais livres so responsveis por vrias aes malficas ao organismo como inflamaes, Diabetes problemas respiratrios, doenas e

neurodegenerativas, envelhecimento

mellitus, et al.,

aterosclerose, 2002; GULCIN

carcinognese et al.,

(AL-MAMARY

2003;

CHANWITHEESUK et al., 2005). O que vem preocupando as indstrias alimentcias so os processos de oxidao de substncias orgnicas, causados pela ao dos radicais livres, onde so uma das principais causas da reduo da vida de prateleira dos produtos alimentcios industrializados, bem como das matrias-primas em geral, sendo o escurecimento enzimtico e a oxidao de lipdios as principais reaes de oxidao nos alimentos (DEGSPARI; WASZCZYNSKYJ, 2004). Na indstria alimentcia a oxidao lipdica inibida por seqestradores de radicais livres. Porm os compostos utilizados como antioxidantes nesse caso so os antioxidantes sintticos, como o terc-butil-hidroxianisol (BHA), terc-butil-hidroxi-tolueno (BHT), terc-butil-hidroquinona (TBHQ) e galato de propila (PG), que so comprovadamente txicos. Destaca-se ento a necessidade de investimento em pesquisas que buscam encontrar produtos naturais com atividade antioxidante, os quais permitiro substituir os sintticos ou fazer associao entre eles (SOUSA et al., 2007). A funo dos antioxidantes de impedir a formao dos radicais livres que venham a danificar clulas e tecidos. Nos alimentos, a adio dessas substncias impede a deteriorao qumica e microbiana que so responsveis pela reduo no valor nutritivo (ANDREO; JORGE, 2006).

As substncias com ao antioxidantes de origem naturais possuem, na maioria das vezes um ncleo fenlico, como tocoferol, flavonides e cidos glicos e apresentam destaques especiais como antioxidantes (DEGSPARI

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WASZCZYNSKYJ, 2004; ANDREO; JORGE, 2006), por atuarem como eficientes captadores de espcies reativas de oxignio (EROs) (Figura 1). A utilizao do caroo de abacate, que apresenta em mdia 25% do peso do fruto, constitui uma fonte interessante para a explorao e criao de novos produtos (PENEDO et al., 2007). Em um estudo cientfico, a ao antioxidante do abacate foi encontrada na casca, semente e polpa (HIRASAWA et al., 2008). Sugere-se ento a utilizao do caroo de abacate para fabricao de farinhas usadas na confeco de massas em geral.

3.1.OBJETIVO

O objetivo deste trabalho avaliar a atividade antioxidante e analisar o contedo de compostos fenlicos totais das fraes de clorofrmio e acetato de etila resultantes da partio do extrato etanlico bruto do caroo de abacate (Persea Americana Mill.). Observar comparativamente a eficincia da atividade antioxidante do extrato etanlico em relao s fraes obtidas pela partio lquido-lquido do extrato etanlico com os solventes orgnicos como clorofrmio e acetato de etila. Na literatura no existe nenhuma citao sobre ao antioxidante do caroo do abacate, porm a presena de vitaminas A e complexo B pode ser uma possvel relao com a atividade antioxidante desta parte do fruto.

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Figura 1. Potencial da reao de DPPH com eugenol. Reao (1), doao do segundo hidrognio; Reao (2), dimerizao; Reao (3), complexao.

Fonte: BRAND-WILLIAMS et al., 1995.

