MINISTRIO DA AGRICULTURA, PECURIA E ABASTECIMENTO. SECRETARIA DE DEFESA AGROPECURIA. INSTRUO NORMATIVA N 62, DE 26 DE AGOSTO DE 2003.

Oficializar os Mtodos Analticos Oficiais para Anlises Microbiolgicas para Controle de Produtos de Origem Animal e gua O SECRETRIO DE DEFESA AGROPECURIA, DO MINISTRIO DA AGRICULTURA, PECURIA E ABASTECIMENTO, no uso da atribuio que lhe confere o art. 83, inciso IV, do Regimento Interno da Secretaria, aprovado pela Portaria Ministerial n 574, de 8 de dezembro de 1998, resolve: Art. 1 Oficializar os Mtodos Analticos Oficiais para Anlises Microbiolgicas para Controle de Produtos de Origem Animal e gua, com seus respectivos captulos e anexos, em conformidade com o anexo desta Instruo Normativa, determinando que sejam utilizados no Sistema de Laboratrio Animal do Departamento de Defesa Animal. Pargrafo nico. A metodologia de que trata este artigo ser atualizada, sempre que a inovao tecnolgica assim recomendar, por meio de ato do Diretor do Departamento de Defesa Animal. Art. 2 Esta Instruo Normativa entra em vigor na data da sua publicao. MAAO TADANO ANEXO

MTODOS ANALTICOS OFICIAIS PARA ANLISES MICROBIOLGICAS PARA CONTROLE DE PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL E GUA CAPTULO I - CONTAGEM PADRO DE MICRORGANISMOS MESFILOS AERBIOS ESTRITOS E FACULTATIVOS VIVEIS 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a contagem padro de microrganismos mesfilos aerbios estritos e facultativos viveis. Aplica-se a amostras de matrias-primas, gua e alimentos. 2. FUNDAMENTOS Baseia-se na semeadura da amostra ou de suas diluies em gar padro para contagem seguida de incubao em temperatura de 36 1C por 48 horas. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; Agar padro para contagem (PCA); Soluo salina peptonada 0,1%. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL da amostra, de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras, deste Manual. Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Esta a diluio 10-1. 5.2 Inoculao em placas: A partir da diluio inicial (10-1), efetuar as demais diluies desejadas em soluo salina peptonada 0,1%, de acordo com as instrues contidas no Anexo II, Diluies e solues, deste Manual. Semear 1 mL de cada diluio selecionada em placas de Petri estreis. Adicionar cerca de 15 a 20 mL de PCA fundido e mantido em banho-maria a 46-48C. Homogeneizar adequadamente o gar com o inculo. Deixar solidificar em superfcie plana. 5.3 Incubao: Incubar as placas invertidas a 36 1C por 48 horas. 5.4 Leitura: Segundo o tipo de amostra em anlise, realizar a leitura selecionando as placas de acordo com o seguinte critrio, contando todas as colnias presentes: Produtos em geral: Placas que contenham entre 25 e 250 colnias;

Amostras de gua: Placas que contenham entre 30 e 300 colnias. 6. RESULTADOS A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes na amostra em anlise, seguindo as instrues contidas no Anexo IV, Procedimentos para contagem de colnias, deste Manual. Expressar o resultado em UFC/g ou mL. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA FRANK, J.F. Microbial spoilage of foods: Milk and dairy products. In: Food Microbiology Fundamentals and Frontiers. Michael P. Doyle, Beuchat, L.R.; Montville, T.J. (Eds.). ASM Press Washington D.C., p. 101-116. MORTON, R.D. Aerobic Plate Count.In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.63-67. CAPTULO II CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a contagem de bolores e leveduras em alimentos. Aplica-se a amostras de matrias-primas, alimentos e raes. 2. FUNDAMENTOS Baseia-se na verificao da capacidade desses microrganismos se desenvolverem em meios de cultura com pH prximo a 3,5 e temperatura de incubao de 25 1C. A utilizao de meios acidificados a pH 3,5 0,1 promove seletivamente o crescimento de fungos, inibindo a maioria das bactrias presentes no alimento. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; gar batata glicose 2%; L(+) cido tartrico 10%; Soluo salina peptonada 0,1%. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Preparo das placas Fundir o gar batata glicose. Resfriar em banho-maria at 46-48C. Acidificar o meio at pH 3,5 por meio da adio de 1,5 mL de soluo de cido tartrico 10% para cada 100 mL de meio. Verter nas placas cerca de 15 a 20 mL.

Deixar solidificar em superfcie plana. Identificar as placas. Antes da utilizao, secar as placas semi-abertas com o fundo voltado para cima em estufa a 50C por cerca de 15 minutos, ou em fluxo laminar expondo a superfcie pelo tempo necessrio para a completa secagem. 5.2 Pesagem e preparo da amostra Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL da amostra de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras, deste Manual. Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1%. Para amostras de doce de leite e de leite condensado, utilizar como diluente soluo salina peptonada com 20% de glicose. A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas, de acordo com o Anexo II, Diluies e solues, deste Manual. 5.3 Procedimentos de controle Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.4 Inoculao em placas Inocular 0,1 mL das diluies selecionadas sobre a superfcie seca de gar batata glicose 2% acidificado a pH 3,5. Com o auxlio de ala de Drigalski ou basto do tipo hockey, espalhar o inculo cuidadosamente por toda a superfcie do meio, at sua completa absoro. Utilizar no mnimo duas diluies decimais ou duplicata da mesma diluio. Nos casos em que a legislao exigir valores menores que 100 UFC/g ou mL, distribuir em duplicata 1 mL da diluio 10-1 em 3 placas (0,4 mL, 0,3 mL e 0,3 mL). No caso de produtos lquidos poder ser inoculado 0,1 mL diretamente da amostra (10), o que corresponder diluio 10-1. 5.5 Incubao: Incubar as placas, sem inverter, a 25 1C, por 5 a 7 dias, em incubadora de B.O.D. 5.6 Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 15 e 150 colnias. OBSERVAO: No abrir, em hiptese alguma, as placas que contenham crescimento de fungos, para evitar a contaminao ambiental por meio da disperso dos seus esporos. 6. RESULTADOS A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes de acordo com o Anexo IV, Procedimentos para a contagem de colnias, deste Manual. Expressar o resultado em UFC/g ou mL. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA TOURNAS, V.; STACK, M.E.; MISLIVEC, P.B.; KOCH, H.A.; BANDLER, R. Yeasts, molds and mycotoxins. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http://www.cfsan.fda.gov CAPTULO III

CONTAGEM DE MICRORGANISMOS MESFILOS AERBIOS VIVEIS CAPAZES DE CAUSAR ALTERAO EM PRODUTOS LCTEOS LQUIDOS UHT 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a contagem de microrganismos mesfilos aerbios viveis em produtos UHT, com excluso daqueles comprovadamente no patognicos e no causadores de alteraes fsicas, qumicas e organolpticas do produto. Detectar a presena de Bacillus sporothermodurans para diferenci-lo dos demais microrganismos mesfilos aerbios viveis. Aplica-se a amostras de produtos lcteos lquidos, tratados pelo processo UHT. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Pr-incubao: Baseia-se na incubao das amostras em estufa a 36 1C por 7 dias e posterior verificao da ocorrncia de alteraes das caractersticas do produto. 2.2 Contagem em placa: Baseia-se na semeadura da amostra e suas diluies em gar crebro-corao e em gar nutriente isento de extrato de levedura, seguida de incubao a 30 1C por 72 horas, e posterior identificao dos microrganismos presentes. 2.3 Limitaes do Mtodo: Devido opacidade produzida pela homogeneizao do meio de cultura com alguns tipos de amostras, pode haver dificuldade para a contagem de colnias na diluio 100. Nesses casos, o resultado final deve ser obtido nas diluies subseqentes, o que pode resultar em dados finais estimados. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; gar crebro-corao (ABHI); gar nutriente isento de extrato de levedura; gar esculina; Caldo crebro-corao nitrato (BHI-NO3); Caldo vermelho de fenol com glicose; Soluo salina peptonada 0,1%; gar uria; Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de para-aminodimetilanilina) ou tiras para teste de oxidase (comercialmente disponveis); Perxido de hidrognio 3%; Alfa-naftilamina 0,5%; cido sulfanlico 0,8%; Corantes para colorao de Gram; Zinco em p; Etanol 70% ou Etanol 70 GL; Reagentes para colorao de Gram. 4. EQUIPAMENTOS

Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Preparo da amostra: Aps a pr-incubao, as amostras visualmente inalteradas devem ser agitadas por 25 vezes. Antes da abertura, desinfetar externamente as embalagens com soluo desinfetante e aps com etanol 70% ou etanol 70 GL. Deixar secar. Com auxlio de tesouras ou bisturis previamente esterilizados, abrir a embalagem. Caso se observe alterao evidente (coagulao, floculao, dessorao, odor no caracterstico ou outros), interromper a anlise e reportar como produto alterado aps incubao a 36 1C por 7 dias. As amostras que apresentarem qualquer alterao no devem ser analisadas. Reportar o resultado como amostra alterada, incluindo informaes sobre o tipo de alterao observada. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Contagem em placas: Diluir a amostra em tubos contendo 9 mL de soluo salina peptonada 0,1% at 10-2. Pipetar 1mL diretamente da amostra (100) e 1 mL de cada uma das diluies preparadas -1 (10 e 10-2), transferindo-as para placas de Petri estreis, em duplicata. Adicionar cerca de 20 mL de gar crebro-corao (ABHI) a uma das placas de cada diluio. Nas demais, adicionar cerca de 20mL de gar nutriente isento de extrato de levedura. Homogeneizar adequadamente os meios com os inculos. Deixar solidificar. Inverter as placas. 5.4 Incubao: Incubar as placas a 30 1C por 72 horas. 5.5 Leitura: Verificar a presena de colnias nas placas, contando cada uma e observando suas caractersticas. Selecionar placas que contenham entre 25 e 250 colnias para a realizao da contagem. Se os resultados de contagem obtidos em ambos os meios forem coerentes entre si, proceder conforme Anexo IV, Procedimentos para contagem de colnias, deste Manual. Se os resultados forem discrepantes entre si, considerar o resultado obtido nas placas de ABHI. Quando o crescimento bacteriano devido presena de esporos de Bacillus sporothermodurans na amostra em anlise, ser observado nas placas de ABHI um abundante crescimento de colnias lisas, de forma regular, com colorao entre branco e bege, com dimetro mximo de 3 mm, facilmente identificveis. No gar nutriente isento de extrato de levedura, o Bacillus sporothermodurans comumente no forma colnias visveis, porm podero se desenvolver colnias puntiformes, de colorao entre branco e bege. Esta diferenciao necessria porque as colnias de B.sporothermodurans no devem ser contabilizadas no clculo de mesfilos aerbios viveis capazes de causar alterao no produto. Quando for observado crescimento em ambos os meios, realizar a contagem nas placas

de ABHI, registrando em separado o nmero de colnias suspeitas de serem Bacillus sporothermodurans, que devero ser confirmadas de acordo com o que segue: Repicar 3 a 5 colnias suspeitas para tubos com ABHI inclinado. Incubar a 36 1C por at 72h. Realizar os testes confirmatrios. 5.6 Colorao de Gram Preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram, conforme instrues constantes do Anexo VII, Procedimentos de colorao, deste Manual. Quando forem observados bastonetes Gram positivos, realizar a prova da catalase conforme item 5.7. Quando forem observados microrganismos com morfologia e caractersticas diferentes de bastonetes Gram positivos, reportar o nmero encontrado como a contagem total de microrganismos aerbios mesfilos. 5.7 Catalase: Com auxlio de ala de platina, palito de madeira, basto de vidro ou Pipeta de Pasteur, estreis, transferir a cultura para uma lmina ou placa de vidro contendo uma gota de perxido de hidrognio 3%. Misturar o inculo ao perxido e observar a reao. A no formao de borbulhas indica prova negativa para catalase. A formao de borbulhas indica prova positiva para catalase. A maioria dos membros do gnero Bacillus apresentam reao de catalase positiva. Quando a colorao de Gram demonstrar a presena de bastonetes Gram positivos e a prova da catalase for positiva para a cultura em teste, confirmar a presena de Bacillus sporothermodurans por meio das provas da oxidase, crescimento em anaerobiose, hidrlise da esculina, fermentao da glicose, reduo do nitrato e produo de urease, conforme abaixo descrito. 5.8 Oxidase: Usando ala de platina, Pipeta de Pasteur, palitos de madeira ou de plstico, descartveis e estreis, realizar a prova de oxidase, espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase ou sobre tiras para teste de oxidase. Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Aps esse tempo, reaes falso positivas podem ocorrer. O aparecimento de cor azul (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou vermelho intenso (oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de uma reao positiva. No utilizar alas de nquel-cromo ou alas de ao inoxidvel para realizar a prova de oxidase, pois traos de xido de ferro na superfcie flambada pode produzir reao falso positiva. O Bacillus sporothermodurans apresenta reao de oxidase positiva. 5.9 Crescimento em anaerobiose: Inocular a cultura em tubos de ABHI inclinados e incubar em jarra de anaerobiose a 36 1C por 72h. O Bacillus sporothermodurans no cresce em anaerobiose. 5.10 Hidrlise da esculina: Inocular a cultura, com agulha, em tubos contendo gar esculina inclinado. Incubar a 36 1C por 72h. A hidrlise da esculina evidenciada pelo enegrecimento do meio. O Bacillus sporothermodurans hidrolisa a esculina.

5.11 Fermentao da glicose: Semear tubos com caldo vermelho de fenol-base adicionados de glicose. Incubar a 36 1C por at 72 horas. A viragem de cor do indicador vermelho de fenol para amarelo indica a fermentao do acar presente. O Bacillus sporothermodurans no fermenta a glicose. 5.12 Reduo de nitrato: Inocular a cultura, com ala, em tubos contendo caldo BHINO3. Incubar a 36 1C por 72 horas. Aps incubao, adicionar aos tubos 0,5 a 1 mL de alfa naftilamina 0,5%, e 0,5 a 1 mL de cido sulfanlico 0,8%. O aparecimento de colorao rosa indica positividade para reduo de nitrato. Quando no houver desenvolvimento de colorao, adicionar ao tubo alguns miligramas de p de zinco. Nessa situao, o aparecimento de colorao rosa indica reao negativa, enquanto que o no desenvolvimento de cor indica positividade. O Bacillus sporothermodurans no reduz o nitrato a nitrito. 5.13 Prova da urease: Inocular a cultura, com ala, em tubos ou placas contendo gar uria. Incubar a 36 1C por 72h. Observar o crescimento com mudana de colorao para rosa intenso, o que indica positividade para produo de urease. O Bacillus sporothermodurans no produz urease. 6. RESULTADOS A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos mesfilos aerbios viveis presentes na amostra em anlise, seguindo as instrues contidas no Anexo IV, Procedimentos para contagem de colnias, deste Manual. O nmero de UFC/mL de Bacillus sporothermodurans no dever ser reportado como resultado da contagem de mesfilos aerbios. Quando estes microrganismos forem encontrados, fazer constar do campo OBS do Certificado Oficial de Anlise (COA): Presena de Bacillus sporothermodurans. Somente ser reportado o nmero de unidades formadoras de colnias de outros mesfilos encontrados. Devero ainda acompanhar o resultado da anlise informaes adicionais sobre o tipo de microrganismo encontrado (como por exemplo: cocos Gram positivos, bastonetes Gram negativos, flora mista, etc.) ou o(s) microrganismo(s) aerbio(s) presente(s), quando identificado(s). Os resultados de contagem de microrganismos mesfilos aerbios viveis em leite UHT a 30C por at 72 horas devem ser expressos em UFC/mL. Para todos os produtos UHT, o resultado da anlise de pr-incubao por 7 dias a 36 1C deve ser expresso como alterado ou sem alterao. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA BRASIL. Ministrio da Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrria. Secretaria de Defesa Agropecuria. Departamento de Defesa Animal. Manual de mtodos microbiolgicos para

alimentos. Coordenao Geral de Laboratrio Animal. 1991/1992 2 reviso. 136p. PETTERSSON, B.; LEMBKE, F.; HAMMER, P.; STACKEBRANDT, E.; PRIEST, F.G. Bacillus sporothermodurans, a new species producing highly-heat-resistant endospores. International Journal of Systematic Bacteriology, 1996. p. 759-764. SWANSON, K.M.J.; PETRAN, R.L.; HANLIN, J.H. Culture methods for enumeration of microorganisms. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p. 53-62. MORTON, R.D. Aerobic Plate Count. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.63-67. CAPTULO IV CONTAGEM DE Clostridium SULFITO REDUTORES E DE Clostridium perfringens 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a contagem de Clostridium sulfito redutores e de Clostridium perfringens em alimentos. Aplica-se a amostras de matrias-primas e alimentos. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Contagem: Baseia-se na inoculao da amostra ou de uma diluio da mesma em meios de cultura seletivos. Aps incubao em anaerobiose, os Clostridium formam colnias negras, devido reao de reduo de sulfito a sulfeto, que reage com citrato de amnio e ferro III, formando um precipitado negro. 2.2 Fermentao tempestuosa: Baseia-se na verificao da fermentao tempestuosa do leite presente no meio leite com ferro, caracterstica do Clostridium perfringens.p. Essa fermentao caracteriza-se por formao de cogulo bem definido, com grande formao de gs, durante incubao temperatura seletiva de 46 1C. 2.3 Testes confirmativos: A confirmao de Clostridium perfringens se faz por meio de provas confirmativas, com as quais se evidenciam suas caractersticas de: imobilidade, reduo de nitratos, produo de cido e gs a partir da lactose, fermentao da rafinose e liquefao da gelatina. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; Soluo salina peptonada 0,1%; gar triptose - sulfito - cicloserina (TSC)- base ou gar Sahid Ferguson Perfringens (SFP) -base; gar estoque; gar motilidade - nitrato tamponado;

Meio leite com ferro; Meio lactose-gelatina; Caldo vermelho de fenol-base; Soluo de rafinose 10% ; Caldo de carne cozida (opcional caldo Tarozzi); Meio tioglicolato; Alfa naftilamina 0,5%; cido sulfanlico 0,8%; Soluo de cicloserina 5%; Polimixina B; Kanamicina; Vaspar ou leo mineral ou parafina lquida; Gerador de anaerobiose; Reagentes para colorao de Gram. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g da amostra de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras, deste Manual. Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1% e homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Essa a diluio 10-1. 5.2 Procedimentos de controle Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Inoculao em Placas A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas de acordo com o Anexo II, Diluies e solues, deste Manual. A partir das diluies escolhidas, semear alquotas de 1 mL em placas estreis e adicionar cerca de 15 mL de gar TSC ou SFP em temperatura de 46 - 48C. Homogeneizar cuidadosamente e deixar solidificar em superfcie plana. Aps, adicionar uma segunda camada de cerca de 10 mL do mesmo meio. Deixar solidificar em superfcie plana. 5.4 Incubao: Imediatamente aps a solidificao do gar, incubar as placas (sem inverter), em jarra de anaerobiose a 36 1C por 18 a 24 horas. 5.5 Seleo e Isolamento: As colnias tpicas de Clostridium sulfito redutores so negras e de tamanho varivel de 1 a 3 mm no gar TSC e no gar SFP. Selecionar placas que contenham entre 20 e 200 colnias tpicas. Contar todas as colnias negras presentes. Anotar o resultado. Esse resultado, multiplicado pela diluio usada, corresponde ao nmero de Clostridium sulfito redutores presentes por grama da amostra em anlise. Escolher 5 colnias negras e repicar para tubos com gar estoque. Incubar em

anaerobiose a 36 1C por no mnimo 24 horas. Paralelamente, repicar para meio tioglicolato ou caldo de carne cozida (com selo estril de vaspar ou vaselina ou parafina lquida ou leo mineral). 5.6 Testes confirmativos para Clostridium perfringens 5.6.1 Colorao de Gram: A partir de cultura pura em gar estoque ou dos meios usados paralelamente, preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram. Quando for verificada a presena de bastonetes retos com extremidades arredondadas, Gram-positivos, realizar a prova de fermentao tempestuosa. 5.6.2 Fermentao tempestuosa (storm test): Transferir 1 mL da cultura fresca obtida no meio tioglicolato ou no caldo de carne cozida para um tubo contendo meio leite com ferro. Adicionar o selo estril e incubar a 46 1C em banho-maria por 6 horas (reincubar por maior tempo (12 a 18 h) quando o controle positivo no apresentar reao claramente positiva). Alternativamente, pode ser utilizada uma suspenso da cultura em teste, obtida pela lavagem da superfcie do gar estoque com soluo salina peptonada 0,1%, transferindo 1 mL desta para o meio leite com ferro. O Clostridium perfringens geralmente coagula o leite em at 6 horas a 46C, com formao de cogulo firme e grande quantidade de gs (fermentao tempestuosa). A partir das culturas que se apresentaram como C.perfringens na colorao de Gram e ofereceram resultado positivo na prova de fermentao tempestuosa, realizar as seguintes provas: 5.6.3 Prova da motilidade Inocular a cultura, com agulha, em gar motilidade-nitrato tamponado. Incubar em anaerobiose a 36 1C por 24 horas. O Clostridium perfringens imvel, com crescimento apenas ao longo da linha de inoculao. 5.6.4 Prova da reduo do nitrato: Aps a leitura da motilidade, acrescentar ao gar 0,5 a 1 mL de soluo de alfa-naftilamina 0,5% e 0,5 a 1 mL de cido sulfanlico 0,8%. O aparecimento de colorao vermelha indicar a reduo do nitrato a nitrito. Para confirmao do resultado negativo, acrescentar alguns miligramas de p de zinco. O aparecimento de uma cor rosa ser indicativo da no reduo do nitrato, enquanto que a no alterao de cor ser indicativa de reao positiva para reduo do nitrato. O Clostridium perfringens reduz nitrato a nitrito. 5.6.5 Fermentao da lactose e liquefao da gelatina: Inocular a cultura, com agulha, em vrios pontos do meio lactose-gelatina. Se o meio for utilizado 8 ou mais horas aps a sua preparao, regener-lo por aquecimento a 50C por 2 horas em banhomaria, antes da inoculao. Incubar em anaerobiose a 36 1C por 44 2h. Aps a incubao, manter os tubos em geladeira por 1 hora. Observar a fermentao da lactose pela produo de bolhas de gs e pela mudana da cor do meio de vermelho para amarelo e tambm a liquefao da gelatina por meio da permanncia do estado lquido aps o resfriamento por cerca de 1 hora em geladeira. O Clostridium perfringens fermenta a lactose e liquefaz a gelatina em 44 2h a 36 1C. 5.6.6 Fermentao da rafinose: Repicar a cultura para tubo contendo caldo para fermentao da rafinose. Aps inoculao, adicionar 1 a 2 mL de selo estril: vaspar ou vaselina ou parafina lquida ou leo mineral. Incubar a 36 1C por 72 2h.

Verificar a fermentao da rafinose pela viragem da cor do indicador vermelho de fenol para amarelo. As provas de liquefao da gelatina em 44 2h horas e a fermentao da rafinose em 72 2h tornam possvel a diferenciao entre Clostridium perfringens e outros clostrdios imveis e redutores de nitrato como o Clostridium celatum, Clostridium sardiniense e Clostridium paraperfringens. O Clostridium perfringens fermenta a rafinose dentro de 72 2h. CARACTERSTICAS DIFERENCIAIS DE CLOSTRDIOS Espcies de Clostridium C. perfringens A C.perfringens B C. absonum C. baratii C. celatum C. paraperfringens C. sardiniense Meio motilidade nitrato Motilidade Nitrato + + + + + + + Meio lactose-gelatina cido/ gs Liquefao.gelatina AG/T + (48h) AG/T + (48/72h) AG/CS -* AG/CS AG/CS AG/CS AG/CS -*

A = cido; AG = cido e gs; T = turbidez; CS = claro com sedimento celular; + = positiva; = negativa; (+) = fraco; = motilidade fraca; * = hidrlise lenta da gelatina 6. RESULTADOS 6.1 Clculo do nmero de Clostridium sulfito redutores presentes na amostra: Calcular o nmero de Clostridium sulfito redutores multiplicando o nmero de colnias negras contadas no gar TSC ou no gar SFP pelo fator de diluio usado, conforme recomendaes constantes do Anexo IV, Procedimentos para contagem de colnias, deste Manual. 6.2 Clculo do nmero de Clostridium perfringens: Considerar como Clostridium perfringens as colnias que se apresentarem, na colorao de Gram, como bastonetes Gram positivos, retos, com extremidades arredondadas, positivos para a prova de fermentao tempestuosa, imveis, redutores de nitrato, fermentadores da lactose em 44 2h, da rafinose em at 72 2h e capazes de hidrolizar a gelatina em 44 2h. A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes, de acordo com o Anexo IV, Procedimentos para a contagem de colnias, deste Manual. Expressar o resultado em UFC/g. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA RHODEHAMEL, E.J.; HARMON, S.M. Clostridium perfringens. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http://www.cfsan.fda.gov. LABBE, R.G. Clostridium perfringens. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.325-330.

MacFADDIN, J.F. Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria. Williams & Wilkins, Baltimore, USA, 1985. 928p. MacFADDIN, J.F. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. Lippincott Williams& Wilkins, Baltimore, USA, 2000. 912p. CAPTULO V CONTAGEM DE Staphylococcus aureus 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a contagem de Staphylococcus aureus. Aplica-se a amostras de matrias-primas e alimentos. Para os produtos destinados ao comrcio no MERCOSUL, a contagem final se referir apenas a Staphylococcus coagulase positiva. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Contagem: Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras em gar Baird-Parker, cuja composio evidencia a habilidade desse microrganismo de crescer na presena de 0,01 a 0,05% de telurito de potssio em combinao com 0,2 a 0,5 % de cloreto de ltio e 0,12 a 1,26% de glicina. O Staphylococcus aureus reduz anaerbia e aerobiamente o telurito de potssio, produzindo colnias negras. O gar Baird-Parker suplementado com soluo de gema de ovo possibilita a verificao das atividades proteoltica e lipoltica do Staphylococcus aureus , por meio do aparecimento de um halo de transparncia e um de precipitao ao redor da colnia, respectivamente. 2.2 Prova da coagulase: Baseia-se na comprovao da capacidade de coagular o plasma de coelho pela ao da enzima coagulase produzida pelo microrganismo. 2.3 Provas complementares 2.3.1 Colorao de Gram: Baseia-se na verificao das caractersticas morfolgicas e tintoriais do microrganismo. 2.3.2 Prova da termonuclease: Baseia-se na degradao do DNA em oligonucleotdeos pela ao da enzima DNAse produzida pelo microrganismo. A reao evidenciada pelo aparecimento de um halo de colorao rsea no gar azul de toluidina e de clarificao, quando utilizado o gar para teste de DNAse com verde de metila. 2.3.3 Prova da catalase: Baseia-se na capacidade da enzima catalase de decompor o perxido de hidrognio, liberando oxignio, o que evidenciado por meio da formao de borbulhas. 2.4 Limitaes do Mtodo: A metodologia para contagem de S. aureus, no que se refere aos resultados da prova de coagulase, apresenta limitaes quanto especificidade, devido ao fato de que algumas espcies de Staphylococcus relacionadas a animais, como o S. intermedius, S. hyicus, S. delphini e S. schleiferi ssp coagulans, tambm serem coagulase positivas. Cepas de S. schleiferi ssp schleiferi e algumas cepas de S. lugdunensis apresentam fraca reao na prova da coagulase. Alm disso, o S. schleiferi ssp schleiferi apresenta reao de termonuclease positiva.

3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; gar Baird-Parker - base; gar azul de toluidina - DNA ou gar para ensaio de DNAse, com verde de metila; gar estoque; Caldo crebro-corao (BHI); Soluo salina peptonada 0,1%; Soluo salina 0,85%; Emulso de gema de ovo a 50%; Telurito de potssio 3,5%; Plasma de coelho oxalatado ou com EDTA; Perxido de hidrognio 3%; Etanol 70% ou Etanol 70 GL; Reagentes para colorao de Gram. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g da amostra de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras, deste Manual. Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Essa a diluio 10-1. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Inoculao: A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas de acordo com o Anexo II, Diluies e solues, deste Manual. Inocular, sobre a superfcie seca do gar Baird-Parker, 0,1 mL de cada diluio selecionada. Com o auxlio de ala de Drigalski ou basto do tipo hockey, espalhar o inculo cuidadosamente por toda a superfcie do meio, at sua completa absoro. Utilizar no mnimo duas diluies decimais ou duplicata da mesma diluio. Nos casos em que a legislao exigir valores menores que 100 UFC/g ou mL, distribuir em duplicata 1 mL da diluio 10-1 em 3 placas (0,4 mL, 0,3 mL e 0,3 mL). No caso de produtos lquidos poder ser inoculado 0,1 mL diretamente da amostra (10o), o que corresponder diluio 10-1. 5.4 Incubao: Incubar as placas invertidas a 36 1C por 30 a 48 horas. 5.5 Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 20 e 200 colnias. Contar as colnias tpicas (T): negras brilhantes com anel opaco, rodeadas por um halo claro, transparente e destacado sobre a opacidade do meio. Contar tambm colnias atpicas (A): acinzentadas ou negras brilhantes, sem halo ou com

apenas um dos halos. Registrar separadamente as contagens de colnias tpicas e atpicas. Selecionar 3 a 5 colnias de cada tipo (T) e/ou (A) e semear cada colnia em tubos contendo BHI, para confirmao. Incubar a 36 1C, por 24 horas. Observao: para a obteno do nmero final de UFC/mL ou g, utilizar, de preferncia, apenas uma diluio, pois, uma colnia atpica pode tornar-se tpica na diluio subseqente em funo da maior disponibilidade de nutrientes e pela menor competio bacteriana. 5.6 Prova da coagulase: Transferir 0,3 mL de cada tubo de cultivo em BHI para tubos estreis contendo 0,3 mL de plasma de coelho. Incubar a 36 1C por 6 horas. Verificar a presena de cogulos, considerando os critrios a seguir: Reao negativa: no formao de cogulo; Reao 1+ : cogulo pequeno e desorganizado; Reao 2+ : cogulo pequeno e organizado; Reao 3+ : cogulo grande e organizado; Reao 4+: coagulao de todo o contedo do tubo, que no se desprender quando o tubo for invertido; Quando a reao de coagulao for do tipo 3+ e 4+, considerar a prova positiva para Staphylococcus aureus; Quando a reao de coagulao for negativa, considerar a prova negativa para Staphylococcus aureus. Quando a reao for duvidosa do tipo 1+ e 2+, repicar do mesmo caldo de cultura para um tubo contendo gar estoque ou outro contendo caldo BHI. Incubar a 36 1C por 24 horas, para a realizao dos testes complementares. 5.7 Testes complementares: A partir da cultura pura em BHI ou gar estoque, realizar as seguintes provas confirmativas: 5.7.1 Colorao de Gram: Preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram. A ausncia de cocos Gram positivos indica teste negativo para Staphylococcus aureus. A presena de cocos Gram positivos indica a necessidade da realizao de testes complementares. 5.7.2 Pesquisa de termonuclease: Fazer orifcios eqidistantes com cerca de 2 mm de dimetro no gar para ensaio de termonuclease ou no gar azul de toluidina - DNA, em placas previamente preparadas. Colocar os tubos das culturas, mantidos em caldo BHI, em banho-maria fervente por 15 minutos. Deixar esfriar e preencher completamente um orifcio para cada cultivo a ser analisado. Incubar a 36 1C por 4 horas ou a 50 2C por 2 horas. O aparecimento, ao redor dos orifcios, de um halo rosa no gar azul de toluidina ou de um halo de clarificao no agar para ensaio de DNAse com verde de metila, ser indicativo de reao positiva para termonuclease. Considerar como positivas as culturas que apresentarem halo de dimetro superior a 1 mm. O Staphylococcus aureus termonuclease positiva. 5.7.3 Prova da catalase: Com auxlio de ala de platina, basto de vidro, palito de madeira

ou Pipeta de Pasteur, estreis, retirar uma alquota do cultivo em gar estoque e transferir para uma lmina ou placa de vidro contendo uma gota de perxido de hidrognio a 3%. Misturar o inculo ao perxido e observar a reao. A no formao de borbulhas indica prova negativa para catalase. A formao de borbulhas indica prova positiva para catalase. O Staphylococcus aureus catalase positiva. 6. RESULTADOS Quando o nmero de colnias confirmadas for igual ao nmero de colnias selecionadas e repicadas, o resultado ser igual contagem inicial, levando-se em considerao a diluio utilizada. Quando o nmero de colnias confirmadas for diferente do nmero de colnias selecionadas e repicadas, calcular a proporo de colnias positivas de acordo com o Anexo IV, Procedimentos para contagem de colnias, deste Manual. O resultado final ser a soma dos resultados de colnias tpicas e atpicas confirmadas. Expressar o resultado como: Contagem de Staphylococcus aureus: X x 10y UFC/ g ou mL ou Contagem de Staphylococcus coagulase positiva: X x10y UFC/ g ou mL. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA BENNETT, R.W.; LANCETTE, G.A. Staphylococcus aureus. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponivel em: http://www.cfsan.fda.gov BRASIL. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento. Regulamentos tcnicos de identidade e qualidade de leite e produtos lcteos. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento/ Secretaria de Defesa Animal/ Departamento de Inspeo de Produtos de Origem Animal/ Diviso de Normas Tcnicas. Braslia, D.F. Srie Regulamentao Tcnica de Identidade e Qualidade de Produtos de Origem Animal; n.2. 1997, 77p. GUNN, B.A.Culture Media, Tests, and Reagents in Bacteriology. In: Clinical and Pathogenic Microbiology, Howard, B.J.; Keiser, J.F.; Smith, T.F. et all(Eds.). 2 ed. Mosby. St. Louis, 1994, p. 863-912. HOWARD. B. J.; KLOOS, W.E. Staphylococci. In: Clinical and Pathogenic Microbiology, Howard, B.J.; Keiser, J.F.; Smith, T.F. et all (Eds.). 2 ed. Mosby. St. Louis, 1994, p.243-256. LANCETTE, G. A.; TATINI, S.R. Staphylococcus aureus. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. P.387-403. MAC FADDIN, J.F. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clinica. Buenos Aires: Editorial Mdica Panamericana S.A. 1980, p. 39-49 e 50-60. MAC FADDIN, J.F. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. Lippincott Williams& Wilkins, Baltimore, USA, 2000. 912p. PAHO. Organizacin Panamericana de la Salud. Contaminacin microbiana de los alimentos vendidos en la va pblica en ciudades de Amrica Latina y caractersticas socioeconomicas de sus vendedores y consumidores. Almeida, C.R.; Schuch, D.M.T.; Gelli, D.S. et al. (Eds.). 1996, 176p. SALYERS, A.A; WHITT, D.D. Disease Without Colonization; Food-Borne Toxinoses caused by Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus, and Clostridium perfringens. In:

Bacterial Pathogenesis: A Molecular Approach. Washington: ASM, 1994, p. 130-140. VARNAM, A.H.; EVANS, M.G. Foodborne Pathogens Na illustrated text. London: Wolf Publishing Ltd, 1991.p. 235-265. CAPTULO VI CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES TERMOTOLERANTES EM ALIMENTOS 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a contagem de coliformes totais e coliformes termotolerantes em alimentos. Aplica-se a amostras de matrias-primas, alimentos e raes, devendo ser utilizada quando o limite mximo tolerado for igual ou superior a 100 UFC/g ou mL. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Prova presuntiva: Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras sob teste em gar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA) e posterior contagem das colnias suspeitas. O gar cristal violeta vermelho neutro bile apresenta em sua composio sais biliares e cristal violeta, responsveis pela inibio de microrganismos Gram positivos e vermelho neutro, um indicador de pH que revela a fermentao da lactose pelos microrganismos presentes. A adio de sobrecamada visa a preveno do crescimento e do espraiamento de colnias na superfcie do gar. 2.2 Prova confirmativa para coliformes totais; A confirmao da presena de coliformes totais feita por meio da inoculao das colnias suspeitas em caldo verde brilhante bile 2% lactose e posterior incubao a 36 1C. A presena de gs nos tubos de Durhan evidencia a fermentao da lactose presente no meio. O caldo verde brilhante bile 2% lactose apresenta em sua composio bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante) responsveis pela inibio de microrganismos Gram positivos. 2.3 Prova confirmativa para coliformes termotolerantes: A confirmao da presena de coliformes termotolerantes feita por meio da inoculao das colnias suspeitas em caldo EC e posterior incubao em temperatura seletiva de 45 0,2C, em banho-maria com agitao ou circulao de gua. A presena de gs nos tubos de Durhan evidencia a fermentao da lactose presente no meio. O caldo EC apresenta em sua composio uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante impedindo a sua acidificao. A seletividade devido a presena de sais biliares responsveis pela inibio de microrganismos Gram positivos. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidrarias e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; gar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA);

Caldo verde brilhante bile 2% lactose; Caldo EC; Soluo salina peptonada 0,1%. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. Banho-maria com movimentao de gua (agitao ou circulao). 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL da amostra de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual. Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Esta a diluio 10-1. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.4.1.2 Incubao: Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 48 horas. 5.4.1.3 Leitura: A presena de coliformes totais confirmada pela formao de gs (mnimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescncia quando agitado gentilmente. Anotar o resultado obtido para cada colnia, bem como a diluio utilizada. Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubados por mais 24 horas. 5.4.2 Coliformes termotolerantes 5.4.2.1 Inoculao: Inocular as culturas suspeitas de coliformes termotolerantes em tubos contendo caldo EC. 5.4.2.2 Incubao: Incubar os tubos a 45 0,2C, por 24 a 48 horas em banhomaria com agitao. 5.4.2.3 Leitura: A presena de coliformes termotolerantes confirmada pela formao de gs (mnimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescncia quando agitado gentilmente. Anotar o resultado obtido para cada tubo, bem como a diluio utilizada. Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubados por mais 24 horas. 6. RESULTADOS Para alimentos comercializados no MERCOSUL, os resultados de contagem de coliformes totais se referem determinao contagem de coliformes a 35C e os resultados da contagem de coliformes termotolerantes correspondem determinao coliformes a 45C. Para o clculo final das contagens de coliformes totais e termotolerantes, proceder de acordo com as indicaes contidas no Anexo IV, Procedimentos para contagem de colnias, deste Manual. Expressar o resultado em UFC/g ou mL.

