Espectrofotometra UV-visible

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1.- Introduccin La luz es el fenomeno visible de la radiacion electromagnetica. La radiacion electromagnetica interactua con la materia, y dicha interaccion nos permite estudiar la materia a nivel molecular en las tecnicas denominadas de espectroscopa. Vamos a trabajar desde su enfoque ondulatorio como corpuscular. Una onda electromagnetica es una perturbacion electromagnetica que se propaga en el espacio. Dicha onda presenta distintos parametros Longitud de onda (): Es la distancia recorrida por la radiacion en un ciclo completo, entre dos mnimos o maximos, en definitiva, entre dos puntos en fase uno respecto al otro. Es la es de igual modulo y sentido distancia comprendida entre dos puntos en los que el vector (es identico). La longitud recorrida en cada ciclo. Se expresa en nm Este parametro sirve para clasificar energeticamente las radiaciones electromagneticas. Tambien se pueden clasificar por el numero de onda ( = 1/) o numero de oscilaciones en la unidad de distancia Frecuencia (): Es el numero de ciclos que completa la onda en un segundo. Tiene dimensiones de tiempo-1. Velocidad de la luz (c): Constante, es la distancia recorrida por la luz por unidad de tiempo, en el vaco alcanza 300 mil km/s = Constante de Planck (h): Es otra constante que relaciona la energa de una onda con su frecuencia, cuyo valor es 6,6252 10-34 J s. As = = / La espectrofotometra trabaja con el visible y el UV cercano, intervalo que abarca desde unos 180 nm hasta 780 nm. Tengamos en cuenta que la energa de interaccion entre dos partculas vara con la distancia, y que se debilita al alejarnos de una distancia optima. Ademas la energa de dicha interaccion esta cuantizada, es decir, existen diferentes niveles de energa fuera de los cuales nunca se encuentra el sistema. Desde el estado fundamental E0 en el que todas las contribuciones a la energa de la partcula son mnimas, la partcula se encuentra en el mnimo energetico, mas estable, y cualquier intercambio supondra alcanzar un nivel no fundamental mas energetico y por tanto menos estable. Pero debido a la cuantizacion, ese nivel excitado sera uno o varios en concreto y no cualquiera. Para alcanzarlos, la magnitud del intercambio energetico debe ser equivalente a la diferencia de energa entre ambas. De hecho la ocupacion de los diferentes niveles energeticos por las moleculas es un suceso estadstico regulado por la mecanica estadstica de Boltzmann y cuyo parametro mas importante es la diferencia energetica entre ambos niveles, de manera que

= /
A temperatura ambiente casi todas las moleculas pueblan el estado menos energetico, as que >> . Cuando la inecuacion se convierte en una igualdad = , el sistema se haya

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saturado, y tiende a recuperar el estado original dado por Boltzmann, en un fenomeno conocido como relajacion. La naturaleza del intercambio energetico dependera de la energa que contenga la radiacion, es decir de su frecuencia. La molecula solo captara la energa de la radiacion si el valor de esta es exactamente igual al de la diferencia entre su estado y el de un nivel energetico mas excitado. De ah que cuando se realicen medidas espectroscopicas haya que elegir una zona del espectro cuya energa se corresponda a esa diferencia, porque si no, no hay interaccion luz-materia. Segun el tipo de efecto que queramos que cause la luz en la materia tambien deberemos elegir nuestra longitud de onda, ya que las longitudes de onda largas causan variaciones vibracionales y rotacionales, mientras que las cortas inducen fenomenos subatomicos como transiciones electronicas.

2.- Interacciones de la luz con la materia: dispersin, absorcin. La luz va a tener diferentes acciones al interaccionar con la materia. La dispersion es una agrupacion de diferentes fenomenos. Cuando el tamano de las partculas es mucho menor que la longitud de onda de la radiacion que atraviesa la solucion que las contiene, la radiacion puede interaccionar con la nube electronica de las partculas y se generan dipolos inducidos momentaneos en una cantidad proporcional a la polarizabilidad.