3.2. REVISO BIBLIOGRFICA

3.2.1. Abacate

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O abacate um alimento bastante energtico, calrico e com alto valor nutricional, quando comparado com outros frutos tropicais, e por isso considerado um dos mais valiosos entre os frutos tropicais, contm as vitaminas lipossolveis que faltam em geral s outras frutas. rico em protenas e vitaminas A e B, medianamente rico em vitaminas D e E, e pobre em vitamina C (CANTO, SANTOS E TRAVAGLINI, 1980; BLEINROTH E CASTRO, 1992; TANGO E TURATTI, 1992). Possui fibras alimentares, folato, carotenides, substncias antioxidantes benficas sade, e gorduras insaturadas. Contendo substncias antioxidantes, h uma proteo contra o desenvolvimento de doenas crnicas, como as cardiovasculares e o cncer. Entre elas, o abacate contm uma boa quantidade de substncias chamadas pr-anticianidinas, que atuam diminuindo a oxidao das gorduras no sangue o processo de oxidao das gorduras leva formao de placas de colesterol nas artrias. Outras substncias antioxidantes do abacate so os carotenides betacaroteno, alfa caroteno, lutena e zeaxantina, que podem ter ao preventiva em alguns tipos de cncer, como o de mama, e diminuem o risco de doenas oculares como degenerao macular e catarata. A fruta tambm muito rica em gorduras insaturadas, especialmente as monoinsaturadas. Estas gorduras ajudam a diminuir o nvel de colesterol total e de colesterol ruim (LDL-c) no sangue, e a aumentar o colesterol bom (HDL), oferecendo assim um efeito protetor contra o desenvolvimento de doenas cardiovasculares. As gorduras tambm fazem com que a absoro dos carotenides pelo organismo seja maior. O folato (vitamina B9) essencial para a produo do material gentico e ajuda a prevenir ms-formaes fetais. indicado para todas as mulheres em idade frtil. E a vitamina C, que tambm tem ao antioxidante, importante para proteger o organismo de infeces, manter a sade de ossos, cartilagens, mucosas e facilitar a absoro de ferro. Alm desses componentes o abacate

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possui potssio, mineral importante na regulao da tenso arterial, ferro, magnsio e vitaminas do complexo B. O abacate pode ser encontrado na Amrica Latina e outras regies subtropicais e tropicais do mundo, sendo que o Brasil ocupa hoje o quarto lugar como produtor deste fruto. No Brasil, o abacate mais consumido ao natural com acar, como sobremesa ou batido com leite, porm no existem relatos do uso do caroo como alimento, onde acaba sendo descartado como resduo alimentar. A busca de uma utilizao para estes resduos consiste em uma prtica econmica e ecologicamente correta para a gerao de novos produtos. Sendo o caroo do abacate 25% em mdia do peso total da fruta, sua possvel utilizao seria como farinha para a produo de massas em geral.

3.2.2 VITAMINAS DO ABACATE

3.2.2.1. Vitamina A (Retinol)

A Vitamina A (Figura 2), conhecida por axeroftol ou retinol, pertence ao grupo de compostos conhecido como retinides. Nos alimentos de origem vegetal, somente so encontrados precursores de vitamina A, denominados de prvitamina A. So precursores de vitamina A os carotenides que contm o anel de -ionona, sendo que o -caroteno o que exibe maior atividade de vitamina A (RIBEIRO, 2007).

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Figura 2. Vitamina A (retinol)

3.2.2.2. Betacaroteno O betacaroteno um pigmento carotenide antioxidante. Tem sido descobertas grandes propriedades para o betacaroteno em pesquisas. Sabe-se hoje que ele um antioxidante (inibe radicais livres, prevenindo o envelhecimento), beneficia a viso noturna, aumenta a imunidade, d elasticidade pele, aumenta o brilho dos cabelos e o fortalecimento das unhas, alm de atuar no metabolismo de gorduras. O betacaroteno tambm favorvel na obteno do bronzeamento da pele. Quando transformado em vitamina A em nosso organismo, auxilia na formao de melanina, pigmento responsvel por proteger a pele dos raios ultravioleta e conferir o bronzeamento.

Figura 3. Betacaroteno

3.3. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

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Antioxidantes so substncias que retardam a velocidade da oxidao de lipdios ou outras molculas, atravs de inibio de radicais livres (DUARTEALMEIDA et al., 2006), impedindo a formao dos radicais livres que venham a danificar clulas e tecidos. Por esse motivo muitos produtos base de antioxidantes so comercializados na inteno de bloquearem a ao dos radicais livres, podendo ajudar a prevenir doenas cardacas, cncer e vrias outras condies associadas com o envelhecimento.