7. BIBLIOGRAFIA C ONSULTADA BRASIL. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento. Regulamentos tcnicos de identidade e qualidade de leite e produtos lcteos. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento/ Secretaria de Defesa Animal/ Departamento de Inspeo de Produtos de Origem Animal/ Diviso de Normas Tcnicas. Braslia, D.F. Srie Regulamentao Tcnica de Identidade e Qualidade de Produtos de Origem Animal; n.2, 1997, 77p. ICMSF. Microorganismos de los Alimentos - Tcnicas de Anlisis Microbiolgico. International Commission on Microbiological Specifications for Foods. V.1. 2. ed. Acribia, Zaragoza, Espanha. HITCHINS, A.D.; FENG, P.; WATKINS W.D.; RIPPEY S.R.; CHANDLER L.A. Escherichia coli and the Coliform bacteria. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http://www.cfsan.fda.gov. KORNACKI, J.L.; JOHNSON, J.L. Enterobacteriaceae, Coliforms and Escherichia coli as Quality and Safety Indicators. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p. 69-82. CAPTULO VII CONTAGEM DE Bacillus cereus 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a contagem de Bacillus cereus. Aplica-se a matrias primas e alimentos. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Contagem: Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras sob teste em gar polimixina gema de ovo vermelho de fenol (MYP) ou em gar cereus (PEMBA). Em ambos adicionada emulso de gema de ovo que objetiva a verificao da produo de lecitinase pelo B.cereus . No gar PEMBA, a presena de 0,1% de peptona associada ao piruvato de sdio evidencia a precipitao da lecitina da gema do ovo adicionada ao meio. A polimixina B um agente seletivo utilizado nos dois meios, que atua sobre a flora acompanhante. No PEMBA, quando um grande nmero de leveduras esperado no alimento, poder ser adicionada tambm cicloheximide (40g/mL) como agente seletivo. Estes dois meios contm manitol, carbohidrato no fermentado pelo B.cereus . No MYP, o indicador de pH o vermelho de fenol e no PEMBA, o azul de bromotimol. 2.2 Provas Bioqumicas: A identificao bioqumica de Bacillus cereus baseia-se na verificao de produo de -hemolisina, motilidade em meio semislido, na capacidade de decomposio da tirosina, reduo do nitrato a nitrito, verificao do tipo de crescimento em superfcie de gar nutriente, e da no produo de corpsculos de incluso cristalina. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; Soluo salina peptonada 0,1%; gar nutriente; gar manitol gema de ovo polimixina segundo Mossel (MYP) ou gar cereus (PEMBA);

gar estoque; gar Columbia sangue de carneiro desfibrinado; gar tirosina; gar motilidade - nitrato; cido sulfanlico soluo 0,8%; Alfa-naftilamina soluo aquosa 0,5%; Polimixina B - soluo contendo 5.000 UI/mL; Emulso de gema de ovo 50%; Sangue de carneiro desfibrinado; cido actico 5N; Zinco em P; Reagentes para colorao de corpsculos de incluso cristalina; Reagentes para colorao de Gram. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL da amostra de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras, deste Manual. Adicionar 225 mL da soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Esta a diluio 10-1. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Inoculao A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas conforme o Anexo II, Diluies e solues, deste Manual. Inocular sobre a superfcie seca do gar MYP ou gar PEMBA 0,1 mL de cada diluio selecionada. Com auxilio de ala de Drigalski ou basto tipo hockey, espalhar o inculo cuidadosamente por toda a superfcie do meio at completa absoro. Utilizar, no mnimo, duas diluies decimais ou duplicata da mesma diluio. Nos casos em que for necessria a obteno de resultado menor que 100 UFC/g ou mL distribuir 1 mL da diluio 10-1 em 3 placas (0,4 mL, 0,3 mL e 0,3 mL). No caso de amostras lquidas, poder ser inoculado 0,1 mL diretamente da amostra. 5.4 Incubao: Incubar as placas invertidas a 30 1C por 30 a 48 horas. 5.5 Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 15 e 150 colnias. Contar as colnias rodeadas por um halo de precipitao opaco sobre um fundo rseo, no gar MYP e azul turquesa com aspecto recortado, com cerca de 5 mm de dimetro e rodeadas por halo de precipitao de lecitina hidrolizada, no gar PEMBA.

Selecionar 3 a 5 colnias tpicas e seme-las em tubos com gar estoque inclinado. Incubar a 36 1C por 24 horas. De cada tubo, fazer esfregao e corar pelo mtodo Gram para verificar a presena de bastonetes curtos Gram positivos, com extremidades quadradas dispostos em cadeias. Os esporos so centrais ou sub-terminais. Das culturas puras em gar estoque inclinado, realizar as seguintes provas: 5.6 Identificao Bioqumica 5.6.1 Motilidade e reduo de nitrato Inocular, com agulha, tubos contendo gar motilidade-nitrato. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Aps incubao, verificar o tipo de crescimento presente. Culturas imveis mostram crescimento apenas na linha de inoculao, enquanto que as mveis crescem de forma difusa. O Bacillus cereus em 50 a 90% dos casos mostra-se mvel. Aps a leitura da motilidade, adicionar aos tubos 2 a 3 gotas de alfa naftilamina 0,5% e 2 a 3 gotas de cido sulfanlico 0,8%. O aparecimento de colorao rosa indica positividade para reduo de nitrato. Quando no houver desenvolvimento de colorao, adicionar ao tubo alguns miligramas de p de zinco. Nesta situao, o aparecimento de colorao rosa indica reao negativa, enquanto que o no desenvolvimento de cor indica positividade. O Bacillus cereus reduz o nitrato a nitrito. 5.6.2 -hemlise em gar sangue de carneiro. Inocular por estria em placa com gar sangue de carneiro. Incubar a 36 1C por 24 horas. Observar a produo de -hemlise caracterstica do Bacillus cereus. Bacillus cereus produtor de -hemlise. 5.6.3 Decomposio da tirosina: Inocular por estrias a superfcie de gar tirosina (inclinado em tubo ou distribudo em placas). Incubar a 36 1C por 48 horas. Aps incubao, observar o aparecimento de uma zona clara prxima ao crescimento produzida pela decomposio da tirosina. Nos casos em que houver dvidas, reincubar por at 7 dias a 36 1C. O Bacillus cereus decompe a tirosina. 5.6.4 Crescimento rizide: Inocular com ala sobre a superfcie seca de gar nutriente, depositando o inculo no ponto central da placa. Incubar a 36 1C por 48 a 72 horas. Aps incubao verificar o tipo de crescimento. Crescimento rizide se caracteriza pelo aparecimento de colnias com longas extenses em forma de razes ou longos fios, tpicas de Bacillus mycoides. O Bacillus cereus no apresenta crescimento rizide, porm algumas cepas podem apresentar colnias rugosas em forma de galxia. 5.6.5 Teste para verificao da presena de corpsculos de incluso cristalina. A partir das culturas suspeitas repicadas em gar estoque inclinado (item 5.5) e deixadas em temperatura ambiente por 2 a 3 dias, verificar a presena de corpsculos de incluso cristalina procedendo conforme item 7 do Anexo VII, Procedimentos de colorao, deste Manual.

A presena de cristais tetragonais de toxina so abundantes em culturas velhas (3-4 dias) de Bacillus thuringiensis, que so liberados somente aps a lise do esporngio. Verifica-se ento a presena dos cristais e esporos livres. O Bacillus cereus no produz corpsculos de incluso cristalina. PROVAS DIFERENCIAIS PARA MICRORGANISMOS DO GNERO Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus megaterium cereus thuringiensis

Bacillus mycoides

Bacillus anthracis

Colorao de + +a + + + Gram Catalase + + + + + Motilidade b -c d Reduo de + + + nitrato Hemlise em + + + -d sangue de carneiro Decomp. da + + -d tirosina Corpsc.de + incluso cristalina Crescimento + rizide a: 90 a 100% so positivos b: 50 a 90% so positivos c: 90 a 100% so negativos d: a maioria negativa 6.RESULTADOS A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes na amostra em anlise seguindo as instrues contidas no Anexo IV, Procedimentos para contagem de colnias, deste Manual. Calcular o nmero de Bacillus cereus multiplicando o nmero de colnias confirmadas, nas provas confirmativas, pelo fator de diluio usado, conforme recomendaes constantes no Anexo III, Procedimentos bsicos de contagem, deste Manual. Expressar o resultado em UFC/g ou mL. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA BRASIL. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento. Regulamentos tcnicos de identidade e qualidade de leite e produtos lcteos. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento/ Secretaria de Defesa Animal/ Departamento de Inspeo de Produtos de Origem Animal/ Diviso de Normas Tcnicas. Braslia, D.F. Srie Regulamentao Tcnica de Identidade e Qualidade de Produtos de Origem Animal; n.2. 1997, 77p. BENNETT, R.W.and BEHY, N. . Bacillus cereus . In: Compendium of Methods for the

Microbiological Examination of Foods. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.). 4.ed. Washington DC: American Public Health Association, 2001, p.311-316 MAC FADDIN, J.F. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica. Buenos Aires: Editorial Mdica Panamericana S.A. 1980, 275p. RHODEHAMEL, E.J. and HARMON, S.M. Bacillus cereus. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http://www.cfsan.fda.gov. CAPTULO VIII CONTAGEM TOTAL DE ENTEROBACTRIAS 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a contagem de Enterobactrias. Aplica-se a amostras de produtos de origem animal. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Contagem: Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras testadas em gar cristal violeta vermelho neutro bile glicose (VRBG), cuja composio evidencia a habilidade dos microrganismos fermentarem a glicose com produo de cido, reao indicada por uma viragem do indicador a vermelho e a precipitao de sais biliares ao redor das colnias. A seletividade exercida pela presena de cristal violeta e bile no meio. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; gar cristal violeta vermelho neutro bile glicose (VRBG); gar estoque; Soluo salina peptonada 0,1%; Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de para-aminodimetilanilina), ou tiras de papel para teste de oxidase; Reativos para colorao de Gram. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos, obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL da amostra de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras, deste Manual. Adicionar 225 mL de soluo salina 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Esta a diluio 10-1. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Inoculao: A partir da diluio inicial (10-1), efetuar as demais diluies desejadas em soluo salina peptonada 0,1% de acordo com as instrues contidas no Anexo II, Diluies e

solues, deste Manual. Inocular 1 mL de cada diluio em placas de Petri esterilizadas. Adicionar a cada placa cerca de 15 mL de gar cristal violeta vermelho neutro bile glicose previamente fundido e mantido a 46C-48C em banho-maria. Homogeneizar cuidadosamente o inculo com o meio e deixar em repouso at total solidificao. Aps adicionar uma Segunda camada com o mesmo meio e deixar solidificar. 5.4 Incubao: Aps completa solidificao do meio, incubar as placas em posio invertida em temperatura de 36 1C por 18 a 24 horas. 5.5 Leitura: Selecionar placas que contenham entre 15 e 150 colnias. Contar as colnias de colorao vermelha, rodeadas ou no por halo de precipitao da bile presente no meio, com 0,5 a 2 mm de dimetro e anotar os resultados de contagem. Selecionar 3 a 5 colnias tpicas e repicar para tubos com gar estoque inclinado. Incubar a 36 1C por 24 horas. Realizar a prova da oxidase conforme o item 5.6. 5.6 Prova da oxidase: Usando ala de platina, Pipeta de Pasteur, palitos de madeira estreis, ou de plstico descartveis estreis, realizar a prova da oxidase espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase ou sobre tiras de papel com reativo para oxidase, comercialmente disponveis. Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Aps este tempo, reaes falso-positivas podem ocorrer. O aparecimento de cor azul (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou vermelho intenso (oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de reao positiva. No utilizar alas de nquel-cromo ou alas de ao inoxidvel para realizar a prova da oxidase, pois traos de xido de ferro na superfcie flambada podem produzir reao falsopositiva. Todas as enterobactrias apresentam reao de oxidase negativa. 5.7 Colorao de Gram: Das colnias oxidase negativas, preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram, seguindo as instrues contidas no Anexo VII, Procedimentos de colorao, deste Manual. Todas as enterobactrias apresentam-se como bastonetes Gram negativos. 6. RESULTADOS A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes de acordo com o Anexo IV, Procedimentos para a contagem de colnias, deste Manual. Expressar o resultado em UFC/g ou mL 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA KONEMAN, E.W.; ALLEN, S.D.; DOWELL, V.R.; JANDA, W.M.; SOMMERS, H.M.; WINN, W.C. Enterobacteriaceae . In: Diagnstico micro-biolgico. Texto y Atlas Color. 3ed. Mxico, D.F.: Editorial Medica Panamericana. 1997, p.203-267. MAC FADDIN , J.F. Pruebas Bioquimicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica. Buenos Aires: Editorial Mdica Panamericana S.A. 1980, 275 p. VARNAM, A.H.; EVANS, M.G. Foodborne Pathogens-Na illustrated text. London: Wolf

Publishing Ltd. 1991, 557p. CAPTULO IX NMERO MAIS PROVVEL DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES TERMOTOLERANTES EM GUA E GELO 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para determinao do Nmero Mais Provvel de coliformes totais e coliformes termotolerantes em amostras de gua e gelo. Aplica-se a amostras de gua e de gelo usados em estabelecimentos produtores de alimentos. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Prova presuntiva: Baseia-se na inoculao da amostra em caldo lauril sulfato de sdio, em que a presena de coliformes evidenciada pela formao de gs nos tubos de Durhan, produzido pela fermentao da lactose contida no meio. O caldo lauril sulfato de sdio apresenta, em sua composio, uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante, impedindo a sua acidificao. A seletividade do meio se deve presena do lauril sulfato de sdio, um agente surfactante aninico que atua na membrana citoplasmtica de microrganismos Gram positivos, inibindo o seu crescimento. 2.2 Prova confirmativa para coliformes totais: confirmao da presena de coliformes totais feita por meio da inoculao dos tubos positivos para a fermentao de lactose, na prova presuntiva, em caldo verde brilhante bile 2% lactose, e posterior incubao a 36 1C. A presena de gs nos tubos de Durhan do caldo verde brilhante evidencia a fermentao da lactose presente no meio. O caldo verde brilhante bile 2% lactose apresenta em sua composio bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante), responsveis pela inibio dos microrganismos Gram positivos. 2.3 Prova confirmativa para coliformes termotolerantes: A confirmao da presena de coliformes termotolerantes feita por meio da inoculao em caldo EC, com incubao em temperatura seletiva de 45 0,2C a partir dos tubos positivos obtidos na prova presuntiva. A presena de gs nos tubos de Durhan evidencia a fermentao da lactose presente no meio. O caldo EC apresenta em sua composio uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante, impedindo a sua acidificao. A seletividade do meio se deve presena de sais biliares, responsveis pela inibio dos microrganismos Gram positivos. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; Caldo lauril sulfato de sdio concentrao simples; Caldo lauril sulfato de sdio concentrao dupla; Caldo verde brilhante bile 2% lactose; Caldo EC; Soluo salina peptonada 0,1%.

4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. Banho-maria com movimentao de gua (agitao ou circulao). 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Preparo da amostra: Preparar a amostra de gua de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual. No caso de amostras de gelo, quando encaminhadas em frascos de boca larga, deixar descongelar no prprio frasco, sob refrigerao, pelo perodo necessrio para seu completo descongelamento. Antes do incio da anlise, homogeneizar bem. Quando o gelo for encaminhado em sacos plsticos, colocar a amostra dentro de outro saco plstico resistente (sem perfuraes) e deixar descongelar, sob refrigerao, pelo perodo necessrio para seu completo descongelamento. Aps descongelamento total, verificar a presena de gua no saco plstico de proteo da amostra, o que indica a presena de perfuraes na embalagem do gelo. Nesse caso, no analisar a amostra. Da mesma forma, as amostras de gelo que chegarem descongeladas ou em descongelamento devero ser descartadas. Quando a embalagem da amostra de gelo mostrar evidncias de que no continha perfuraes, aps o descongelamento total, homogeneizar bem e proceder anlise, seguindo o procedimento estabelecido para amostras de gua. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Prova presuntiva 5.3.1 Inoculao: Inocular volumes de 10 mL da amostra a ser analisada em uma srie de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao dupla. Inocular volumes de 1 mL da amostra na segunda srie de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao simples e volumes de 1 mL da diluio 10-1 na terceira srie de 3 tubos contendo o mesmo meio. Observao: caso seja necessrio um maior nmero de diluies, proceder de acordo com as instrues contidas no Anexo II, "Diluies e solues", deste Manual. Neste caso, inocular volumes de 1 mL de cada uma das diluies efetuadas em sries de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao simples. Quando o limite de aceitao for <2,0/100mL, usar sries de 5 tubos. Quando o limite de aceitao for <1,0/100mL, usar sries de 10 tubos. 5.3.2 Incubao: Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 48 horas. 5.3.3 Leitura: A suspeita de coliformes totais indicada pela formao de gs nos tubos de Durhan (mnimo 1/10 do volume total) ou efervescncia quando agitado gentilmente. Anotar o nmero de tubos positivos em cada srie de diluio. Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubados por mais 24 horas.

5.4 Prova confirmativa 5.4.1 Coliformes Totais 5.4.1.1 Inoculao: Repicar cada tubo positivo de caldo lauril sulfato de sdio obtido na prova presuntiva, para tubo contendo caldo verde brilhante bile 2% lactose. 5.4.1.2 Incubao: Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 48 horas. 5.4.1.3 Leitura: A presena de coliformes totais confirmada pela formao de gs (mnimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescncia quando agitado gentilmente. Anotar o nmero de tubos positivos em cada srie de diluio. Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubados por mais 24 horas. 5.4.2 Coliformes termotolerantes 5.4.2.1 Inoculao: Repicar cada tubo positivo de caldo lauril sulfato de sdio obtido na prova presuntiva, para tubo contendo caldo EC. 5.4.2.2 Incubao: Incubar os tubos a 45 0,2C, por 24 a 48 horas em banhomaria com agitao ou circulao de gua. 5.4.2.3 Leitura: A presena de coliformes termotolerantes confirmada pela formao de gs (mnimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescncia quando agitado gentilmente. Anotar o resultado obtido para cada tubo, bem como a diluio utilizada. Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubados por mais 24 horas. 6. RESULTADOS A partir da combinao de nmeros correspondentes aos tubos que apresentaram resultado positivo em cada um dos testes confirmativos (coliformes totais e coliformes termotolerantes), verificar o Nmero Mais Provvel de acordo com o Anexo III, "Procedimentos bsicos de contagem, deste Manual. Certificar-se que a tabela de NMP usada a indicada para o caso especfico. Expressar o valor obtido em NMP/100 mL. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA APHA Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 20 ed. Washington DC. Clesceri, L.S.; Greenberg, A.E.; Eaton, A.D.; Franson, M.A.H. (Ed.), 1998. p. 9.47-9.55. HITCHINS, A.D.; FENG, P.; WATKINS W.D.; RIPPEY S.R.; CHANDLER L.A. Escherichia coli and the Coliform bacteria. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http://www.cfsan.fda.gov. KORNACKI, J.L.; JOHNSON, J.L. Enterobacteriaceae, Coliforms and Escherichia coli as Quality and Safety Indicators. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p. 69-82. CAPTULO X NMERO MAIS PROVVEL DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES TERMOTOLERANTES EM ALIMENTOS

1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a determinao do Nmero Mais Provvel de coliformes totais e termotolerantes em alimentos. Aplica-se a amostras de matrias-primas e alimentos, devendo ser utilizada quando o limite mximo tolerado for inferior a 100 UFC/g ou mL. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Prova presuntiva: Baseia-se na inoculao da amostra em caldo lauril sulfato de sdio, em que a presena de coliformes evidenciada pela formao de gs nos tubos de Durhan, produzido pela fermentao da lactose contida no meio. O caldo lauril sulfato de sdio apresenta, em sua composio, uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante, impedindo a sua acidificao. A seletividade do meio se deve presena do lauril sulfato de sdio, um agente surfactante aninico que atua na membrana citoplasmtica de microrganismos Gram positivos, inibindo o seu crescimento. 2.2 Prova confirmativa para coliformes totais: A confirmao da presena de coliformes totais feita por meio da inoculao dos tubos positivos para a fermentao de lactose em caldo verde brilhante bile lactose 2% e posterior incubao a 36 1C. A presena de gs nos tubos de Durhan do caldo verde brilhante evidencia a fermentao da lactose presente no meio. O caldo verde brilhante bile lactose 2% apresenta, em sua composio, bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante), responsveis pela inibio dos microrganismos Gram positivos. 2.3 Prova confirmativa para coliformes termotolerantes: A confirmao da presena de coliformes termotolerantes feita por meio da inoculao em caldo EC, com incubao em temperatura seletiva de 45 0,2C a partir dos tubos positivos obtidos na prova presuntiva. A presena de gs nos tubos de Durhan evidencia a fermentao da lactose presente no meio. O caldo EC apresenta em sua composio uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante, impedindo a sua acidificao. A seletividade do meio se deve presena de sais biliares, responsveis pela inibio dos microrganismos Gram positivos. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; Caldo lauril sulfato de sdio concentrao simples; Caldo lauril sulfato de sdio concentrao dupla; Caldo verde brilhante bile lactose 2%; Caldo EC; Soluo salina peptonada 0,1%. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. Banho-maria com movimentao de gua (agitao ou circulao) 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Pesagem e preparo da amostra 5.1.1 Produtos slidos e pastosos: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL da amostra de

acordo com as instrues contidas no Anexo V, "Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual. Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Esta a diluio 10-1. 5.1.2 Produtos lquidos: Preparar as amostras de acordo com as instrues contidas no Anexo V, "Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Prova presuntiva 5.3.1 Inoculao 5.3.1.1 Produtos slidos, pastosos e creme de leite pasteurizado: A partir da diluio inicial (10-1), inocular volumes de 10 mL em srie de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao dupla (corresponde diluio 10). A seguir, inocular volumes de 1 mL da diluio inicial (10-1) em uma srie de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao simples. A partir da diluio 10-1, preparar a diluio 10-2 em soluo salina peptonada 0,1% de acordo com as instrues contidas no Anexo II, Diluies e solues, deste Manual. Inocular 1 mL da diluio 10-2 na terceira srie de 3 tubos. Havendo necessidade, outras diluies decimais podem ser inoculadas em sries de 3 tubos. 5.3.1.2 Produtos lquidos: Diretamente da amostra (100), inocular volumes de 1 mL em uma srie de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao simples. Transferir tambm 1 mL da amostra para tubo contendo soluo salina peptonada 0,1% de forma a obter a diluio 10-1. A partir da diluio10-1, efetuar as demais diluies desejadas em soluo salina peptonada 0,1% de acordo com as instrues contidas no Anexo II, Diluies e solues, deste Manual. A seguir, inocular volumes de 1 mL da diluio 10-1 na segunda srie de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao simples. Inocular 1 mL da diluio 10-2 na terceira srie de 3 tubos. Havendo necessidade, outras diluies decimais podero ser inoculadas em sries de 3 tubos. 5.3.2 Incubao: Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 48 horas. 5.3.3 Leitura: A suspeita de coliformes totais indicada pela formao de gs nos tubos de Durhan (mnimo 1/10 do volume total) ou efervescncia quando agitado gentilmente. Anotar o nmero de tubos positivos em cada srie de diluio. Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubados por mais 24 horas. 5.4 Prova confirmativa 5.4.1 Coliformes Totais 5.4.1.1 Inoculao: Repicar cada tubo positivo de caldo lauril sulfato de sdio obtido na

prova presuntiva, para tubo contendo caldo verde brilhante bile 2% lactose. 5.4.1.2 Incubao: Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 48 horas. 5.4.1.3 Leitura: A presena de coliformes totais confirmada pela formao de gs (mnimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescncia quando agitado gentilmente. Anotar o nmero de tubos positivos em cada srie de diluio. Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubados por mais 24 horas. 5.4.2 Coliformes Termotolerantes 5.4.2.1 Inoculao: Repicar cada tubo positivo de caldo lauril sulfato de sdio, obtido na prova presuntiva, para tubo contendo caldo EC. 5.4.2.2 Incubao: Incubar os tubos a 45 0,2C, por 24 a 48 horas em banho-maria com agitao ou circulao de gua. 5.4.2.3 Leitura: A presena de coliformes termotolerantes confirmada pela formao de gs (mnimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescncia quando agitado gentilmente. Anotar o resultado obtido para cada tubo, bem como a diluio utilizada. Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubados por mais 24 horas. 6. RESULTADOS A partir da combinao de nmeros correspondentes aos tubos que apresentaram resultado positivo em cada um dos testes confirmativos (coliformes totais e coliformes termotolerantes), verificar o Nmero Mais Provvel de acordo com o Anexo III, "Procedimentos bsicos de contagem, deste Manual. Certificar-se que a tabela de NMP usada a indicada para o caso especfico. Expressar o valor obtido em NMP/g ou mL. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA HITCHINS, A.D.; FENG, P.; WATKINS W.D.; RIPPEY S.R.; CHANDLER L.A. Escherichia coli and the Coliform bacteria. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http:// www.cfsan.fda.gov. KORNACKI, J.L.; JOHNSON, J.L. Enterobacteriaceae, Coliforms and Escherichia coli as Quality and Safety Indicators. In Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p. 69-82. CAPTULO XI NMERO MAIS PROVVEL DE Staphylococcus aureus 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a determinao do NMP de Staphylococcus aureus em alimentos. Aplica-se a amostras de alimentos em que os limites de aceitao determinados pela legislao encontram-se abaixo de 100 UFC/g ou mL.

2. FUNDAMENTOS 2.1 Determinao do NMP: Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras sob teste em caldo telurito manitol glicina, segundo Giolitti e Cantoni ou Caldo soja triptona com sal 10%- piruvato de sdio 1% (TSB-NP), com posterior confirmao em gar Baird-Parker. No caldo TSB-NP, a alta concentrao de NaCl (10%) atua seletivamente, inibindo o crescimento de microbiota acompanhante que no apresente capacidade de se desenvolver nesta condio. O Staphylococcus aureus reduz, anaerbia e aerobiamente, o telurito de potssio, produzindo escurecimento do caldo Giolitti e Cantoni, bem como colnias negras no gar BairdParker. O gar Baird-Parker, enriquecido com soluo de gema de ovo, possibilita a evidenciao das atividades proteoltica e lipoltica do Staphylococcus aureus, respectivamente, por meio do aparecimento de um halo de precipitao e um de transparncia ao redor da colnia. Prova da coagulase Baseia-se na comprovao da capacidade do microrganismo de coagular o plasma de coelho pela ao da enzima coagulase. 2.3 Provas complementares 2.3.1 Colorao de Gram: Baseia-se na verificao das caractersticas morfolgicas e tintoriais do microrganismo. 2.3.2 Prova da termonuclease: Baseia-se na degradao do DNA em oligonucleotdeos pela ao da enzima DNAse produzida pelo microrganismo. A reao evidenciada pelo aparecimento de um halo de colorao rsea no gar azul de toluidina e de clarificao, quando utilizado o gar para teste de DNAse com verde de metila. 2.3.3 Prova da catalase: Baseia-se na capacidade da enzima catalase de decompor o perxido de hidrognio, liberando oxignio, o que evidenciado por meio da formao de borbulhas. 2.4 Limitaes do Mtodo: A metodologia para contagem de S. aureus, no que se refere aos resultados da prova de coagulase, apresenta limitaes quanto especificidade, devido ao fato de algumas espcies de Staphylococcus relacionadas a animais, como o S. intermedius, S. hyicus, S. delphini e S. schleiferi ssp coagulans, tambm serem coagulase positivas. Cepas de S. schleiferi ssp schleiferi e algumas cepas de S. lugdunensis apresentam fraca reao na prova da coagulase. Alm disto, o S. schleiferi ssp schleiferi apresenta reao de termonuclease positiva. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; gar Baird-Parker-base; gar azul de toluidina - DNA ou gar para ensaio de DNAse com verde de metila; gar estoque; Caldo soja triptona sal 10%-piruvato de sdio 1% (TSB-NP) ou Caldo telurito manitol glicina segundo; Giolitti e Cantoni (GC); Caldo crebro-corao (BHI); Soluo salina peptonada 0,1%; Soluo salina 0,85%;

Soluo de azul de toluidina 1%; Emulso de gema de ovo a 50%; Telurito de potssio 3,5%; Plasma de coelho oxalatado ou com EDTA; Perxido de hidrognio 3%; Etanol 70% ou Etanol 70 GL; Reagentes para colorao de Grm. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Pesagem e preparo da amostra 5.1.1 Alimentos slidos: Pesar 25 0,2 g da amostra de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras, deste Manual. Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos no stomacher. Esta a diluio10-1. A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas de acordo com o Anexo II, Diluies e solues, deste Manual. Inocular 1 mL de cada diluio selecionada em trs sries de trs tubos contendo caldo telurito manitol glicina (GC) ou caldo TSBNP. Adicionar a cada tubo de caldo GC uma camada de 1 a 2 mL de selo estril (vaspar, vaselina, leo mineral ou parafina lquida, estreis e previamente fundidos). 5.1.2 Alimentos lquidos: Pipetar 1 mL diretamente da amostra e tranferir para cada um dos trs tubos contendo caldo GC ou caldo TSB-NP. Transferir tambm 1 mL da amostra para um tubo contendo 9 mL de soluo salina peptonada 0,1% (diluio 10-1). A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas de acordo com o Anexo II, Diluies e solues, deste Manual. Inocular 1 mL das duas diluies subseqentes em sries de trs tubos com caldo GC ou caldo TSB-NP. Adicionar uma camada de 1 a 2 mL de selo estril (vaspar, vaselina, leo mineral ou parafina lquida, estreis e previamente fundidos) a cada tubo de caldo GC. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Incubao: Incubar a 36 1C por 48 horas. 5.4. Leitura: Fazer a leitura anotando os tubos que apresentarem escurecimento: do meio ou precipitado negro em caldo GC e turvao em: caldo TSB-NP. 5.5. Provas confirmatrias: Com pipetas de Pasteur estreis, retirar do fundo de cada tubo de caldo GC positivo uma gota da cultura e coloc-la sobre a superfcie seca de gar BairdParker, junto borda da placa, estriando posteriormente com ala, de forma a obter colnias

isoladas. A partir dos tubos de caldo TSB-NP que apresentarem turvao, com auxlio de ala de platina ou nquel-cromo, repicar sobre a superfcie seca de gar Baird-Parker. Incubar a 36 1C por 30 a 48 horas. Selecionar de 2 a 3 colnias negras, brilhantes, com anel opaco de precipitao e/ou rodeadas por halo transparente, correspondentes a cada um dos tubos positivos e repicar cada colnia para um tubo contendo caldo BHI. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. A partir das culturas em BHI, efetuar a prova da coagulase. 5.5.1 Prova da coagulase: Transferir 0,3 mL de cada tubo de cultivo em BHI para tubos estreis contendo 0,3 mL de plasma de coelho. Incubar a 36 1C, por 6 horas. Verificar a presena de cogulos, considerando os critrios a seguir: Reao negativa: no formao de cogulo; Reao 1+ : cogulo pequeno e desorganizado; Reao 2+ : cogulo pequeno e organizado; Reao 3+ : cogulo grande e organizado; Reao 4+: coagulao de todo o contedo do tubo que no se desprender quando o tubo for invertido; Quando a reao de coagulao for do tipo 3+ e 4+, considerar a prova positiva para Staphylococcus aureus; Quando a reao de coagulao for negativa, considerar a prova negativa para Staphylococcus aureus; Quando a reao for duvidosa do tipo 1+ e 2+, repicar do mesmo caldo de cultura para um tubo contendo gar estoque ou caldo BHI. Incubar a 36 1C por 24 horas para a realizao dos testes complementares. 5.6 Testes complementares: A partir da cultura pura em caldo BHI ou gar estoque, realizar as seguintes provas confirmativas: 5.6.1 Colorao de Gram: Preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram. A ausncia de cocos Gram positivos indica teste negativo para Staphylococcus aureus. A presena de cocos Gram positivos indica a necessidade da realizao de testes complementares. 5.6.2 Pesquisa da termonuclease: Fazer orifcios eqidistantes, com cerca de 2 mm de dimetro, no gar para ensaio da termonuclease ou no gar azul de toluidina - DNA, em placas previamente preparadas. Colocar os tubos das culturas mantidas em caldo BHI em banho-maria fervente por 15 minutos. Deixar esfriar e preencher completamente um orifcio para cada cultivo a ser analisado. Incubar a 36 1C por 4 horas ou a 50 2C por 2 horas. O aparecimento de um halo rosa no gar azul de toluidina ou de um halo de clarificao no gar para ensaio de DNAse com verde de metila, ser indicativo de reao positiva para termonuclease. Considerar como positivas as culturas que apresentarem halo de dimetro superior a 1 mm. O Staphylococcus aureus termonuclease positiva. 5.6.3 Prova da catalase Com auxlio de ala de platina, basto de vidro, palito de madeira ou pipeta de Pasteur, estreis, retirar uma alquota do cultivo em gar estoque e transferir para uma lmina ou placa de vidro contendo uma gota de perxido de hidrognio a 3%. Misturar o inculo ao perxido e observar a reao.

A no formao de borbulhas indica prova negativa para catalase. A formao de borbulhas indica prova positiva para catalase. O Staphylococcus aureus catalase positiva. 6. RESULTADOS A partir da combinao de nmeros correspondentes aos tubos que apresentaram resultado positivo em cada um dos testes confirmativos, verificar o Nmero Mais Provvel de acordo com o Anexo III, Procedimentos bsicos de contagem, deste Manual. Certificar-se de que a tabela de NMP em uso a indicada para cada caso especfico. Expressar o valor obtido em NMP/g ou mL. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA AOAC Official Method 987.09 Staphylococcus aureus in Foods: most probable number method for isolation and enumeration. In: Microbiological Methods. 17 ed., AOAC, Andrews, W.H. (Ed.), cap. 17.5.01, 1998. BENNETT, R.W.; LANCETTE, G.A. Staphylococcus aureus In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http://www.cfsan.fda.gov BRASIL. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento. Regulamentos tcnicos de identidade e qualidade de leite e produtos lcteos. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento/ Secretaria de Defesa Animal/ Departamento de Inspeo de Produtos de Origem Animal/ Diviso de Normas Tcnicas. Braslia, D.F. Srie regulamentao tcnica de identidade e qualidade de produtos de origem animal; n.2. 1997, 77p. GUNN, B.A.Culture Media, Tests, and Reagents in Bacteriology. In: Clinical and Pathogenic Microbiology, Howard, B.J.; Keiser, J.F.; Smith, T.F. et all(Eds.). 2 ed. Mosby. St. Louis, 1994, p. 863-912. HOWARD. B. J.; KLOOS, W.E. Staphylococci. In: Clinical and Pathogenic Microbiology, Howard, B.J.; Keiser, J.F.; Smith, T.F. et all (Eds.). 2 ed. Mosby. St. Louis, 1994, p.243-256. LANCETTE, G. A.; TATINI, S.R. Staphylococcus aureus . In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. P.387-403. MAC FADDIN, J.F. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bactrias de importncia clinica. Buenos Aires. Editorial Mdica Panamericana S.A. 1980, p. 39-49 e 50-60. MAC FADDIN, J.F. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. Lippincott Williams& Wilkins, Baltimore, USA, 2000. 912p. CAPTULO XII NMERO MAIS PROVVEL DE Vibrio parahaemolyticus 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a determinao do nmero mais provvel de Vibrio parahaemolyticus. Aplica-se a amostras de pescado e derivados. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Provas presuntivas 2.1.1 Enriquecimento em caldo seletivo Inoculao em meio de cultura de enriquecimento seletivo: caldo glicose sal Teepol (GSTB) ou caldo Horie arabinose violeta de etila (HAEB), em

que a presena de Vibrio parahaemolyticus evidenciada pela turvao do meio aps a incubao. Em sua composio, o meio GSTB apresenta teepol, soluo aquosa de sulfatos de sdio alcalinos primrios que atuam na membrana citoplasmtica de microrganismos Gram positivos, inibindo o seu crescimento e formalina que funciona como um agente antimicrobiano. Como o Vibrio parahaemolyticus halfilo obrigatrio, os dois meios contm 3% de cloreto de sdio. 2.1.2 Isolamento em gar tiosulfato citrato sacarose sais biliares (TCBS) Isolamento se realiza em gar TCBS, meio seletivo altamente alcalino que contm elevada concentrao de tiossulfato e citrato de sdio, responsveis pela inibio do crescimento das enterobactrias presentes. A bile e o colato de sdio inibem os enterococos. Como indicador de pH, o meio possui o azul de timol e o azul de bromotimol que alteram a cor do meio para amarelo quando da formao de cido pelos microrganismos que fermentam a sacarose contida no meio. 2.2 Provas de identificao: A identificao de Vibrio parahaemolyticus feita por meio de provas bioqumicas, sorolgicas, morfolgicas e tintoriais. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; gar Meller-Hinton sal 3%; gar nutriente sal 3%; gar gelatina sal 3%; gar soja triptona sal 3%; gar tiosulfato citrato sacarose sais biliares (TCBS); gar ferro trs acares (TSI) sal 3% ou gar Kligler sal 3%; gar motilidade sal 3%; Caldo glicose sal teepol (GSTB) ou Caldo Horie arabinose violeta de etila (HAEB); Caldo peptonado sem sal; Caldo peptonado sal 3%; Caldo peptonado sal 6%; Caldo peptonado sal 8%; Caldo peptonado sal 10%; Caldo ONPG sal 3%; Caldo vermelho de fenol manitol sal 3%; Caldo vermelho de fenol sacarose sal 3%; Caldo vermelho de fenol arabinose sal 3%; Caldo vermelho de fenol arginina sal 3%; Caldo vermelho de fenol lisina sal 3%; Meio O/F (Hugh-Leifson) sal 3%; Soluo salina peptonada 0,1% sal 3%; Soluo fisiolgica (NaCl 0,85%); Agente vibriosttico O 129 10g ; Agente vibriosttico O 129 150 g; Arabinose; L-arginina;

L-lisina; Manitol; Sacarose; leo mineral ou parafina lquida estreis; Reativo para Oxidase (oxalato de para-amino-dimetilanilina ou N'N'N'N'-tetrametilparafenileno-diamina); Teepol; O-nitrofenil--D-galactopiranosdeo ou p-nitrofenil--D-galactosdeo; Etanol 96%; Reagentes para colorao de Gram. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Preparo e Pesagem: Preparar a amostra de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual. Pesar 50g da amostra. Adicionar 450 mL de Caldo peptonado sal 3%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Esta a diluio 10-1. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Provas presuntivas 5.3.1 Inoculao em caldo de enriquecimento seletivo: A partir da diluio inicial (10-1), efetuar as demais diluies desejadas em Caldo peptonado sal 3% (no mnimo mais duas diluies) de acordo com as instrues contidas no Anexo II, Diluies e solues, deste Manual. Inocular volumes de 1 mL de cada uma das diluies desejadas em sries de 3 tubos contendo GSTB ou caldo HAEB. 5.3.2 Incubao: Incubar os tubos a 36 1C por 18 horas a 24 horas. 5.3.3 Leitura: A presena de turvao do meio indica a suspeita da presena de Vibrio parahaemolyticus. Anotar o nmero de tubos de cada srie que apresentaram turvao. 5.3.4 Isolamento em gar tiosulfato citrato sais biliares (TCBS) 5.3.4.1 Inoculao: A partir de cada tubo de GSTB ou HAEB que apresentar turvao, sem agit-lo e com auxlio de uma ala de nquel-cromo, de platina ou descartvel estril, retirar uma alada do crescimento da superfcie e estri-la sobre a superfcie seca de gar tiosulfato citrato sacarose sais biliares (TCBS). 5.3.4.2 Incubao: Incubar as placas em posio invertida a 36 1C por 24 horas. 5.3.4.3 Leitura: Verificar o aparecimento de colnias arredondadas, opacas, de cor azul esverdeada, com 2 a 3 mm de dimetro, tpicas de Vibrio parahaemolyticus. Quando no houver colnias suspeitas, o resultado ser negativo para o tubo de origem. 5.4 Provas preliminares para identificao de Vibrio parahaemolyticus De cada placa, selecionar de 2 a 3 colnias tpicas e transfer-las simultaneamente para tubos contendo caldo peptonado sal 3% e gar nutriente sal 3% inclinado.

Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. 5.4.1 Colorao de Gram: A partir do cultivo mantido em gar nutriente sal 3%, proceder colorao de Gram de acordo com as instrues descritas no Anexo VII, Procedimentos de colorao, deste manual. O Vibrio parahaemolyticus se apresenta como bastonetes retos ou curvos Gram negativos. Em culturas antigas, pode se apresentar em forma de cocobacilos. 5.4.2 Crescimento com 8% de sal e sem sal: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, transferir, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, uma alada para um tubo contendo caldo peptonado sem sal e caldo peptonado sal 8%. Incubar os tubos a 36 1C por 18 a 24 horas. Aps o perodo de incubao, verificar a presena de turvao indicativa da ocorrncia de crescimento. O Vibrio parahaemolyticus no cresce no meio sem sal e cresce no meio com 8% de sal. 5.4.3 Prova da oxidase: A partir do cultivo mantido em gar nutriente sal 3%, usando palitos de madeira, de plstico descartveis, pipetas Pasteur, ou ala de platina, realizar a prova de oxidase espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase ou sobre tiras de papel para teste de oxidase, comercialmente disponveis. Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Aps este tempo, podem ocorrer reaes falsopositivas. O aparecimento de cor azul (quando usado o reativo N'N'N'N'-tetrametil-parafenilenodiamina) ou de cor vermelha intensa (quando o reativo usado o oxalato de para-aminodimetilanilina) indicativo de reao positiva. OBS: No utilizar alas de nquel-cromo ou alas de ao para realizar a prova de oxidase, pois traos de xido de ferro na superfcie flambada podem produzir reao falso-positiva. O Vibrio parahaemolyticus oxidase positiva 5.4.4 Caldo vermelho de fenol sacarose sal 3%: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, inocular, com auxlio de ala de nquel-cromo, um tubo contendo caldo vermelho de fenol sacarose sal 3%. Cobrir o meio com 2 a 3 mL de leo mineral ou parafina lquida, estreis. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Aps o perodo de incubao, observar a mudana de colorao do meio, de vermelho para amarelo, devido fermentao da sacarose e produo de cido. O Vibrio parahaemolyticus no altera a colorao do meio pois no capaz de fermentar a sacarose. 5.4.5. gar ferro trs acares sal 3% (TSI) ou gar Kligler ferro sal 3% A partir do cultivo mantido no gar nutriente sal 3% inclinado, com auxlio de agulha de platina ou nquel-cromo, inocular, mediante picada central em toda a profundidade do gar e estriando a superfcie inclinada, tubos com gar TSI sal 3% ou gar Kligler ferro sal 3%. Incubar a 36 1C por 24 horas. O Vibrio parahaemolyticus apresenta base cida (amarela), sem gs, sem produo de H2S e bisel alcalino (vermelho). 5.4.6 Teste ONPG: A partir da cultura em TSI, inocular uma alada espessa em tubo contendo 0,5 mL de caldo ONPG sal 3%. Incubar em banho-maria a 36 1C, durante 2 horas. Examinar os tubos , verificando o aparecimento ou no de cor amarela, indicativa de reao positiva. Se o caldo permanecer incolor, a reao negativa.

O Vibrio parahaemolyticus ONPG negativo. 5.5 Provas adicionais para identificao de Vibrio parahaemolyticus As colnias que apresentarem comportamento compatvel com V.parahaemolyticus nas provas preliminares, devero ser submetidas s provas adicionais, conforme descrito em 5.5.1 a 5.5.9. 5.5.1 Teste do crescimento a 42C: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo caldo peptonado sal 3%. Incubar a 42 1C por 24 horas. Aps o perodo de incubao, observar a presena de turvao dos meios. O vbrio parahaemolyticus cresce temperatura de 42C. 5.5.2 gar gelatina sal 3%: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular uma placa de Petri contendo gar gelatina sal 3% (cada placa pode ser dividida em at 6 setores e cada cultivo pode ser inoculado no centro de cada setor). Incubar as placas a 36 1C por 18 a 24 horas. Colocar as placas em refrigerao por alguns minutos antes e realizar a leitura, o que facilita a vizualizao do halo. O aparecimento de um halo opaco ao redor do crescimento indica a presena da gelatinase. O Vibrio parahaemolyticus gelatinase positiva. 5.5.3 Teste da motilidade: A partir da cultura mantida no gar nutriente sal 3% inclinado, com auxlio de agulha de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, atravs de picada central, inocular um tubo contendo gar motilidade sal 3%. Incubar a 36 1C por 24 horas. Um crescimento bacteriano difuso ao redor da picada caracteriza motilidade positiva. O Vibrio parahaemolyticus apresenta motilidade positiva. 5.5.4 Prova de Hugh-Leifson glicose (OF): A partir do cultivo mantido em gar nutriente sal 3% , inocular, com auxlio de agulha de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, dois tubos contendo meio OF glicose (Hugh-Leifson) sal 3%. Cobrir um dos tubos com 2 a 3 mL de leo mineral ou parafina lquida, estril. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Aps o perodo de incubao, verificar a viragem de cor dos meios de verde para amarelo e a presena de bolhas de gs nos meios. A cor amarela nos dois tubos significa fermentao da glicose. A presena de cor amarela somente no tubo sem leo mineral significa utilizao oxidativa da glicose. O Vibrio parahaemolyticus fermenta a glicose sem produo de gs, ou seja, os dois tubos devem apresentar colorao amarela. 5.5.5 Descarboxilao da lisina: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo Caldo vermelho de fenol lisina sal 3%. Inocular tambm um tubo contendo meio base (sem adio do aminocido) que servir de controle. Cobrir os tubos com 2 a 3 mL de leo mineral ou parafina lquida, estril.

Incubar a 36 1C por, no mximo, 4 dias, juntamente com um tubo de Caldo vermelho de fenol lisina sal 3% no inoculado, que servir de controle negativo. Examinar os tubos todos os dias. Durante o perodo de incubao, a cor do meio passa para amarela devido fermentao da glicose, e, ocorrendo a descarboxilao da lisina, o meio retorna cor prpura devido produo de aminas primrias e dixido de carbono. O tubo controle, sem aminocido, deve virar para amarelo e assim permanecer. O Vibrio parahaemolyticus descarboxila a lisina. 5.5.6 Hidrlise da arginina: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo caldo arginina sal 3%. Inocular tambm um tubo contendo o meio base (sem adio do aminocido) que servir de controle. Cobrir os tubos com 2 a 3 mL de leo mineral ou parafina lquida, estril. Incubar a 36 1C por, no mximo, 4 dias, juntamente com um tubo de caldo arginina sal 3% no inoculado, que servir de controle negativo. Examinar os tubos todos os dias. Durante o perodo de incubao, a cor do meio passa para amarela devido fermentao da glicose, e, ocorrendo a hidrlise da arginina, o meio retorna a cor prpura devido produo de aminas primrias e dixido de carbono. O tubo controle, sem aminocido, deve virar para amarelo e assim permanecer. O Vibrio parahaemolyticus no hidrolisa a arginina. 5.5.7 Prova da fermentao do manitol e arabinose: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo caldo vermelho de fenol manitol sal 3% e outro tubo contendo caldo vermelho de fenol arabinose sal 3%. Cobrir o meio com 2 a 3 mL de leo mineral ou parafina lquida, estril. Incubar a 36 1C por 24 horas. Aps o perodo de incubao, observar a mudana de colorao dos meios de vermelho para amarelo, devido fermentao dos acares e conseqente produo de cido. 99% das cepas de Vibrio parahaemolyticus fermenta o manitol. 50% das cepas de Vibrio parahaemolyticus fermenta a arabinose. 5.5.8 Teste do halofilismo: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular tubos contendo caldo peptonado sal 6% e 10%. Incubar a 36 1C por 24 horas. Aps o perodo de incubao, observar a presena de turvao nos meios. O Vibrio parahaemolyticus cresce a 6% de sal e no cresce, ou apresenta crescimento discreto, a 10% de sal. 5.5.9 Sensibilidade do agente vibriosttico O/129 Esta prova utilizada como diferencial entre Vibrio parahaemolyticus e V. vulnificus. Embeber um swab previamente esterilizado com a cultura suspeita mantida em caldo peptonado sal 3% e inocular uma placa contendo gar Meller-Hinton sal 3% ou agar soja triptona sal 3%, espalhando bem o inculo, de forma a obter um crescimento o mais homogneo possvel. Deixar as placas absorverem o inculo. Colocar um disco do agente vibriosttico O/129 com concentrao de 10g e um disco de

concentrao de 150g. Incubar as placas a 36 1C por 24 horas. O Vibrio parahaemolyticus resistente concentrao de 10g de agente vibriosttico O/129 enquanto o V. vulnificus sensvel. Todos os vbrios so sensveis concentrao de 150g do agente O/129. 6. RESULTADOS Sero consideradas como positivas para Vibrio parahaemolyticus as culturas que apresentarem os seguintes resultados nas provas adicionais de identificao: Motilidade - positiva Hugh Leifson (OF) - glicose fermentativo Descarboxilao da lisina - positivo Hidrlise da arginina - negativo Crescimento a 42C - positivo Fermentao do manitol - positivo Fermentao da arabinose - positivo Sensibilidade ao Agente Vibriosttico O/129 - 10g - resistente Sensibilidade ao Agente Vibriosttico O/129 - 150g - sensvel gar gelatina sal 3% - crescimento com formao de halo Halofilismo (6% sal) - positivo Halofilismo (8% sal) - positivo Halofilismo (10% sal) - negativo ou crescimento discreto A partir da combinao de tubos com resultado positivo em cada srie, calcular o Nmero Mais Provvel de acordo com o Anexo III, Procedimentos Bsicos de Contagem, deste Manual. Expressar o valor obtido em NMP/g. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA ELLIOT, E.L.; KAYSNER, C.A.; JACKSON, L. e CEBULE, T.A. V. cholerae, V parahaemolyticus, V. vulnificus and Others vbrio spp. In Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http: www.cfsan.fda.gov. MacFADDIN, J.F. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. 3ed. Lippincott Williams & Wilkins (Ed.), Philadelphia. 2000. p. 160-169. CAPTULO XIII NMERO MAIS PROVVEL (NMP) DE MICRORGANISMOS MESFILOS AERBIOS VIVEIS CAPAZES DE CAUSAR ALTERAO EM PRODUTOS LCTEOS UHT E ESTERILIZADOS, PASTOSOS E VISCOSOS 1.OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a determinao do NMP de microrganismos mesfilos aerbios viveis, com excluso daqueles comprovadamente no patognicos e no causadores de alteraes fsicas, qumicas e organolpticas em produtos lcteos pastosos e viscosos. Detectar a presena de Bacillus sporothermodurans para diferenci-lo dos demais microrganismos mesfilos aerbios viveis. Aplica-se a amostras de creme de leite e outros produtos pastosos e viscosos tratados pelo processo UHT e produtos esterilizados.

2. FUNDAMENTOS 2.1 Pr-incubao: Baseia-se na incubao das amostras em estufa a 36 1C por 7 dias e posterior verificao da ocorrncia de alteraes das caractersticas do produto. 2.2 Determinao do NMP: Baseia-se na semeadura de diluies seriadas da amostra em tubos contendo caldo crebro-corao-sal 0,65%-extrato de levedura 0,6% (BHI-SE), seguida de incubao a 30 1C por 72 horas, com posterior repique em gar crebro-corao (BHI) e gar nutriente isento de extrato de levedura e a subseqente identificao da flora presente. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; gar crebro-corao (ABHI); gar nutriente isento de extrato de levedura; gar esculina; gar uria; Caldo crebro-corao nitrato (BHI-NO3); Caldo crebro-corao-sal 0,65%-extrato de levedura 0,6% (BHI-SE); Caldo crebro-corao-sal 0,65%-extrato de levedura 0,6% concentrao dupla (BHISE2); Caldo vermelho de fenol com glicose; Soluo salina peptonada 0,1%; Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de para-aminodimetilanilina) ou tiras para teste de oxidase; Perxido de hidrognio 3%; Alfa-naftilamina 0,5%; cido sulfanlico 0,8%; Zinco em p; Etanol 70% ou Etanol 70 GL; Reagentes para colorao de Gram. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Preparo da amostra: Aps pr-incubao, as amostras visualmente inalteradas devem ser agitadas por 25 vezes. Antes da abertura, desinfetar externamente as embalagens com soluo desinfetante e posteriormente com etanol 70% ou etanol 70 GL. Deixar secar. Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL da amostra de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras, deste Manual. Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1%. A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas de acordo com o Anexo II, Diluies e solues, deste Manual. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio.

5.3 Inoculao: Inocular 10 mL da diluio 10-1, 1 mL da diluio 10-1 e 1 mL da diluio 102, separadamente, em trs sries de trs tubos contendo 10 mL de BHI-SE. Na primeira srie de tubos, que foram inoculados com 10 mL da diluio 10-1, usar o meio com concentrao dupla (BHI-SE2). Incubar a 30 1C por 72 horas. 5.4 Confirmao do crescimento: Finalizado o perodo de incubao, repicar todos os tubos sobre a superfcie seca de ABHI e de gar nutriente isento de extrato de levedura, estriando de forma a obter colnias isoladas. Incubar a 30 1C por at 72 horas. 5.5 Leitura: O crescimento nas placas ser indicativo de presena de mesfilos aerbios no tubo de origem, porm ser necessria a diferenciao entre Bacillus sporothermodurans (que no patognico nem produz alterao do produto) e outros mesfilos aerbios capazes de alterar o alimento. Registrar o nmero de tubos que apresentaram crescimento de colnias nas placas correspondentes, registrando em separado as colnias suspeitas de Bacillus sporothermodurans. Quando o crescimento bacteriano for devido presena de esporos de Bacillus sporothermodurans na amostra em anlise, ser observado crescimento abundante de colnias lisas, de forma regular, com colorao entre branco e bege, com dimetro mximo de 3 mm, facilmente identificveis, nas placas com ABHI. No gar nutriente isento de extrato de levedura, o Bacillus sporothermodurans comumente no forma colnias visveis, porm podero se desenvolver colnias puntiformes de colorao entre branco e bege. Selecionar de 2 a 3 colnias correspondentes a cada um dos tubos positivos e repicar para tubos com ABHI inclinado. Incubar a 36 1C por at 72 horas e realizar os seguintes testes confirmatrios: 5.6 Colorao de Gram: Preparar esfregao das colnias suspeitas e corar pelo mtodo de Gram . Quando forem observados bastonetes Gram positivos, realizar a prova da catalase conforme o item 5.7. Quando forem observados microrganismos com morfologia e caractersticas diferentes de bastonetes Gram positivos, considerar o tubo correspondente como positivo para presena de aerbios mesfilos. 5.7 Catalase: Com auxlio de ala de platina, palito de madeira, basto de vidro ou Pipeta de Pasteur, estreis, transferir a cultura para uma lmina ou placa de vidro contendo uma gota de perxido de hidrognio 3%. Misturar o inculo ao perxido e observar a reao. A no formao de borbulhas indica prova negativa para catalase. A formao de borbulhas indica prova positiva para catalase. A maioria dos membros do gnero Bacillus apresenta reao de catalase positiva. Quando a colorao de Gram demonstrar a presena de bastonetes Gram positivos e a prova da catalase for positiva para a cultura em teste, proceder confirmao da presena de Bacillus sporothermodurans por meio das provas da oxidase, hidrlise da esculina, fermentao da glicose, reduo do nitrato, produo de urease e crescimento em anaerobiose, conforme

abaixo descrito. 5.8 Oxidase: Usando ala de platina, Pipeta de Pasteur, palitos de madeira ou de plstico descartveis, estreis, realizar a prova da oxidase, espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo ou sobre tiras de papel com reativo para oxidase, comercialmente disponveis. Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Aps esse tempo, reaes falso positivas podem ocorrer. O aparecimento de cor azul (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou vermelho intenso (oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de reao positiva. No utilizar alas de nquel-cromo ou alas de ao inoxidvel para realizar a prova de oxidase pois traos de xido de ferro na superfcie flambada pode produzir reao falso positiva. O Bacillus sporothermodurans apresenta reao de oxidase positiva. 5.9 Crescimento em anaerobiose: Inocular a cultura em tubos de ABHI inclinados e incubar em jarra de anaerobiose a 36 1C por 72h. O Bacillus sporothermodurans no cresce em anaerobiose. 5.10 Hidrlise da esculinaInocular a cultura, com agulha, em tubos contendo agar esculina inclinado. Incubar a 36 1C por at 72 horas. A hidrlise da esculina evidenciada pelo enegrecimento do meio. O Bacillus sporothermodurans hidrolisa a esculina. 5.11 Fermentao da glicose: Semear tubos de caldo vermelho de fenol-base adicionados de glicose. Incubar a 36 1C por at 72 horas. A viragem de cor do indicador vermelho de fenol para amarelo indica a fermentao do acar presente. O Bacillus sporothermodurans no fermenta a glicose. 5.12 Reduo de nitrato: Inocular a cultura, com ala, em tubos contendo caldo BHINO3. Incubar a 36 1C por 72 horas. Aps incubao, adicionar aos tubos 0,5 a 1 mL de alfa naftilamina 0,5%, e 0,5 a 1 mL de cido sulfanlico 0,8%. O aparecimento de colorao rosa indica positividade para reduo de nitrato. Quando no houver desenvolvimento de colorao, adicionar ao tubo alguns miligramas de p de zinco. Nesta situao, o aparecimento de colorao rosa indica reao negativa enquanto que o no desenvolvimento de cor indica positividade. O Bacillus sporothermodurans no reduz o nitrato nitrito. 5.13 Prova da urease: Inocular com ala a superfcie de placas ou tubos com agar uria previamente preparadas. Incubar a 36 1C por at 72 horas. Observar o crescimento com mudana de colorao para rosa intenso, o que indica positividade para produo de urease. O Bacillus sporothermodurans no produz urease.

6. RESULTADOS Considerar positivos os tubos que apresentaram crescimento de outras bactrias diferentes do Bacillus sporothermodurans e considerar como negativo quando no for observado crescimento de colnias nas placas e quando o crescimento observado for confirmado como sendo somente de Bacillus sporothermodurans. A partir dos resultados obtidos, consultando a tabela de NMP apropriada e seguindo as instrues contidas no Anexo III, Procedimentos bsicos de contagem, deste Manual, calcular o nmero mais provvel de microrganismos mesfilos aerbios viveis presentes na amostra em anlise. Quando for confirmada a presena de Bacillus sporothermodurans juntamente com outros mesfilos na amostra, devero ser excludos os tubos que continham apenas Bacillus sporothermodurans para o clculo final do NMP de microrganismos mesfilos aerbios viveis. Quando for observada somente a presena de colnias de Bacillus sporothermodurans na amostra, reportar o resultado de mesfilos aerbios viveis como <0,3 NMP/mL. Sempre que for observada a presena de Bacillus sporothermodurans, fazer constar no Certificado Oficial de Anlise (COA), no campo OBS., a expresso: Presena de Bacillus sporothermodurans. Devero ainda acompanhar o resultado de anlise informaes adicionais sobre o tipo de microrganismo encontrado (como por exemplo: cocos Gram positivos, bastonetes Gram negativos, flora mista, etc.) ou o(s) microrganismo(s) aerbio(s) presente(s), quando identificado(s). Os resultados da anlise de NMP de microrganismos mesfilos aerbios viveis a 30C por 72 horas em produtos lcteos UHT e esterilizados, pastosos e viscosos, devem ser expressos em: NMP/g. O resultado da anlise de pr-incubao a 36C por 7 dias deve ser expresso como alterado ou sem alterao. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA BRASIL. Ministrio da Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrria. Secretaria de Defesa Agropecuria. Departamento de Defesa Animal. Manual de mtodos microbiolgicos para alimentos. Coordenao Geral de Laboratrio Animal. 1991/1992 2 reviso. 136p. PETTERSSON, B.; LEMBKE, F.; HAMMER, P.; STACKEBRANDT, E.; PRIEST, F.G. Bacillus sporothermodurans, a new species producing highly-heat-resistant endospores. International Journal of Systematic Bacteriology, 1996. P. 759-764. MORTON, R.D. Aerobic Plate Count.In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.63-67. CAPTULO XIV PESQUISA DE Listeria monocytogenes 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer mtodo analtico para a deteco de Listeria monocytogenes em alimentos de origem animal. A metodologia aplica-se a todos os alimentos crneos e lcteos. 2. FUNDAMENTOS

2.1 Enriquecimento Seletivo: O enriquecimento seletivo, realizado em duas etapas (a primeira em caldo UVM, e a segunda em caldo Fraser), tem a finalidade de inibir a flora acompanhante, permitindo a recuperao de baixos nmeros de clulas de Listeria sp. O efeito seletivo no caldo UVM exercido pela associao de cido nalidxico e acriflavina e no caldo Fraser pelo cloreto de ltio, cido nalidxico e acriflavina. 2.2 Seleo e Isolamento: Nos produtos crneos, a seleo se realiza em dois meios slidos: gar triptose com cido nalidxico (ATN) e gar Palcam (AP), enquanto que nos produtos lcteos esta se realiza em agar Oxford (AO), gar Palcam (AP) e gar triptose com cido nalidxico (ATN). As substncias impedientes presentes nos meios slidos so cido nalidxico no ATN, sulfato de polimixina B, acriflavina, cloreto de ltio e ceftazidina no AP, e cloreto de ltio, acriflavina, sulfato de colistina, cefotetan, cicloheximide e fosfomicina no AO. A seleo no ATN baseia-se nas caractersticas das colnias, quando observadas sob luz oblqua, em estereoscpio. No AP, observa-se a no fermentao do manitol e a formao de esculetina pela hidrlise da esculina, reao revelada pela presena de ferro trivalente. No AO, as colnias de Listeria sp apresentam-se pretas, rodeadas por halo negro devido hidrlise da esculina. 2.3 Confirmao da presena de Listeria sp: A confirmao bioqumica de Listeria sp realiza-se por meio da verificao da produo de catalase, observao das caractersticas morfolgicas e tintoriais, verificao do crescimento tpico em meio semi-slido e, adicionalmente, por meio da verificao da incapacidade de reduo de nitrato e verificao da positividade nas reaes de Vermelho de Metila e Voges Proskauer (VM-VP). 2.4 Identificao de Listeria monocytogenes: A diferenciao das espcies de Listeria sp realiza-se por meio da verificao da produo de -hemlise em gar sangue de cobaio ou gar sangue de carneiro, verificao da capacidade de produzir reao de CAMP positiva com S. aureus (e opcionalmente tambm com Rodococcus equi), e verificao da capacidade de fermentao dos carbohidratos ramnose, xilose e manitol. A utilizao concomitante de culturas de R. equi e S. aureus no CAMP teste til para a diferenciao de L. ivanovii, que apresenta reao de CAMP forte com R. equi (em forma de flecha). Quando se julgar conveniente, a identificao poder ser realizada por meio de um sistema comercialmente disponvel de testes bioqumicos miniaturizados padronizados, conjuntamente com a prova de -hemlise ou CAMP teste. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; Caldo Fraser - base; Caldo de enriquecimento para Listeria (UVM) ou opcionalmente Caldo para Enriquecimento de Listeria (LEB); Caldo VM-VP; Caldo vermelho de fenol - base ou gar para fermentao de carbohidratos - base; gar Palcam (AP); gar Columbia com cido nalidxico - base; gar triptose com cido nalidxico (ATN);

gar Oxford (AO) - base; gar motilidade; S. aureus ATCC 25923 para CAMP teste; Rodococcus equi ATCC 6939 para CAMP teste (opcional); Sistema miniaturizado para identificao bioqumica de Listeria (opcional); cido nalidxico 1%; Acriflavina cloridrato 1%; Perxido de hidrognio 3%; Vermelho de metila 0,06%; Alfa-naftol 5%; Hidrxido de potssio 40%; cido sulfanlico 0,8%; Alfa-naftilamina 0,5%; Suplemento para caldo UVM (cido nalidxico 20mg/L; acriflavina 12mg/L); Suplemento para caldo LEB (acriflavina 12mg/L); Suplemento para gar Oxford (cicloheximide 200mg/0,5L; sulfato de colistina 10,0mg/0,5L; acriflavina 2,5mg/0,5L; Cefotetan 1,0mg/0,5L; fosfomicina 5,0mg/0,5L); Suplemento para gar Palcam (polimixina B 5,0mg/0,5L; acriflavina 2,5mg/0,5L; Ceftazidime 10,0mg/0,5L); Suplemento para caldo Fraser (citrato de amnio e ferro III 250mg/0,5L; acriflavina 12,5mg/0,5L; cido nalidxico 10mg/0,5L); P de Zinco; Xilose soluo aquosa 5%; Manitol soluo aquosa10%; Ramnose soluo aquosa 5%; Sangue desfibrinado de carneiro; Sangue desfibrinado de cobaio . OBS: Os suplementos podem ser adquiridos em forma de vial (comercialmente disponvel), necessitando apenas a suspenso em diluente antes de seu uso. Verificar sempre a composio, comparando com aquela indicada nesta metodologia. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. Estereoscpio com iluminao em ngulo de 45. 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Preparo da Amostra: Acrescentar alquota de 25 0,2 g ou mL da amostra preparada conforme Anexo V, 225 mL de caldo UVM adicionado de seu suplemento. OBS: Verificar a formulao do Caldo UVM ou LEB. Algumas marcas de caldo UVM j contm em sua formulao cido nalidxico e acriflavina. O caldo LEB j contm cido nalidxico, bastando a suplementao com 0,25 mL de soluo 1% de acriflavina. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Primeiro enriquecimento seletivo: Homogeneizar as alquotas preparadas conforme item 5.1 e incubar a 30 1C por 24 horas.

5.4 Segundo enriquecimento seletivo.: Aps a incubao, transferir 0,1 mL da cultura para tubo contendo 10mL de caldo Fraser suplementando-o, se necessrio, com 0,1 mL do vial diludo conforme a indicao do fabricante. OBS:Alguns fabricantes de caldo Fraser fornecem o meio j pronto para o uso; outros fornecem o meio adicionado de cido nalidxico e de acriflavina, bastando a suplementao com citrato de amnio e ferro III (0,1 mL de soluo a 5% equivalente a 250 mg/0,5L de meio). Incubar a 30 1C por 24 a 48 horas. 5.5 Isolamento 5.5.1 Amostras de produtos crneos: Utilizando ala de platina de 5 mm de dimetro, repicar do caldo Fraser para placas contendo ATN e placas contendo AP suplementado, sendo que as placas devem estar com as superfcies secas, de forma a proporcionar a obteno de colnias isoladas. Opcionalmente, pode ser usado o ATNS em paralelo com os meios ATN e AP. Incubar as placas de ATN a 30 1C por 24 horas e as placas de AP e ATNS, na mesma temperatura, por 24 a 48 horas. 5.5.2 Amostras de produtos lcteos: Utilizando ala de platina de 5 mm de dimetro, repicar do caldo Fraser para placas contendo AO suplementado e placas contendo AP suplementado, sendo que as placas devem estar com as superfcies secas, de forma a proporcionar a obteno de colnias isoladas. Incubar as placas de ATN a 30 1C por 24 horas e as placas de AP na mesma temperatura, por 24 a 48 horas. 5.6 Seleo; Com auxlio de lupa ou estereoscpio com iluminao angular de 45, selecionar 3 a 5 colnias de cor azulada ou azulacinzentada em ATN. Selecionar, com o auxlio de conta-colnias ou de estereoscpio com iluminao normal, colnias pretas rodeadas por halo escuro em AO. Selecionar, com o auxlio de conta-colnias ou de estereoscpio com iluminao normal, colnias verde-amareladas rodeadas por zona escura, ou colnias verde-acinzentadas, em AP. 5.7 Confirmao da presena de Listeria sp: Repicar o mesmo inculo para tubos com gar estoque inclinado e para placas contendo ATN. Incubar a 30 1C por 24 horas. Verificar a pureza das culturas no ATN. Utilizar as culturas do gar estoque para a realizao das provas de confirmao e identificao. 5.7.1 Prova da catalase Em uma placa de Petri, depositar 1 gota de perxido de hidrognio 3%. Com auxlio de ala de platina, basto de vidro, palito de madeira ou pipeta de Pasteur, retirar uma alquota do cultivo e misturar com a gota do reagente. A presena de catalase se traduz por desprendimento de borbulhas de oxignio (catalase positiva). Das culturas catalase positivas, fazer um esfregao para colorao de Gram. 5.7.2 Colorao de Gram: A Listeria sp se apresenta como bastonete curto ou na forma de cocobacilo, Gram positivo. 5.7.3 Prova da motilidade tpica: Inocular uma alquota da cultura em gar motilidade, com agulha, por picada. Incubar em estufa de B.O.D. (Demanda Biolgica de Oxignio) a 22-25C por 2 a 5 dias. Aps incubao, verificar o tipo de crescimento. A Listeria sp apresenta crescimento mvel caracterstico em forma de guarda-chuva. 5.7.4 Prova de Reduo de Nitrato: Aps a leitura da motilidade, adicionar a cada tubo 2 a

3 gotas de alfa-naftilamina 0,5% e 2 a 3 gotas de cido sulfanlico a 0,8%. O aparecimento de colorao rosa indica positividade. Quando no houver desenvolvimento de colorao, adicionar ao meio alguns miligramas de p de zinco. Nesse caso, o aparecimento de colorao rosa indica reao negativa e a no alterao de cor indica positividade. As culturas de Listeria sp no reduzem o nitrato. 5.7.5 Prova de VM-VP: Inocular tubos com caldo VM-VP e incubar a 36 1C, por 5 dias. Aps a incubao, pipetar alquotas de 5 e 1 mL da cultura para dois tubos estreis. No tubo contendo 5 mL adicionar 2 a 3 gotas de soluo de vermelho de metila a 0,06%. O aparecimento da cor vermelha indica reao VM positiva. No tubo contendo 1 mL, adicionar 0,6 mL de alfa-naftol soluo alcolica 5% e 0,2 mL de hidrxido de potssio soluo aquosa 40% (nesta ordem) e agitar. Deixar em repouso por 1 a 2 horas. O aparecimento da cor vermelha escura indica reao VP positiva. As culturas de Listeria sp apresentam reaes VM e VP positivas. 5.8 Identificao de Listeria monocytogenes: As culturas que tenham confirmado as caractersticas do gnero Listeria devero ser testadas para diferenciao entre Listeria monocytogenes e outras espcies por meio das seguintes provas bioqumicas: 5.8.1 Produo de -hemlise: Sobre a superfcie seca de gar sangue desfibrinado de cobaio ou carneiro (ACNS), estriar o inculo com ala ou semear com agulha, por picada. Incubar a 36 1C por 24 a 48 horas. A reao positiva se traduz pelo aparecimento de zona clara transparente (-hemlise) ao redor das colnias. As culturas de Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii e Listeria seeligeri so hemolticas. OBS: A utilizao de sangue de cobaio desfibrinado nesta prova oferece a vantagem de zonas de hemlise mais claras, especialmente com culturas de L.monocytogenes fracamente hemolticas. 5.8.2 CAMP teste: Em gar Columbia com cido nalidxico adicionado de 5% de sangue de carneiro desfibrinado (CNAS), com auxlio de agulha ou ala de 1 L, traar uma linha perpendicular linha previamente semeada com S. aureus. Tomar o cuidado para que as linhas no se toquem. Incubar a 36 1C por 72 horas, em atmosfera de 2 a 5% de dixido de carbono (CO2). As culturas de Listeria monocytogenes e Listeria seeligeri produzem zona clara de hemlise total acentuada prximo linha de crescimento do Staphylococcus aureus. Opcionalmente, este teste pode ser feito com S. aureus e R. equi. Nesse caso, traar na placa de CNAS uma linha vertical com inculo de S. aureus e outra com R. equi, distantes alguns centmetros entre si. Semear as culturas teste em linhas horizontais entre as linhas de S. aureus e R. equi, mantendo distncia de cerca de 1,5 cm entre as linhas e cuidando que estas no toquem as linhas de S. aureus e R. equi. Incubar a 36 1C por 72 horas, em atmosfera de 2 a 5% de dixido de carbono (CO2). Aps a incubao, examinar as placas para verificao de hemlise na zona de interao, prximo s linhas verticais. A atividade hemoltica de L. monocytogenes e L. seeligeri se apresenta aumentada prximo a linha de crescimento do S. aureus. As demais listerias apresentam reao de CAMP negativa com o S. aureus. A reao de CAMP produzida pela L.

ivanovii com R. equi se caracteriza por ser mais intensa e se apresentar em forma de flecha. As L. innocua, L. welshimeri e L. grayi so no-hemolticas e no apresentam reao de CAMP positiva com o S. aureus nem com o R. equi. O CAMP teste diferencia L. ivanovii de L. seeligeri e pode diferenciar uma L. seeligeri, fracamente hemoltica, de L. welshimeri. Isolados que do reaes tpicas para L. monocytogenes, exceto para a produo de hemolisina, devem ser testadas para CAMP antes de serem identificadas como L. innocua (no hemoltica). A maioria dos isolados de L. monocytogenes produz tambm uma zona de intensificao da hemlise junto linha de crescimento do R. equi. 5.8.3 Fermentao de carbohidratos: Inocular 3 tubos com caldo vermelho de fenol-base, adicionados respectivamente, de xilose, manitol e ramnose. Incubar a 30 1C por 36 horas. A viragem de cor do indicador vermelho de fenol para amarelo indica a fermentao do acar presente. Alternativamente, esta prova pode ser realizada inoculando as culturas com agulha (em apenas um ponto) em 3 placas de gar para fermentao de carbohidratos adicionado de xilose, manitol e ramnose, respectivamente. A viragem de cor do indicador prpura de bromocresol (azul) para amarelo indica a fermentao do acar presente. As reaes tpicas das diversas Listeria sp esto representadas no quadro abaixo: -hemlise Red-NO3 CAMP Teste-SA CAMP Teste-RE Manitol Ramnose Xilose VM Gram LM + + V + + + LIVA + + + + + LINN V + + LW V + + + LS + + + + + LG + + +

V= varivel AS = S.aureus RE = R.equi LM = L. monocytogenes; LIVA = L. ivanovii; LINN = L. innocua; LW = L.welshimeri; LS = L.seeligeri; LG = L. grayi 6. RESULTADOS 6.1 Interpretao: Considerar como Listeria monocytogenes as culturas que apresentarem reaes tpicas nas provas bioqumicas. 6.2 Expresso dos resultados: Expressar o resultado como: Pesquisa de Listeria monocytogenes: Presena/25 g ou mL; ou Pesquisa de Listeria monocytogenes: Ausncia/25 g ou mL Nota: sempre que as anlises laboratoriais demonstrarem a presena de outras espcies de Listeria, da rea reservada a observaes, do Certificado Oficial de Anlise, dever constar:

Presena de Listeria, seguida do nome da espcie encontrada. Por exemplo: Presena de Listeria innocua, Presena de Listeria welshimeri ou outra. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA BENNETT , R.W.; WEAVER, R.E. Seradiagnosis of Listeria monocytogenes. In: AOAC International. Bacterial Analytical Manual. 8. ed. Gaithersburg. Food and Drug Administration, 1995. p.11.01-11.08. RYSER, E.T.; DONNELLY, C.W. Listeria. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4 ed. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), Washington: American Public Health Association, 2001. p.63-67. HITCHINS A.D. Listeria monocytogenes . In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponivel em: http://www.cfsan.fda.gov MacFADDIN, J.F. Media for isolation - Cultivation - Identification-Maintenance of Medical Bacteria. John Buttler (Ed.) William & Wilkins. Baltimore. 1985. CAPTULO XV PESQUISA DE Salmonella 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer metodologia analtica para a deteco de Salmonella sp em amostras de alimentos, raes e ingredientes. Aplica-se a amostras de alimentos de origem animal, raes e ingredientes. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Pr-enriquecimento: Baseia-se na incubao, a 36 1C por 16 a 20 horas, de 25 0,2 g ou 25 0,2 mL da amostra, adicionada de 225 mL do diluente especfico para cada caso, estabelecido no item 5.1. Esse procedimento visa minimizar os efeitos do processamento industrial dos alimentos, capaz de promover estresse nas clulas de Salmonella, sem inativ-las biologicamente. Quando utilizada soluo salina peptonada tamponada, esta avorece a manuteno do pH, evitando que as bactrias acompanhantes acidifiquem o meio, prejudicando a recuperao das clulas de Salmonella. Para leite em p, segundo o FDA, o diluente utilizado gua destilada estril adicionada de soluo de verde brilhante, o que visa inibir o crescimento de bactrias Gram positivas. 2.2 Enriquecimento seletivo: Baseia-se na utilizao de meios que contm substncias de ao impediente do crescimento para a maioria dos microrganismos interferentes e na incubao em temperatura seletiva. O enriquecimento seletivo de Salmonella se faz obrigatoriamente nos meios lquidos seletivos, caldo Rappaport Vassiliadis e caldo selenito-cistina. Adicionalmente, utiliza-se o caldo tetrationato. No caldo Rappaport Vassiliadis, a presena de verde malaquita e de cloreto de magnsio, associada temperatura de 41 0,5C por 24 a 30 horas, atua como agentes seletivos da microbiota acompanhante, enquanto a presena de peptona de farinha de soja estimula o crescimento de Salmonella. No caldo selenito-cistina, o agente inibidor selenito de sdio atua inibindo os coliformes e enterococos. Esse meio incubado a 41 0,5C por 24 a 30 horas.