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Estos momentos magneticos absorben los fotones. Si el dipolo fuera permanente, simplemente se observara una disminucion de la intensidad de la radiacion (habran menos fotones), pero los dipolos desaparecen y al hacerlo reemiten fotones con la misma que los absorbidos, pero los emiten en todas direcciones, de ah la dispersion. Transcurre un cierto tiempo entre que los fotones absorbidos se reemiten, con lo que las ondas emitidas por estas partculas se encontraran retrasadas, y por tanto, ya no estan en fase, respecto a las ondas de la luz que no ha interaccionado y que conserva la direccion de propagacion. Esto equivale a que la luz viaja mas lentamente a traves de la materia, porque la interaccion consume tiempo. Esto tambien provoca la refraccion. Segun la teora de orbitales moleculares, cuando se forma un enlace entre dos atomos, dos orbitales atomicos se fusionan para formar a su vez dos orbitales moleculares. Uno de ellos, denominado orbital enlazante, posee menos energa que cualquiera de los orbitales atomicos de los que se origino, por lo que se produce una atraccion (la interaccion es favorable). El otro orbital es mas energetico, se denomina antienlazante y genera repulsion. A cada uno de los 2 orbitales se puede acomodar un par de electrones de espines apareados (signo opuesto). Se denomina estado singlete a aquellos en los que los electrones tienen espines antiparalelos, y este corresponde a los estados fundamentales. La excitacion puede llevar uno de los electrones de un orbital enlazante a uno antienlazante -Orbitales enlazantes. Los enlaces sencillos. -Orbitales enlazantes. Forman parte de enlaces multiples y los electrones contenidos estan muy deslocalizados e interactuan con facilidad con el entorno, distribuyendose como nubes electronicas por encima y debajo del plano formado por el enlace. -Orbitales n. En heteratomos un par de electrones desapareado que no participa en el enlace directamente: retienen su caracter atomico -Orbitales * antienlazantes. La version excitada de los enlazantes. -Orbitales * antienlazantes. La version excitada de los enlazantes. Si los electrones se encuentran en orbitales antienlazantes, la molecula se encuentra en un estado energetico superior. Para que se produzca esta transicion electronica se debe absorber radiacion de una energa concreta que debe ser menor de mil nm, < 1.000 nm, que corresponde a la de la region UVvisible. Cuando esto ocurre, no hay dispersion (absorcion temporal, fugaz) sino una absorcion. La espectroscopa de absorcin UV-visible analiza los trnsitos electrnicos poco energticos del tipo n* y * y no * porque lo realizan las moleculas de disolvente, aire, etc. Solo se utiliza en compuestos con dobles enlaces y heteroatomos. Se produce tambien una perdida de intensidad de la radiacion, pero no hay retraso. La longitud de onda a la que ocurre la absorcion es una caracterstica molecular intrnseca en el entorno que provea el disolvente. Los electrones excitados se relajan y ceden la energa muchas veces en forma de emisin de luz. Como hay mas de una transicion posible, hay mas de una que excite a los electrones. El numero de transiciones producidas aumenta con la probabilidad de que se den, la cual no es constante, sino que vara para cada , y eso se refleja en que la intensidad de la luz absorbida a esa en que se dan mas transiciones es mayor. Las transiciones mas probables y que mas se dan son las que dan un movimiento asimetrico de la carga.