A atividade antioxidante de compostos fenlicos ocorre principalmente devido s suas propriedades de xido-reduo, as quais podem desempenhar um importante papel na absoro e neutralizao de radicais livres, quelando o oxignio triplete e singlete ou decompondo perxidos (Degspari e Waszczynskyj, 2004). O mtodo mais utilizado para determinar a atividade antioxidante em extratos, a avaliao da atividade seqestradora do radical livre 2,2-difenil-1picril-hidrazila DPPH (Figura 4) que possui colorao prpura e absorve na faixa de 515-517 nm. Este mtodo baseia-se na transferncia de eltrons de um composto antioxidante para um oxidante (DUARTE-ALMEIDA et al., 2006). O DPPH reduzido formando difenil-picril-hidrazina, de colorao amarela com conseqente desaparecimento da absoro. Ele um radical livre estvel que, na presena de um antioxidante doador de hidrognio (AH), pode ser reduzido em meio alcolico, formando difenil picrilhidrazina (KOLEVA et al., 2002). Esta reduo pode ser verificada mediante espectrofotometria a 515 nm, pela diminuio da absorvncia, com simultnea mudana de colorao violeta escura original, para amarela clara (KOLEVA et al., 2002). Ou seja, quanto mais DPPH for reduzido, menor a colorao violcea, conseqentemente maior a atividade antioxidante da soluo testada. O tempo de reao varia entre 10 a 30 minutos.

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Segundo Duarte-Almeida et al (2006) o decaimento de absorvncia das amostras (Aam) correlacionado ao decaimento da absorvncia do controle (Ac) resulta na porcentagem de seqestro de radicais livres (% SRL), que expressa atravs da equao abaixo: % SRL = Ac Aam / Ac x 100

Figura 4. Difenilpicrilhidrazila (DPPH radical livre) (1) e Difenilpicrilhidrazina (no radical) (2).Fonte: MOLYNEUX, 2004.

4. MATERIAL E METODOS

4.1. MATERIAL VEGETAL

Os abacates sero adquiridos atravs de coletas feitas em propriedades da regio de Camb. Logo aps a separao da polpa os caroos sero separados e armazenados para posterior anlise.

4.1.1. Preparo dos extratos vegetais

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Os caroos de abacate foram fragmentados e aps a secagem, foram modos em moinhos de facas. O material vegetal foi submetido extrao com etanol e em seguida sofreu uma partio lquido-lquido com solventes orgnicos clorofrmio e acetato de etila - obtendo-se as fraes clorofrmio e acetato de etila.

4.1.1.1 Obteno das fraes de clorofrmio e acetato de etila

A partir do extrato etanlico do caroo de abacate rotaevaporado, a partio foi realizada em funil de separao com a adio de 100 mL de gua destilada, 100 mL de metanol e 100 mL de clorofrmio para obter a frao de clorofrmio. Para a aquisio da frao de acetato de etila o mesmo procedimento foi realizado com adio de gua destilada, metanol e 100 mL de acetato de etila. As fraes foram conduzidas secura, em evaporador rotativo sob presso reduzida e ento dissolvidas em etanol, para serem utilizadas na determinao do contedo de compostos fenlicos e nos testes de atividade antioxidante.

4.2 Determinao do contedo de compostos fenlicos

O contedo de compostos fenlicos nas fraes de clorofrmio e acetato de etila foi realizado baseado no mtodo colorimtrico de Folin-Ciocalteau (ANDRADE et al., 2007). Preparou-se solues com concentrao de 500g do contedo das fraes por mL de etanol, onde em cada 100 L destas solues adicionou-se 500 L do reagente de Folin-Ciocalteau. Em seguida, adicionou-se 1,5 mL de soluo saturada de carbonato de sdio 20% e 6 mL de gua destilada. Aps um repouso de 90 minutos em temperatura ambiente foi feita a leitura, em triplicata, no espectrofotmetro UV-Vis (marca: FEMTO; Modelo:800XI) para a

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determinao da absorbncia a 765 nm (LUZIA & JORGE, 2009). Utilizou-se cido glico (10 a 100 g/mL) dissolvido em gua destilada, para elaborao da curva de concentrao padro (SINGLETON, et al.,1965.) e os valores de

fenlicos totais foram expressos como equivalentes de cido glico (mg de cido glico/g de amostra). A equao da curva de calibrao do cido glico foi Y =1144,7x + 2.7878 onde Y a concentrao do cido glico (g/mL), A a absorbncia a 765 nm e o coeficiente de correlao R = 0,9962. Todas as anlises foram realizadas em triplicata (grfico 1).