No caldo tetrationato, a seletividade conferida pelo tetrationato e pelo verde brilhante. 2.3 Isolamento e seleo: Baseia-se na seleo de colnias de Salmonella em, pelo menos, dois meios slidos: o gar verde brilhante vermelho de fenol lactose sacarose (BPLS) obrigatoriamente e outro gar de maior impedincia escolhido pelo laboratrio. No gar verde brilhante, a novobiocina adicionada visa principalmente a inibio de Proteus sp. Esse meio apresenta em sua composio bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante), responsveis pela inibio de microrganismos Gram positivos. Como meio de maior impedincia, utilizar MLCB ou Rambach ou XLD ou XLT4 ou outro. No gar Rambach, a diferenciao entre Salmonella e outros microrganismos promovida pela presena de propilenoglicol, e tambm de um cromgeno que evidencia a hidrlise da betagalactosidase. No gar MLCB, a concentrao de ons Magnsio promove o crescimento de Salmonella. A presena de verde-brilhante inibe a flora acompanhante. Esse gar no utiliza a fermentao da lactose como sistema de identificao, o que possibilita a deteco de cepas de comportamento atpico no BPLS. A produo de H2S evidenciada pelo enegrecimento do centro da colnia. Cepas de Salmonella H2S negativas, como Salmonella Sendai, Salmonella Berta, Salmonella Pullorum e Salmonella Seftenberg, podem produzir colnias azuis. um meio que, associado ao caldo de enriquecimento Rappaport Vassiliadis, tem sua seletividade substancialmente aumentada. A Salmonella Typhi e a Salmonella Paratyphi no crescem nesse meio devido presena de verde-brilhante. 2.4 Identificao bioqumica: Baseia-se na evidenciao das propriedades fisiolgicas e metablicas das culturas suspeitas: por meio da verificao da presena de citocromo oxidase; deteco de pirrolidonil peptidase (PYRase) segundo Bennett et. al (1999); produo de urease; fermentao da glicose, sacarose e lactose no meio TSI; deteco de beta-galactosidase; descarboxilao da lisina; produo de H2S; motilidade e produo de indol. Para confirmao final, em casos de dvida, realizam-se outras provas complementares, baseadas na inoculao das culturas suspeitas em uma bateria miniaturizada de testes padronizados. Os microtubos contendo substratos desidratados para cada teste so reidratados pela adio da suspenso do microrganismo teste em diluente especfico para esta finalidade. 2.5. Prova de soroaglutinao: Baseia-se na reao antgeno-anticorpo, com conseqente aglutinao do antgeno frente ao anti-soro para Salmonella polivalente O. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidrarias e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; gar verde brilhante vermelho de fenol lactose sacarose (BPLS); gar Rambach ou gar manitol lisina cristal violeta verde brilhante (MLCB) ou gar XLD ou gar; XLT4 ou outro; gar ferro trs acares (TSI) ou gar Kligler (KIA); gar estoque; Caldo lisina descarboxilase ou gar lisina ferro - (LIA); Caldo uria ou gar uria; gar fenilalanina; Caldo selenito cistina; Caldo Rappaport Vassiliadis;

Caldo tetrationato (adicional); Caldo VM/VP; Meio SIM; Sistema miniaturizado de provas bioqumicas para identificao de enterobactrias; Soluo salina 0,85%; Soluo salina 2%; gua destilada estril; Soluo salina peptonada 1% tamponada; Soluo salina peptonada 1% tamponada com 1% Tween 80; Soluo de -naphtol 5%; Soluo de hidrxido de potssio 40%; Soluo de uria 40% estril; Soluo de iodo-iodeto; Reativo de Kovac's (opcional: reativo de Ehrlich); Verde brilhante soluo aquosa 0,1%; Cloreto frrico soluo aquosa 10%; Novobiocina soluo aquosa 4%; Soro anti Salmonella polivalente O; Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de para-aminodimetilanilina) ou tiras para teste de oxidase; leo mineral, parafina lquida ou vaspar estreis; Reativos para prova da PYRase - cido L-piroglutmico 7- amino 4-metil cumarina (7 AMC) e Dimetilaminocinamaldedo; Tween 80. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. Banho-maria com movimentao de gua (agitao ou circulao). 5. PROCEDIMENTOS 5.1. Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL da amostra, de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual. Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 1% tamponada (ver excees na observao abaixo). Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos no stomacher. Deixar 1 hora em temperatura ambiente. OBS: Para leite em p e soro de leite em p, utilizar como diluente gua destilada e adicionar 5 mL de verde brilhante soluo aquosa 0,1%. Para produtos gordurosos (creme e manteiga) utilizar como diluente soluo salina peptonada 1% tamponada com 1% de Tween 80. Para os demais alimentos, utilizar soluo salina peptonada 1% tamponada. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Pr-enriquecimento: O pr-enriquecimento se realiza por meio da incubao das alquotas das amostras preparadas conforme item 5.1, a 36 1C por, no mnimo, 16 horas e no

mais que 20 horas. 5.4 Enriquecimento seletivo: A partir do procedimento de pr-enriquecimento estabelecido em 5.3, inocular, simultaneamente, nos meios lquidos seletivos conforme abaixo: 5.4.1 Inoculao em caldo Rappaport Vassiliadis: Pipetar alquotas de 0,1 mL das amostras pr-enriquecidas para tubos contendo 10 mL de caldo Rappaport Vassiliadis. Incubar os tubos a 41 0,5C, em banho-maria, preferencialmente com agitao ou circulao contnua de gua, por 24 a 30 horas. 5.4.2 Inoculao em caldo selenito cistina: Pipetar alquotas de 1 mL das amostras prenriquecidas e transferir para tubos contendo 10 mL de caldo selenito cistina. Incubar os tubos a 41 0,5C em banho-maria, preferencialmente com agitao ou circulao contnua de gua, por 24 a 30 horas. 5.4.3 Inoculao em caldo tetrationato (adicional): Pipetar alquotas de 1 mL das amostras pr-enriquecidas e transferir para tubos contendo 10 mL de caldo tetrationato. Incubar os tubos a 41 0,5C em banho-maria, preferencialmente com agitao ou circulao contnua de gua, por 24 a 30 horas. 5.5 Isolamento: A partir dos caldos seletivos de enriquecimento, repicar sobre a superfcie previamente seca de placas com cada meio slido seletivo, estriando de forma a se obter colnias isoladas. Dessa forma sero obtidas 2 placas de BPLS, uma originria do caldo Rappaport Vassiliadis e outra originria do caldo selenito cistina e 2 placas do segundo meio seletivo utilizado pelo laboratrio, obtidas do mesmo modo. Incubar todas as placas, invertidas, a 36 1C por 18 a 24 horas. 5.6 Seleo: Selecionar de 3 a 10 colnias suspeitas por amostra, conforme caractersticas descritas em 5.6.1. 5.6.1 Caractersticas das colnias tpicas ou suspeitas de Salmonella nos diferentes meios slidos. Em gar BPLS, as colnias apresentam-se incolores ou de cor rosada, entre translcidas a ligeiramente opacas. Quando rodeadas por microrganismos fermentadores de lactose, podem apresentar-se de cor verde-amarelada. Em gar Rambach, apresentam-se de cor vermelha. Alguns sorovares podem se apresentar com colorao rosa claro, de cor pssego ou amarelas (cor de gema). Em gar MLCB, apresentam-se negras, convexas, lisas e brilhantes, com bordas regulares. As colnias de Salmonella Pullorum e de Salmonella Gallinarum apresentam-se de tamanho pequeno (cerca de 1 mm), de cor azul intensa ou violeta. 5.7 Provas Bioqumicas: As colnias selecionadas devem ser repicadas em gar no seletivo e incubadas a 36 1C por 18 a 24 horas, a fim de verificar sua pureza. 5.7.1 Provas bioqumicas preliminares: Como bateria mnima para identificao de Salmonella, devem ser realizadas as seguintes provas bioqumicas: 5.7.1.1 Produo de urease: Semear maciamente em caldo ou gar uria. Incubar a 36 1C por 24 a 30 horas. Observar a colorao do meio. A manuteno da cor inicial do meio indica que no ocorreu hidrlise da uria. A alterao para rosa intenso indicativa de alcalinizao do meio devido ao da urease sobre a uria. Salmonella no produz urease.

5.7.1.2 Reaes em gar TSI ou gar Kligler (KIA): Inocular o gar atravs de picada profunda e estriamento na superfcie inclinada do bisel. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. No gar TSI, esto presentes: glicose (1,0 g/L), lactose (10,0 g/L) e sacarose (10,0 g/L). Como a glicose um monossacardeo e est em baixa concentrao, ser rapidamente fermentada anaerobiamente, formando cido no fundo do tubo, o que torna o meio amarelo pela viragem do indicador vermelho de fenol (todos os membros da famlia Enterobacteriaceae fermentam a glicose com produo de cido). A fermentao aerbia da glicose, que ocorre na superfcie do bisel, resulta em cido pirvico, que posteriormente degradado a CO2 e gua. A grande maioria das salmonelas no fermenta a sacarose e a lactose, no provocando alteraes no meio TSI (que contm esses dois acares; j no KIA, a sacarose no est presente). Como a fonte de carbono utilizvel (glicose) rapidamente esgotada, a Salmonella passa a degradar aerobiamente o substrato protico do meio, produzindo amonaco (NH3), o que confere ao meio um pH alcalino, modificando a colorao do bisel para rosa intenso. A maioria das salmonelas apresenta no TSI e no KIA as seguintes reaes: cido na base, com ou sem produo de gs. Alcalino ou inalterado no bisel. Com produo de H2S. 5.7.1.3 Descarboxilao da lisina: Utilizar caldo lisina ou gar LIA. Inocular o caldo lisina e adicionar selo estril (vaspar, vaselina, parafina), visando evitar o contato do meio com o ar e o conseqente aparecimento de uma falsa alcalinizao na superfcie do meio por degradao aerbia do substrato protico. Quando usar o gar, inocular atravs de picada profunda, estriando na superfcie inclinada do bisel. Incubar a 36 1C por 24 a 30 horas. Observar se ocorreu descarboxilao da lisina pela alcalinizao do meio, o que demonstrado pela no alterao de cor do indicador presente. A atividade da enzima lisina descarboxilase dependente do pH, sendo mais ativa em pH abaixo de 5,5. A acidificao do meio obtida pela fermentao da glicose presente. Nessa etapa do processo, ocorre a viragem do indicador prpura de bromocresol, de violeta para amarelo. recomendvel a inoculao de um tubo controle de caldo base para descarboxilao sem lisina, para comprovao da acidificao pela fermentao da glicose. Esse tubo deve permanecer amarelo at o final do perodo de incubao. Na condio anaerbia, obtida pelo uso da camada de selo (no caldo lisina) ou na base (do LIA), todo o oxignio no combinado consumido pelo microrganismo presente, na fase inicial de crescimento. A descarboxilao da lisina, que ocorre posteriormente, resulta na produo de uma diamina (cadaverina) e CO2, que conferem ao meio caractersticas de alcalinidade e nova viragem da cor do indicador, que passa de amarelo para violeta. A diamina cadaverina estvel quando produzida em condies anaerbias. A maioria das salmonelas capaz de produzir lisina descarboxilase. Quatro por cento das cepas de Salmonella no descarboxilam a lisina. A Salmonella paratyphi A e alguns outros sorovares no produzem lisina descarboxilase. 5.7.1.4 Meio SIM: Inocular com picada o meio de cultura. Incubar a 36 1C por 24 a 30 horas.

A motilidade caracterizada pela difuso do crescimento por todo o meio. Se for restrito linha de semeadura, indica que o microrganismo imvel. A maioria das salmonelas apresenta motilidade positiva. A Salmonella Gallinarum e a Salmonella Pullorum apresentam motilidade negativa. O meio SIM o meio mais indicado para a verificao da produo de H2S. O H2S um gs incolor produzido pelo microrganismo em teste, pela reduo do tiosulfato presente no meio. A revelao da presena de H2S se realiza por meio da reao do H2S com o citrato de ferro e amnio (presente no meio), formando um precipitado negro insolvel. Quinze por cento das culturas de Salmonella Choleraesuis e 95% das de Salmonella Paratyphi A no produzem H2S. A maioria das salmonelas produz H2S . Quatorze por cento das cepas de Salmonella so H2S negativo. Aps a leitura da motilidade e da produo de H2S, adicionar algumas gotas de reativo de Kovacs (ou, opcionalmente de reativo de Ehrlich) aos tubos para verificar se houve produo de indol. A oxidao do triptofano presente no meio SIM leva formao de trs principais compostos: indol, escatol e indolacetato. A adio do reativo de Kovacs resulta na formao de um anel vermelho, resultante da reao entre o indol e o dimetilaminobenzaldedo contido nesse reativo. Quase a totalidade das salmonelas no produz indol. Segundo Weissfeld et al (1994), cerca de 1% das salmonelas produzem indol. 5.7.1.5 Prova da Oxidase: Usando palitos de madeira, de plstico descartveis ou pipetas Pasteur, estreis, ou ala de platina, realizar a prova de oxidase espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase, ou sobre tiras de papel para teste de Oxidase, disponveis comercialmente. Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Aps esse tempo, podem ocorrer reaes falsopositivas. O aparecimento de cor azul (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou vermelho intenso (oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de reao positiva. No utilizar alas de nquel-cromo ou alas de ao para realizar a prova de oxidase, pois traos de xido de ferro na superfcie flambada podem produzir reao falso-positiva. Todas as salmonelas apresentam reao de oxidase negativa. 5.7.2 Provas bioqumicas complementares opcionais 5.7.2.1 Desaminao da fenilalanina Inocular a superfcie do gar fenilalanina por estriamento. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Adicionar 2 a 3 gotas de soluo de cloreto frrico 10%. A alterao da colorao da cultura na superfcie do bisel para verde indica reao de desaminao da fenilalanina. Salmonella no desamina a fenilalanina. 5.7.2.2 Reao de Voges-Proskauer Inocular o caldo VM-VP em duplicata. Incubar um dos tubos a 36 1C por, pelo menos, 24 horas. O outro tubo deve ser incubado a 22 1C, por 96 horas. Adicionar primeiramente 0,6 mL de soluo de -naphtol 5% e, em seguida, 0,2 mL de soluo de hidrxido de potssio 40%. Agitar os tubos para que haja oxigenao do meio. Aguardar de 10 a 15 minutos.

A alterao da cor para rosa intenso indica reao de VP positiva. Hafnia alvei apresenta reao positiva a 22 1C e resultado varivel a 36 1C. Salmonella apresenta reao negativa para VP nas duas temperaturas. 5.7.2.3 Deteco da enzima pirrolidonil peptidase (PYRase) A partir das culturas em gar estoque que apresentaram resultados compatveis com Salmonella, realizar o teste da presena da enzima pirrolidonil peptidase (PYRase). Espalhar a cultura suspeita sobre carto impregnado com cido L-piroglutmico, substrato que ser hidrolisado pela PYRase, quando produzido pelo microrganismo teste. Para revelar a hidrlise do cido L-piroglutmico, adicionar sobre o carto algumas gotas de para-dimetilaminocinamaldedo, o que, nos casos positivos, resultar no desenvolvimento de colorao vermelha. Esta prova destina-se diferenciao entre Citrobacter e Salmonella. Todas as cepas de Citrobacter sp produzem a enzima pirrolidonil peptidase (reao positiva). Todas as cepas de Escherichia coli e 96% das Salmonella no produzem essa enzima (reao negativa). 5.7.3 Comportamentos atpicos de Salmonella Algumas cepas de Salmonella podem apresentar as seguintes reaes atpicas: fermentao da lactose (bisel do TSI e KIA cido); fermentao da sacarose (bisel do TSI cido); no produo de H2S (SIM sem H2S, TSI/KIA sem H2S); no descarboxilao da lisina (meio cido); produo de indol (reao positiva no SIM). 5.8 Reao sorolgica frente ao anti-soro polivalente O Ressuspender o cultivo obtido em gar estoque inclinado (de 18 a 24 horas) em aproximadamente 2 mL de soluo salina 0,85%. Em lmina de vidro, placa de Petri ou placa de Huddleson, depositar separadamente uma gota de soluo salina 2% e uma gota do soro anti-Salmonella polivalente "O", diretamente do frasco. Em seguida, acrescentar a cada uma delas uma gota da suspenso em teste. Com movimentos circulares, realizar a leitura com iluminao sobre fundo escuro em 1 a 2 minutos. Classificar a reao do seguinte modo: Positiva: presena de aglutinao somente na mistura cultivo + anti-soro; Negativa: ausncia de aglutinao em ambas as misturas; No especfica: presena de aglutinao em ambas as misturas (formas rugosas). As culturas que apresentarem resultados compatveis com Salmonella, porm incapazes de assegurar sua identificao por meio da sorologia, devero ser reisoladas em gar noseletivo e serem novamente submetidas reao sorolgica. 5.9 Provas opcionais: Adicionalmente, podem ser utilizados sistemas miniaturizados de provas bioqumicas para identificao de enterobactrias, aprovados para uso pela CLA/MAPA. 6. RESULTADOS 6.1 Interpretao: Emitir o resultado como positivo para Salmonella quando as culturas apresentarem reaes tpicas nas provas bioqumicas e reao sorolgica positiva frente ao antisoro polivalente O.

As culturas que apresentarem perfil bioqumico compatvel com Salmonella e que no reagirem frente ao anti-soro polivalente O ou apresentarem reao inespecfica devem ser identificadas por mtodo molecular ou remetidas para uma Instituio de Referncia, para concluso do resultado. 6.2 Sorotipificao: Remeter as culturas identificadas como Salmonella a uma Instituio de Referncia no pas, designada pela Coordenao de Laboratrio Animal (CLA) para sorotipificao. Manter no laboratrio as culturas isoladas de Salmonella, adequadamente identificadas. Manter registro de todas as confirmaes sorolgicas realizadas pela Instituio de Referncia. 6.3 Expresso dos resultados Expressar o resultado como: Pesquisa de Salmonella : PRESENA/25 g ou mL; ou Pesquisa de Salmonella : AUSNCIA/25 g ou mL 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA ANDREWS, W.H.; FLOWERS, R.S.; SILLIKER, J.; BAILEY, J.S. Salmonella. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.357-380. ANDREWS, W.H.; HAMMACK, T.S. Salmonella. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http://www.cfsan.fda.gov. BENNETT, A.R.; MaCPHEE, S.; BETTS, R.; POST, D. 1999. Use of pyrrolidonyl peptidase to distinguish Citrobacter from Salmonella. Letters in Applied Microbiology, Oxford. 28: 175-178. ISO. International Organization for Standardization. International Standard ISO 6579, 3.ed. 1993. CAPTILO XVI PESQUISA DE Salmonella POR SEPARAO IMUNOMAGNTICA (IMS) 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer metodologia analtica para a deteco de Salmonella sp., pelo mtodo de separao imunomagntica. Aplica-se em alimentos de origem animal. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Pr-enriquecimento: Baseia-se na incubao de 25 0,2 g ou 25 0,2 mL da amostra, adicionada de 225 mL do diluente especfico para cada caso, a 36 1C por 16 a 20 horas. Este procedimento visa minimizar os efeitos do processo tecnolgico capaz de promover injria celular fisiolgica, sem inativar biologicamente a clula. Quando utilizada soluo salina peptonada 1% tamponada, o tampo utilizado favorece a manuteno do pH, o que assegura melhor recuperao das clulas de Salmonella. Para leite em p, o diluente utilizado gua destilada estril adicionada de soluo de verde brilhante, o que visa inibir o crescimento de bactrias Gram positivas. 2.2 Separao imunomagntica: Baseia-se em duas aes principais: a captura por ligao imunolgica e a separao por ao de foras magnticas. A aplicao destas duas

aes leva obteno de efeitos de concentrao e purificao do microrganismo alvo. O sistema de separao imunomagntica utiliza microesferas superparamagnticas cobertas uniformemente com uma fina camada polimrica, biologicamente inerte, que protege o material magntico e oferece uma rea de superfcie definida para adsorso ou acoplamento de vrias molculas, onde esto ligados anticorpos monoclonais especficos para Salmonella.. 2.2.1 Lavagem das microesferas (beads): Baseia-se em trs passos de lavagem com soluo salina tamponada, adicionada de tween 20, realizados com a finalidade de retirar microrganismos inespecificamente ligados s partculas imunomagnticas. 2.3 Enriquecimento seletivo: Baseia-se na semeadura da alquota imunomagneticamente separada em meio que contm substncias de ao impediente do crescimento para a maioria dos microrganismos interferentes, e incubao em temperatura seletiva de 41 0,5C por 18 a 24h. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidrarias e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; Partculas imunomagnticas de 280 nm cobertas com anticorpo anti-Salmonella (beads); gar Rambach; gar verde brilhante vermelho de fenol lactose sacarose (BPLS); gar ferro trs acares (TSI) ou gar ferro dois acares Kligler (KIA); gar manitol lisina cristal violeta verde brilhante (MLCB); gar estoque; Caldo lisina descarboxilase ou gar lisina ferro (LIA); Caldo uria ou gar uria; Caldo Rappaport Vassiliadis (RV); Meio SIM; Soluo salina 0,85%; Soluo salina 2%; Soluo salina peptonada tamponada, pH 7,2 (PBS); gua destilada estril; Soluo salina peptonada 1% tamponada; cido clordrico 0,1N; Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de para-aminodimetilanilina) ou tiras para teste de oxidase; Reativo de Kovacs (ou, opcionalmente, reativo de Ehrlich); Verde brilhante soluo aquosa 0,1%; Cloreto frrico soluo aquosa 10%; Novobiocina soluo aquosa 4%; Soro anti-Salmonella polivalente O; Soluo salina peptonada 1% tamponada adicionada de 0,02% de tween 20; leo mineral, vaspar ou parafina lquida estreis. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia; Misturador de amostras; Separador imunomagntico;

Pipetadores automticos ajustveis (5-50, 50-200, 100-1000L) e respectivas ponteiras com barreira. 5. PROCEDIMENTO 5.1 Preparo da amostra: Proceder conforme instrues contidas no Captulo XV, Pesquisa de Salmonella, deste Manual. 5.2 Pr-enriquecimento; Proceder conforme instrues contidas no Captulo XV, Pesquisa de Salmonella, deste Manual. 5.3 Separao imunomagntica; De cada amostra pr-enriquecida, transferir uma alquota de 1 mL para tubo eppendorf com tampa apegada, com capacidade de 1,5 mL. Adicionar a cada eppendorf 20 microlitros de partculas imunomagnticas de 280nm cobertas com anticorpo especfico para Salmonella (beads). Aps homogeneizao por suaves inverses sucessivas do eppendorf, dispor os tubos no equipamento misturador onde devero permanecer por 30 minutos, em baixa velocidade. Em seguida colocar os tubos no separador com a barra magntica j acoplada no suporte, onde devem permanecer por 10 minutos. Sem retirar os tubos do separador magntico, retirar todo o lquido dos tubos eppendorf com o auxlio de pipetas Pasteur, ou descartveis com bulbo, estreis, tomando o cuidado para no tocar na parede onde as partculas imunomagnticas esto aderidas. Descartar o lquido em recipiente com desinfetante testado e aprovado. Retirar a barra magntica do suporte do separador. A cada tubo, adicionar 1 mL de soluo salina peptonada 1% tamponada, adicionada de 0,02% de tween 20 e misturar delicadamente por repetidas inverses. Recolocar a barra magntica no suporte do separador e deixar por mais 5 minutos. Repetir esta operao por mais 2 vezes e finalizar com uma lavagem adicional com PBS, sempre descartando o lquido em recipiente com desinfetante aprovado. Depois da retirada total do lquido, suspender os beads em 20 L de PBS. Esta ser denominada frao imunomagneticamente separada ou FIS. 5.4 Enriquecimento seletivo e pr-isolamento: Inocular a FIS, obtida conforme item 5.3, em tubo com 10 mL de caldo Rappaport Vassiliadis. Incubar os tubos a 41 0,5C, em banho-maria com agitao ou circulao contnua de gua, por 24 a 30 horas. 5.5 Isolamento, seleo e identificao bioqumica e sorolgica Proceder conforme Captulo XV, Pesquisa de Salmonella, deste Manual. 6. RESULTADOS Proceder conforme Captulo XV, Pesquisa de Salmonella, deste Manual. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA DYNAL. Cell separation and protein purification technical handbook. 2 ed. Oslo: DYNAL, 1996. 165p. ISO. International Organization for Standardization. International Standard ISO 6579, 3.ed. 1993.

OLSVIK, O.; POPOVIK, T.; SKJERVE, E. et al. Magnetic Separation Techniques in Diagnostic Microbiology. Clinical Microbiology Reviews, v. 7, p. 43-54, 1994. SAFARIK, I.; SAFARIKOV, M.; FORSYTHE, S.J. The application of magnetic separations in applied microbiology. Journal of Applied Bacteriology, Oxford, v. 78, p. 576-585, 1995. CAPTULO XVII PESQUISA DE Vibrio cholerae 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a pesquisa de Vibrio cholerae em alimentos; A metodologia para deteco de Vibrio cholerae destina-se verificao da presena deste patgeno em alimentos de origem animal. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Pr-enriquecimento: Baseia-se na recuperao das clulas, fisiologicamente lesadas ou no, e crescimento em meio no seletivo. 2.2 Etapa presuntiva: Baseia-se no isolamento das colnias em meio slido seletivo, gar TCBS, e em meio no seletivo, gar gelatina, e posterior incubao a 36 1C, sendo as colnias tpicas submetidas identificao bioqumica. O gar TCBS apresenta, em sua composio, elevada concentrao de tiosulfato e citrato de sdio, alm de ser altamente alcalino, inibindo assim o crescimento das enterobactrias. A bile e o colato de sdio inibem os enterococos. Como indicador de pH, o meio possui o azul de timol e o azul de bromotimol, que provocam a mudana de colorao do meio para amarelo quando da fermentao da sacarose presente no meio, com conseqente formao de cido. 2.3 Provas de identificao: A identificao de Vibrio cholerae feita por meio de provas bioqumicas, sorolgicas e tintoriais. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; gar sal triptona (T1N1); gar ferro dois acares (gar Kligler); gar tiosulfato citrato sacarose sais biliares (gar TCBS); gar soja triptona (TSA); gar gelatina (AG); gua peptonada alcalina pH 8,5 0,1; Caldo peptonado sem sal; Caldo peptonado sal 3%; Caldo peptonado sal 6%; Caldo vermelho de fenol base; Caldo gelatina fosfato sal (GPS); Caldo vermelho de fenol manitol; Caldo vermelho de fenol sacarose; Meio O/F Hugh-Leifson;

Bacto Vibrio cholerae - anti-soro polivalente; Arabinose; Desoxicolato de sdio; L-arginina; L-inositol; L-lisina; L-ornitina; Manitol; Manose; Reativo para oxidase (oxalato de para-amino-dimetilanilina ou N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou tiras para teste de oxidase; Etanol 96%; Reagentes para colorao de Gram; leo mineral estril. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Enriquecimento: Preparar a amostra de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual. Pesar, separadamente, 25 0,2 g da amostra em dois recipientes estreis. Adicionar 225 mL de gua peptonada alcalina pH 8,5 a um dos recipientes e 225 mL de caldo gelatina fosfato sal (GPS) ao outro. Homogeneizar, no mximo por 60 segundos em stomacher. Incubar os caldos a 36 1C por 6 a 8 horas. Para amostras de ostras, inocular um terceiro recipiente com 25 0,2 g de amostra e 225 mL de gua peptonada alcalina pH 8,5, que dever ser incubado por 6 a 8 horas a 42 0,2C. No agitar os frascos aps a incubao. 5.2 Procedimentos de controle; Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Inoculao; Aps a incubao, com auxlio de ala de nquel-cromo descartvel, estril ou de platina, transferir uma alada de 3 mm de dimetro, retirada da superfcie de cada cultivo, para placas de gar tiosulfato citrato sais biliares sacarose (TCBS) e de gar gelatina (AG). Incubar as placas em posio invertida a 36 1C por 24 horas. 5.4 Leitura; Verificar o aparecimento de colnias tpicas. No gar TCBS, as colnias de Vibrio cholerae apresentam-se com colorao amarela, ligeiramente elevadas no centro, com bordas translcidas e 2 a 3 mm de dimetro. Algumas cepas lento-fermentadoras da sacarose se apresentam verdes no TCBS, aps 24 horas de incubao. No gar gelatina, as colnias de Vibrio cholerae apresentamse como colnias transparentes com uma zona opaca ao seu redor que, geralmente, torna-se mais ntida aps alguns minutos sob refrigerao.

5.5 Provas preliminares para a identificao do Vibrio cholerae 5.5.1 Preparo do inculo: Selecionar 3 ou mais colnias de cada placa dos diversos meios. Repicar cada colnia para um tubo com gar sal triptona (T1N1) inclinado. Incubar a 36 1C por 24 horas. 5.5.2 String Test; Colocar uma gota (grande) de soluo de desoxicolato de sdio 0,5 % sobre uma lmina. Retirar uma alada da cultura mantida em T1N1 inclinado (5.5.1) e suspend-la na gota. O aparecimento, em cerca de um minuto, de uma massa mucide, que forma um filamento quando a ala suspensa a uma altura de 2 a 3 cm da lmina (string test positivo), presuntivo da presena de Vibrio cholerae. 5.5.3 Prova da oxidase. Usando palitos de madeira, de plstico descartveis ou pipetas Pasteur, estreis, ou ala de platina, realizar a prova de oxidase espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase, ou sobre tiras de papel para teste de oxidase, comercialmente disponveis. Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Aps este tempo, podem ocorrer reaes falsopositivas. O aparecimento de cor azul (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou vermelho intenso (oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de reao positiva. No utilizar alas de nquel-cromo ou alas de ao para realizar a prova de oxidase, pois traos de xido de ferro na superfcie flambada podem produzir reao falso-positiva. O Vibrio cholerae oxidase positiva. 5.5.4 Colorao de Gram: A partir da cultura mantida em T1N1, fazer um esfregao e corar pelo mtodo de Gram, de acordo com as instrues contidas no Anexo VII, Procedimentos de colorao, deste Manual. O Vibrio cholerae apresenta-se como bastonete Gram negativo, reto ou curvo. 5.5.5 Leitura: Sero consideradas como suspeitas de Vibrio cholerae as colnias que forem oxidase positiva, "String Test" positivo e se mostrarem ao microscpio como bastonetes Gram negativos, retos ou curvos. 5.6 Provas para a identificao de Vibrio cholerae 5.6.1 Teste do halofilismo: A partir da cultura mantida em T1N1, com auxlio de agulha de nquel-cromo ou de platina, inocular tubos contendo caldo peptonado sem sal, tubos contendo caldo peptonado sal 3% e caldo peptonado sal 6%. Incubar a 36 1C por 24 horas. Aps o perodo de incubao, observar a presena de turvao nos meios. O Vibrio cholerae cresce na ausncia e na presena de 3% de sal e no cresce na presena de 6% de sal. Esta prova permite a diferenciao entre Vibrio cholerae e Vibrio alginolyticus, pois o primeiro cresce na ausncia de sal, o que no acontece com o segundo. Observao: Reservar o tubo com o caldo peptonado sal 3%, que servir de inculo para outras provas de identificao. 5.6.2 gar ferro dois acares (Kligler): A partir das culturas mantidas em T1N1, com auxlio de uma agulha de nquel-cromo ou de platina, inocular o gar Kligler mediante picada central profunda, estriando na superfcie inclinada do bisel. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Neste meio, o Vibrio cholerae fermenta a glicose presente, produzindo a acidificao da

base (amarela), sem produo de gs (sem bolhas) nem de H2S (sem enegrecimento). Por no metabolizar a lactose, produz uma alcalinizao no bisel (vermelho). 5.6.3 Fermentao da sacarose: A partir da cultura mantida em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo ou de platina, inocular um tubo contendo caldo vermelho de fenol-sacarose. Cobrir o meio com 1 a 2 mL de leo mineral, ou vaselina lquida, estril. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Aps o perodo de incubao, observar a mudana de colorao do meio de vermelho para amarelo, devido fermentao da sacarose e produo de cido. O Vibrio cholerae fermenta a sacarose. 5.6.4 Descarboxilao da lisina: A partir do inculo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, inocular um tubo contendo caldo lisina. Inocular tambm um tubo de meio base (sem lisina), que servir de controle para a produo de cido a partir da glicose contida no meio. Cobrir os tubos com 1 a 2 mL de leo mineral, ou vaselina lquida, estril. Incubar a 36 1C por no mximo 4 dias, juntamente com um tubo de caldo lisina, no inoculado e coberto por leo, que servir de controle negativo. Examinar os tubos todos os dias. Durante o perodo de incubao, a cor do meio passa para amarela devido fermentao da glicose e, ocorrendo a descarboxilao da lisina, o meio retorna cor prpura devido produo de aminas primrias e dixido de carbono. O tubo controle, sem aminocido, deve virar para amarelo e assim permanecer. O Vibrio cholerae descarboxila a lisina. 5.6.5 Leitura: Sero consideradas como suspeitas de Vibrio cholerae as colnias que apresentarem as caractersticas abaixo, que devero ser confirmadas por meio de provas adicionais. Kligler - Bisel vermelho (alcalino) Kligler - Base amarela sem gs (cida) Kligler - Sem enegrecimento (H2S negativo) Sacarose - Positiva Lisina descarboxilase - Positiva Caldo peptonado sem sal - Crescimento Caldo peptonado sal 3% - Crescimento Caldo peptonado sal 6% - Sem crescimento 5.7 Provas adicionais para a identificao do Vibrio cholerae 5.7.1 Prova de Hugh-Leifson glicose (Meio O/F): A partir do inculo mantido em T1N1, com auxlio de agulha de nquel-cromo ou de platina, inocular dois tubos contendo meio de HughLeifson glicose. Cobrir um dos tubos com 1 a 2 mL de leo mineral, ou vaselina lquida, estril. Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 48 horas. Aps o perodo de incubao, verificar a viragem de cor dos meios de verde para amarelo e a presena de gs nos tubos de Durhan. A cor amarela em ambos significa fermentao da glicose. A presena de cor amarela somente no tubo sem leo mineral significa utilizao oxidativa da glicose. O Vibrio cholerae fermenta a glicose sem produo de gs, por isto ambos os tubos devem apresentar colorao amarela, sem gs.

5.7.2 Prova da fermentao do manitol: A partir da cultura mantida em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo ou de platina, inocular um tubo contendo caldo vermelho de fenol manitol. Cobrir o meio com 1 a 2 mL de leo mineral, ou vaselina lquida, estril. Incubar a 36 1C por 24 a 48 horas. Aps o perodo de incubao, observar a mudana de colorao do meio de vermelho para amarelo, o que indica a fermentao do manitol. O Vibrio cholerae fermenta o manitol. 5.7.3 Prova da fermentao da arabinose: A partir da cultura mantida em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo ou de platina, inocular um tubo contendo caldo vermelho de fenol arabinose. Cobrir o meio com 1 a 2 mL de leo mineral, ou vaselina lquida, estril. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Aps o perodo de incubao, observar a mudana de colorao do meio de vermelho para amarelo, o que indica a fermentao da arabinose. O Vibrio cholerae no fermenta a arabinose, portanto o meio deve permanecer vermelho. 5.7.4 Prova da fermentao da manose: A partir da cultura mantida em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, de platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo caldo vermelho de fenol manose. Cobrir o meio com 2 a 3 mL de leo mineral, ou vaselina lquida, estril. Incubar a 36 1C por 24 a 48 horas. Aps o perodo de incubao, observar a mudana de colorao do meio de vermelho para amarelo, o que indica a fermentao da manose. O Vibrio cholerae fermenta a manose. 5.7.5 Prova da fermentao do inositol: A partir da cultura mantida em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo ou de platina, inocular um tubo contendo caldo vermelho de fenol inositol. Cobrir o meio com 1 a 2 mL de leo mineral, ou vaselina lquida, estril. Incubar a 36 1C por 24 a 48 horas. Aps o perodo de incubao, observar a mudana de colorao do meio de vermelho para amarelo, o que indica a fermentao do inositol. O Vibrio cholerae no fermenta o inositol, portanto o meio deve permanecer vermelho. 5.7.6 Prova da descarboxilao da ornitina: A partir da cultura mantida em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo ou de platina, inocular um tubo contendo caldo ornitina. Semear tambm um tubo de meio base (sem ornitina) para controle. Cobrir os tubos com 1 mL de leo mineral, ou vaselina lquida, estril. Incubar a 36 1C por no mximo 4 dias, juntamente com um tubo de caldo ornitina no inoculado e com leo, que servir de controle negativo. Examinar os tubos todos os dias. Durante o perodo de incubao, a cor do meio passa para amarela devido fermentao da glicose, e, ocorrendo a descarboxilao da ornitina, o meio retorna cor prpura devido produo de aminas primrias e dixido de carbono. O tubo controle, sem aminocido, deve virar para amarelo e assim permanecer. O Vibrio cholerae descarboxila a ornitina. 5.7.7 Prova da hidrlise da arginina: A partir da cultura mantida em caldo peptonado sal

3%, com auxlio de ala de nquel-cromo ou de platina, inocular um tubo contendo caldo arginina. Semear tambm um tubo de meio base (sem arginina) para controle. Cobrir os tubos com 1 mL de leo mineral, ou vaselina lquida, estril. Incubar a 36 1C por no mximo 4 dias, juntamente com um tubo de caldo arginina no inoculado e leo, que servir de controle negativo. Examinar os tubos todos os dias. Durante o perodo de incubao, a cor do meio passa para amarela devido fermentao da glicose e, ocorrendo a hidrlise da arginina, o meio retorna cor prpura devido produo de aminas primrias e dixido de carbono. O tubo controle, sem aminocido, deve virar para amarelo e assim permanecer. O Vibrio cholerae no hidrolisa a arginina, portanto ambos os tubos devem permanecer amarelos. 5.7.8 Leitura: Sero consideradas como suspeitas de Vibrio cholerae as colnias que apresentarem as caractersticas abaixo, que devero ser confirmadas por meio do teste sorolgico. Hugh-Leifson (Meio O/F) glicose - Fermentativo Fermentao do manitol - Positivo Fermentao da arabinose - Negativo Fermentao da manose - Positivo Fermentao do inositol - Negativo Descarboxilao da ornitina - Positivo Hidrlise da arginina - Negativo 5.8 Teste sorolgico: Marcar duas sees de aproximadamente 1 x 2 cm no interior de uma placa de Petri ou em uma lmina de vidro de 2 x 3 polegadas ou em uma placa Huddleson. Colocar uma pequena quantidade da cultura, crescida em gar T1N1 inclinado, diretamente sobre a placa ou lmina, na regio marcada. Adicionar uma gota de soluo salina 0,85% na parte inferior de cada uma das regies marcadas. Com auxlio de uma ala ou agulha de nquel-cromo ou de platina, suspender a cultura com soluo salina em cada seo. Adicionar uma gota do anti-soro polivalente de Vibrio cholerae a uma das sees com a suspenso da cultura e misturar com a ala. A outra seo contendo antgeno somente um controle de autoaglutinao. Observar a reao em 1 minuto contra um fundo escuro. Uma reao positiva indicada por uma aglutinao rpida e forte. Enviar as culturas que se comportem como Vibrio cholerae, em gar estoque, para tipificao Instituio de Referncia designada pela CLA. 6. RESULTADO Sero consideradas como positivas para Vibrio cholerae as culturas que apresentarem os resultados esperados tanto nas provas adicionais de identificao quanto no teste sorolgico. Expressar o resultado como: Pesquisa de Vibrio cholerae: Presena/25g ou mL; ou Pesquisa de Vibrio cholerae: Ausncia/25g ou mL 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA ICMSF. International Commission on Microbiological Specifications for Foods.