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Las transiciones son discretas, no continuas: solo se absorben determinadas longitudes de onda. Vemos cuatro franjas porque el electron tiene 5 estados energeticos y 4 transiciones, que se corresponden con fotones con una energa exactamente igual a la correspondiente en el espectro. El espectro de absorcion generado es caracterstico de la molecula. As, el analisis del espectro del Sol nos indica que hay hidrogeno, ya que el espectro de absorcion carece de las longitudes de onda a las que el hidrogeno absorbe. Este espectro discreto se observa sobre todo en gases. Sin embargo, aunque la absorcion sea un fenomeno originalmente discreto, la influencia del entorno puede mostrarnos espectros continuos en moleculas en disolucion. En lugar de lneas discretas tenemos bandas de absorbancia cuyo maximo corresponde a la de onda de absorcion mas probable 3.-La ley de Lambert-Beer La absorcion de luz se produce en materiales con sustancias denominadas cromforos, sustancias con una configuracion electronica tal que la diferencia energetica entre alguno de los niveles energeticos de sus electrones es igual a la energa de la radiacion que recibe. Al producirse la absorcion se absorbe intensidad de luz de forma que = 0 La ley de Lambert nos dice que La absorbancia de una especie es proporcional a la longitud del paso de luz. () = ()

= o tambin = ,
Siendo k el coeficiente de absorcion. Se obtiene k al multiplicar el area de la nube electronica de las moleculas por la probabilidad de que un foton las atraviese. En biologa se trabaja con moleculas en disolucion. Si se elige un disolvente adecuado, se

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puede suponer que la absorcion es funcion de la concentracion de soluto. La ecuacion que gobierna esto es la Ley de Beer. Ley de Beer La absorbancia de una especie es proporcional a su concentracin.

, o tambin = ,

En la practica no se mide la intensidad de la luz que atraviesa la muestra, sino magnitudes derivadas como la transmitancia y la absorbancia.

= log

= log

La transmitancia no es directamente proporcional al valor de la concentracin A partir de ambas leyes, se deduce la ecuacin de Lambert-Beer = = =

= log

1 0 0 = log = log = ln = = 0 2,303

Se define la absorbancia como el logaritmo en base 10 de la inversa de la transmitancia (inversa para eliminar el signo negativo, de esta manera el logaritmo siempre sera positivo porque el argumento siempre es >1). Representando graficamente obtenemos una recta que pasa por 0. El coeficiente de extincion sera la constante de la sustancia por -2.3 para pasar a logaritmo decimal (quitar el numero e). Al transformar una curva exponencial en un logaritmo podemos estar amplificando matematicamene los errores. La absorbancia s es directamente proporcional a la concentracin de soluto. Hay que descontar la contribucin a la absorbancia del disolvente, lo que se hace realizando blancos A altas concentraciones la ley de Lambert-Beer no se cumple porque la curva exponencial entra en la zona en la que grandes cambios en la concentracin no cambian la absorbancia apenas. El aparato empieza a necesitar mucha sensibilidad para notar estos pequeos cambios en la ley. Si no los nota, empieza a medir absorbancias menores de las reales. Este es el motivo por el que absorbancias mayores de 1 no nos sirven, y tendremos que diluir las muestras en las que medimos esa absorbancia. La absorbancia sera real, pero no el valor de C calculado a partir de ella. Esta propiedad de absorcin de luz nos sirve para identificar compuestos en disolucin. Tambin sirve para calcular la concentracin. Podemos seguir reacciones qumicas, en base a mediciones de concentracin de reactivos y productos