Grfico 1. Curva de Concentrao padro de cido Glico

4.3 Avaliao da atividade antioxidante (anlise quantitativa)

A ao antioxidante das fraes de clorofrmio e acetato de etila foi avaliada pela capacidade dos compostos antioxidantes, presentes nas amostras, de captarem o radical livre DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazina), conforme as metodologias descritas na literatura (BRAND-WILLIAMS et al., 1995;

MOLYNEUX., 2004; DUARTE-ALMEIDA et al., 2006). Para a avaliao da

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atividade captadora do radical livre DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazina), alquotas das fraes de clorofrmio e acetato de etila, foram diludas com etanol para se obter solues com concentraes de 12,5 a 1250 g/mL. Foram preparados 10 amostras contendo 50 L das solues diludas da fraes de clorofrmio e acetato de etila, com a adio de 0,5 mL de soluo DPPH 0,3mM, 1mL de etanol e 1mL de soluo tampo, o controle foi preparado contendo 1mL de soluo tampo, 1mL de etanol e 0,5mL de soluo DPPH, sem adio de fraes . Aps um perodo de 30 min efetuou-se as leituras das absorbncias na faixa de 516 nm. As leituras foram feitas em triplicatas, utilizando a mdia para confeco dos grficos 2 e 3 e posterior anlises dos resultados. Mensurou-se a atividade antioxidante atravs da capacidade dos solues das fraes de descorarem solues diludas do radical 2,2-difenil-1-picril hidrazila (DPPH).

Tabela 1. Solues para a leitura de absorvncia. Branco 1mL de soluo tampo 1,5 mL de etanol Controle 1mL de soluo tampo 1mL de etanol 0,5 mL de DPPH Amostra 1mL de soluo tampo 1mL de etanol 0,5 mL de DPPH 50 L de frao de

Acetato/clorofrmio

4.3.1. Clculo para preparo das solues dos extratos em diferentes diluies. As dissolues partiram da soluo estoque de 1g/100 mL: 0,125 mg x 1000 mg 100 mL x = 12,5 L 0,25 mg x 1000 mg 100 mL x = 25 L 0,5 mg x 1000 mg 100mL x = 50 L

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1,25 mg x 1000 mg 100 mL x = 125 L 5 mg x 1000 mg 100 mL x = 500 L 10 mg x 1000 mg 100 mL x = 1000 L

2,5 mg x 1000 mg 100 mL x = 250 L 6,25 mg x 1000 mg 100 mL x = 625 L 12,5 mg x 1000 mg 100 mL x = 1250 L

3,75 mg x 1000 mg 100 mL x = 375 L 7,5 mg x 1000 mg 100 mL x = 750 L

4.3.2. Preparo da soluo tampo

Utilizou-se tampo de acetato 0,1 M, com pH 5,5. Para isso, foi preparado uma soluo de cido actico 0,1M, na qual foi adicionada acetato de sdio e atravs de um aparelho pHmetro o controle foi realizado at que a soluo alcanasse pH 5,5.

4.3.3. Preparo da soluo de DPPH 0,3 mmol/L

1 mol 394 g 3 x 10-4 mol x x = 0,1182 g DPPH 0,1182 g 1000 mL

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x 25 mL x = 0,0029 g DPPH

5. RESULTADOS E DISCUSSO

5.1. Contedo de compostos fenlicos O resultado para quantificao do contedo de compostos fenlicos, usando a curva padro do cido glico (Grfico 1), foi de 777,1(mg de cido glico/g de amostra de frao de acetato) e 786,3 (mg de cido glico/g de amostra de frao de Clorofrmio)

5.2. Avaliao da atividade antioxidante

O DPPH utilizado para reagir com diferentes diluies das amostras, onde quanto maior a concentrao de antioxidantes presentes nas amostras, mais amarelada ser a soluo. A leitura foi realizada no espectrofotmetro UV-Vis (marca: FEMTO; Modelo:800XI) a 516 nm (KURATOMI et al., 2008). O parmetro utilizado para a interpretao dos resultados do mtodo de DPPH o clculo da concentrao eficiente ou o valor IC50 (tambm chamado de valor EC50). Que pode ser definido como a concentrao do extrato que causa a perda de 50% da atividade de DPPH (cor) (MOLYNEUX, 2004).