Microorganismos de los Alimentos Tcnicas de Anlisis Microbiolgico. V.1. 2.ed. Acribia, Zaragoza - Espanha. ELLIOT, E.L.; KAYSNER, C.A.; JACKSON, L. e CEBULE, T.A. V. cholerae, V parahaemolyticus, V. vulnificus and Others vbrio spp. In Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http://www.cfsan.fda.gov. KAYSNER, C.A.; DePAOLA, A. Vibrio . In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4 ed. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), Washington: American Public Health Association, 2001, p. 405 - 420. CAPTULO XVIII PESQUISA DE Escherichia coli O157:H7 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento analtico para a pesquisa de Escherichia coli O157:H7 em alimentos e gua. 2. FUNDAMENTOS 2.1 Enriquecimento seletivo: Baseia-se na incubao de 25 0,2 g ou mL da amostra em soluo salina peptonada tamponada adicionada de vancomicina, cefixime e cefsulodin (SPTVCC), por 6 horas em temperatura de 36 1C. O efeito seletivo exercido pela associao de vancomicina, cefixime e cefsulodin, que visa inibio da flora acompanhante, especialmente Proteus sp e Aeromonas sp. 2.2 Separao imunomagntica: Baseia-se em duas aes principais: a captura por ligao imunolgica e a separao por ao de foras magnticas. A aplicao dessas duas aes leva obteno de efeitos de concentrao e purificao do microrganismo-alvo. O sistema de separao imunomagntica utiliza microesferas superparamagnticas cobertas uniformemente com uma fina camada polimrica, biologicamente inerte, que protege o material magntico e oferece uma rea de superfcie definida para adsorso ou acoplamento de vrias molculas onde esto ligados anticorpos policlonais anti E coli O157. Na lngua inglesa, estas microesferas so denominadas de beads. 2.2.1 Lavagem das microesferas: Baseia-se em trs passos de lavagem com soluo salina tamponada, adicionada de tween 20, realizados com a finalidade de retirar microrganismos inespecificamente ligados s partculas imunomagnticas. 2.3 Isolamento: Baseia-se na semeadura da alquota imunomagneticamente separada sobre a superfcie seca de gar MacConkey Sorbitol (MCS), o que permite que as clulas aderidas s microesferas formem colnias. Normalmente mais de uma clula se adere a cada partcula imunomagntica, o que pode resultar em colnias originrias de mais do que uma clula aderida. No gar MCS, o efeito seletivo exercido pelos sais biliares e pelo cristal violeta presentes no meio, que atuam inibindo a flora Gram positiva. A fermentao do sorbitol evidenciada pela viragem da cor do indicador de pH (vermelho neutro) para vermelho intenso. 2.4 Identificao bioqumica: Baseia-se na inoculao das culturas suspeitas em uma bateria miniaturizada de testes padronizados. Os microtubos, contendo substratos desidratados para cada teste, so reidratados pela adio da suspenso do microrganismo teste em diluente

especfico para esta finalidade. Durante a incubao a 36 1C, devido ao metabolismo bacteriano, ocorrem mudanas de colorao dos indicadores contidos no substrato. Novobiocina; Soluo aquosa de Cefixime 1%; Soluo de Sorbitol 10%; Soluo de Celobiose 10%; Soluo de Dulcitol 10%; Reativo para oxidade (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de para-aminodimetilanilina) ou tiras para teste de oxidase; Cloreto frrico; Reativo de Kovacs(ou, opcionalmente, reativo de Ehrlich); Hidrxido de potssio; Alfa naftilamina 0,5%; Alfa naftol; cido sulfanlico 0,8%; Soluo aquosa de Cloreto de Clcio 10 mmol; Partculas imunomagnticas de 280nm cobertas com anticorpo antiEscherichia coli O157; Sistema miniaturizado para identificao de Enterobactrias. Em alguns testes, a leitura final somente se realiza aps a adio de reativos especficos. 2.5 Ltex teste O ltex-teste para identificao de Escherichia coli O157 consiste de dois reagentes base de ltex. O primeiro formado por partculas de ltex, cobertas com anticorpo especfico produzido em coelho (ltex reagente); o segundo o reagente controle, que formado por partculas de ltex, cobertas com globulinas de coelho primune (ltex controle). Quando cultivos de Escherichia coli O157 so submetidos ao ltex-teste, ocorre aglutinao do ltex-reagente e no do ltex-controle. 2.6 Provas complementares Outras provas complementares so realizadas com a finalidade de identificar e diferenciar Escherichia coli O157:H7 de outros membros de sua espcie, tais como motilidade, produo de -Dglicuronidase, e fermentao de carboidratos. A verificao da produo de -hemolisina destina-se obteno de um indicativo sobre a verocitotoxigenicidade do isolado, j que existe uma forte correlao positiva entre a produo desta hemolisina e de verotoxina. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e outros materiais bsicos para laboratrios de microbiologia de alimentos; gar MacConkey-sorbitol (MCS); gar eosina azul de metileno (EMB); gar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA); gar soja triptona, com CaCl2 e eritrcitos lavados de carneiro (ASSTCa); gar soja triptona; gar estoque; gar motilidade;

Soluo salina peptonada tamponada com vancomicina, cefsulodin e cefixime (SPT VCC); Caldo verde brilhante-bile-lactose 2% - metilumbeliferil-glicurondeo (BRILA-MUG); Caldo verde brilhante-bile-lactose 2%; Caldo vermelho de fenol-base; Caldo soja triptona; Caldo EC modificado com novobiocina (Caldo EC + n); Soluo salina tamponada pH 7,2; Soluo salina tamponada 1% adicionada de 0,02% de tween 20; Soluo salina 0,85%; Soluo salina peptonada 0,1%; Meio SIM; Soluo aquosa de Vancomicina 0,8%; Soluo aquosa de Cefsulodin 1%; 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios para laboratrios de microbiologia; Cmara UV (366 nm); Misturador de Amostras; Separador Imunomagntico; Pipetadores automticos ajustveis (5-50, 50-200, 100-1000L) e ponteiras correspondentes, com barreira. 5.PROCEDIMENTOS 5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar assepticamente 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL de amostra em sacos de stomacher ou frascos Erlenmeyer estreis, seguindo as orientaes contidas no Anexo II, Diluies e solues, deste Manual. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Pr-enriquecimento: A cada alquota adicionar 225 mL de SPT-VCC e incubar por 6 horas a 36 1C. 5.4 Separao imunomagntica: Aps as 6 horas de incubao, de cada amostra prenriquecida, transferir 1 mL para tubo eppendorf com tampa apegada. Adicionar a cada eppendorf 20 L de beads 280nm cobertas com anticorpo policlonal antiEscherichia coli O157. Aps homogeneizao, por suaves inverses sucessivas do eppendorf, dispor os tubos no equipamento misturador onde devero permanecer por 30 minutos em baixa velocidade. Em seguida, colocar os tubos no separador com suporte magntico j acoplado, onde devem permanecer por 5 minutos. Sem retirar os tubos do separador magntico, extrair todo o lquido dos tubos eppendorf, com o auxlio de pipetas Pasteur ou descartveis com bulbo, estreis, tomando o cuidado para no tocar na parede onde as partculas imunomagnticas esto aderidas. Descartar o lquido em recipiente com desinfetante. Retirar o suporte magntico do separador. A cada tubo, adicionar 1 mL de soluo salina

peptonada 1% tamponada - 0,02% de tween 20 e misturar delicadamente por repetidas inverses. Recolocar o suporte magntico no separador e deixar por mais 5 minutos. Repetir esta operao por mais 2 vezes e finalizar com uma lavagem adicional com PBS sem tween, sempre descartando o lquido em recipiente com desinfetante. Depois da retirada total do lquido, suspender os beads em 20 L de PBS. Esta ser denominada frao imunomagneticamente separada ou FIS. 5.5 Semeadura, seleo e isolamento: Inocular no centro de uma placa com gar MCS, previamente seca, 10 L da FIS. Espalhar com auxlio de ala de Drigalski ou basto tipo hokey. Partindo dos 10 L restantes da FIS, inocular com ala de 1 L sobre outra placa com gar MCS, de forma a obter colnias isoladas. Incubar a 36 1C por 24 a 30 horas. Utilizando estereoscpio com luz oblqua incidente sobre a colnia, selecionar de 3 a 5 colnias sorbitol negativas com superfcie suavemente ondulada, com bordas em forma de "saia", irregulares, achatadas, e repicar em placas com gar VRBA e gar BEM. Tambm repicar para tubos com gar estoque inclinado. Incubar a 36 1C por 18 a 24h. Aps o perodo de incubao, observar a pureza e caractersticas das culturas e, quando necessrio, reisolar em superfcie seca de gar MCS. Quando, aps dois procedimentos de reisolamento, no forem obtidos cultivos puros, repicar para tubos com caldo EC+n, ou com caldo verde brilhante bile lactose 2% e incubar por 18 a 24 horas a 36 1C, inoculando posteriormente sobre a superfcie seca de gar MCS e de gar EMB, independentemente da produo de gs nos tubos de Durhan. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Utilizando estereoscpio com luz oblqua incidente sobre a colnia, selecionar de 3 a 5 colnias sorbitol negativas com superfcie suavemente ondulada, com bordas em forma de "saia", irregulares, achatadas, e repicar em placas com gar VRBA e gar EMB. Tambm repicar para tubos com gar estoque inclinado. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. 5.6 Teste da oxidase: A partir dos cultivos puros em gar estoque inclinado, usando palitos de madeira estreis ou de plstico descartvel, ala de platina ou pipeta de Pasteur, realizar a prova da oxidase espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase (podem tambm ser utilizadas tiras para oxidase, comercialmente disponveis). O aparecimento de cor azul intensa (N N N N -tetrametil-parafenileno-diamina) ou vermelho escuro (oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de reao positiva. No utilizar alas de nquel-cromo ou de ao para realizar a prova de oxidase. Todas as cepas de Escherichia coli O157:H7 apresentam resultado negativo na prova de oxidase. As culturas que apresentam resultado positivo no pertencem famlia Enterobacteriaceae, portanto no necessitam ser submetidas a testes complementares para Escherichia coli 0157:H7. 5.7 Teste de aglutinao de ltex: Submeter as culturas puras obtidas conforme item 5.5 ao teste de aglutinao de ltex, suspendendo-as em duas gotas de soluo salina colocadas sobre o carto de teste que acompanha o kit.

 primeira, misturar uma gota do ltex reagente e sobre a outra uma gota do ltex controle. Misturar por um minuto e observar aglutinao. Considerar como positivas as culturas que, em um minuto ou menos, apresentarem aglutinao apenas no ltex reagente. Para os controles positivo e negativo, utilizar os controles que acompanham o kit. As culturas que apresentarem resultado negativo no teste de aglutinao de ltex devem ser descartadas. 5.8 Testes adicionais 5.8.1 Verificao da motilidade das culturas suspeitas.: A partir das culturas puras, em gar estoque inclinado, que apresentarem reao positiva frente ao ltex reagente e negativa frente ao ltex controle, repicar para tubos contendo gar motilidade modificado, utilizando agulha de inoculao. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Observar o tipo de crescimento: difuso (motilidade positiva) ou apenas na linha de inoculao (motilidade negativa). As cepas de Escherichia coli O157:H7 apresentam motilidade positiva, enquanto que a E.coli ATCC 25922 apresenta motilidade negativa. 5.8.2 Verificao da produo de -D-glicuronidase e de gs em caldo BRILA-MUG. A partir das culturas isoladas conforme item 5.5, repicar para tubos com caldo verde brilhante bile-lactose-metilumbeliferil-glicurondeo (BRILA-MUG), com tubos de Durhan invertidos. Incubar a 36 1C por 24 a 48 horas. Observar a produo de gs nos tubos de Durhan. Anotar os resultados. Em cmara de UV (366nm), verificar a formao de 4-metilumbeliferona a partir do MUG. Considerar como positivo para -Dglicuronidase as culturas que produzirem fluorescncia no meio de cultura. A Escherichia coli O157:H7 no produz -D-glicuronidase, portanto no se observa fluorescncia no caldo BRILA-MUG. A Escherichia coli ATCC 25922 produz fluorescncia (reao positiva) neste meio. OBS: A cultura de E.coli O157:H7 ATCC 43888 (no toxignica) no produz gs no caldo verde brilhante lactose 2%, enquanto que as E.coli O157:H7 verotoxignicas ATCC 43889, ATCC 43890 e ATCC 43894 so capazes de produzir gs neste meio. 5.8.3 Verificao da fermentao do sorbitol, da celobiose e do dulcitol A partir das culturas isoladas conforme item 5.5, repicar para tubos contendo 3 mL de caldo vermelho de fenol base adicionado, separadamente, de sorbitol, celobiose e de dulcitol (esterilizados por filtrao), de forma a obter uma concentrao final do acar de 0,1%. Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 30 horas. Aps incubao, observar a produo de cido, evidenciada pela viragem do indicador vermelho de fenol para amarelo nas culturas fermentadoras dos acares presentes. Os resultados esperados esto na tabela abaixo: Cultura Escherichia coli O157:H7 Escherichia hermannii Escherichia fergusonii Escherichia coli Sorbitol + Celobiose + + -* Dulcitol + -/+

 : 60% so pos. -/+ : 19% so positivas -*: 2% so positivas 5.8.4 Verificao da produo de enterohemolisina: A partir das culturas puras obtidas conforme item 5.5, repicar em estrias para a superfcie seca de gar soja triptona, com cloreto de clcio e eritrcitos de carneiro (ASSTCa). Para preparar o ASSTCa, a cada 100mL de gar soja triptona adicionar 1 mL CaCl2 1M e 5 mL de eritrcitos lavados de carneiro. Incubar a 36 1C por 4 horas. Verificar atividade hemoltica e registrar os resultados obtidos. Reincubar at 24 horas repetindo a leitura. Considerar como positivas para produo de enterohemolisina as culturas que no produzirem hemlise em 4 horas e apresentarem reao hemoltica caracterstica de alfahemolisina (colorao esverdeada ao redor das colnias) aps 24 horas de incubao. A grande maioria das cepas de Escherichia coli O157:H7 verotoxignicas so alfahemolticas. 5.9 Provas Opcionais: Adicionalmente, podem ser utilizados sistemas miniaturizados de provas bioqumicas para identificao de enterobactrias, aprovados para uso pela CLA/MAPA. 5.9.1 Sistema miniaturizado para identificao de enterobactrias: Repicar, para tubos com gar estoque inclinado, as culturas que apresentaram reao positiva frente ao ltex reagente, negativas frente ao ltex controle, motilidade positiva, -D-glicuronidase negativa, com ou sem produo de gs a partir da lactose, no fermentadoras do sorbitol e da celobiose, e capaz de fermentar o dulcitol. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Seguir as recomendaes do fabricante do sistema utilizado. 6. RESULTADOS Considerar o resultado positivo para Escherichia coli O157:H7 as amostras em que os isolados se comportarem como abaixo descrito: a) Colnia caracterstica de E.coli em VRBA e BEM; b) Sorbitol negativo no MCS; c) Celobiose negativa no caldo vermelho de fenol; d) Dulcitol positivo no caldo vermelho de fenol; e) Sorbitol negativo no caldo vermelho de fenol; f) Aglutinao positiva frente ao ltex reagente em um minuto; g) Aglutinao negativa frente ao ltex controle; h) Motilidade positiva. i) -D-glicuronidase negativa j) No hemoltica em 4 horas k) Alfa-hemoltica em 24 horas (presuntivo para verotoxina) l) Perfil bioqumico correspondente a Escherichia coli no sitema para identificao de enterobactrias. As culturas que se comportarem como Escherichia coli O157:H7 devem ser mantidas pelo laboratrio e encaminhadas Instituio de Referncia para enterobactrias, designada pela CLA para sorotipificao, inclusive com soro flagelar H7, e teste de verotoxigenicidade. Os resultados de confirmao sorolgica e de verotoxigenicidade podem demorar um tempo relativamente grande. Por este motivo, emitir o resultado de anlise considerando os resultados obtidos no laboratrio. Quando o resultado sorolgico confirmar a presena de E.coli O157:H7 (verotoxignica ou no), comunicar por escrito ao responsvel pelo SIF que encaminhou a amostra para anlise.

Manter arquivo de todas informaes sorolgicas realizadas pela Instituio de Referncia. 6.1 Expresso do resultado; Expressar o resultado como: Pesquisa de Escherichia coli O157:H7 - Presena /25 g ou mL; ou Pesquisa de Escherichia coli O157:H7 - Ausncia/25 g ou mL. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA BENNETT, A.R.; MacPHEE, S. BETTS, R.P. The isolation and detection of Escherichia coli O157:H7 by use of immunomagnetic separation and immunoassay procedures. Letters in Applied Microbiology. Oxford; v. 22, p. 237-243, 1996. BEUTIN, L.; MONTENEGRO, M.A.; OSKOV, I. et al. Close association of verotoxin (Shigalike toxin) production with enterohemolysin production in strains of Escherichia coli. Journal of Clinical Microbiology. Washington; v. 27, p. 2559-2564, 1989. CHAPMAN, P.A. Evaluation of commercial latex slide test for identifying Escherichia coli O157. Journal of Clinical Pathology. London, v. 42, p. 1109-1110, 1989. CUBBON, M.D.; COIA, J.E.; HANSON. M.F. et al. A comparison of immunomagnetic separation, direct culture and polymerase chain reaction for the detection of verocytotoxinproducing Escherichia coli O157:H7 in human faeces. Journal of Medical Microbiology. Essex, v.44, p. 219-222, 1996 DYNAL(a). Cell separation and protein purification technical handbook. 2 ed. Oslo: DYNAL, 1996. 165p. DYNAL(b). Testing food sample for Escherichia coli O157:H7 - IMS vs direct plating. Oslo: DYNAL, 1996. FRATAMICO, P.M.; SCHULTZ, F.J.; BUCHANAN, R.L. Rapid isolation of Escherichia coli O157:H7 from enrichment cultures of foods using an immunomagnetic separation method. Food Microbiology, London, v. 9, p. 105-113, 1992. MARCH, S.B.; RATNAM, S. Latex agglutination test for detection of Escherichia coli serotype O157. Journal of Clinical Microbiology, Washington, v. 27, p. 1675-1677, 1989. OLSVIK, O.; POPOVIK, T.; SKJERVE, E. et al. Magnetic Separation Techniques in Diagnostic Microbiology. Clinical Microbiology Reviews, Washington, v. 7, p. 43-54, 1994. SAFARIK, I.; SAFARIKOV, M.; FORSYTHE, S.J. The application of magnetic separations in applied microbiology. Journal of Applied Bacteriology, Oxford, v. 78, p. 576-585, 1995. WRIGHT, D.J.; CHAPMAN, P.A.; SIDDONS, C.A. Immunomagnetic separation as a sensitive method for isolating Escherichia coli O157 from food samples. Epidemiology and Infection, Cambridge, v. 113, p. 31-39, 1994. CAPTULO XIX PESQUISA DE Paenibacillus larvae subsp. larvae 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer metodologia analtica para a deteco de Paenibacillus larvae subsp. larvae (referido no restante do texto como P. larvae), agente da enfermidade Cria Ptrida Americana. A metodologia destina-se verificao da presena de esporos do agente em amostras de produtos da colmia. 2. FUNDAMENTOS

2.1 Preparo da Amostra; O aquecimento da amostra a 45C visa diminuir a viscosidade, permitir a distribuio homognea dos esporos e facilitar a manipulao. A diluio com soluo salina tamponada, alm de viabilizar a concentrao dos esporos pela centrifugao que se segue, contribui para bloquear parcialmente a ao inibidora de crescimento bacteriano, exercida por substncias presentes no mel. 2.2 Centrifugao; Visa concentrar os esporos presentes na amostra por meio de centrifugao a 3.000 x g por 30 minutos (g = 0, 0000118 x raio do rotor (cm) x rpm2). 2.3 Choque Trmico; Por meio do aquecimento, a 80C por 10 min., do sedimento da amostra obtido por centrifugao, obtm-se a eliminao das formas vegetativas de bactrias que podem interferir no crescimento de Paenibacillus larvae e dificultar a seleo de colnias. 2.4 Isolamento e Seleo; Baseia-se na semeadura sobre a superfcie seca de gar Paenibacillus larvae (ABL), meio composto por gar estoque, gar soja triptona, gar Cereus (PEMBA) - base, suplementado com emulso de gema de ovo, cido nalidxico e cido pipemdico. A emulso de gema de ovo promove a multiplicao de P.larvae e permite a diferenciao de microrganismos pela reao da lecitinase. A presena de 0,1% de peptona, associada ao piruvato de sdio (presentes no PEMBA), evidencia a precipitao da lecitina da gema do ovo, provocada por espcies de Bacillus que possuem essa propriedade. O manitol, carboidrato presente no meio, no fermentado pelo Paenibacillus larvae. O indicador de pH presente no meio o azul de bromotimol. O cido nalidxico atua inibindo total ou parcialmente o crescimento de P. alvei, B. megaterium, P.larvae subsp. pulvifaciens, P. polymyxa e B. pumilus. O cido pipemdico atua prevenindo o crescimento de B. circulans, B. subtilis, B. licheniformis, B. cereus, B. mycoides, P.larvae subsp. pulvifaciens e P. apiarius. 2.5 Provas confirmativas: Baseiam-se na observao das caractersticas morfolgicas e tintoriais; na observao da capacidade de decompor a casena; na incapacidade de produzir catalase; no crescimento escasso em gar nutriente isento de extrato de levedura e no crescimento tpico no gar leite com tiamina (ALT). 3.REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia; Tubos para centrfuga tipo Falcon ou similar, com tampa rosquevel, cap. 100 mL; gar cereus (PEMBA) - base* (opcional: gar manitol gema de ovo poliximina segundo Mossel (MYP) - base); gar estoque*; gar soja triptona*; Emulso de gema de ovo 50%*; cido pipemdico soluo 0,2%*; cido nalidxico soluo 0,1%*; Tiamina cloridrato soluo aquosa 0,1%**; Leite desnatado UHT**; gar gar com extrato de levedura**; gar nutriente sem extrato de levedura; Caldo crebro-corao com tiamina (BHIT); Soluo salina fosfatada tamponada pH 7,2 (PBS);

Perxido de hidrognio 3%; Caldo experimental para anaerbios; * Componente do gar Bacillus larvae (ABL); ** Componente do gar leite com tiamina (ALT). 4. EQUIPAMENTOS Centrfuga (3.000 x g); Banho-maria a 80C; Termmetro 100C. 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Preparo da amostra: Mel e produtos in natura: Aquecer a amostra em banhomaria a 45C para facilitar a manipulao da mesma e a homogeneizao dos esporos presentes. Transferir, assepticamente, 20 mL da amostra para tubo de centrifuga estril e adicionar 30 mL de soluo salina fosfatada tamponada (PBS). Homogeneizar bem. Produtos da colmia liofilizados: pesar, assepticamente, 5g do produto em tubo de centrfuga estril e adicionar 45 mL de PBS. Deixar em repouso por 10 a 15 min. Homogeneizar bem. Plen: pesar, assepticamente, 5g da amostra e adicionar 45 mL de PBS misturando vigorosamente. Filtrar a mistura em papel filtro n 2 (Whatman). Deixar em repouso por 2 horas para decantao do plen residual. Transferir cuidadosamente para tubos de centrfuga estreis com tampa. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Concentrao por centrifugao Centrifugar a 3.000x g por 30 minutos. Aps centrifugao, descartar cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 1 mL de PBS e transferir para tubos com tampa de rosca. Aquecer a 80C, em banho-maria, por 10 minutos. 5.4 Isolamento: Transferir 0,1 mL da suspenso preparada conforme item 5.3 para a superfcie seca de placas com ABL. Com o auxlio de basto tipo hockey, espalhar cuidadosamente o inculo sobre a placa paralelamente, usando ala de 10 L, inocular a suspenso por estrias sobre a superfcie seca de outra placa com ABL. Incubar as duas placas invertidas a 36 1C por at 5 dias, observando, aps 48h e depois diariamente, o crescimento de colnias tpicas de Paenibacillus larvae. No ABL, as colnias tpicas de Paenibacillus larvae se apresentam planas, com superfcie suavemente granulada, achatadas, com ou sem centro elevado de maior densidade, com bordas levemente irregulares, sem brilho, de cor verde- amarelada e dimetro de 2 a 5mm, sem halo de precipitao da lecitina, com ou sem halo de liplise. Alguns isolados podem apresentar colnias com centro muitas vezes mais denso (opaco) que as bordas (translcidas). 5.5 Seleo: Selecionar 3 a 10 colnias tpicas e testar quanto presena de catalase.

5.5.1 Prova da Catalase; Com auxlio de uma ala de platina, basto de vidro, palito de madeira ou pipeta de Pasteur estreis, retirar uma alquota do cultivo, transferir para uma lmina ou placa de vidro contendo uma gota de perxido de hidrognio a 3%. Misturar o inculo ao perxido e observar a reao. A no formao de borbulhas indica prova negativa para catalase. A formao de borbulhas indica prova positiva para catalase. As culturas de Paenibacillus larvae so catalase negativas. Repicar as colnias catalase negativas para tubos contendo gar leite com tiamina inclinado e incubar a 36 1C por 24 a 48 h. Manter essas culturas para testes complementares, caso sejam necessrios. 5.6 Provas Confirmativas: Realizar as provas confirmativas completas em cada uma das colnias catalase negativas. 5.6.1 Colorao de Gram; Das colnias suspeitas, fazer esfregao e corar pelo mtodo de Gram. O P.larvae se apresenta como bastonete Gram positivo, comumente longo e fino, porm, pode se apresentar de diversos tamanhos, em cadeias de comprimento varivel. As culturas que se apresentarem como suspeitas no Gram e catalase negativas devem ser testadas para: 5.6.2 Crescimento em superfcie de gar nutriente sem extrato de levedura: A partir das colnias catalase negativas, repicar tambm em tubos com gar nutriente inclinado isento de extrato de levedura e incubar a 36 1C por 3 dias. A maioria dos Paenibacillus larvae apresenta escasso crescimento em gar nutriente sem extrato de levedura aps 3 dias. 5.6.3 Decomposio da casena e verificao de crescimento tpico no ALT A partir das colnias catalase negativas, repicar sobre a superfcie seca de placas com gar leite com tiamina (ALT) e incubar a 36 1C por 3 dias. Aps incubao, verificar a presena de halo transparente ao redor das colnias. O Paenibacillus larvae decompe a casena em at 3 dias. As colnias de Paenibacillus larvae subsp. larvae no ALT se apresentam de colorao entre branco e gelo, de aspecto sutil e delicado (pouco densas). Diferenciao entre Paenibacillus larvae subsp. larvae e outros microrganismos relacionados comumente encontradas em amostras de produtos apcolas. Decomposio da casena P.larvae subsp. larvae POS* POS Paenibacillus alvei POS Brevibacillus laterosporus P.larvae subsp. Pulvifaciens POS NEG Paenibacillus popilliae NEG Paenibacillus lentimorbus Microrganismos Catalase NEG POS POS NEG NEG NEG Crescimento em gar nutriente sem extrato de levedura NEG ou escasso POS POS POS NEG NEG

Associado ao crescimento caracterstico no ALT. 6. RESULTADOS

6.1 Interpretao Considerar como P.larvae subsp. larvae as culturas que se apresentarem como bastonetes Gram positivos finos, mdios a longos, dispostos em cadeias, catalase negativas, com reao positiva para hidrlise da casena associada ao crescimento tpico no ALT, e com crescimento escasso no gar nutriente sem extrato de levedura em 3 dias. 6.2 Expresso do Resultado Expressar o resultado das anlises de mel como: Pesquisa de Paenibacillus larvae subsp. larvae: Presena /20 mL de mel; ou Pesquisa de Paenibacillus larvae subsp. larvae: Ausncia /20 mL de mel. Para outros produtos da colmia expressar o resultado como: Presena (ou Ausncia) / quantidade de amostra submetida anlise. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA SCHUCH, D.M.T.; MADDEN, R.H.; SATTLER, A. 2001. An improved method for the detection and presumptive identification of Paenibacillus larvae subsp. larvae spores in honey J. Apicult. Res., 40(2): 59-64. GOCHNAWER, T. A., CORNER, J. 1974. Detection and identification Bacullis larvae in a commercial pollen samples. J. Apicult. Res. 13: 264-267. DSMZ - Deutsche SammLung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. Bacterial Nomenclature Up-to-Date - (Approved Lists, Validation Lists).Nov. 2002. Braunschweig, Germany.Disponvel In: http://www.dsmz.de/bactnom/bactname.htm CAPTULO XX TESTE DE ESTERILIDADE COMERCIAL PARA ALIMENTOS DE BAIXA ACIDEZ - pH > 4,6 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a verificao da eficcia do processo de esterilizao aplicado a alimentos de baixa acidez, comercialmente estreis; Aplica-se a amostras de alimentos comercialmente estreis de baixa acidez (enlatados). 2. FUNDAMENTOS Pr-incubao:: Baseia-se na incubao das amostras nas temperaturas de 36 1C pelo perodo de 10 dias e a 55 1C pelo perodo de 5 a 7 dias, objetivando a deteco de crescimento bacteriano com formao de gs, evidenciado pelo tufamento da embalagem e na verificao de possveis microfugas. 2.1 Semeadura e incubao: Baseia-se na utilizao de meios lquidos no seletivos com capacidade de promover o crescimento de microrganismos por meio da incubao em aerobiose e anaerobiose, em temperaturas ideais para o desenvolvimento de microrganismos mesfilos e termfilos. 2.2 Provas complementares 2.2.1 Colorao pelo mtodo de Gram e de esporos: Baseia-se na observao microscpica das caractersticas morfolgicas e tintoriais dos microrganismos presentes e de seus esporos.

Prova da Catalase Baseia-se na verificao da capacidade do microrganismo em teste produzir a enzima catalase, que decompe o perxido de hidrognio, liberando oxignio, o que evidenciado por meio da formao de borbulhas. 2.2.3 Prova da termofilia estrita: Baseia-se na verificao da germinao e crescimento dos esporos nas temperaturas de 36 1C e 55 1C para certificao da exigncia absoluta de elevada temperatura para seu desenvolvimento. A germinao dos esporos a 36 1C indica a capacidade mesoflica do microrganismo. O crescimento a 36 1C e a 55 1C indica a capacidade termoflica facultativa do microrganismo. O crescimento somente a 55 1C indica a capacidade termoflica estrita do microrganismo. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; Equipamentos, vidraria e outros; Abridores metlicos estreis; Pinas estreis; Caldo de carne cozida (CCC) ou Caldo Tarozzi; Caldo glicose triptona; gar glicose triptona; gar nutriente; gar nutriente com sulfato de mangans; gar para esporulao; gar crebro-corao (ABHI); Corantes para a colorao de esporos; Corantes para a colorao de Gram; Perxido de hidrognio 3%; Vaspar ou vaselina ou leo mineral ou parafina lquida. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS 5.1 Pr-incubao: Seguir os procedimentos para pr incubao no item 3.1.1 do Anexo V, Procedimento para o preparo, pesagem e descarte de amostras, deste Manual. Verificar, aps o perodo de pr-incubao a 36 1C e 55 1C, se os recipientes no sofreram tufamento. Verificar se o papel filtro apresenta manchas que possam evidenciar a presena de microfugas ou vazamentos. Registrar como sem alterao quando no se observar qualquer alterao dos recipientes e como alterado quando qualquer alterao for detectada. Descrever a alterao, quando ocorrer. 5.1.1 Amostras que sofreram alterao durante a pr-incubao: Ao final da princubao, quando o papel filtro sobre o qual ficaram incubadas as latas estiver manchado, evidenciando a presena de microfugas, submeter a respectiva amostra anlise de aerbios e anaerbios, mesfilos ou termfilos, de acordo com a temperatura da pr-incubao. Proceder

conforme item 5.3 para a anlise destas amostras. 5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio. 5.3 Amostras tufadas; As amostras que derem entrada no laboratrio com evidncias de tufamento e estiverem acompanhadas de ofcio com solicitao de anlise especial sero analisadas imediatamente, devendo ser preparadas conforme as instrues descritas abaixo: Fazer desinfeco da embalagem com algodo embebido em soluo desinfetante e em seguida com etanol 70% ou etanol 70 GL. Deixar secar. Posicionar a lata com borda no codificada para cima e costura lateral voltada para o lado oposto ao analista. Colocar um chumao de algodo embebido em soluo desinfetante, previamente aprovada pelos testes do laboratrio, no local onde ser iniciada a abertura da embalagem. Esse procedimento tem o objetivo de proteger o ambiente e o analista contra uma possvel contaminao proveniente do alimento em anlise pela expulso de gases e/ou lquidos presentes no recipiente no momento do rompimento da hermeticidade. Outros cuidados como o uso de luvas, mscara, toucas, etc. tambm devero ser adotados. Usando um abridor de latas metlico, previamente esterilizado, abrir um pequeno orifcio sob o chumao de algodo. Deixar em repouso sem retirar a proteo de algodo sobre o orifcio at que a presso interna do produto esteja equilibrada com a externa. Com outro abridor estril, abrir cuidadosamente a lata e transferir pores do contedo, tomadas do lado oposto ao local do orifcio inicialmente feito, para os meios de cultivo indicados. Aps a retirada das alquotas estabelecidas pela metodologia especfica, fechar cuidadosamente a lata e acondicion-la em saco plstico autoclavvel, fechando-o com fita adesiva. A amostra, assim embalada, dever ser imediatamente descartada conforme norma especfica do laboratrio. As amostras alteradas que chegarem desacompanhadas de ofcio com solicitao especfica no sero analisadas. Fazer constar no Certificado Oficial de Anlise a informao do motivo da no aceitao. No flambar os recipientes tufados. Os mesmos devero ser somente desinfetados com algodo embebido em soluo desinfetante. Manter registros das condies das amostras no momento da sua recepo no laboratrio. 5.4 Inoculao das amostras; Utilizando a amostra incubada a 36 1C, retirar alquotas de cerca de 1 a 2 gramas ou mL e semear em quatro tubos contendo caldo de carne cozida ou caldo Tarozzi, e tambm em quatro tubos contendo caldo glicose triptona. Aps a inoculao das amostras, acrescentar, assepticamente, sobre o caldo de carne cozida ou caldo Tarozzi uma camada de aproximadamente 2 cm de vaspar ou vaselina ou leo mineral ou parafina lquida, estril, previamente fundido. 5.5 Incubao; Incubar dois tubos de cada meio nas temperaturas de 36 1C e 55 1C por 120 horas (5 dias). 5.6 Leitura e Interpretao: Verificar, nos tubos contendo caldo de carne cozida ou caldo

Tarozzi, a formao de gs, a turvao do meio e possvel alterao na aparncia da carne do meio, sinais indicativos de crescimento bacteriano. Os clostrdios sacarolticos produzem cido e gs com odor cido, sem a digesto da carne cozida mas com conseqente avermelhamento da mesma. Os clostrdios proteolticos degradam a protena em aminocidos, com a precipitao da tirosina na forma de cristais brancos, produzindo um odor ftido de compostos sulfurados com conseqente enegrecimento da carne cozida e turvao do caldo. Verificar, nos tubos com caldo glicose triptona, se ocorreu turvao e/ou formao de pelcula na superfcie do caldo, alteraes que indicam crescimento bacteriano. Considerar como negativo o teste para a esterilidade comercial quando no se observar nenhuma das alteraes citadas acima e os controles corresponderem aos resultados esperados. Dar seqncia ao teste quando forem observadas quaisquer das alteraes citadas acima e os controles corresponderem aos resultados esperados. 5.6.1 Confirmao de tubos com crescimento positivo ou suspeito: Os tubos suspeitos de apresentarem crescimento devem ser repicados por estriamento em placas de ABHI, conforme segue: 5.6.1.1 Quando o tubo suspeito for o de caldo glicose triptona incubado a 36 1C (aerbios mesfilos) repicar concomitantemente para duas placas com ABHI. Incubar uma destas placas a 55 1C e a outra a 36 1C por 24 a 48 horas. 5.6.1.2 Quando o tubo suspeito for o de caldo glicose triptona incubado a 55 1C (aerbios termfilos) repicar para uma placa com ABHI. Incubar a 55 1C por 24 a 48 horas. 5.6.1.3 Quando o tubo suspeito for o de caldo de carne cozida (ou de caldo Tarozzi), incubado a 36 1C (anaerbio mesfilo) ou a 55 1C (aerbios termfilos), repicar para uma placa com ABHI. Incubar por 24 a 48 horas, na mesma temperatura de incubao usada para o tubo de origem (36 1C ou 55 1C), em anaerobiose. 5.6.2 Leitura: Aps a incubao, verificar o crescimento de microrganismos nas placas. O no crescimento indicar resultado negativo para o teste de esterilidade comercial. Quando for verificado crescimento nas placas, repicar as culturas obtidas para tubos com gar estoque inclinado e incubar nas mesmas condies das placas de origem. Aps incubao, realizar os testes complementares a seguir: 5.7 Testes complementares 5.7.1 Colorao de Gram: A partir das colnias que crescerem nas placas, preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram, conforme instrues constantes do Anexo VII, Procedimentos de colorao, deste Manual. Quando for verificada a presena de bastonetes Gram positivos nos tubos incubados em anaerobiose, a realizao da prova de catalase necessria para a diferenciao entre Bacillus sp (catalase positiva) e Clostridium sp (catalase negativa). Registrar no resultado final a morfologia dos cultivos celulares isolados observada. 5.7.2 Prova da catalase: Com auxlio de ala de platina, palito de madeira, basto de vidro ou Pipeta de Pasteur estril, transferir a cultura para uma lmina de vidro contendo uma gota de perxido de hidrognio a 3%. A no formao de borbulhas indica prova negativa para catalase. A formao de borbulhas indica prova positiva para catalase. No caso da presena de bastonetes Gram positivos, resultados de catalase negativos indicam a presena de Clostridium sp e resultados positivos indicam a presena de Bacillus sp. Quando for detectada a presena de Clostridium sp, guardar as culturas para testes

complementares, caso sejam necessrios. 5.7.3 Prova da termofilia estrita: Quando forem detectados bastonetes termfilos, realizar prova para confirmao de termofilia estrita do microrganismo isolado. A partir dos tubos com caldo glicose triptona positivos incubados a 55 1C, repicar maciamente para tubos contendo gar nutriente inclinado com sulfato de mangans (ou gar para esporulao). Incubar a 55 1C de 2 a 10 dias. A partir do segundo dia, verificar a presena de esporos por meio da aplicao da tcnica para colorao de esporos, conforme instrues constantes do Anexo VII, Procedimentos de colorao, deste Manual. Quando forem detectadas culturas esporuladas, preparar suspenso de esporos, lavando o crescimento obtido no tubo com gar nutriente/sulfato de mangans com 1 mL de gua destilada ou deionizada estril. Inativar as formas vegetativas por meio da aplicao de um choque trmico a 80C por 15 minutos na suspenso preparada de 1 mL. Inocular 0,1 mL do lavado, aps o choque trmico, em dois tubos contendo caldo glicose triptona. Incubar um tubo a 36 1C e outro a 55 1C por 2 a 4 dias. Verificar o crescimento de microrganismos, evidenciado pela turvao do caldo. O crescimento bacteriano somente no tubo incubado a 55 1C determina a termofilia estrita do microrganismo isolado. O crescimento bacteriano nos dois tubos determina a termofilia facultativa do microrganismo isolado. Registrar no resultado final a caracterstica mesoflica ou termoflica do microrganismo isolado. 5.7.4 Confirmao de microrganismos flat sour (opcional): A partir das culturas obtidas nas placas de ABHI, provenientes dos tubos positivos de caldo glicose triptona incubados a 55 1C, repicar para a superfcie seca de 2 placas com gar glicose triptona. Incubar uma das placas a 36 1C por 72 horas e a outra a 55 1C por 48 horas em cmara mida. O crescimento de colnias amarelas, regulares, com dimetro de aproximadamente 2 a 3 mm, rodeadas de zona de clarificao tambm amarela, nas placas incubadas a 55 1C, com ncleo opaco e o no crescimento naquelas incubadas a 36 1C, confirmar a presena de Bacillus stearothermophilus (renomeado Geobacillus stearothermophilus ), microrganismo responsvel pela deteriorao flat sour. 6. RESULTADOS 6.1 Pr-incubao: Expressar, no campo referente a emisso do resultado para prova de pr-incubao, nas temperaturas requeridas, o resultado como sem alterao quando no se observar qualquer alterao ou anormalidade no recipiente e nas caractersticas fsicas e/ou sensoriais da amostra, e como alterado quando for observada qualquer alterao ou anormalidade no recipiente ou nas caractersticas fsicas e/ou sensoriais da amostra. Nesse caso, descrever o tipo de alterao observado. 6.2 Pesquisa de aerbios e anaerbios termfilos e mesfilos: Expressar, nos campos referentes a emisso dos resultados para as pesquisas de aerbio e anaerbio mesfilo e termfilo, o resultado como negativa, quando no for observado qualquer desenvolvimento de microrganismos no teste aplicado e como positiva quando for observada a presena de

microrganismos. Sempre que possvel, fazer constar do resultado final as observaes feitas ao microscpio. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA BRASIL. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento-Secretaria de Defesa Animal Departamento Nacional de Defesa Animal - Coordenao Geral de Laboratrio Animal - Mtodos de Anlise Microbiolgica para Alimentos - Teste de Esterilidade Comercial Braslia, D.F. 1991/1992 - 2 Reviso, p. 111 - 113. DEIBEL K. E.; JANTSCHKE, M. Canned Foods - Tests for Commercial Sterility . In: In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p. 577-588. DENNY C. B; PARKINSON, N.G. Canned Foods - Tests for cause of spoilage . In: In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.583-600. DSMZ - Deutsche SammLung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. Bacterial Nomenclature Up-to-Date-(Approved Lists, Validation Lists).Nov.2002.Braunschweig, Germany.Disponvel In:http://www.dsmz.de/bactnom/bactname.htm ANEXO I PROCEDIMENTOS DE RECEBIMENTO DE AMOSTRAS 1. RECEBIMENTO DAS AMOSTRAS NO LABORATRIO O setor de recepo far a triagem das amostras enviadas pelo SIF. Somente sero aceitas, pelo setor de recepo do laboratrio, as amostras lacradas pelo responsvel pela colheita que vierem acompanhadas de cinta de identificao no produto (protegida para evitar danificaes) e Certificado Oficial de Anlise (COA) devidamente preenchido. 1.1 Certificados Oficiais de Anlise: Os COAs devero ser originais, carbonados, carimbados e assinados pelo responsvel pela colheita. Cabe a este o correto preenchimento ( mo ou mquina), legvel em todas as vias. O responsvel pela colheita dever preencher os campos 1, 2 e 4 a 16 do certificado. Sero recusadas as amostras que vierem acompanhadas de fotocpias dos mesmos ou de Certificado Oficial de Anlise (COA) proveniente de outra instituio. 1.2 Nmero de Protocolo; O setor de recepo de amostras do laboratrio dever registrar o nmero do protocolo da amostra no laboratrio no campo n 3 do COA. 1.3 Outras verificaes e registros: No recebimento das amostras, devero ser anotadas informaes referentes data, hora e temperatura de recebimento da amostra. No campo referente temperatura da amostra no recebimento, dever ser registrada a condio de resfriamento em que a amostra foi entregue no laboratrio, isto : resfriada, congelada ou em temperatura ambiente. Quando houver necessidade de verificao da temperatura com termmetro, dever ser utilizada uma amostra recebida nas mesmas condies das demais e que ser usada

unicamente para esta finalidade. 1.4 Amostras rejeitadas; O setor de recepo de amostras reter todos os Certificados Oficiais de Anlise das amostras que chegarem fora das condies especificadas nestas normas, os quais sero encaminhados ao Setor de Microbiologia com a informao (cdigo) do motivo da rejeio. O Setor de Microbiologia far constar do corpo do certificado (espaos destinados aos resultados) a informao: Amostra no analisada, seguida da descrio do motivo pelo qual a anlise no foi realizada. Caber ao portador das amostras a responsabilidade do retorno das mesmas sempre que rejeitadas por estarem em desacordo com as normas aqui estabelecidas. As amostras enviadas por transportadora ou correio, que forem rejeitadas pelo laboratrio, ficaro disposio do remetente por 3 (trs) dias. Aps esse prazo, sero incineradas. 1.4.1 Motivos e respectivos cdigos para rejeio de amostras 001 / AD - amostra descongelada 002 / AP - amostra em putrefao 003 / AV - amostra violada (lacre ou embalagem) 004 / PV - amostra fora do prazo de validade 005 / EP - prazo excedido entre colheita entrada no laboratrio 006 / FC - amostra fora do cronograma 007 / CI - certificado incompleto ou incorretamente preenchido 008 / OM - outro motivo - ser especificado 2. AMOSTRAS FORA DE CRONOGRAMA Amostras fora do cronograma somente sero aceitas para anlise nos seguintes casos: Quando houver anlise anterior com resultados fora dos padres; Quando houver autorizao prvia por parte do laboratrio ou do Servio de Inspeo de Produtos (SIPA). Em ambos os casos, fazer constar do certificado de anlise o responsvel pela autorizao da remessa da amostra. O SIPA dever notificar o laboratrio com antecedncia sobre a autorizao e necessidade de anlise de amostras fora do cronograma. 3. DEVOLUO DE AMOSTRAS APS ANLISE As amostras que derem entrada no laboratrio de microbiologia em nenhuma hiptese sero devolvidas ao interessado, em razo de que nesta rea so manipulados microrganismos de risco sade pblica. 4. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA BRASIL. Ministrio da Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrria. Secretaria de Defesa Agropecuria. Departamento de Defesa Animal. Manual de mtodos microbiolgicos para alimentos. Coordenao Geral de Laboratrio Animal. 1991/1992 2 reviso. p.4-5 H. W., ANDREWS, G. A. JUNE. Food sampling and preparation of sample homogenate. In: Bacteriological Analytical Manual. 8.ed. Food and Drug Administration. AOAC International, Gaithersburg, USA. 1995. p. 1-2. MIDURA, T.F., BRYAN, R.G. Sampling plans, sample collection, shipment and preparation for analysis. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed.

Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.13-23. ANEXO II DILUIES E SOLUES 1. DILUIES Diluio o procedimento de adio de uma substncia a outra para reduzir a concentrao de uma das substncias. O uso mais comum da palavra diluio ocorre no sentido de que tantas partes de um material esto sendo diludas em um nmero total de partes do produto final (diluente + material). Uma diluio uma expresso de concentrao ou proporo, no de volume. Diluio indica a quantidade relativa de substncias em uma soluo. Em frases de diluio, o menor nmero sempre se refere ao nmero de partes da substncia que est sendo diluda, enquanto que o maior nmero sempre se refere ao nmero de partes que constitui a soluo final. Exemplo: Frase de Diluio: Fazer uma diluio 1 para 10 de leite em soluo salina peptonada. Esta frase poderia ser escrita de outras formas, com o mesmo significado: Fazer uma diluio 1 em 10, de leite em soluo salina peptonada. Fazer uma diluio 1 para 10, de leite com soluo salina peptonada. Fazer uma diluio 1/10, de leite com soluo salina peptonada. Fazer uma diluio 1:10, de leite usando soluo salina peptonada. Fazer uma diluio de 1 parte de leite e 9 partes de soluo salina peptonada. 1.1 Diluies decimais: Diluies decimais so diluies em que a quantidade de substncia a ser diluda corresponde unidade, ou mltiplos da unidade e o volume final da soluo diluda igual a 10 ou mltiplo de 10 (diluies de base 10). 1.2 Diluies decimais seriadas: So diluies decimais preparadas em srie e que possuem um fator de diluio nico e igual a 10. Exemplo: Preparar diluies decimais de uma cultura bacteriana em fase estacionria at 10-3: a) Preparar uma diluio 1:10 da cultura em fase estacionria em soluo salina peptonada, isto , misturar 1 mL da cultura em fase estacionria com 9 mL de soluo salina peptonada (10-1). b) A partir da diluio 1:10 preparada conforme item 1 deste exemplo, aps homogeneizao em agitador de tubos, tomar 1 mL e misturar com 9 mL de soluo salina peptonada, de forma a obter a diluio 1:100 da cultura em fase estacionria (10-2). c) A partir da diluio 1:100 preparada conforme item 2 deste exemplo, aps homogeneizao em agitador de tubos, tomar 1 mL e misturar com 9 mL de soluo salina peptonada, de forma a obter a diluio 1:1000 da cultura em fase estacionria (10-3). 1.3 Clculos de Diluies 1.3.1 Clculo envolvendo uma diluio: Para preparar uma diluio 1:100 de carne em

soluo salina peptonada, devemos misturar uma parte de carne em um volume final de 100 partes, isto , 1 + 99. Quando necessrio preparar um determinado volume de uma diluio especfica de uma substncia, o clculo se efetua pelo processo razo-proporo, conforme exemplo abaixo: Substncia: NaCl Volume a ser preparado: 130 mL Diluio: 1:80 (= 1 parte de NaCl em volume final de 80 partes) 1 parte de NaCl = X gramas de NaCl 80 partes de soluo final 130 mL de soluo final 80 X = 130 x 1 X = 130 = 1,625 partes de NaCl/130 mL de soluo 80 ou Vi x Ci = Vf x Cf Vi = volume inicial Ci = concentrao inicial Vf = volume final Cf = concentrao final 1.3.2 Vrias diluies relacionadas: Vrios mtodos laboratoriais indicam o uso de uma srie de diluies, o que nada mais que um nmero de solues obtidas pela diluio de uma substncia em um diluente, e fazendo diluies seqenciais a partir das solues resultantes. 1.4 Diluies de alimentos para realizao de anlises microbiolgicas: O processo de diluio da amostra, bem como o procedimento tcnico utilizado durante esse processo, constituem fatores importantes de interferncia nos resultados finais da anlise microbiolgica. Em microbiologia de alimentos, comumente so utilizadas diluies decimais da amostra, adotando-se rotineiramente dois critrios: massa por unidade de volume (m/v) e volume por unidade de volume (v/v). Para a obteno de uma diluio de base 10, homogeneizam-se pores da amostra com volume de diluente necessrio para completar o volume correspondente a 10 vezes o volume (ou peso) da amostra. Assim, a diluio 1:10 de uma amostra de leite pasteurizado pode ser obtida homogeneizando: 1 mL de leite + 9 mL de diluente, ou 10 mL de leite + 90 mL de diluente, ou 20 mL de leite + 180 mL de diluente, ou 25 mL de leite + 225 mL de diluente, e assim por diante. Em todos os exemplos acima, a amostra resulta diluda 1:10 (10-1) e, conseqentemente, em cada mL da diluio teremos uma quantidade de amostra correspondente a um dcimo de mL (0,1 mL) e 0,9 mL de diluente. Sempre que necessrio inocular amostras lquidas sem diluir em meios de cultura, considera-se que a amostra se encontra na diluio 100. Para produtos slidos h a necessidade de pesar a amostra. Normalmente utilizam-se alquotas de 10 ou 25 gramas de alimentos slidos. Dez ou vinte e

cinco gramas de alimento no correspondem necessariamente a 10 ou 25 mL de alimento. O volume vai variar com a densidade e temperatura do alimento em anlise. Alimentos slidos, em p ou pastosos sempre tero que sofrer diluio antes do incio da anlise, usando-se o critrio massa por unidade de volume (m/v). Normalmente a diluio inicial de amostras slidas, em p ou pastosas, utilizada para anlises microbiolgicas 1:10. Outras diluies como 1:2, 1:5, ou outras podem ser usadas em casos especiais. Antes do incio do procedimento de diluio fundamental que a amostra seja bem homogeneizada (produtos lquidos em p e pastosos) ou que a alquota para anlise, obtida de produtos slidos, seja tomada de vrios pontos de forma a representar realmente a amostra. 1.5 Pontos crticos do processo de diluio de amostras de alimentos 1.5.1 Homogeneizao da amostra e suas diluies: A homogeneizao inadequada da diluio inicial, e das subseqentes, poder acarretar diferenas muito grandes na contagem das colnias e resultados incoerentes quando do uso de duas ou mais diluies sucessivas. Para a obteno de resultados corretos de contagem de microrganismos em amostras de alimentos, a homogeneizao de todas as diluies ponto fundamental. A homogeneizao da diluio inicial (amostra/diluente) dever ser realizada em stomacher entre 30 segundos a 2 minutos, dependendo do tipo de amostra. A homogeneizao das diluies subseqentes dever ser realizada com o auxlio de agitador de tubos, por um perodo de tempo no superior a 1 minuto. Evitar a homogeneizao manual das diluies, pois o processo manual resulta a cada vez em diferentes graus de homogeneidade. 1.5.2 Diluies a utilizar x Intervalo de preciso e repetibilidade Considerando que o intervalo de preciso e repetibilidade poder variar de 15 a 150, de 20 a 200, de 25 a 250 e ainda de 30 a 300, dependendo da metodologia analtica empregada, caber ao analista estabelecer diluies que possibilitem a contagem de colnias nesses intervalos de preciso. Dessa forma, para alimentos com expectativa de crescimento bacteriano baixo, devido ao seu processo de fabricao e de conservao, as inoculaes devero ser efetuadas a partir da diluio inicial 100 para lquidos ou 10-1 para slidos ou pastosos, com no mnimo, duas diluies sucessivas. Por outro lado, para alimentos que se desconhece o nmero aproximado de microrganismos existentes, as diluies a serem preparadas devero garantir condies de realizao das contagens. Usualmente, nesses casos, utilizam-se as diluies 10-1 a 10-6. 1.5.3 Tempo desde a primeira diluio at a inoculao em meios de cultura O tempo gasto para a execuo das diluies de uma amostra de alimentos at sua inoculao em meios de cultura dever ser de, no mximo, 20 minutos, de forma a no permitir a multiplicao dos microrganismos contidos nas diferentes diluies, o que acarretaria a obteno de resultados falsos para a contagem de microrganismos. 1.5.4 Possveis contaminaes acidentais: Ao retirar as pipetas dos cartuchos ou ao desenrolar o papel que envolve individualmente cada uma delas, tomar o mximo de cuidado para no tocar com a pipeta a superfcie externa do cartucho, as mos, as bordas externas dos tubos ou dos recipientes. Esses mesmos cuidados devero ser tomados quando se estiver efetuando as inoculaes nas placas ou nos tubos de ensaio. Caso tal situao ocorra, despreze a pipeta e reinicie o procedimento corretamente.

1.5.5 Aderncia do lquido s paredes da pipeta: No inserir a ponta da pipeta mais do que 2,5 cm abaixo da superfcie do lquido dentro dos tubos ou dos recipientes contendo as diluies das amostras, diminuindo assim, a superfcie de contato da pipeta com a amostra diluda. Dispensar lentamente o inculo, permitindo a drenagem total at a marca final da pipeta por um perodo de 4 a 6 segundos, nos casos em que o mesmo corresponda ao volume total da pipeta. Preferentemente, usar pipetas que no sejam de esgotamento total. Quando da dispensa de parte do contedo de uma pipeta, deixar que o lquido escorra lentamente. O procedimento de expulso rpida do lquido contido na pipeta acarreta a reteno de um maior volume de lquido aderido s paredes. 1.5.6 Tipo e capacidade das pipetas: Sempre utilizar pipetas com marcao ntida de volume e, preferencialmente, que permitam a pipetagem do volume desejado sem que seja necessria a expulso da ltima poro da pipeta. Quando esse tipo de pipeta no estiver disponvel no laboratrio, para a pipetagem de 1 mL, recomendvel a utilizao de pipetas com capacidade de 2 mL, com graduao de 1/10 ou 1/100, aspirando o inculo at o volume total da mesma e dispensando a primeira poro (1 mL) no interior da placa ou do tubo. As pipetas utilizadas no devero ter capacidade superior a 10 vezes o volume a ser medido, para assegurar que o inculo dispensado seja o requerido. Por exemplo, se o inculo for de 0,1 mL, utilizar uma pipeta de 1 mL com graduao de no mnimo 1/10, aspirando o inculo at o volume total da mesma e dispensando a primeira diviso no interior da placa ou do tubo. 1.5.7 Preciso dos volumes dos inculos; Manter a pipeta sempre na posio vertical e inclinar o tubo at posio que forme um ngulo de 45 em relao pipeta, facilitando, desta forma, a leitura na pipeta do "menisco" do volume a ser dispensado. 1.5.8. Uso de pipetas: Sempre utilizar uma pipeta para cada diluio. No tocar com a pipeta de uma determinada diluio no diluente da diluio seguinte. NUNCA enxaguar a pipeta com o diluente da diluio subseqente. A mesma pipeta poder ser utilizada para a semeadura de diluies de amostras, desde que se parta da maior diluio (amostra mais diluda) para a menor diluio (amostra menos diluda). 2. SOLUES Solues so misturas homogneas unifsicas constitudas de duas ou mais substncias miscveis. So formados por dois compostos, o soluto e o solvente. O soluto a substncia que est dissolvida no solvente e, conseqentemente, o solvente a substncia que dissolve o soluto. Nas solues, os dois componentes no se encontram quimicamente combinados. 2.1 Solues saturadas: So solues que contm a quantidade mxima possvel de um soluto, em uma determinada temperatura e presso, perfeitamente dissolvido no solvente. Por exemplo, em solues de Cloreto de sdio, a saturao ocorre quando h aproximadamente 360 g do sal por litro de gua. 2.2 Concentrao de solues; Concentrao o quociente entre a quantidade do soluto e a do solvente ou da prpria soluo. Para determinar esse quociente alguns autores referem-se ao ttulo de uma soluo. A concentrao de uma soluo pode ser expressa de 3 maneiras:

a) Massa por unidade de massa (m/m); b) Massa por unidade de volume (m/v); c) Volume por unidade de volume (v/v). A forma mais precisa de se estabelecer a concentrao o de massa por unidade de massa (m/m), porm, nos laboratrios de microbiologia, onde se trabalha rotineiramente com produtos slidos que necessitam ser diludos durante a anlise, o sistema mais freqentemente usado o de massa por volume (m/v). Para amostras lquidas, o sistema usado o de volume por volume (v/v), que o menos preciso dos trs, fato que se deve s variaes de volume em funo das temperaturas do soluto e do solvente (amostra e diluente). 2.2.1 Relao de massa com massa C=M M Onde: C = Concentrao m = Massa do soluto M = Massa do solvente Neste caso a concentrao toma dois nomes particulares: * Molaridade: a relao entre o nmero de moles do soluto e 1000g do solvente. A concentrao expressa em molaridade utilizada em ebuliometria e criometria. * Porcentagem de peso: a relao entre a massa do soluto e 100g da soluo. Exemplo: Preparar uma soluo de sulfato de sdio a 10% em peso significa que em 100g da soluo existem 10 g do sulfato de sdio e 90 g de gua. Relao de volume com volume C=V V1 Onde: C = concentrao V = Volume do soluto V1 = Volume da soluo Neste caso, a concentrao toma o nome de Porcentagem em volume, desde que o volume da soluo seja tomado como 100 mL. aplicada para as solues lquido/lquido e gs/gs. Assim o lcool a 90% em volume significa que em 100 mL da soluo existem 90 mL de lcool.

Relao de massa com volume C=M V Onde: C = concentrao m = massa do soluto V = volume da soluo Neste caso, a concentrao toma diversos nomes conforme a massa do soluto. Pode ser expressa em unidades qumicas de massa (o mol e o n de equivalentes) ou em unidades fsicas de massa (o grama); e o volume da soluo pode ser expresso em litro ou, no caso particular da porcentagem, em 100 mL. Desta forma, podemos fazer o seguinte resumo: a) Unidades Qumicas b) Unidades fsicas A.Mol/litro = Molaridade (M) B.Equivalente-gram/litro = Normalidade( N) A. Gramas/litro = ttulo (T) B. Gramas/100 mL = Percentagem (%)

2.3 Partes: Estabelece uma relao em que a mesma unidade de medida, ou mltiplos da unidade, usada ao longo de todas as pores relacionadas do processo. Partes no se limita a uma nica unidade de medida. Concentraes de partes por milho ou ppm so freqentemente usadas para aditivos de meios de cultura e solues de antibiticos. Exemplo: Uma parte por milho (1 ppm) de cloridrato de tetraciclina possui uma parte do princpio ativo dissolvido em 1 milho de partes da soluo. Medidas que correspondem a 1 ppm so: - grama por tonelada (g/ton); - miligrama por quilo (mg/kg); - micrograma por grama (/g); - mililitro por litro (mL/L); - microlitro por mililitro (L/mL). 2.4 Hidratos; Os sais utilizados no laboratrio de microbiologia podem se apresentar na forma anidra ou na forma de um ou mais hidratos, em que uma ou mais molculas de gua esto ligadas molcula do sal. Quando se necessita preparar uma soluo cuja composio indique o uso de um sal na forma anidra, e somente est disponvel no laboratrio um hidrato, deve-se determinar quanto do hidrato corresponde quantidade da forma anidra estabelecida na formulao. Para esse clculo necessrio considerar os pesos moleculares e, por regra de trs, estabelecer o peso correspondente. Exemplo:

Preparar uma soluo 10% de CuSO4. Somente est disponvel no laboratrio CuSO4.H2O. Sol. 10% = 10 g/100 mL Peso molecular do CuSO4 = 160 Peso molecular do CuSO4.H2O = 178 10 g (CuSO4) = 160 X g (CuSO4.H2O) = 178 X = 10 x 178 = 11,125 g 160 Ento, para preparar a soluo 10% de CuSO4 usando a forma monohidratada, seria necessrio dissolver 11,125 g de CuSO4.H2O em quantidade de gua suficiente para completar 100 mL. O mesmo raciocnio utilizado para os casos em que a formulao indica o uso da forma hidrato e somente est disponvel a forma anidra. 2.5 Potncia de antibiticos: A potncia de um antibitico se refere quantidade de princpio ativo, biologicamente ativo, contido no produto. Poder estar expressa em Unidades (U), em porcentagem (%) ou em miligramas de princpio ativo por grama de produto (mg/g). Exemplos: Sulfato de Polimixina B 7600 U/mg; Tetraciclina 80%; Sulfato de estreptomicina 780 mg/g. As solues de antibiticos, usadas como padres referenciais nas provas de determinao de resduos de antibiticos em alimentos e como aditivos de alguns meios de cultura, podem estar expressas em U/mL, ppm ou ainda em microgramas por mL ). Para preparar uma soluo de antibitico proceder conforme abaixo: a) Sempre verificar a potncia no frasco do produto que est se usando. b) Quando, no frasco, a informao disponvel for apenas do total de U no frasco, verificar o peso total contido no mesmo e determinar quantas U existem por mg do produto. c) Quando a potncia estiver expressa em U/mg, preparar a soluo em U/mL ou calcular a converso para obter solues em ppm ou g/mL. d) Se a potncia se apresenta na forma de porcentagem, converter para mg (um antibitico com potncia de 80% possui 0,8 mg de princpio ativo por mg do produto). e) Pesar uma quantidade mnima de 10 mg do antibitico em balana analtica (quanto menor a quantidade pesada, maior ser o erro possvel de ocorrer). f) Multiplicar o peso obtido pela potncia e dividir pela concentrao final desejada para obter o volume de diluente a ser adicionado. Volume de diluente a adicionar = Peso x Potncia Concentrao final desejada Para obter a soluo 4000U/ml, baste dissolver as 23,7mg de sulfato de poliximina em 45,03mLde tampo

Exemplo 1: Preparar uma soluo 4000 U/mL de sulfato de polimixina B em tampo fosfato pH 8. Potncia do produto usado: 7600 U/mg Peso 23,7 mg (quantidade pesada) Volume = 23,7 x 7600 = 45,03 mL 4000 Para obter a soluo 4000U/mL, basta dissolver as 23,7 mg de sulfato de polimixina em 45,3 mL de tampo. Cada mL desta soluo oferecer uma soluo de sulfato de polimixina de 4000U. OBS: Para que no seja necessrio adicionar volumes fracionados de diluente, conforme o exemplo acima, pode-se estabelecer, de forma inversa, qual a quantidade de antibitico a ser pesado para um volume de diluente pr-determinado, procedendo conforme indicado no item 2.5.1. Exemplo 2 No meio SFP h a indicao da adio de 3 mg/L de sulfato de polimixina e de 12 mg/L de canamicina. Quando as quantidades do aditivo so to pequenas quanto estas, preparar soluo-me. Adicionar ao meio final, volumes das solues-me que ofeream uma concentrao fina, por litro de meio, correspondente ao indicado pelo fabricante. No caso deste exemplo (meio SFP) preparar: a) soluo de sulfato de polimicina a 3mg/L. (potencia 7600 U/mg) Pesar 300mg de sulfato de polimicina e diluir para 100mL, com gua destilada. Esta soluo ter concentrao de 3mg de polimicina B com potncia de 7600U/mg por mL. Neste exemplo seria usado 1 mL desta soluo por litro d meio. b) Kanamicina 12mg/mL. Potncia 80% 1mg do produto contm 0,8 mg de princpio ativo. Pesar mais de 100mg do antibitico (por exemplo 158mg) Multiplicar o peso obtido pela potncia e dividir pela concentrao final desejada para obter o volume de diluente a ser adicionado. X = 158 x 0.8 12 = 10,58mL

OBS: Para que no seja necessrio adicionar volumes fracionados de diluentes, conforem o exemplo acima, pode-se estabelecer, de forma inversa qual a quantidade de antibitico a ser pesado para um volume de diluente pr-determinado, procedendo conforme indicado no item 2.5.1. Cada mL desta soluo conter 12mg de kanamicina 2.5.1. Determinao do peso do peso de antibitico para preparao de solues, priorizando o volume. Nos exemplos 1 e 2 acima os volumes de diluentes a serem adicionados resultaram em nmeros quebrados, o que certamente leva a erros na concentrao final do antibitico. Para evitar volumes fracionados, fazer o clculo inverso, pr estabelecendo o volume de diluente a ser utilizado e calculando a quantidade de antibitico a ser pesado, usando a mesma frmula:

Peso = Vol. De diluente a adicionar x Conc. Final desejada. Potncia Supondo que se dispes de um balo volumtrico de 25mL para a preparao da soluo do exemplo 2, acima, proceder conforme segue: Peso = 25x12 0,8 = 375mg

A quantidade de antibitico a ser pesada neste caso seria de 375mg, que sero diludas em 25mL de diluente para a obteno de uma soluo com 12mg/mL 2.6 Concentrao por Centrifugao: Em microbiologia, o processo de centrifugao freqentemente usado para a concentrao de clulas ou esporos em processos de lavagem ou purificao. O processo de centrifugao promove a sedimentao de partculas mais densas por meio da aplicao de fora centrfuga obtida pela rotao em alta velocidade. As unidades usadas para indicar centrifugao so Rotaes por minuto (RPM) e fora gravitacional (g). Para calcular g se utiliza a seguinte frmula: g = 0,0000118 x raio do rotor (cm) x (rpm)2 3. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA CAMPBELL, J.M.; CAMPBELL, J.B. Diluies. In.: Matemtica de Laboratrio - Aplicaes Mdicas e Biolgicas. 3.ed. Editora Roca. So Paulo, SP. 1986. p. 77-88. CAMPBELL, J.M.; CAMPBELL, J.B. Solues. In.: Matemtica de Laboratrio - Aplicaes Mdicas e Biolgicas. 3.ed. Editora Roca. So Paulo, SP. 1986. p. 93-118. COOPER, T.G. The tools of Biochemistry. John Wiley & Sons, New York. 1977. 422p. FELTRE, R. Solues. In.: Qumica - Fsico-Qumica. 2.ed. So Paulo, SP. Editora Moderna.1983. p. 1-75. SWANSON, K.M.J.; PETRAN, R.L.; HANLIN,J.H. Culture methods for enumeration of microorganisms In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.53-62. ANEXO III PROCEDIMENTOS BSICOS DE CONTAGEM 1. TCNICAS DE CONTAGEM EM PLACAS As tcnicas de contagem em placas permitem a visualizao da formao de colnias a partir de um nmero "fixo" de clulas viveis. So utilizadas, portanto, para se obter a contagem de unidades formadoras de colnias (UFC) presentes na amostra sob anlise. Os meios de cultura usados para a obteno do nmero de colnias em uma amostra podem ser de uso geral (meios com ingredientes nutritivos bsicos), enriquecidos (meios com nutrientes adicionais, como sangue, gema de ovo e soro), acrescidos ou no de sistemas

inibidores e/ou indicadores. A aplicao das tcnicas de contagem tem por base o uso de diluies seriadas, obtidas a partir da homogeneizao de amostras slidas e semi-slidas ou a partir de inoculaes diretas de amostras lquidas e de suas diluies. As tcnicas bsicas de contagem em placas incluem: 1.1 Semeadura em profundidade: Distribuir as alquotas das diluies escolhidas em placas de Petri estreis. Acrescentar 12 a 15 mL do gar a 46-48C. Homogeneizar imediata e adequadamente. Deixar solidificar e incubar as placas (invertidas ou no), de acordo com as exigncias de tempo, temperatura, tenso de oxignio etc, requeridas pelo microrganismo a ser enumerado. 1.2 Semeadura em superfcie: Usar placas em que, previamente, tenha sido distribudo o meio especfico para o microrganismo a ser enumerado. Promover a secagem da superfcie deixando as placas invertidas, semi-abertas com a base apoiada na tampa, por cerca de 15 minutos em estufa a 45-50C. Inocular 0,1 mL, ou no mximo 0,5 mL, das diluies selecionadas, lembrando que 0,1 mL de uma diluio oferece resultado correspondente diluio seguinte, isto , 0,1 mL de 10-1 oferece resultado para a diluio 10-2. Observar que o inculo deve ser depositado no centro da superfcie do gar, evitando tocar a ponta da pipeta no meio, mantendo-a, entretanto, o mais prximo possvel. Espalhar o inculo, com auxlio de ala de Drigalski ou basto de vidro tipo "hockey", estreis, por toda a superfcie do gar, at absoro completa. Inverter as placas aps a absoro completa do inculo e incubar como requerido, o mais rpido possvel. 1.3 Semeadura por Sobrecamada: Proceder como para semeadura em profundidade. Aps homogeneizao do meio de cultura com o inculo e solidificao do gar, acrescentar uma nova camada de 10 a 12 mL do gar correspondente, fundido e mantido a 4648C. Deixar solidificar sem misturar e incubar conforme requerido. A tcnica por sobrecamada poder ser feita a partir de uma semeadura em superfcie, acrescentando-se uma sobrecamada de 10 a 12 mL de gar fundido aps a semeadura, distribuio e absoro total do inculo pelo gar. Deixar solidificar sem misturar e incubar o mais rpido possvel. Quando se pretende a recuperao de clulas em "stress", o tempo decorrido entre a inoculao da primeira camada e a adio da sobrecamada pode ser dilatado, deixando as placas invertidas emtemperatura ambiente, conforme indicao da metodologia especfica. 2. TCNICA DE NMERO MAIS PROVVEL A tcnica de Nmero Mais Provvel (NMP) um mtodo que permite estimar a densidade de microrganismos viveis presentes em uma amostra sob anlise. Esta tcnica no permite a contagem "fixa" de clulas viveis ou de unidades formadoras de colnias (UFC), como acontece com a tcnica de contagem em placas. A anlise por NMP recomendada quando: a) esperado, no alimento em anlise, um baixo nmero do microrganismo alvo (<100/g ou mL) ou quando, em funo de limitaes do mtodo e das diluies necessrias para o

alimento especfico, o padro de aceitao/rejeio no pode ser atendido por meio de provas de contagem. b) Quando, devido ao processo tecnolgico sofrido pelo alimento, as clulas presentes estejam lesadas fisiologicamente (clulas estressadas), no tendo portanto condies de formar colnias em meios slidos seletivos. A tcnica de NMP deve ser realizada incluindo as seguintes etapas analticas: a) Teste presuntivo (leitura dos resultados obtidos na srie de tubos mltiplos). b) Teste confirmatrio (subcultivo dos tubos positivos do teste presuntivo em caldo de maior impedincia ou em gar seletivodiferencial para o microrganismo pesquisado). c) Teste completo (identificao bioqumica da(s) espcie(s)`microbiana(s) presente(s)). Esta tcnica tem por base a probabilidade estatstica relacionada com a freqncia da ocorrncia de resultados positivos mais provveis em funo do nmero real de microrganismos presentes. necessrio que a amostra seja preparada de modo que as bactrias no se encontrem agrupadas, que estejam aleatriamente distribudas na amostra; e que os meios e condies de incubao permitam a recuperao e deteco de ao menos uma clula vivel do organismo alvo. Para a determinao do NMP, a amostra dever ser diluda tantas vezes quantas necessrias para que a ltima diluio de 3, 5 ou 10 tubos apresente todos os resultados negativos. Quanto maior o nmero esperado do microrganismo pesquisado, maiores devero ser as diluies usadas. Quando no se pode estimar qual a diluio do alimento que oferecer essa situao, so inoculadas mais de 3 sries com diluies decimais (por exemplo 100 at 10-4, ou mais diluies). Entretanto, na leitura final do NMP devero ser consideradas somente as 3 diluies mais significativas. Como na rotina de laboratrios analticos esse procedimento aumenta em muito o volume de trabalho e de material a ser usado, normalmente so utilizadas apenas trs diluies, considerando a estimativa do nmero esperado do microrganismo em estudo. Ento, o nmero de clulas viveis presentes obtido por meio de 3 diluies decimais sucessivas e transferncia de alquotas determinadas (tambm decimais, como 10 e 1mL) de cada diluio em sries de tubos. O nmero de tubos por srie varivel, podendo ser de 2 a 10. Mais comumente so usadas sries de 3 ou 5 tubos por diluio. Quando houver necessidade de inocular grande volume (10 mL) da amostra diluda ou no, na primeira srie de tubos, estes devero conter meio em concentrao dupla. O arranjo de nmero de tubos positivos das 3 diluies (ou as mais significativas) transposto para tabelas estatsticas que informam o NMP para as diferentes combinaes de tubos positivos e que tambm incluem os limites de confiana dos nmeros mais provveis dos microrganismos pesquisados em funo da tabela em questo. Os intervalos de confiana 95% constantes das tabelas de NMP oferecem a informao de que, em pelo menos 95% das vezes, h a chance da concentrao real do microrganismo alvo estar incluido no intervalo de confiana calculado para cada arranjo de tubos positivos. Por exemplo, o arranjo de tubos positivos 3-1-0 oferece como NMP o valor 43/g. Nesse caso, o intervalo de confiana 95% corresponde aos valores compreendidos entre 9 e 180. Isto significa que a chance do nmero real presente na amostra estar includo no intervalo de valores entre 9 e 180 UFC/g de 95%. A expresso do NMP feita somente por meio do nmero mais provvel que corresponda

ao arranjo de tubos positivos por srie. Em geral, as tabelas j esto corrigidas considerando g ou mL (e consequentemente, as diluies), para a obteno do NMP. Os exemplos a seguir permitem a seleo das diluies mais significativas, dentre as possibilidades descritas. TABELA 1 Casos Diluio (g ou mL) 1,0 0,1 0,01 1 3/3 3/3 1/3* 2 3/3 3/3 2/3 3 3/3 2/3 4 2/3 2/3 5 3/3 3/3 2/3 6 3/3 2/3 0.001 1/3 1/3 1/3 1/3 0,0001 Combinao tubos 3-3-1 3-2-1 3-2-0 2-2-0 3-2-2 3-2-1 de

Numerador = nmero de tubos positivos Denominador = nmero de tubos inoculados * 3 diluies consideradas significativas para a obteno do NMP 2.1 Interpretao dos resultados de NMP Para a escolha da tabela na qual se verificar o NMP correspondente combinao de tubos positivos, atentar para a quantidade (g ou mL) de amostra que foi realmente inoculada em cada tubo das diferentes sries e no para o volume inoculado. Exemplo 1: Inoculao de 10 mL da amostra na 1 srie 1,0 mL da amostra na 2 srie 1,0 mL da diluio 10-1 na 3 srie Quantidade de amostra inoculada em cada srie 10mL 1,0mL 0,1mL

A tabela a ser consultada dever ser a que oferece resultados de NMP para 10, 1,0 e 0,1 g ou mL. Para a gua, cujo resultado final dever ser expresso em NMP por 100 mL, o nmero constante da tabela dever ser multiplicado por 10. Neste Manual, para maior praticidade, a tabela para leitura de resultados de NMP em gua j contm os nmeros corrigidos (multiplicado por 10). Exemplo 2: Inoculao de 10 mL da diluio 10-1 na 1 srie 1,0 mL da diluio 10-1 na 2 srie Quantidade de amostra inoculada em cada srie 1,0 g ou mL 0,1 g ou mL

1,0 mL da diluio 10-2 na 3 srie

0,01 g ou mL

A tabela a ser consultada dever ser a que oferece resultados de NMP para 1, 0,1 e 0,01 g ou mL. Devido ao fato de que a quantidade de amostra inoculada neste caso igual quantidade para a qual a tabela se refere, o resultado do NMP ser obtido diretamente da tabela. Exemplo 3: Inoculao de 1,0 mL da amostra na 1 srie 1,0 mL da diluio 10-1 na 2 srie 1,0 mL da diluio 10-2 na 3 srie Quantidade de amostra inoculada em cada srie 1,0 g ou mL 0,1 g ou mL 0,01 g ou mL

A tabela a ser consultada dever ser a que oferece resultados de NMP para 1, 0,1 e 0,01 g ou mL. Devido ao fato de que a quantidade de amostra inoculada neste caso igual a quantidade para a qual a tabela se refere, o resultado do NMP obtido ser o mesmo encontrado na tabela. Exemplo 4: Inoculao de 1,0 mL da diluio 10-1 na 1 srie 1,0 mL da diluio 10-2 na 2 srie 1,0 mL da diluio 10-3 na 3 srie Quantidade de amostra inoculada em cada srie 0,1 g ou mL 0,01 g ou mL 0,001 g ou mL

A tabela a ser consultada dever ser a que oferece resultados de NMP para inculos de 0,1, 0,01 e 0,001 g ou mL. Poder tambm ser usada a tabela de NMP para inculos de 1, 0,1 e 0,01 mL desde que o resultado da tabela seja multiplicado por 10, j que a quantidade de amostra inoculada neste caso foi 10 vezes menor que a quantidade para a qual a tabela se refere. 2.2 Casos especficos a) Inoculao de mais de 3 diluies seriadas Quando da inoculao de mais de 3 diluies seriadas, selecionar a maior diluio na qual todos os tubos inoculados so positivos e considerar as 2 diluies maiores seguintes que a selecionada (casos 2 e 3 da tabela 1 acima e exemplos abaixo). Exemplo 1: Amostra de alimento lquido que foi inoculada nas diluies abaixo e apresentou os seguintes resultados: 100 3 tubos positivos 10-1 3 tubos positivos 10-2 3 tubos positivos 10-3 2 tubos positivos 10-4 0 tubos positivos 10-5 0 tubos positivos

O valor de NMP a ser lido na tabela seria aquele para o arranjo de tubos positivos 3/2/0, que corresponde ao valor 9,3 NMP/g ou mL. Como neste caso a amostra estava diluda a 10-2, o resultado obtido na tabela deve ser multiplicado por 100 para a obteno do valor do NMP real por grama ou mL do alimento em anlise. Assim, o resultado final seria 930 NMP/g ou mL. Exemplo 2: Amostra de alimento lquido da qual foram inoculadas apenas as diluies 100, 10-1, 10-2 e 10-3, e os resultados obtidos foram os seguintes: 100 3 tubos positivos 10-1 3 tubos positivos 10-2 3 tubos positivos 10-3 2 tubos positivos O valor de NMP a ser lido na tabela seria aquele para o arranjo de tubos positivos 3/3/2, que corresponde ao valor 110 NMP/g ou mL. Como neste caso a amostra estava diluda a 10-1, o resultado deve ser multiplicado por 10 para se obter o valor do NMP por grama ou mL do alimento em anlise. Assim, o resultado final seria 1100 NMP/g ou mL. Exemplo 3: Na anlise do mesmo alimento acima, caso as diluies inoculadas fossem as seguintes: 10-3 2 tubos positivos 10-4 0 tubos positivos 10-5 0 tubos positivos 10-6 0 tubos positivos O valor de NMP a ser lido na tabela seria aquele para o arranjo de tubos positivos 2/0/0, que corresponde ao valor 0,92 NMP/g ou mL. Como neste caso a amostra estava diludo a 10-3, o resultado deve ser multiplicado por 1000 para se obter o valor do NMP/g ou mL do alimento em anlise. Assim, o resultado final seria 920 NMP/g ou mL. Exemplo 4: No mesmo exemplo acima, se as diluies inoculadas fossem 100, 10-1 e 10-2, considerando os mesmos resultados: 100 3 tubos positivos 10-1 3 tubos positivos 10-2 3 tubos positivos O valor de NMP a ser lido na tabela seria aquele para a combinao de tubos positivos 3/3/3, que corresponde ao valor >110 NMP/g ou mL. Como neste caso a amostra no estava diluda (100), o resultado final a ser emitido obtido diretamente da tabela. As diferenas de resultados observadas nos diferentes exemplos de trabalho com a mesma amostra e diluies diferentes demonstram a importncia de se fazer diluies da amostra considerando o nmero estimado do microrganismo teste, pois a mesma amostra analisada conforme os exemplos 4 (sem suficiente diluio) e 1 (com diluies adequadas) apresentam resultados bem diferentes (> 110 NMP/g ou mL e 930 NMP/g ou mL). O resultado >110 NMP/g ou mL vago e pode no ser adequado para a tomada de deciso a respeito do destino do lote a que se refere o alimento analisado, especialmente quando h uma tolerncia em nmeros maiores que este. Exemplo 5: Nos casos de inoculao em que se utilizam 5 diluies em sries de 3 tubos e que

apresente os resultados abaixo: 100 3 tubos positivos 10-1 3 tubos positivos 10-2 1 tubo positivo 10-3 0 tubos positivos 10-4 0 tubos positivos Considerar o arranjo 3-1-0, j que o resultado mais prximo do real obtido quando a primeira srie considerada contm os 3 tubos positivos e a ltima srie os 3 tubos negativos. b) Inoculao de mais de 3 diluies seriadas em que ocorreram tubos positivos em mais de duas diluies subseqentes escolhida. Neste caso, repassar um tubo positivo da maior diluio positiva para a imediatamente anterior, sucessivamente, at obter arranjo de tubos que se enquadre na situao anterior (casos 5 e 6 da tabela 1). Exemplo 6: Amostra de alimento lquido que foi inoculada nas diluies abaixo, apresentando os seguintes resultados: 100 3 tubos positivos 10-1 3 tubos positivos 10-2 2 tubos positivos 10-3 1 tubo positivo 10-4 1 tubo positivo O resultado final, neste caso, ser o valor da tabela NMP correspondente ao arranjo 3-2-2 tubos positivos. Este arranjo obtido pela transposio do tubo positivo da diluio 10-4 para a diluio anterior. Exemplo 7: Amostra de alimento lquido que foi inoculada nas diluies abaixo, apresentando os seguintes resultados: 100 3 tubos positivos 10-1 2 tubos positivos 10-2 0 tubos positivos 10-3 1 tubo positivo 10-4 0 tubos positivos O resultado final, neste caso, ser o valor da tabela NMP correspondente ao arranjo 3-2-1 de tubos positivos. Esse arranjo de tubos positivos obtido pela transposio do tubo positivo da diluio 10-3 para a diluio 10-2. c) Nos casos de inoculao em que se utilizam 5 diluies em sries de 3 tubos, cujos resultados indicam duas possibilidades de todos os tubos da primeira srie serem positivos e todos os da ltima srie serem negativos, considerar o maior valor de NMP apresentado pela tabela correspondente.