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Cmo se cuantifica? Ley de Lambert-Beer nos relaciona la absorbancia con la concentracin, y nos muestra que es aditiva, la variacin de la absorbancia con la concentracin es lineal La tecnica consistira en ir nm por nm midiendo cuanta luz se transmite a traves de la muestra. LIMITACIONES DE LA LEY DE LAMBERT-BEER ERRORES INSTRUMENTALES Podemos no estar irradiando con una unica longitud de onda, y concentraciones extremas de soluto inducen error ERRORES QUMICOS La ionizacion variable de la muestra altera la medida de absorbancia Otro tipo de interacciones entre la materia y la luz pueden influenciar la medida Por ultimo la falta de uniformidad y homogeneidad de la muestra, y la presencia de impurezas como burbujas nos alteran completamente la medida 4.-El espectrofotmetro Es un equipo de medicin que produce una banda angosta de radiacin espectral, llamada luz monocromtica, y mide el grado de interaccin entre la radiacin y la muestra. LOS COMPONENTES Fuente luminosa o lmpara. Pueden ser halogenas, de deuterio, xenon, mercurio Colimador que focaliza la luz en un punto en concreto Modulo monocromador que selecciona la luz de longitud de onda querida, pudiendo ser un prisma de refraccion cuya rotacion selecciona la longitud de onda deseada, o una red de difraccion que genera desfases de unas respecto a otras. Su poder de resolucion es mayor. Puede venir acompanado de una rendija. Un espacio para colocar la cubeta en cuyo interior se halla la muestra. Las cubetas pueden ser de cuarzo, de plastico o de vidrio. El cuarzo no absorbe el UV, por lo que es util para medir protenas o AN. Hay distintos volumenes, en general el paso de luz es siempre del estandar 1 cm. El fotomultiplicador o receptor (una fotocelula), que transforma la luz en una diferencia de potencial electrico (por el efecto fotoelectrico) que va a un analizador de senal. Registra la intensidad de luz transmitida y con la ecuacion = log 0 calcula la absorbancia. Antes que nada hay que calibrar con una cubeta que contenga todo el contenido de la muestra, menos la molecula cuya absorbancia vamos a medir. A la luz que llega le daremos el 100%. Esto se denomina hacer el blanco. MANEJO DEL ESPECTROFOTMETRO DEL LABORATORIO Encender el aparato 10 minutos antes para que la intensidad se estabilice, al principio

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la luz no es constante. Seleccionamos la longitud de onda, metemos el blanco y calibramos. Insertamos en su espacio la cubeta con la molcula. Existen espectrofotmetros de doble haz que registran la absorbancia del blanco y de la muestra completa simultneamente, con lo que ahorramos tiempo. Precauciones

Las muestras no deben tener burbujas, encontrarse turbias o con precipitados (impurezas).
El volumen de la muestra en la cubeta no debe ser excesivo para evitar que se desborde, la cantidad a adicionar es, como mximo, hasta partes de la cubeta La cubeta se sujeta por los lados opacos y, antes de medir, hay que limpiar siempre las paredes transparentes No se deben derramar lquidos, sobre todo solventes, cidos o lcalis dentro del contenedor de la cubeta, se puede daar parte del mecanismo. La cubeta siempre. Se debe mantener, el espectrofotmetro, limpio y libre de humedad 8/10/13 Aplicaciones Identificar compuestos gracias al espectro de absorcion. Conocer la concentracin de un compuesto en una disolucion con la ley de Lambert-Beer Seguir el curso de reacciones qumicas y enzimaticas gracias a cambios en el espectro de absorcion, que registra cambios qumicos o de estructura, como la transicion alcalina del citocromo c. En funcion de su absorbancia podemos saber la concentracion de dicha sustancia, sabiendo su pico de absorcion. Esto nos permite ver en el espectrofotometro el transcurso de una reaccion qumica. Podemos ver la velocidad de transformacin, y por tanto las velocidades iniciales de las reacciones enzimticas. Determinamos la concentracion de sustancias tambien por medio de agentes complejantes que reaccionen con nuestra sustancia como el reactivo de Biuret. Los agentes complejantes aportan absorbancia a la molecula que queremos estudiar, pero debemos tener cuidado y realizar una buena recta de calibrado. Determinacion de equilibrios de solucion. Determinacion de la estequiometra de las reacciones Influencia del entorno sobre el espectro de absorcin en cromforos proteicos El cromoforo interacciona mediante fuerzas de London con el disolvente, y esta interaccion hace la E entre estado fundamental y excitado menor por lo que en disolucion se produce un desplazamiento del espectro hacia valores mas altos de , menos energeticos, respecto a la forma gaseosa.

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Las bandas de absorcion se ensanchan en disolucion por dos fenomenos: -La interaccin con el disolvente no es homognea en toda la molcula, ya que la solvatacin no es homognea. Las fuerzas de London son distintas, y la E sufre una pequea dispersin.