5.2.1. Leitura das medidas de absorvncia Foram realizadas leituras em triplicata, obtida a mdia de todas as leituras para melhores resultados.

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5.2.2. Fator de inibio da frao de Acetato de etila resultante da partio do extrato etanlico bruto do caroo de abacate = 516nm % SRL = Ac Aam / Ac x 100

Tabela 2. Leitura da Frao de Acetato de Etila Amostra (g/mL) 12,5 250 375 500 625 750 1000 % de inibio 5,9 7,5 8,2 8,9 9,9 11 12,5

Leitura da Frao de Acetato de Etila

14 12

% Inibio DPPH

10 8 6 4 2 0 0 200 400 600 800 1000 1200 Concentrao micrograma/ml y = 0,0067x + 5,7986 R = 0,9965
2

Grfico 2. Curva da atividade antioxidante da Frao de Acetato de Etila utilizando o mtodo de sequestro de radicais DPPH.

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Os dados de IC50 indicam a quantidade de amostra necessria para reduzir 50% do DPPH. O IC50 da frao de acetato de etila foi de 6,59 mg/mL, que pode ser obtido atravs da equao da reta apresentada no grfico 1 (R2= 0,9965).

5.2.3. Fator de inibio da frao de Clorofrmio

Amostra (g/mL) 250 500 625 750 1250

% de inibio 11,2 13 13,4 14,4 16,3

Leitura da Frao de Clorofrmio

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 200 400 600 800 1000 1200 Concentrao micrograma/mL y = 0,005x + 10,326 R2 = 0,977

% Inibio DPPH

Srie1 Linear (Srie1)

1400

Grfico 3. Curva da atividade antioxidante da Frao de Clorofrmio utilizando o mtodo de sequestro de radicais DPPH.

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O IC50 da frao de clorofrmio foi de 7,93 mg/mL, que pode ser obtido atravs da equao da reta apresentada no grfico 1 (R2= 0,977).

6. CONCLUSO

Com a aplicao deste trabalho foi possvel avaliar a atividade antioxidante de fraes de clorofrmio e acetato de etila resultantes da partio do extrato etanlico bruto do caroo do abacate, representados pelo valor de EC50 e tambm quantificar compostos fenlicos totais. Na anlise quantitativa da ao antioxidante das fraes de clorofrmio e acetato de etila observou-se uma ao muito fraca apresentando valores de IC50 de 7,93 mg/mL e 6,59 mg/mL respectivamente. Ao compararmos este resultado ao da analise do extrato etanlico bruto do caroo de abacate (IC50=1,71 mg/mL), observamos que o estrato etanlico tambm teve baixa atividade antioxidante, porem superior ao obtido com as fraes. Esse resultado ocorreu provavelmente devido s parties realizadas, demonstrado uma sinergia entre os composto do extrato etanlico puro, fazendo que este tenha um resultado mais aceitvel. A quantidade de compostos fenlicos encontrada na frao de clorofrmio de 786,26 (mg de cido glico/g de amostra de extrato) e na frao de acetato de etila de 777,1 (mg de cido glico/g de amostra de extrato). Esses valores se mostram elevados. Existe uma relao diretamente proporcional entre a quantidade de fenlicos totais e atividade antioxidante, neste caso esta relao no foi satisfatria. Mesmo no atingindo os resultados esperados, a ao antioxidante do caroo de abacate foi comprovada, fazendo com que este estudo tenha continuidade buscando propor a utilizao e o aproveitamento do alimento.

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Sem duvidas o aprendizado adquirido no decorrer do projeto possibilitando a utilizao do contedo terico na prtica foi de grande importncia, pois contribuiu para o desenvolvimento scio-intelectual do aluno. O uso do espectrofotmetro, do evaporador rotativo possibilitou um maior conhecimento desses aparelhos e facilidade para utiliz-los sem o auxilio de outras pessoas. A cromatografia em camada delgada foi mais bem entendida devido a sua utilizao constante durante todo o projeto.

7- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.

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Ministrio da Educao
Universidade Tecnolgica Federal do Paran Pr-Reitoria de Pesquisa e Ps Graduao

UNIVERSIDADE TECNOLGICA FEDERAL DO PARAN

PR

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Aluno(a) Maira Liza Tenreiro

Orientador(a) Profa. Dra. Isabel Craveiro Moreira