100 3 tubos positivos 10-1 3 tubos positivos 10-2 0 tubos positivos 10-3 0 tubos positivos 10-4 0 tubos positivos 3-3-0 - 24 NMP/g ou mL (100, 10-1 e 10-2) 3-0-0 - 23 NMP/g ou mL (10-1, 10-2 e 10-3) O resultado final, neste caso, ser o valor NMP correspondente ao arranjo 3-3-0 (24 NMP/g ou mL). d) Inoculao de somente 3 diluies seriadas Nos casos de inoculao de somente 3 diluies seriadas, fazer a leitura diretamente na tabela (casos 1 e 4 e exemplo 4). e) Arranjos inexistentes nas tabelas Repetir a anlise sempre que os resultados dos controles aplicados no processo analtico apontarem para esta necessidade, e/ou os arranjos de tubos positivos, na srie de tubos mltiplos, revelarem comportamento incoerente como 0-1-3 ou outros arranjos inexistentes nas tabelas de NMP. f) Atedendo a legislao Utilizar a inoculao de 3 sries de 10, 5 ou 3 tubos quando a legislao estabelecer padro para NMP menor que 1,0, 2,0 ou 3,0, respectivamente. 2.3 Tabelas de NMP Tabela 1. Nmero Mais Provvel por grama ou mL, para sries de 3 tubos com inculos de 0,1, 0,01 e 0,001 g ou mL e respectivos intervalos de confiana 95%. Nmero de Positivos 0,1 0,01 0 0 0 0 0 1 0 1 0 2 0 3 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 2 1 2 1 3 2 0 2 0 2 0 Tubos NMP/g ou mL 0,001 0 1 0 1 0 0 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 <3,0 3,0 3,0 6,1 6,2 9,4 3,6 7,2 11 7,4 11 11 15 16 9,2 14 20 Intervalo Confiana (95%) Inferior -.0,15 0,15 1,2 1,2 3,6 0,17 1,3 3,6 1,3 3,6 3,6 4,5 4,5 1,4 3,6 4,5 Superior 9,5 9,6 11 18 18 38 18 18 38 20 38 42 42 42 38 42 42

2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

1 1 1 2 2 2 3 3 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3

0 1 2 0 1 2 0 1 0 1 2 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3

15 20 27 21 28 35 29 36 23 38 64 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 >1100

3,7 4,5 8,7 4,5 8,7 8,7 8,7 8,7 4,6 8,7 17 9 17 37 40 18 37 40 90 42 90 180 420

42 42 94 42 94 94 94 94 94 110 180 180 200 420 420 420 420 430 1000 1000 2000 4100 -.-

Fonte: Bacteriological Analytical Manual Online, 2001. OBS: Para obter o NMP/g ou mL, para sries de 3 tubos, com inculos de 1,0, 0,1 e 0,01 g ou mL, e respectivos intervalos de confiana 95%, dividir por 10 os valores da Tabela 1 correspondente ao arranjo de tubos positivos obtido na anlise. Tabela 2. Nmero Mais Provvel por 100mL, para sries de 3 tubos com inculos de 10 mL, 1,0 mL e 0,1 mL, e respectivos intervalos de confiana 95%. Nmero de Positivos 10 1,0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 2 0 3 1 0 1 0 1 0 Tubos NMP/g ou mL 0,1 0 1 0 1 0 0 0 1 2 <3,0 3,0 3,0 6,1 6,2 9,4 3,6 7,2 11 Intervalo Confiana (95%) Inferior -.0,15 0,15 1,2 1,2 3,6 0,17 1,3 3,6 Superior 9,5 9,6 11 18 18 38 18 18 38

1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3

1 1 2 2 3 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 0 0 0 1 1 1 1 2 2

0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 0 1 2 0 1 2 3 0 1

7,4 11 11 15 16 9,2 14 20 15 20 27 21 28 35 29 36 23 38 64 43 75 120 160 93 150

1,3 3,6 3,6 4,5 4,5 1,4 3,6 4,5 3,7 4,5 8,7 4,5 8,7 8,7 8,7 8,7 4,6 8,7 17 9 17 37 40 18 37 40 90 42 90 180 420

20 38 42 42 42 38 42 42 42 42 94 42 94 94 94 94 94 110 180 180 200 420 420 420 420 430 1000 1000 2000 4100 -.-

3 2 2 210 3 2 3 290 3 3 0 240 3 3 1 460 3 3 2 1100 3 3 3 >1100 Fonte: Bacteriological Analytical Manual Online, 2001.

Tabela 3. NMP por grama ou mL para sries de 10 tubos com inculos de 10 mL, 1,0 mL e 0,1mL e respectivos intervalos de confiana 95%. Nmero de Positivos 10 1,0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 Tubos NMP/g ou mL 0,1 0 1 2 0 1 <0,9 0,9 1,8 0,9 1,8 Intervalo Confiana (95%) Inferior -.0,04 0,35 0,04 0,33 Superior 3,1 3,1 5,1 3,6 5,1

0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4

2 2 3 0 0 0 1 1 1 2 2 3 3 4 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 4 4 5 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 5 0

0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 0 0

1,8 2,7 2,7 0,94 1,9 2,8 1,9 2,9 3,8 2,9 3,8 3,8 4,8 4,8 2 3 4 3 4 5 4 5 6,1 5,1 6,1 6,1 7,2 7,2 3,2 4,2 5,3 4,2 5,3 6,4 5,3 6,4 7,5 6,5 7,6 8,7 7,6 8,7 8,8 4,5

0,33 0,8 0,8 0,05 0,33 0,8 0,33 0,8 1,4 0,8 1,4 1,4 2,1 2,1 0,37 0,81 1,4 0,82 1 2,1 1,4 2,1 3 2,1 3 3 3,1 3,1 0,9 1,4 2,1 1.4 2,1 3 2,1 3 3,1 3 3,1 3,6 3,1 3,6 3,6 1,6

5,1 7,2 7,2 5,1 5,1 7,2 5,7 7,2 9 7,2 9 9 11 11 7,2 7,3 4,9 7,8 4,9 11 9,1 11 14 11 14 14 15 15 9 9,1 11 10 11 14 12 14 15 14 15 17 15 17 17 11

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6 6 6

0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 5 5 6 6 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 6 0 0 0 0 1 1 1

1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 0 1 0 0 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 0 0 1 2 3 0 1 2

5,6 6,8 5,6 6,8 8 6,8 8 9,2 8,1 9,3 10 9,3 11 11 12 12 12 6 7,2 8,5 9,8 7,3 8,5 9,8 11 8,6 9,9 11 10 11 13 11 13 14 13 14 14 7,8 9,2 11 12 9,2 11 12

2,2 3 2,2 3 3,6 3 3,6 3,7 3,6 4,5 5 4,5 5 5 5,6 5,6 5,6 2,5 3,1 3,6 4,5 3,1 3,6 4,5 5 3,6 4,5 5 4,5 5 5,6 5 5,6 7 6,3 7 7 3,1 3,6 5 5,6 3,7 5 5,6

12 14 12 14 17 15 17 17 17 18 20 18 20 20 22 22 22 14 15 17 18 15 17 18 21 17 18 21 18 21 23 21 23 26 25 26 26 17 17 20 22 18 21 22

6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7

1 2 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 5 6 6 7 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 0 3 3 3 3 4 4 4 4 5 5 5 6 6 6 7

3 0 1 2 3 0 1 2 0 1 2 10 1 2 0 1 0 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 0 1 2 0

14 11 12 14 15 15 14 15 14 15 17 16 17 19 17 19 19 10 12 13 15 12 13 15 17 13 15 17 19 15 15 17 19 21 17 19 21 23 19 21 23 21 23 25 23

7 5 5,6 7 7,4 5,6 7 7,4 7 7,4 9 7,4 9 9 9 9 9 4,5 5 6,3 7,2 5 6,3 7,2 7,7 6,4 7,2 7,7 9 72 7,2 9 9 10 9 9 10 11 9 10 11 10 11 12 11

26 21 22 26 30 23 26 30 26 30 34 30 34 34 34 34 34 20 21 25 28 22 25 28 31 26 28 31 34 30 30 34 34 39 34 34 39 44 34 39 44 39 44 46 44

7 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

7 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 5 5 5 5 6 6 6 7 7 7 8 8 0 0 0 0 1 1 1 1 1 2 2

1 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 0 1 2 0 1 0 1 2 3 0 1 2 3 4 0 1

26 13 15 17 19 15 17 19 21 17 19 21 23 19 21 24 26 22 24 26 29 24 27 29 32 27 30 33 30 33 36 34 37 17 19 22 24 19 22 25 28 31 22 25

12 5,6 7 7,5 9 7,1 7,7 9 10 7,7 9 10 22 9 10 11 12 10 11 12 14 11 12 14 15 12 14 15 14 17 17 17 17 7,5 9 10 11 9 10 11 14 14 10 11

50 25 26 30 34 28 31 34 39 34 34 39 44 34 39 44 50 39 44 50 58 44 50 58 62 50 58 62 58 73 74 73 74 31 34 39 44 39 40 44 58 58 44 46

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

2 2 2 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 6 6 6 6 7 7 7 7 8 8 8 8 9 9 9 0 0 0 0 1 1 1 1 1 2 2

2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 0 1 2 3 0 1 2 3 4 0 1

28 32 35 25 29 32 36 40 29 33 37 41 45 33 37 42 46 51 38 43 47 53 44 49 54 60 50 55 61 68 57 63 70 23 27 31 37 27 32 38 44 52 33 39

14 14 17 12 14 15 17 20 14 15 17 20 20 17 17 20 20 25 17 20 21 25 20 21 25 26 25 25 26 30 25 30 30 11 12 14 17 12 14 17 20 25 15 17

58 58 73 50 58 62 74 91 58 62 74 91 91 73 74 91 91 120 74 91 100 120 91 100 120 120 120 120 120 140 120 140 140 44 50 58 73 57 61 74 91 120 73 79

10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6 6 6 7 7 7 7 7 7 7 7 8 8 8 8 8 8 8

2 3 4 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 5

46 54 63 40 47 56 66 77 89 49 59 70 82 94 110 62 74 87 100 110 130 140 79 94 110 120 140 160 180 100 120 140 150 170 190 220 240 130 150 170 200 220 250 250

20 25 30 17 20 25 30 34 39 21 25 30 38 44 50 26 30 38 44 50 57 70 34 39 50 57 70 74 91 44 50 61 73 91 91 100 110 60 70 80 90 100 120 120

91 120 140 91 100 120 140 150 180 120 120 150 180 180 210 140 150 180 180 210 220 280 180 180 210 220 280 208 350 210 220 280 280 350 350 380 480 250 280 350 350 380 480 480

10 8 6 280 120 10 8 7 310 150 10 8 8 350 150 10 9 0 170 74 10 9 1 200 91 10 9 2 230 100 10 9 3 260 120 10 9 4 300 140 10 9 5 350 150 10 9 6 400 180 10 9 7 460 210 10 9 8 530 210 10 9 9 610 280 10 10 0 240 110 10 10 1 290 120 10 10 2 350 150 10 10 3 430 180 10 10 4 540 210 10 10 6 700 280 10 10 6 920 350 10 10 7 1200 480 10 10 8 1600 620 10 10 9 2300 810 10 10 10 >2300 1300 Fonte: Adaptado Bacteriological Analytical Manual Online, 2001.

480 620 620 310 380 480 480 620 630 820 970 970 1300 480 620 820 970 1300 1500 1900 2400 3400 5300 -.-

3. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA BRASIL. Ministrio da Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrria. Secretaria de Defesa Agropecuria. Departamento de Defesa Animal. Manual de mtodos microbiolgicas para alimentos. Coordenao Geral de Laboratrio Animal. 1991/1992 2 reviso. 136p. MATURIN,L.J.; PEELER, J.T. Aerobic Plate Count. In: Bacteriological Analytical Manual. 8 ed. Arlington, AOAC International, 1995. p. 3.01 - 3.10. SWANSON, K.M.J.; PETRAN, R.L.; HANLIN, J.H. Culture Methods for Enumeration of Microorganisms. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4 ed. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), Washington: American Public Health Association, 2001. p. 53-62. FDA. Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http://www.cfsan.fda.gov ANEXO IV PROCEDIMENTOS PARA CONTAGEM DE COLNIAS 1. INTRODUO A aplicao de procedimentos de controle durante o processo analtico visa garantia da confiabilidade do resultado final, assegurando a sua repetibilidade, preciso e exatido.

A preciso e a exatido do mtodo tambm dependero da correta observao e aplicao dos procedimentos padronizados estabelecidos para a rea analtica. A garantia da validade dos resultados da contagem estar assegurada quando os resultados dos controles indicarem no haver qualquer falha em nenhuma etapa do processo analtico. 2. RECOMENDAES GERAIS 2.1. Sempre utilizar mais de uma placa, seja uma duplicata da mesma diluio, seja duas ou mais diluies diferentes. 2.2. As contagens devero ser realizadas imediatamente aps o perodo de incubao das placas. 2.3. Na impossibilidade de realizar a contagem imediatamente aps o perodo de incubao, manter as placas sob refrigerao em temperatura de 4C a 7C por um perodo no superior a 24 horas. Esse procedimento no deve tornar-se uma prtica rotineira. 2.4. Para a contagem, selecionar placas que contenham um nmero de colnias que se encontre dentro do intervalo de preciso e repetibilidade estabelecido pelo mtodo em uso (por exemplo, 20 a 200 colnias, 25 a 250 colnias, etc). 2.5. As colnias devero ser contadas com o auxlio de contador de colnias equipado com placa de vidro ou acrlico, com dimetro compatvel com o das placas utilizadas, dividido milimetricamente em quadrantes com 1 cm2 de rea e com iluminao artificial uniforme. 2.6. O contador de colnias dever ter capacidade para aumento de 1 a 2 vezes, com dispositivo de regulagem de altura para melhor ajuste do foco, podendo ainda dispor de sistema eletrnico ou manual de registro das contagens. 2.7. O contador de colnias dever estar localizado em local onde no haja incidncia direta de luz sobre a plataforma de apoio da placa, para evitar possveis enganos na identificao das colnias. 2.8. Utilizar o estereoscpio para observao de caractersticas morfolgicas das colnias, para diferenciar microrganismos de partculas da amostra ou do meio e para seleo e isolamento de colnias. 2.9 Verificar sempre a proporcionalidade dos resultados obtidos nas diluies sucessivas. 3. REGRAS GERAIS PARA CLCULO E REGISTROS 3.1 Expresso de resultados de contagem; No clculo das contagens, o resultado final ser expresso emUFC/g ou mL, levando-se em conta a diluio empregada, da seguinte maneira: R = a x 10b UFC/g ou mL R = resultado a = os dois primeiros algarismos significativos, nmeros de 0 a 9

b = expoente (0 a 10) UFC = unidade formadora de colnias g = grama e mL= mililitro Exemplos: Diluio 10-2 (1:100) Mdia das contagens: 25 UFC Resultado: 25 x 100 = 2.500 = 2,5 x 103 UFC/g ou mL Diluio 10-3 (1:1.000) Mdia das contagens: 38 UFC Resultado: 38 x 1.000 = 38.000 = 3,8 x 104 UFC/g ou mL O resultado final ser expresso considerando-se os dois primeiros algarismos representativos, separados por vrgula. Os algarismos subseqentes, quando existirem, devero ser arredondados e transformados em potncia de 10. 3.2 Arredondamento de resultados: Quando se fizer necessrio, e visando no criar uma falsa idia de preciso, aplicar a seguinte regra para a aproximao dos resultados: 3.2.1 Arredondar para cima o segundo algarismo ou o subseqente quando o algarismo imediatamente aps for superior a 5. Exemplo: Diluio 10-2 Mdia das contagens: 186 UFC Arredondando-se o terceiro algarismo para cima tem-se como resultado: 190 x 100 = 19.000 = 1,9 x 104 UFC/g ou mL 3.2.2 Arredondar para baixo o segundo algarismo ou o subseqente quando o algarismo imediatamente aps for inferior a 5. Exemplo: Diluio 10-2 Mdia das contagens: 184 UFC Arredondando o terceiro algarismo para baixo tem-se como resultado: 180 x 100 = 18.000 = 1,8 x 104 UFC/g ou mL 3.2.3 Nos casos em que o terceiro algarismo ou o subseqente for igual a cinco, arredondar para baixo quando o segundo ou o subseqente for menor ou igual a 5 e para cima quando for maior que 5. Exemplos: Diluio 10-2 Mdia das contagens: 185 UFC Arredondando o terceiro algarismo para cima tem-se como resultado: 190 x 100 = 19.000 = 1,9 x 104 UFC/g ou mL Mdia das contagens: 145 UFC Arredondando o terceiro algarismo para baixo tem-se como resultado: 140 x 100 = 14.000 = 1,4 x 104 UFC/g ou mL

Mdia das contagens: 155 UFC Arredondando o terceiro algarismo para baixo tem-se como resultado: 150 x 100 = 15.000 = 1,5 x 104 UFC/g ou mL 3.2.4 Arredondamento de resultados obtidos pela contagem de placas em duplicata de duas diluies diferentes. Nas contagens de placas de duas diluies diferentes, o procedimento de arredondamento semelhante ao da contagem de mesma diluio, isto , s poder ser efetuado aps o clculo da mdia das contagens, que ser explicado a seguir nas regras especficas para contagem de colnias. 3.3 Resultados estimados Nas contagens, em que em todas as placas o nmero de colnias encontrado estiver fora do intervalo de preciso e repetibilidade da metodologia aplicada, incluir no registro do resultado final a expresso "estimado" ou "por estimativa, por meio da abreviatura " est.", aps o g ou mL. Quando houver condies para efetuar a contagem, expressar o nmero obtido. Pode-se ainda expressar o resultado como o limite inferior com o sinal de menor ou o superior com o sinal de maior, por estimativa ou estimado. Exemplos, com limite entre 15 e 150: Diluio 10-2 Mdia das contagens:160 UFC Resultado: 160 x 100 = 16.000 = 1,6 x 104 UFC/g ou mL est. ou >1,5 x 104 UFC/g ou mL est. Mdia das contagens: 11 UFC Resultado: 11 x 100 = 1.100 = 1,1 x 103 UFC/g ou mL est. ou <1,5 x 103 UFC/g ou mL est. Nas contagens de amostras lquidas inoculadas diretamente, ou seja, diluio 100, quando no houver crescimento ou a contagem for menor que 10 UFC, o resultado ser expresso por estimativa e na potncia 100. Caso a contagem seja superior a 10 UFC o resultado ser expresso de acordo com o nmero obtido, ou seja, potncia de 101 ou 102. Exemplo 1 Diluio 100: Intervalo de seleo: 15 a 150 N de colnias contadas:12 Resultado: 12 x 1 = 12 = 1,2 x 101 UFC/mL est. ou <1,5 x 101 UCF/mL est. Exemplo 2 Diluio 100: Intervalo de seleo: 15 e 150 N de colnias contadas: 232

Resultado: 232 x 1 = 232 = 2,3 x 102 UFC/mL est. ou > 1,5 x 102 UFC/mL est. 4. REGRAS ESPECFICAS PARA CONTAGEM DE COLNIAS As contagens se realizam de maneira similar para os casos em que os limites de nmeros de colnias para as placas selecionadas se encontram em diversos intervalos como 15 a 150, 20 a 200, 30 a 300 ou outro. 4.1 Situaes nas quais o nmero de colnias, nas diversas diluies, se encontra dentro dos limites do intervalo de preciso e de respetibilidade. Para os exemplos abaixo, foi considerada a seleo de placas com nmero de colnias contido no intervalo de preciso e repetibilidade de 25 a 250 colnias. 4.1.1 Mesma diluio - placas em duplicata. Calcular a mdia aritmtica dos resultados encontrados e multiplicar pela diluio correspondente. Exemplo: Dil: 10-3 = 130 colnias Dil: 103 = 224 colnias (130 + 224) /2 = 177 x 1.000 = 177.000 > 180.000 UFC Resultado: 1,8 x 105 UFC/g ou mL 4.1.2 Diluies Diferentes Multiplicar o resultado encontrado em cada placa pela respectiva diluio e calcular a mdia aritmtica. Exemplo: Dil: 10-3 = 210 colnias 210 x 1.000 = 210.000 Dil: 10-4 = 32 colnias 32 x 10.000 = 320.000 Fazer a mdia das diluies diferentes (210.000 + 320.000) /2 = 265.000 > 270.000 Resultado: 2,7 x 105 UFC/g ou mL 4.2 Situaes nas quais o nmero de colnias se encontra dentro dos limites do intervalo de preciso e de repetibilidade em uma s diluio. Para os exemplos abaixo, foi considerada a seleo de placas com nmero de colnias contido no intervalo de preciso e repetibilidade de 25 a 250 colnias. Quando, nas diversas diluies, o nmero de colnias em uma diluio encontra-se dentro do limite de 25 a 250 colnias e na outra diluio encontra-se fora deste limite, o resultado no ser expresso como estimado. 4.2.1 Mesma Diluio - placas em duplicata Calcular a mdia aritmtica dos resultados encontrados e multiplicar pela diluio correspondente. Exemplo: Dil: 10-3 = 230 colnias

Dil: 10-3 = 261 colnias (230+261) /2 = 245,5 x 1.000 = 245.500 _ 240.000 Resultado: 2,4 x 10-5 UFC/g ou mL 4.2.2 Diluies diferentes Exemplo 1: Dil: 10-3 = 232 colnias 232 x 1.000 = 232.000 Dil: 10-4 = 15 colnias 15 x 10.000 = 150.000 (232.000 + 150.000) /2 = 191.000 Resultado final: 1,9 x 105 UFC/g ou mL Exemplo 2: Dil: 10-3 = 270 colnias 270 x 1.000 = 270.000 Dil: 10-4 = 29 colnias 29 x 10.000 = 290.000 (270.000 + 290.000) /2 = 280.000 Resultado final: 2,8 x 105 UFC/g ou mL 4.3 Situaes nas quais as placas apresentam resultados de contagem acima do intervalo de preciso e repetibilidade 4.3.1 Quando for possvel realizar a contagem em pelo menos uma das placas: Para os exemplos abaixo, foi considerada a seleo de placas com nmero de colnias contido no intervalo de preciso e repetibilidade de 25 a 250 colnias. Quando todas as placas apresentarem mais de 250 colnias na maior diluio, multiplicar o resultado encontrado em cada placa pelas respectivas diluies e calcular a mdia aritmtica. Expressar o resultado como estimado. Exemplo: Dil: 10-4 = 380 colnias 380 x 10.000 = 3.800.000 Resultado: 3,8 x 106 UFC/g ou mL est. 4.3.2 Quando o nmero for excessivamente alto para contar Nunca expressar o resultado como muito numeroso para contar ou TNTC (too numerous to count). Escolher pores da placa que sejam representativas da distribuio das colnias em toda placa e estimar o nmero de colnias presentes. 4.3.2.1 Se houver menos de 10 colnias por cm2 Contar as colnias em 12 cm2 selecionando 6 quadrados consecutivos dispostos horizontalmente e 6 quadrados consecutivos dispostos em ngulo reto com os quadrados horizontais escolhidos. Somar as contagens obtidas nos 12 quadrados e dividir o valor obtido por 12, de forma a

obter a mdia de colnias por cm2 da placa. Multiplicar o valor encontrado para cada cm2 pela rea da placa utilizada (placas padro de plstico de 15 x 100 mm possuem rea aproximada de 56 cm2) e, finalmente, multiplicar pela diluio usada. Expressar o resultado como estimado. Exemplo: rea das placas: 56 cm2 Maior diluio inoculada: 10-3 Quadrado 1: 7 colnias Quadrado 2: 7 colnias Quadrado 3: 6 colnias Quadrado 4: 8 colnias Quadrado 5: 6 colnias Quadrado 6: 8 colnias Quadrado 7: 8 colnias Quadrado 8: 8 colnias Quadrado 9: 8 colnias Quadrado 10: 6 colnias Quadrado 11: 9 colnias Quadrado 12: 7 colnias

7+7+6+8+6+8+8+8+8+6+9+7 = 88/12 = 7,3 UFC por cm2 7,3 x 56 x 1.000 = 408.800 Resultado final = 4,1 x 105 UFC/g ou mL estimado. 4.3.2.2 Quando o nmero de colnias por cm2 exceder a 10 Contar as colnias em 4 quadrados representativos, somar os valores encontrados e dividir por 4 para obter a mdia de colnias por cm2 da placa. Multiplicar o valor encontrado para cada cm2 pela rea da placa utilizada (placas padro de plstico de 15 x 100 mm possuem rea aproximada de 56 cm2) e, finalmente, multiplicar pela diluio usada. Expressar o resultado como estimado. Exemplo: rea das placas: 56 cm22 Maior diluio inoculada: 10-3 Quadrado 1: 35 colnias Quadrado 2: 40 colnias Quadrado 3: 32 colnias Quadrado 4: 37 colnias 35 + 40 + 32 + 37 = 144 / 4 = 36 UFC por cm2 36 x 56 x 1.000 = 2.016.000 Resultado final = 2,0 x 106 UFC/g ou mL est. 4.3.2.3 Quando o nmero de colnias por cm2 exceder a 100 Multiplicar a rea da placa por 100 e aps multiplicar pela maior diluio usada. Expressar o resultado como maior que (>) o nmero obtido. Exemplo: Placa de rea de 56 cm2. Diluies usadas: 10-2, 10-3 e 10-4. Observou-se mais de 100 colnias por cm2 nas placas onde foi inoculada a maior diluio. 56 x 100 x 10.000 = 56.000.000 Resultado final = > 5,6 x 107 UFC/g ou mL est.

OBS: Nas situaes descritas acima, nos itens 4.2 e 4.3, o resultado tambm pode ser expresso como maior que 250 vezes amaior diluio utilizada. Expressar o resultado como nmero estimado. Exemplo: 10-2 (> 250) 10-3 (> 250) = > 2.500.000 10-4 (> 250) Resultado: > 2,5 x 106 UFC/g ou mL est. 4.4 Placas com colnias invasoras 4.4.1 Quando a rea invadida exceder 1/4 da rea total, expressar o resultado como "presena de colnias invasoras". 4.4.2 Quando a rea invadida for inferior a 1/4 da rea total, contar tanto as invasoras como as normais. Quando as colnias invasoras estiverem aglutinadas, contar como uma colnia e quando estiverem isoladas, contar uma a uma. 4.5 Contagem incoerentes Quando o resultado da contagem da maior diluio for duas ou mais vezes maior que o resultado obtido na diluio anterior, ou o da menor diluio for duas ou mais vezes maior que o resultado obtido na diluio posterior, considerar como resultado final o valor da menor diluio. Exemplo 1: Dil: 10-2 = 140 colnias (14.000) Dil: 10-3 = 52 colnias (52.000) Resultado: 1,4 x 104 UFC/g ou mL Exemplo 2: Dil: 10-2 = 95 colnias (9.500) Dil: 10-3 = 2 colnias (2.000) Resultado: 9,5 x 104 UFC/g ou mL 4.6 Situaes nas quais todas as placas encontram-se com nmeros de colnias abaixo dos limites do intervalo de preciso e repetibilidade. Para os exemplos abaixo, foi considerada a seleo de placas com nmero de colnias contido no intervalo de preciso e repetibilidade de 25 a 250 colnias. Neste caso, o resultado deve ser expresso pelo nmero de colnias da placa de menor diluio, por estimativa. Exemplo: Dil: 10-2 = 21 UFC Dil: 10-3 = 2 UFC 21 x 100 = 2.100 Resultado 2,1 x 103 UFC/g ou mL est. 4.6.1 Situaes nas quais todas as placas no apresentem crescimento de colnias, independente do intervalo de seleo Quando em nenhuma placa for observado o crescimento de colnias, emitir o resultado como estimado: <1,0 vezes a menor diluio utilizada. Ex.: <1,0 x 101 UFC/g ou mL est.

4.7 Clculo de contagens quando necessria a confirmao de colnias Tpicas (T) e Atpicas (A) Verificar qual das situaes descritas anteriormente dever ser aplicada. Seguir a regra especfica para cada caso, contando e registrando, separadamente, colnias tpicas (T) e atpicas (A). 4.7.1 Quando todas as colnias repicadas so confirmadas pelos testes confirmativos O resultado final da contagem ser igual ao nmero obtido na contagem inicial multiplicado pela diluio (de acordo com o determinado pela regra de contagem aplicada). 4.7.2 Quando no se confirmam todas as colnias repicadas Quando o nmero de colnias confirmadas diferente do nmero de colnias repicadas, calcular o resultado final utilizando a seguinte frmula: R=Cxcxd R R = Resultado C = nmero de colnias contadas c = nmero de colnias confirmadas r = nmero de colnias repicadas d = diluio utilizada Exemplo: Diluio 10-2 = 30 colnias contadas, das quais 20 eram tpicas e 10 atpicas. Para confirmao, foram repicadas 5 colnias de cada tipo. Quatro colnias tpicas e duas atpicas apresentaram resultado positivo nos testes confirmativos. Aplicando-se a frmula, teremos para colnias tpicas: RT 20 x 4 x 100 = 1.600 5 Aplicando-se a frmula, teremos para colnias atpicas: RA = 10 x 2 x 100 = 5 400 =

O resultado final ser igual soma das colnias tpicas e atpicas confirmadas: Resultado final = RT + RA = 1600 + 400 = 2000 = 2,0 x 103 UFC/g ou mL. 4.7.3 Quando for necessrio contar colnias tpicas e atpicas em placas de diferentes diluies Nunca somar colnias tpicas ou atpicas de diferentes diluies, pois colnias atpicas em uma determinada diluio podero se apresentar tpicas em diluies subseqentes. Submeter aos testes confirmativos, segundo a metodologia especfica para cada caso, 3 a 5 colnias tpicas e 3 a 5 colnias atpicas da diluio escolhida. Calcular o nmero de UFC/g ou mL somente aps a confirmao de cada tipo (T e A) em uma mesma diluio.

Exemplo: Diluio 10-2 = 240 colnias contadas, das quais 50 eram tpicas e 190 atpicas. Diluio 10-3 = 20 colnias tpicas e 5 atpicas. Como na diluio 10-3 o nmero de colnias se encontra fora do intervalo de preciso e repetibilidade, a diluio escolhida para confirmao foi 10-2. Destas, foram repicadas 5 colnias tpicas e 5 colnias atpicas. Todas as colnias tpicas e 4 atpicas apresentaram resultado positivo nos testes confirmativos. 10-2 RT = 50x5x100 = 5000 5 Aplicando-se a frmula, teremos para colnias atpicas: 10-2 RA = 190x4x100 = 15.200 5 Colnias confirmadas na diluio 10-2 = 20.200 colnias Resultado final ser a soma do nmero de colnias confirmadas na diluio escolhida: Res final = 5.000 + 15.200 = 2,0 x104UFC/g ou mL.

5. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA BRASIL. Ministrio da Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrria. Secretaria de Defesa Agropecuria. Departamento de Defesa Animal. Manual de mtodos microbiolgicos para alimentos. Coordenao Geral de Laboratrio Animal. 1991/1992 2 reviso. 136p. SWANSON, K.M.J.; PETRAN, R.L.; HANLIN,J.H. Culture methods for enumeration of microorganisms In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.53-62. ANEXO V PROCEDIMENTOS PARA O PREPARO, PESAGEM E DESCARTE DE AMOSTRAS 1. CONSIDERAES GERAIS 1.1. A pesagem e o preparo de amostras so pontos crticos de controle do processo analtico. 1.2. O local deve estar higienizado antes do incio da pesagem, conforme norma especfica do laboratrio. 1.3. Deve ser feito um controle do ambiente, conforme norma especfica do laboratrio. 1.4. O responsvel pelo procedimento deve, antes do incio dos trabalhos, realizar assepsia das mos e antebraos. 1.5. Deve ser usado uniforme de uso exclusivo para a rea analtica e Equipamento de Proteo Individual (EPI), conforme estabelecido em normas especficas do laboratrio. 1.6. Devem ser aplicados os procedimentos de verificao de balanas, conforme procedimento especfico do laboratrio. 1.7. O trabalho deve ser realizado perto da chama do bico de Bunsen, no caso de uso de bancada, ou em fluxo laminar especfico para tal atividade. 1.8. A superfcie de trabalho deve estar protegida por pano de campo embebido em soluo desinfetante no inflamvel, previamente testada.