-Existen transiciones entre diferentes modos vibracionales y rotacionales dentro del mismo estado. Por tanto una transicin entre estados puede no ser de la misma E porque se pueden alcanzar estados vibracionales y rotacionales distintos. Tambien ocurren desplazamientos hacia el rojo y el violeta, bato e hipsocromismo respectivamente, segun la interaccion con el disolvente contribuya a hacer favorable la transicion o no. En protenas un aumento de la polaridad del entorno, debido a un aumento en la constante dielectrica, desplaza el espectro al azul. La desnaturalizacion de protenas lleva a un desplazamiento al azul porque la polaridad del medio interior hidrofobo se vuelve mayor, especialmente en residuos aromaticos.

Fluorimetra. Fluorescencia y fosforescencia

La fluorescencia es un fenomeno de emision que consiste en la emision de luz previamente absorbida. Ocurre cuando el electron es excitado con un foton y relaja. La relajacion no siempre lleva asociada la luminiscencia o emision de radiacion electromagnetica. Distinguiremos entre formas no radiativas o radiativas de relajacion. Las no radiativas ocurren por un proceso de relajacion vibracional y rotacional a traves del cual la molecula va bajando en subniveles de menor energa hasta el ultimo dentro del estado excitado. La energa liberada se convierte en energa cinetica de las moleculas, es decir, se libera calor. Este es el origen del calentamiento de la materia en contacto con luz. Se puede producir una conversion interna si el estado excitado y el estado fundamental solapan en algun subnivel energetico. Un cruce de sistemas ocurre cuando hay solapamiento entre estado excitado singlete y triplete. Estas dos ultimas transiciones son horizontales, porque se produce entre dos niveles de igual energa (isoenergeticas) y por tanto no liberan energa. Se les denomina no fluorescentes NF. El estado triplete es una trampa energetica de electrones que permite conservar su energa durante mas tiempo sin que se relajen para poder por ejemplo convertir esta energa en energa qumica. Las transiciones radiativas ocurren en la transicion del nivel vibracional menos energetico del estado excitado ya sea singlete o triplete, hacia el estado fundamental. La transicion desde el estado singlete se denomina fluorescencia. La transicion desde el estado triplete se denomina fosforescencia. Ambos son transitos verticales, ya que la molecula pasa de estado excitado a fundamental.

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Para que se produzca la absorcion de luz la molecula debe tener cromoforos: enlaces o conjuntos capaces de absorber luz. No todos los cromoforos son capaces de emitir luz, solo aquellos con una estructura electronica adecuada que favorezca la fluorescencia sobre los procesos NF seran fluorescentes o fluorforos. El fluoroforo puede ser intrnseco de la molecula o extrnseco (anadido para estudiar la molecula). Los fluorocromos son capaces de absorber radiacion de una longitud de onda y son capaces de emitir otra a menor longitud de onda que puede ser visible.

La fosforescencia consiste en la emision de luz a longitud de onda mas larga tiempo despues de ser absorbida. Es como una fluorescencia retrasada, que puede ser de segundos a das. La fluorescencia es mucho mas rapida, de 10-9 segundos. La fosforescencia es mas lenta porque el estado excitado triplete es mucho mas estable que el singlete.

Algunos fluorocromos

El espectrofluormetro Es similar a un espectrofotometro pero tiene algunas modificaciones, pues lo que interesa no es medir la intensidad de luz tras pasar por la muestra, sino la longitud de onda de la luz resultante. Para ello el colector de luz se situa a 90 con respecto a la lampara, con esto evitamos detectar la luz que transita por la muestra, sino la que es emitida por sus fluorocromos. Solo la luz emitida por fluorescencia alcanzara el colector, no por ir en esa direccion exclusiva, sino por ir en todas

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direcciones. NOTA: no toda la luz emitida es detectada, pero no importa porque lo que nos interesa es saber la de la luz, que es igual en todas las direcciones El aparato de sirve de lamparas de arco de xenon. Se produce una chispa que induce la fluorescencia en el gas xenon. La lampara ha de ser de mayor potencia para excitar al maximo numero de fluoroforos y aumentar la intensidad de la senal El hecho de que midamos a 90 nos exige que las cubetas tengan todas sus caras pulidas y bien transparentes. Usaremos cubetas de cuarzo Es importante controlar la temperatura porque influye en el rendimiento cuantico, es decir, la fraccion de transiciones fluorescentes respecto a la suma de fluorescentes y no fluorescentes (CI y CES) El espectro de excitacion es el conjunto de longitud de onda en la que se absorbe la radiacion. El espectro de emision sera aquel en el que la emite (siempre de longitud de onda mayor). Aunque escojamos una unica longitud de onda concreta para excitar, el espectro de emision no cambia respecto a la amplitud. Sin embargo, s cambia la intensidad de esta luz emitida Espectros de emisin y excitacin La excitacion con una luz monocromatica no impide que la emision se produzca en multiples longitudes de onda, siempre mayores que la de la luz absorbida. Sin embargo, se emite en varias longitudes de onda, porque se producen transiciones hacia diferentes modos de vibracion y rotacion dentro del estado fundamental, segun la probabilidad de dichas transiciones, correspondiendo a los picos de emision las transiciones con mas probabilidad. Como la transicion al estado fundamental desde el excitado es mucho mas lenta que la transicion desde diferentes modos vibracionales y rotacionales del estado excitado hacia el menos energetico excitado, se puede aproximar que todas las transiciones se producen desde el modo menos energetico del estado excitado. De ah que -El espectro suela ser independiente de la longitud de onda de absorcin -El espectro de emisin ser una representacin de la distribucin de los modos vibracionales y rotacionales del estado fundamental. El espectro de emision registra la intensidad de la fluorescencia en funcion de las longitudes de onda de emision. Cual es el color predominante de la emision? Tambien suele ocurrir que el espectro de emision sea la imagen especular del de absorcion porque la probabilidad de las transiciones es aproximadamente constante en ambos sentidos. Se desplaza al rojo porque una parte de la energa se pierde en transiciones no radiativas, que no dan luz. El espectro de excitacion registra la intensidad de luz emitida a una sola longitud de onda a partir de diferentes longitudes de onda de excitacion. Como responde la muestra al rojo, verde, etc? Es como un espectro de absorcion, solo que en vez de registrar cuanta luz se absorbe a diferentes longitudes de onda, registro cuanta de esa luz se emite a una unica longitud de onda. La cantidad de luz emitida en esa longitud de onda constante sera proporcional a la luz que absorbio a las diferentes longitudes de onda. Si absorbio poco, habra poca fluorescencia Si la muestra solo tiene un fluoroforo, lo normal es que el espectro de excitacion coincida con el de absorcion, porque la intensidad de la fluorescencia a longitud de onda de emision constante solo depende del coeficiente de extincion molar. La cosa cambia si hay mas de un

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fluoroforo, ya no coinciden.

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Aplicaciones Fluorescencia intrnseca Si excito la clorofila a una longitud de onda que absorbe, se produce fluorescencia. Esto me permite detectar la clorofila Fluorescencia extrnseca En protenas por ejemplo puedo unir un anticuerpo fluorescente a la protena. En un microscopio de fluorescencia podre ver la protena donde vea la fluorescencia. Tambien se pueden agregar fluoroforos extrnsecos directamente, tales como el DNS-Cl, el FITC o ANS. Quenching Apagamiento. La fluorescencia se desactiva porque moleculas del medio pueden interaccionar con el fluoroforo. Se produce una desexcitacion o relajacion no radiativa como consecuencia de la interaccion. Uno de los desactivadores mas frecuentes es el oxgeno molecular O2. La energa se disipa en forma de calor Luces fosforescentes? FUENTE GARCA-SEGURA, JM ET AL. CAPTULOS 2 ESPECTROFOTOMETRA UV-VISIBLE Y 3 EMISIN DE FLUORESCENCIA (PP 64-166) EN TCNICAS INSTRUMENTALES DE ANLISIS EN BIOQUMICA (2008). EDITORIAL SNTESIS