1.9. Todo o material deve estar organizado e em condies adequadas de uso antes do incio dos trabalhos. 1.10. No deve ser permitida a entrada e a permanncia de pessoas estranhas no local, principalmente durante a pesagem das amostras. 2. INSTRUES PARA MANUTENO E DESCARTE DE AMOSTRAS NO LABORATRIO 2.1 No laboratrio, aps o recebimento, as amostras devem ser estocadas at o momento da anlise, conforme abaixo: 2.1.1 Refrigeradas perecveis: As refrigeradas perecveis devem ser mantidas sob refrigerao e analisadas o mais rapidamente possvel. Aguardar no mximo at o dia seguinte. 2.1.2 Congeladas: As amostras congeladas devem ser mantidas no mximo a 18 C e analisadas em um prazo mximo de 7 dias da colheita. 2.1.3 No perecveis Amostras no perecveis devem ser estocadas em lugar fresco, protegidas da umidade e da luz, de forma que suas caractersticas originais sejam mantidas, e analisadas o mais rapidamente possvel. 2.2 Registros: Manter registros completos sobre as amostras recebidas e analisadas, conforme estabelecido em procedimento especfico do laboratrio. 2.3 Manuteno das amostras aps a anlise: Aps a retirada das alquotas para anlise, as amostras devem ser embaladas em sacos plsticos de primeiro uso, perfeitamente identificadas e mantidas congeladas, conforme item 2.1.2. As amostras estveis em temperatura ambiente devem ser mantidas identificadas, protegidas por saco plstico de primeiro uso ou adequadamente fechadas na embalagem original, em temperatura ambiente e em local apropriado previamente estabelecido, conforme item 2.1.3. Todas as amostras, exceto gua, leite e outros produtos lquidos, os quais devem ser descartados logo aps a realizao do procedimento analtico, devem ser mantidas nas condies acima especificadas por 10 dias. Aps esse prazo, as amostras devem ser descartadas conforme item 2.4. 2.4 Descarte de amostras analisadas: Todas as amostras que derem entrada no laboratrio de microbiologia devem ser descartadas conforme procedimento especfico estabelecido pelo laboratrio. 3. PREPARO DA AMOSTRA Quando a metodologia indicar diluentes diferentes, como por exemplo para provas de: Contagem de Microrganismos, Pesquisa de Salmonella, Pesquisa de Listeria monocytogenes, Pesquisa de Vibrio cholerae, etc., fazer tantas pesagens por amostra quantas forem necessrias. 3.1 Enlatados: No recebimento de amostras de conservas enlatadas, verificar a integridade das embalagens, observando se esto amassadas, levemente tufadas ou com microfugas aparentes. Quando forem observadas quaisquer dessas alteraes, proceder conforme estabelecido no Captulo 20 Teste de Esterilidade Comercial para Alimentos de baixa acidez. 3.1.1 Pr-incubao de amostras visualmente normais: As amostras de conservas

visualmente normais devem ser incubadas a 36 1C por 10 dias a 55 1C por um perodo de 5 a 7 dias, conforme instrues abaixo: - Retirar cuidadosamente a cinta de identificao; - Lavar a lata com gua e detergente, usando esponja; - Secar com flanela limpa e seca; - Identificar a amostra com o nmero de protocolo do laboratrio; - Recolocar a cinta de identificao usando fita adesiva para prend-la na amostra; - Forrar a prateleira das estufas com papel filtro e incubar as amostras de forma que a recravao fique em contato com o papel filtro. Verificar, aps o perodo de pr-incubao a 36 1C e 55 1C, se os recipientes no sofreram tufamento. Verificar se o papel filtro apresenta manchas que possam evidenciar a presena de microfugas ou vazamentos. Registrar como sem alterao quando no se observar qualquer alterao dos recipientes e como alterado quando qualquer alterao for detectada. Descrever a alterao, quando ocorrer. 3.1.2 Amostras que sofreram alterao durante a pr-incubao: Ao final da princubao, quando o papel filtro sobre o qual ficaram incubadas as latas estiver manchado, evidenciando a presena de microfugas, submeter a respectiva amostra anlise de aerbios e anaerbios, mesfilos ou termfilos, de acordo com a temperatura da pr-incubao. 3.1.3 Preparo das amostras aps a pr-incubao: Fazer desinfeco da embalagem com algodo embebido em soluo desinfetante e etanol 70% ou etanol 70 GL. Posicionar a lata com borda no codificada para cima e costura lateral voltada para o lado oposto ao analista. Usando um abridor de latas metlico, previamente esterilizado, abrir um pequeno orifcio. Abrir a lata e transferir pores do contedo para os meios de cultivo indicados. 3.2 Produtos UHT No recebimento das amostras, verificar a integridade e alteraes nas embalagens logo aps o recebimento. As amostras que apresentarem qualquer alterao no devem ser analisadas. Fazer constar do COA amostra alterada, incluindo informaes sobre o tipo de alterao detectada. 3.2.1 Pr-incubao das amostras visualmente normais: Aps sofrerem limpeza e desinfeo, as amostras devem ser incubadas sobre folhas de papel filtro, em estufa a 36 1C, por um perodo de 7 dias. As amostras cujas embalagens mostrarem qualquer alterao aps o perodo de incubao no devem ser analisadas. Emitir o resultado como amostra alterada, incluindo informaes sobre o tipo de alterao observada. 3.2.2 Preparo das amostras aps a pr-incubao Produtos UHT lquidos: Agitar ou inverter o recipiente com a amostra por 25 vezes. Antes da abertura da embalagem, proceder assepsia da mesma usando algodo embebido em soluo desinfetante e em seguida etanol 70% ou etanol 70 GL. Deixar secar. Com auxlio de tesouras ou bisturis previamente esterilizados, cortar a embalagem e iniciar a anlise conforme indicado no Captulo 3 Contagem de microrganismos mesfilos aerbios viveis capazes de causar alterao em produtos lcteos lquidos UHT. Produtos UHT pastosos e viscosos :

Antes da abertura da amostra, proceder assepsia da embalagem usando algodo embebido em soluo desinfetante e em seguida etanol 70% ou etanol 70 GL. Com auxlio de tesoura, previamente esterilizada, abrir a embalagem, e, usando esptulas ou colheres estreis, pesar, assepticamente, 25 0,2 g da amostra e transferi-la para sacos de stomacher ou para frascos estreis apropriados. 3.3 Produtos slidos: Antes da abertura da amostra, proceder assepsia da embalagem usando algodo embebido em soluo desinfetante e etanol 70% ou etanol 70 GL. Com auxlio de pinas, tesouras ou bisturis, previamente esterilizados, cortar e pesar, assepticamente, 25 0,2 g da amostra colhida de vrios pontos (superfcie e profundidade) em sacos para stomacher. No caso de anlise de mexilhes, antes de abrir as conchas, escov-las com gua e sabo, enxaguar bem em gua corrente e aps em gua estril. Sec-las com gaze esterilizada e abri-las assepticamente com o auxlio de faca ou bisturi. Preparar uma amostra composta, em recipiente estril, misturando de 10 a 12 exemplares e incluindo o lquido das conchas. Pesar 50 g dessa amostra composta e homogeneizar com 450 mL do diluente especfico. Dividir em duas alquotas de 250 mL e transferir para recipientes estreis. Frango inteiro resfriado - Pesar, assepticamente, alquotas dos seguintes locais para o preparo da amostra: peito, coxas ou asas, proximidades da cloaca e dorso, at completar as 25 0,2 g da amostra, em sacos para stomacher. Frango inteiro congelado - Antes da pesagem, as amostras devem ser descongeladas em refrigerador por, no mximo, 18 horas. Pesar da mesma forma que o frango inteiro resfriado. Outros produtos crneos congelados - Antes da pesagem, as amostras devem ser descongeladas em refrigerador por, no mximo, 18 horas. Pesar, ento, assepticamente, 25 0,2 g da amostra em sacos para stomacher. 3.4 Semi-conservas: Antes da abertura da amostra, proceder assepsia da embalagem usando algodo embebido em soluo desinfetante e etanol 70% ou etanol 70 GL. Com auxlio de pinas, tesouras, abridores metlicos ou bisturis, previamente esterilizados, pesar assepticamente 25 0,2 g da amostra, colhida de vrios pontos, em sacos para stomacher. 3.5 Produtos pastosos e viscosos Antes da abertura da amostra, proceder assepsia da embalagem usando algodo embebido em soluo desinfetante e etanol 70% ou etanol 70 GL. Amostras de produtos pastosos: com auxlio de esptulas ou colheres, previamente esterilizadas, pesar assepticamente 25 0,2 g da amostra colhida de vrios pontos (superfcie e profundidade), em frascos erlenmeyer estreis ou em sacos para stomacher. Amostra de produtos lquidos densos (ex: iogurte): Agitar o recipiente que contm a amostra para homogeneizao. Realizar assepsia da embalagem usando algodo embebido em soluo desinfetante e etanol 70% ou etanol 70 GL. Com auxlio de esptulas ou colheres, previamente esterilizadas, pesar assepticamente 25 0,2 g em frasco erlenmeyer estril ou em sacos plsticos para stomacher. 3.6 gua

Agitar ou inverter o recipiente com a amostra por 25 vezes, ou ainda aspirar o contedo deste por 10 vezes com pipeta, auxiliado por pipetador, quando no houver espao livre para a homogeneizao. Antes da abertura da embalagem, proceder assepsia da mesma usando algodo embebido em soluo desinfetante e etanol 70% ou etanol 70 GL. Para pesquisa de Salmonella em gua usada em aqicultura e em gua de chiller, homogeneizar bem a amostra invertendo o recipiente por 25 vezes, e transferir 100 mL da amostra para um frasco contendo 50 mL de gua peptonada 1% tamponada em concentrao tripla. 3.7 Outros Produtos Lquidos Agitar ou inverter o recipiente com a amostra por 25 vezes. Antes da abertura da embalagem, proceder assepsia da mesma usando algodo embebido em soluo desinfetante e etanol 70% ou etanol 70 GL. Quando no houver espao livre dentro do recipiente para homogeneizao da amostra, aspirar o contedo deste por 10 vezes com pipeta, auxiliado por pipetador. Com auxlio de tesouras ou bisturis previamente esterilizados, cortar a embalagem e retirar a alquota analtica. 3.8 Produtos gordurosos Antes da abertura da embalagem, proceder assepsia da mesma, usando algodo embebido em desinfetante e etanol 70% ou etanol 70 GL. Com auxlio de esptula estril, pesar assepticamente 25 0,2 g da amostra, retirando alquotas de vrios pontos da superfcie e profundidade, em frasco erlenmeyer previamente esterilizado, ou em sacos stomacher. Colocar em banho-maria a 46 1C, por um perodo mximo de 15 minutos. Somente aps a liquefao da amostra, adicionar o diluente previamente aquecido a 46 1C. Agitar, de forma a obter uma suspenso homognea. Para amostras de produtos gordurosos, utilizar o diluente especificado na tcnica, adicionado de 1% de Tween 80. 3.9 Produtos em p e granulados Agitar ou inverter o produto por 25 vezes. Antes da abertura da embalagem que contm a amostra, proceder assepsia da mesma usando algodo embebido em soluo desinfetante e etanol 70% ou etanol 70 GL. Pesar, assepticamente, 25 0,2 g da amostra e transferir, cuidadosamente, para um frasco erlenmeyer ou saco para stomacher. OBS: Quando as embalagens forem sacos de 25 kg ou mais, ou quando as amostras forem colhidas em vidros onde no exista espao livre para homogeneizao, transferir cerca de 500g do produto para um saco estril, e em seguida agitar ou inverter o saco com a amostra por 25 vezes. Com o auxlio de tesouras ou bisturis previamente esterilizados, cortar a embalagem e em seguida pesar, assepticamente, 25 0,2 g da amostra em sacos para stomacher, utilizando esptula ou colher estril. 3.10 Ovos Ovos com casca: Lavar a casca de 5 a 7 ovos com escova e secar bem. Coloc-los de

molho em soluo de cido peractico 0,02% por 15 minutos. Aps, secar com algodo embebido em etanol 70% ou etanol 70 GL. Quebrar a casca assepticamente, transferindo a gema para recipiente estril. Descartar as claras. Misturar as gemas com auxlio de basto de vidro estril. Pesar 25 0,2 g da mistura de gemas em sacos para stomacher. No caso de ovos de codorna, pesar 25 0,2 g de gema com a clara. Ovo lquido integral e ovo em p: Pesar assepticamente 25 0,2 g da amostra em frasco erlenmeyer ou saco para stomacher. 4. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA ANDREWS, J.R.; JUNE, G.A. Food Sampling and Preparation of Sample Homogenate. In: Bacteriological Analytical Manual Online. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http:// www.cfsan.fda.gov BRASIL. Ministrio da Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrria. Secretaria de Defesa Agropecuria. Departamento de Defesa Animal. Manual de mtodos microbiolgicos para alimentos. Coordenao Geral de Laboratrio Animal. 1991/1992 2 Reviso. 136p. ANEXO VI PROCEDIMENTOS DE MICROSCOPIA 1. COMPONENTES BSICOS DO MICROSCPIO 1.1 Estativa o corpo do microscpio que d suporte aos outros componentes. 1.2 Revlver porta objetivas Suporte rotativo de objetivas, acoplado no brao da estativa. 1.3 Objetivas Tubos de lentes que formam a primeira imagem ampliada do objeto. Fornecida geralmente nos aumentos 10x (vezes), 20x, 40x e 100x. As objetivas modernas de 40x vm com a lente frontal mvel para evitar danos lmina e lente frontal. A objetiva de 40x moderna possui diafragma-ris acionada por anis para correo da espessura da lamnula. 1.4 Tubo de observao Suporte de oculares. Existem trs tipos: monoculares, bioculares e trioculares. Neste ltimo caso, o terceiro tubo serve para fixao da mquina fotogrfica. 1.4.1 Ajuste de dioptria Dioptria a diferena de capacidade visual de cada olho. Nos tubos destinados s oculares, existem controles giratrios que permitem o ajuste da dioptria. 1.4.2 Ajuste da distncia interpupilar Os tubos das oculares so mveis, para permitir o ajuste da distncia interpupilar, que varia individualmente. 1.5 Oculares Tubos com lentes por onde se realizam as observaes microscpicas. Fornecidos com aumentos de 10x e 16x.

Para maior comodidade dos usurios de culos, existem as oculares de campo amplo que permitem a observao com os culos. Estas lentes aumentam a imagem virtual formada pelas objetivas. Se a objetiva for de 100x e a ocular de 10x, o resultado ser um aumento de 1.000x (10 x 100). 1.6 Platina Mesa onde so colocadas as preparaes para observaes microscpicas. Nelas, se encontram acopladas o charriot, com comandos coaxiais que permitem a movimentao nas coordenadas X e Y. 1.7 Charriot O charriot serve para fixar a lmina microscpica e moviment-la em todas as direes. 1.8 Condensador um conjunto de lentes colocado logo abaixo da platina do microscpio que concentra e fornece luz necessria iluminao do objeto em estudo. O diafragma-ris do condensador (diafragma de abertura) crtico na formao da imagem. Se estiver totalmente aberto, a imagem torna-se menos ntida devido reflexo da luz ao longo do trajeto tico e a outros fatores. Quando muito fechado, se obtm menor resoluo e diminuio da nitidez com o aumento da refringncia do material. Para se obter uma boa imagem, o condensador dever estar mais prximo possvel da lmina. Organismos de maior tamanho e mais refringentes, como ovos de helmintos e protozorios, tornam-se mais facilmente evidenciados com o condensador um pouco baixo e o diafragma de abertura mais fechado. 1.9 Lentes auxiliares Existentes em alguns modelos de microscpio que possuem lentes auxiliares abaixo do condensador. Quando disponveis so somente utilizadas junto com as objetivas de 10x e 20x. Sem estas lentes, no possvel obter uma boa iluminao do campo microscpico. 1.10 Diafragma de campo Situado na base da estativa e serve para controlar a intensidade luminosa. Possui um diafragma-ris que pode ser aberto ou fechado atravs do anel de controle. 1.11 Lente fosca Est localizada sobre o diafragma de campo e se destina a melhorar a difuso do feixe luminoso. 1.12 Lente luz do dia Lente cinza azulada utilizada para que o feixe luminoso se aproxime da aparncia da luz natural. Geralmente colocada sobre o diafragma de campo. 1.13 Controles de ajuste macromtrico e micromtrico O controle macromtrico serve para focalizao inicial do objeto e o micromtrico para ajustes finos de focalizao.

1.14 Freio do controle macromtrico Encontrado na maioria dos microscpios modernos junto ao controle macromtrico, permitindo a regulagem de sua presso. 1.15 Iluminador Situado na parte posterior da base da estativa. O feixe luminoso emitido pela lmpada conduzido atravs de um sistema de lentes at o espelho, situado abaixo do diafragma de campo luminoso, que o conduz para o condensador, passando pela lmina, objetiva e ocular. 1.16 Voltmetro Para reduo da energia eltrica de rede para a voltagem da lmpada. 1.17 Lmpadas Existem dois tipos: incandescentes e de halognio. As de halognios fornecem uma iluminao mais eficiente. 2. MICROSCOPIA DE CAMPO CLARO A microscopia de campo claro tem como aplicaes a observao de microrganismos e tecidos corados, a observao de objetos com bastante contraste a fresco, como helmintos e seus ovos, e a observao de suspenses de bactrias sem tratamento prvio em lminas escavadas. Este tipo de microscopia baseia-se na formao de imagem pela multiplicao do aumento da objetiva pelo aumento da ocular. A formao de uma imagem ntida est relacionada no s com o grande aumento das objetivas, mas tambm com sua capacidade de resoluo, que o poder de separar dois pontos muito prximos. Uma ocular de grande capacidade pode produzir uma imagem maior que uma ocular padro de 10x, mas como no haver um aumento correspondente do poder de resoluo, no mostrar maiores detalhes. 2.1 Acessrios Os acessrios necessrios para microscopia de campo claro so: a) Lente fosca; b) Lente luz do dia; c) Oculares de campo amplo. 2.2 Procedimento Ligar o cabo eltrico na tomada. Ligar a lmpada. Colocar o preparado no microscpio. Ajustar a distncia interpupilar (ver 1.4.2) e a dioptria (ver 1.4.1). Colocar a objetiva de 10x no trajeto de luz. Encostar o condensador na lmina. Regular a intensidade luminosa com o boto de ajuste correspondente, quando existir este dispositivo. A intensidade luminosa deve ser ajustada para cada tipo de objetiva. Quanto maior a capacidade de aumento, maior ser a necessidade de iluminao.

Colocar a lente auxiliar em posio, nos microscpios com este dispositivo. Fixar o preparado microscpico, montado em lminas perfeitamente limpas, no charriot e colocar na posio desejada por meio dos controles coaxiais (Controles nas coordenadas X e Y). Focalizar com o macromtrico. Realizar a focalizao fina com o controle micromtrico. Movimentar o controle micromtrico para evidenciar estruturas existentes em vrios nveis do preparado. Movimentar toda lmina atravs dos controles coaxiais de modo regular at encontrar a estrutura procurada. Se necessitar de maior aumento, colocar as lentes correspondentes em posio e focalizar. Nota: No utilizar lentes auxiliares em observaes com objetivas de 40x e 100x, pois prejudicam a nitidez da imagem. A lente frontal do condensador dever estar na sua posio mais alta para que se possa aproveitar toda a sua capacidade. 2.3 Observao com aumento de 10x e 20x Geralmente utilizada para organismos grandes como helmintos e seus ovos e para focalizao de lminas. 2.4 Observao com aumento de 40x possvel a observao de alguns organismos maiores ou clulas neste aumento. utilizado para pr-focagem do campo, pois torna mais cmoda a focalizao fina com a objetiva de 100x. Para observao com este aumento necessrio a utilizao de lamnulas. A espessura da lamnula no deve ultrapassar a 0,17 mm. Esta medida vem gravada na objetiva de 40x. A espessura da montagem da pea (corte histolgico ou esfregao mais meio de montagem e lamnula) deve ser o mais fina possvel. A espessura excessiva interfere na formao da imagem devido difrao da trajetria do feixe luminoso. 2.5 Observao com aumento de 100x (em leo de imerso) necessrio utilizar leo de imerso para que os raios luminosos no sejam desviados pela camada de ar entre a lente e a lmina. - Focalizar o preparado com a objetiva de 40x; - Colocar uma gota de leo de imerso sobre o preparado (leo de imerso deve apresentar ndice de refrao ne = 1,518 e de disperso de = 43); - Colocar a objetiva de imerso (100x) em posio; - Encostar a lente frontal da objetiva no leo por meio da manipulao dos controles coaxiais do charriot; - Focalizar atravs do controle micromtrico. 2.6 Observao de preparados frescos em lminas escavadas Esta tcnica se utiliza para a observao de movimento bacteriano em suspenso sem tratamento prvio; - Colocar uma gota de suspenso bacteriana sobre uma lamnula, com uma pipeta de

Pasteur; - Colocar uma pequena quantidade de vaselina slida nos cantos da lamnula com a gota; - Colar a lamnula com a gota para baixo na rea da escavao da lmina; - Focalizar com aumento de 10x e depois de 40x, com a rea escavada da lmina para cima. Os organismos apresentam-se estticos ou com movimentos retilneos, ondulantes, espiralados, sempre progressivos. Os movimentos trmulos so causados pelo movimento browniano que provocado por fenmeno fsico observado em meio fluido se diferenciando do movimento microbiano. 3. MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE A microscopia de contraste de fase utilizada para a observao de preparados sem tratamento prvio com corantes (movimentos bacterianos, presena de flagelos, estruturas celulares). Nesta tcnica, a formao de imagem segue o princpio fsico da interferncia de ondas luminosas em diferentes fases que se intensificam ou se anulam entre si. 3.1 Acessrios de microscopia de contraste de fase 3.1.1 Objetivas anulares de 10x, 20x, 40x e 100x So lentes com uma srie de anis concntricos (anis de fase). 3.1.2 Discos de diafragmas anulares So discos acoplados sobre o condensador onde podemos colocar os diafragmas anulares em posio, por meio de movimento em revlver. Os anis de cada um correspondem aos espaos existentes entre os anis de fase da objetiva correspondente. Existem modelos em que o condensador vem conjugado neste disco. O disco contm marcas indicando o aumento da objetiva correspondente na sua borda externa, alm da marca zero onde nenhum diafragma encontra-se no trajeto luminoso. 3.1.3 Lente ou microscpio auxiliar Usado para centralizao dos anis de fase do diafragma anular. Tubo tipo telescpio colocado no tubo de observao para centralizao dos diafragmas anulares. 3.1.4 Filtro verde para diafragma de campo 3.2 Procedimento - Colocar o disco de diafragma anular correspondente ao aumento de cada objetiva; - Ligar o microscpio; - Colocar o disco na posio zero e centralizar o diafragma de campo com a objetiva de 10x em posio; - Colocar a lente auxiliar no tubo de observao; - Soltar o parafuso de fixao da lente frontal telescpica da lente auxiliar e moviment-la para cima e para baixo, at obter uma imagem ntida dos anis de fase das objetivas e dos diafragmas anulares; fixar o tubo telescpico; - Fazer com que os anis de fase coincidam entre si atravs dos controles existentes nas laterais de cada diafragma anular com auxlio da pequena chave que o acompanha. Realizar este ajuste em todos os aumentos; - Colocar o filtro verde sobre o diafragma de campo; - Colocar uma gota da suspenso de microrganismos em meio lquido ou diluda em soluo fisiolgica com uma pipeta de Pasteur, e cobrir com uma lamnula;

- Seguir o mesmo procedimento para microscopia de campo claro, sempre utilizando o diafragma anular com a objetiva correspondente. Observaes: - Listeria spp apresentam movimentos de tombamento sobre o seu prprio eixo. Campylobacter apresenta movimento tpico espiral (saca-rolha); - O microscpio de contraste de fase pode ser utilizado para observaes em campo claro com o disco de diafragmas anulares colocado na posio zero. 4. MICROSCOPIA DE CAMPO ESCURO A microscopia de campo escuro aplica-se observao de microrganismos vivos, sem preparao prvia. Os raios luminosos so projetados obliquamente sobre o preparado pela ao do condensador cardiide e, quando encontram obstculos com capacidade de desvi-los, como por exemplo bactrias, so refratados e atingem a objetiva, formando uma imagem com contorno brilhante no campo microscpico. Quando no existe nenhum corpo que desvie estes raios, o campo microscpico aparece escuro porque os raios oblquos no conseguem penetrar na objetiva. 4.1 Acessrio de microscopia de campo escuro 4.1.1 Condensador cardiide So condensadores que desviam obliquamente o trajeto dos raios luminosos originrios da fonte luminosa. Existem dois tipos: o seco e o mido. O condensador mido necessita de um meio lquido entre a lente frontal e a lmina, para que o feixe luminoso possa atingir de forma correta a preparao. O condensador seco mais prtico, mas a imagem formada no muito ntida. 4.2 Procedimentos - Colocar o condensador cardiide; Colocar uma gota de leo de imerso sobre a lente frontal do condensador; no caso de condensador seco, este procedimento dispensvel, entretanto a utilizao na forma mida aumenta a nitidez da imagem. O condensador seco bastante til para exames rotineiros de grande quantidade de amostras como nos testes de microaglutinao para leptospiras. - Colocar uma gota da suspenso de microrganismos em meio lquido ou diluda em soluo fisiolgica; - Encostar a lente frontal do condensador na lmina; - Focalizar com a objetiva de 10x; - Fechar o diafragma de campo; - Centralizar a imagem do diafragma de campo acionando os parafusos de centralizao; - Colocar outras objetivas em posio e realizar o exame. Observaes - A visualizao de um campo escuro com microrganismos com halos brilhantes, em movimentos retilneos, ondulatrios ou espiralados; - As objetivas acima de 20x no so eficientes para este tipo de observao devido pequena capacidade de captao de luz; - As lminas para campo escuro devem medir entre 0,8 a 1,1mm.

5. ILUMINAO DE KEHLER PARA MICROSCPIO DE CAMPO CLARO Esta tcnica refere-se aos procedimentos gerais de regulagem do sistema tico de microscpios. Por meio deste mtodo de iluminao, pode ser evitada a formao da imagem do filamento da lmpada no campo luminoso, com a obteno de melhor rendimento do sistema tico. 5.1 Procedimento Centralizao da lmpada: nos microscpios que possuem parafusos para centralizao da lmpada, retirar as oculares e observar a imagem do filamento da lmpada. Se no estiver centralizada, atuar sobre os parafusos de controles, at que a imagem fique no centro do campo, ou, nos aparelhos em que isto no seja possvel, fechar o diafragma-ris do condensador e movimentar o suporte da lmpada para frente e para trs at que a imagem do filamento da lmpada seja projetada nitidamente no diafragma-ris. Fixar o suporte da lmpada e depois centralizar a imagem. - Colocar em posio a objetiva de 10x; - Colocar a lmina com o preparado microscpico; - Focalizar a lmina; - Realizar o ajuste da distncia interpupilar; - Focalizar atravs da objetiva sem o controle de ajuste de dioptria e depois ajustar o foco para o outro olho por meio de manobras no controle de ajuste da dioptria; - Afastar a lente auxiliar, quando existir; - Fechar o diafragma de campo; - Baixar e levantar o condensador at que a imagem da borda do diafragma de campo surja nitidamente em foco; - Centralizar a imagem do diafragma de campo atravs dos parafusos de controles existentes no condensador; - Levantar o condensador at a sua posio mxima; - Para que o condensador funcione com o mximo rendimento, abrir totalmente o diafragma de campo e fech-lo at que comece a diminuir a intensidade luminosa; - Centralizao do diaframa-ris do condensador: Alguns modelos possuem diaframa-ris que precisam ser centralizados e possuem quatro parafusos de controle, sendo dois para centralizao do condensador e dois para centralizao do diafragma-ris do condensador. A centralizao do diafragma-ris pode ser realizada seguindo o processo de centralizao do condensador. O diafragma-ris do condensador deve ser fechado em torno de 1/3 de sua abertura mxima para melhor eficincia do sistema tico. O condensador deve ser colocado na sua posio mais alta para aproveitamento de toda a sua eficincia. 6. UTILIZAO DE LMINAS E LAMNULAS As lminas devem ser transparentes, livres de manchas e devem medir um milmetro de espessura. As lamnulas devem medir 0,17 mm de espessura para permitir a formao de uma boa imagem. 6.1 Preparo

- Lavar as lminas e lamnulas com detergente comum, esfregando uma a uma; - Enxagar em gua destilada duas vezes para retirar os resduos; - Secar e manter em frascos com lcool etlico comercial at o momento do uso. 6.2 Descarte As tcnicas de colorao nem sempre so suficientes para inativar o organismo presente na lmina ou lamnula. As lminas e lamnulas devem ser tratadas como as demais vidrarias de laboratrio, depositadas em frascos contendo desinfetante aps o uso e descartadas por meio de tratamento pelo calor mido. 7. CUIDADOS COM O MICROSCPIO 7.1 Durante o uso 7.1.1 Nunca soprar as lentes para retirar a poeira, pois micropartculas de saliva podem se depositar nas lentes. 7.1.2 Nunca usar lenos faciais para limpeza de lentes pois estes podem conter filamentos de vidro que riscam a lente. Podero ser usados tecido de linho ou algodo hidrfilo. 7.1.3 Nunca limpar as lentes com o tecido especial para limpeza de lentes seco. 7.1.4 Seguir rigorosamente as instrues do fabricante do equipamento quanto ao uso de solventes para a limpeza. 7.1.5 Nunca usar lcool para limpeza de lentes, pois a cola usada na montagem das mesmas freqentemente solvel em lcool. 7.1.6 Limpar o leo residual das objetivas ao final de cada uso com algodo hidrfilo, ou uma flanela macia, umedecido em xilol ou em ter-acetona 1:1. 7.1.7 Nunca deixar os orifcios de conexo das objetivas e oculares abertos. Mant-los fechados por plug de proteo adequados ou com as prprias oculares ou objetivas. 7.1.8 No tocar nas lentes com as mos. 7.1.9 Somente usar leo de imerso que atenda a especificao estabelecida pelo fabricante. 7.1.10 Nunca usar leo de imerso para trabalhos com objetivas que no sejam de imerso. Estes leos danificam as substncias de montagem destas objetivas. 7.1.11 Os microscpios devem ser colocados em superfcies isentas de vibraes e no so recomendadas mudanas de localizao. 7.2 Limpeza 7.2.1 Corpo Usar lcool ou uma flanela levemente umedecida com gua para limpeza do corpo do microscpio. Quando usar a flanela mida, secar imediatamente com uma flanela seca. Lubrificar as partes mveis com lubrificante derivado do petrleo, como a vaselina, ou outro lubrificante recomendado pelo fabricante. 7.2.2 Lentes e partes ticas Retirar a poeira usando ar expulso por bulbo de borracha. Para limpar as lentes, usar tecido especial para limpeza de lentes levemente umedecido em soluo limpadora (ex.: Kodak), especfica para lentes de microscpios e equipamentos ticos. Resduos de corantes podem ser retirados com algodo hidrfilo embebido em xilol.

8. CONSERVAO DE MICROSCPIOS Esta instruo se destina a estabelecer procedimentos de limpeza e conservao de microscpios e a preveno contra fungos nos componentes ticos. 8.1 Materiais necessrios Pincis de plo natural desengordurado com lcool-ter; Panos de algodo macio; Xilol ou benzina; Slica-gel; Tabletes de paraformaldedo; Vaselina lquida. leo lubrificante fino para mquina de costura. Soluo ter-acetona 1:1. 8.2 Procedimento Retirar a poeira das lentes com pincel. No usar espanador, pano ou camura para este fim. As marcas de dedos ou manchas de gorduras devem ser removidas com panos embebidos em benzina ou xilol. No utilizar lcool que pode dissolver a cola que une as lentes. A limpeza das objetivas deve ser limitada s lentes frontais e posteriores, roscas e superfcies externas. Imediatamente aps finalizao do trabalho, limpar o leo de imerso da objetiva com flanela limpa e macia, embebida em soluo 1:1 de ter-acetona. Manter o instrumento em local ventilado e seco. Os microscpios devem ser mantidos em ambiente com umidade relativa abaixo de 65%. Os microscpios devem ser submetidos periodicamente ao arejamento, colocando-os prximos a um ventilador. Os pequenos componentes que no se encontram em uso devem ser guardados em compartimentos bem secos com slica-gel no seu interior, salvo instrues em contrrio do fabricante. A slica-gel hidratada toma a cor rsea e pode ser regenerada em estufa temperatura de 120C por algumas horas, recuperando a cor azulada. Instrumentos quando guardados em caixas devem ser protegidos com tabletes de paraformaldedo. Cobrir os instrumentos que so mantidos no local de trabalho com protetor que permita a ventilao e colocar tabletes de paraformaldedo sobre a platina. As partes brilhantes, foscas ou fosfatadas devem ser protegidas com vaselina lquida neutra. Os parafusos de controle e de fixao de componentes devem ser retirados pelo menos anualmente, lavados com solvente e lubrificados com leo, pois a graxa utilizada pelo fabricante seca e dificulta a manobra com estas peas. O mesmo deve ser realizado com a engrenagem do charriot. 8.3 Condies consideradas inadequadas para o armazenamento - Ambiente com umidade relativa do ar acima de 75%; - Escurido e falta de movimento de ar; - P e marcas de dedos nas superfcies de vidro;

- Estocagem em caixa de madeira por longo perodo sem proteo de desinfetantes ou agentes dissecantes. 9. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA BRYCE, J.R.; POELMA, P.L. Microscopic Examination of Foods and Care and Use of the Microscope. In: Bacteriological Analytical Manual. 8.ed. Food and Drug Administration. AOAC International, Gaithersburg, USA. 1995. p. 2.01-2.06. CLARRIDGE, J.E.; MULLINS, J.M. Microscopy and Staining. In: Clinical and Pathogenic Microbiology. Howard, B.J. et all. 2nd Ed. Mosby. St. Louis, 1994, p. 101-115. FAO. Manuales para el control de calidad de los alimentos. 14/12 Organizacion de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacion, Roma 199. p.37-52. ANEXO VII PROCEDIMENTOS DE COLORAO 1. OBJETIVO As tcnicas de colorao usadas em microbiologia se destinam observao de estruturas morfolgicas como esporos, flagelos e forma das clulas, diferenciando microrganismos. 2. PREPARAO DE ESFREGAO Para sucesso na observao, necessrio que o esfregao seja bem feito, apresentandose em monocamadas, suficientemente concentrado de forma a facilitar a visualizao. A secagem dos esfregaos deve ocorrer ao ar. Depois de secos, os esfregaos podem ser fixados com calor, passando rapidamente 2 a 3 vezes atravs da chama de bico de Bunsen. 3. COLORAO DE GRAM A colorao de Gram utiliza caractersticas diferenciais das clulas bacterianas. Estas caractersticas diferenciais se referem estrutura da parede celular dos microrganismos. Os microrganismos que contm altos teores de cido teicico em sua parede celular se coram, pela colorao de Gram, em azul intenso e so chamados de Gram positivos. Os microrganismos que contm lipopolissacardeos na membrana externa somente se coram com o contracorante, mostrando-se da cor do mesmo (vermelho), e so denominados Gram negativos. 3.1 Reagentes 3.1.1 Cristal Violeta Este composto cora toda a clula em azul intenso. Preparo Soluo A Cristal violeta (90-95% de pureza) - 2 g Etanol 95% - 20 mL Filtrar em papel de filtro. Preparo Soluo B Oxalato de amnio - 0,2 g gua destilada - 80 mL Preparo Soluo de trabalho Misturar as solues colocando-se a soluo B sobre a A.

Deixar em repouso por 24 horas, filtrando em seguida. Estocar em frasco mbar. 3.1.2 Soluo de lugol (iodo iodeto de potssio) O iodeto substitui o cloro do cristal violeta, formando um complexo insolvel em gua. Preparo da soluo de trabalho: Cristais de iodo (ou ressiblimado) - 1 g Iodeto de potssio - 2 g gua destilada. - 300 mL Misturar e deixar em repouso at dissoluo. 3.1.3 Descorante A soluo de etanol 95% - acetona atua como descorante. A descolorao ocorre apenas nas clulas de microrganismos Gram negativos. Alguns autores sugerem que o lcool altera a permeabilidade da membrana externa dos organismos Gram negativos, devido sua ao sobre a membrana lipopolissacardica, permitindo a retirada do complexo cristal violeta-iodeto da clula. Preparo da soluo descorante de etanol - acetona: Acetona - 10 mL Etanol 95% - 100 mL 3.1.4 Safranina (contracorante) A safranina atua como contracorante tornando as clulas Gram negativas coradas e visveis. As clulas de microrganismos Gram positivos provenientes de culturas velhas, lesadas por qualquer motivo ou mortas, tambm podem ser coradas pela safranina. Preparo do contracorante - Safranina O - Soluo estoque Safranina O - 2,5 mL Etanol 95% - 100 mL Soluo de trabalho Soluo estoque de safranina O - 10 mL gua destilada - 90 mL 3.2 Procedimento de colorao de Gram modificado por Hucker Originalmente, a colorao descrita por Christiam Gram usava violeta de genciana, que uma mistura de cristal violeta com outros componentes. Hucker modificou o mtodo substituindo a violeta genciana pelo cristal violeta puro, que muito estvel e permite uma melhor diferenciao dos microrganismos. a) Cobrir o esfregao com cristal violeta por 1 minuto; b) Retirar o excesso de cristal violeta; c) Cobrir com lugol por 1 minuto; d) Escorrer e lavar suavemente em gua; e) Descorar com lcool-acetona ou etanol 95% por 1 a 5 segundos (at que a maior parte do cristal violeta seja removido); d) Lavar delicadamente em gua; e) Adicionar soluo de contracorante - safranina - por 30 segundos; f) Lavar delicadamente em gua; g) Deixar secar no ambiente. 4. COLORAO DE GRAM PARA ANAERBIOS

Esta colorao se baseia na substituio da safranina por arbol fucsina, que mais efetiva para a colorao de alguns anaerbios Gram negativos e Legionella. O aumento do tempo de exposio ao contracorante (carbol fucsina) permite uma maior penetrao do mesmo dentro destas clulas, o que as tornar mais facilmente visveis. Para anaerbios o descorante usado o etanol. 4.1 Procedimento de colorao a) Corar o esfregao por 30 segundos com cristal violeta; b) Retirar o excesso de cristal violeta; c) Cobrir com lugol por 30 segundos; d) Escorrer e lavar com gua corrente (fluxo suave); e) Descorar com etanol 95% por 30 segundos; f) Lavar com gua corrente (fluxo suave); g) Adicionar soluo de contracorante carbol fucsina por 1 minuto ou mais (soluo aquosa de fucsina bsica 0,8% (m/v); h) Deixar secar em ambiente. 5. TCNICAS DE COLORAO PARA FLAGELOS 5.1 Colorao para flagelos Os flagelos so organelas das bactrias responsveis pela motilidade, os quais possuem, em sua constituio, molculas proticas denominadas flagelinas. O flagelo formado por milhares de monmeros polimerizados de flagelina ordenados de maneira a formar um nico flagelo. Algumas dificuldades podem ser encontradas quando se deseja demonstrar este tipo de estrutura em uma bactria: a) A produo de flagelos nas bactrias no contnua e dependente de vrios fatores como temperatura, substrato, estgio do crescimento, etc; b) Os flagelos podem ser acidentalmente removidos da bactria pela pipetagem ou homogeneizao muito vigorosa; c) O flagelo se despolimeriza facilmente, isto , se dissocia em monmeros de flagelina com freqncia (quando a temperatura alcana mais de 60C, quando o pH se torna muito cido (pH 4,0) e quando a clula est em presena de lcalis, de uria e de solventes orgnicos); d) necessria a aplicao de tcnicas para aumentar o dimetro dos flagelos, de forma a torn-los visveis pelas tcnicas microscpicas usualmente adotadas em laboratrios microbiolgicos. O cido tnico contido no corante se ligar ao flagelo, tornando-o mais grosso. A demonstrao do flagelo ocorrer devido ligao do corante ao cido tnico. 5.2 Procedimento a) Preparar cultura da bactria em estudo sobre a superfcie de gar infuso de crebro ou em gar soja triptona (com ou sem sangue), incubando em temperatura e tempo adequados; b) Transferir delicadamente uma alada do crescimento para tubo contendo cerca de 3mL de gua destilada. Inverter o tubo uma vez para homogeneizar a suspenso. Colocar uma gota desta suspenso sobre uma lmina e deixar secar ao ar; c) Cobrir a lmina com o corante e deixar por 5 minutos, at que um brilho metlico

esverdeado cubra metade da rea. No deixar o corante secar sobre a lmina; d) Retirar o corante enxaguando com gua; e) Secar; f) Observar ao microscpio com objetiva de imerso. 5.3 Preparo do corante - Soluo A Fucsina (certificada para colorao de flagelo) - 0,5 g lcool etlico 95% - 50 mL Misturar e deixar em repouso de um dia para o outro para dissoluo. Preparo do corante - Soluo B Cloreto de sdio - 0,75 g cido tnico - 1,5 g gua destilada - 100 mL Misturar vigorosamente as solues A e B. A mistura de corantes pode ser usada at 2 meses aps o preparo, se mantida sob refrigerao. Poder se formar um precipitado. O precipitado no deve ser homogeneizado com o restante da soluo durante procedimento de colorao. 6. TCNICA PARA COLORAO DE ESPOROS (Wirtz-Conklin) 6.1 Colorao com verde malaquita A parede dos esporos constitui uma barreira eficaz contra a entrada e a sada de materiais do esporo. O tempo prolongado de exposio ao corante (verde malaquita), associado ao aquecimento, permite o rompimento desta barreira obtendo-se, ento, o esporo corado em verde intenso. Como contracorante utilizada a safranina, que cora outras estruturas em rosa, facilitando a diferenciao dos esporos. 6.1.1 Preparo de solues Soluo A : Verde malaquita 5% Verde malaquita - 2,5 g gua destilada - 50 mL Misturar e deixar em repouso de um dia para o outro para dissoluo. Soluo B: Safranina - Soluo estoque Safranina O - 50 g Etanol 95% - 2000 mL Soluo B: Safranina - Soluo de trabalho Soluo estoque de safranina O - 300 mL gua destilada - 2700 mL 6.1.2 Procedimento a) Preparar esfregao e fixar pelo calor; b) Cobrir o esfregao com o corante verde malaquita; c) Aquecer gua em um becker at comear a sair vapor. Colocar a lmina sobre este becker, mantendo o corante aquecido por 5 minutos. Alternativamente, cobrir a lmina com verde malaquita e aproximar o mximo possvel de uma chama de bico de Bunsen e deixar at que desprenda vapor. Afastar do fogo e aps 1 a 2 minutos repetir a operao por 3 a 4 vezes;

d) Lavar suavemente com gua. Evitar o choque trmico que poder quebrar a lmina; e) Contracorar com soluo de safranina por 30 segundos; f) Lavar e secar; g) Observar ao microscpio com objetiva de imerso. 7. COLORAO PARA CORPSCULOS DE INCLUSO CRISTALINA A deteco de corpsculos de incluso cristalina uma das provas usadas para caracterizar algumas variedades de Bacillus thuringiensis, sendo utilizada como prova diferencial de Bacillus cereus. Os corpsculos de incluso cristalina de algumas variedades de Bacillus thuringiensis so cristais tetragonais de toxina, abundantes em culturas velhas (3-4 dias), que somente so liberados aps a lise do esporngio. Dois mtodos esto descritos para esta finalidade: colorao a quente, com soluo de fucsina bsica 0,5%, e colorao a frio, com soluo corante base de azul de Coomasie. 7.1 Colorao com fucsina bsica a) Repicar a cultura em gar nutriente inclinado; b) Incubar a 30 1C por 24 horas e posteriormente em ambiente por 2 a 3 dias; c) Preparar esfregao em lmina de vidro limpa; d) Secar ao ar e fixar rapidamente passando sobre uma chama de bico de Bunsen; e Mergulhar em lcool metlico, deixando em contato por 30 segundos. Retirar e deixar secar ao ar. f) Corar com soluo de fucsina bsica 0,5% a quente (aproximaro mximo possvel de uma chama de bico de Bunsen e deixar at que desprenda vapor. Afastar do fogo e aps 1 a 2 minutos repetir a operao; g) Esperar cerca de 30 segundos para que a lmina esfrie e h) Observar ao microscpio com objetiva de imerso. Os corpsculos de incluso cristalina do Bacillus thuringiensis se apresentam como pequenos discos de bordas convexas (em forma de gro de lentilha) de cor rosa intensa. 7.2 Colorao com azul de Coomasie 7.2.1 Preparo da soluo Corante - azul de Coomasie Azul coomasie - 0,25 g Metanol - 50 mL cido actico glacial - 7 mL gua destilada - 100 mL 7.2.2 Procedimento a) Repicar a cultura em gar nutriente inclinado; b) Incubar a 30 1C por 24 horas e, posteriormente, em ambiente por 3 a 4 dias; c) Preparar esfregao em lmina de vidro limpa; d) Secar ao ar e fixar rapidamente passando sobre uma chama de bico de Bunsen; e) Cobrir o esfregao com a soluo de azul de Coomasie por 3 minutos; f) Escorrer e lavar suavemente com gua corrente; g) Secar; h) Observar ao microscpio com objetiva de imerso.

Os corpsculos de incluso cristalina do Bacillus thuringiensis se apresentam como estruturas tetragonais de cor azul intensa. 7.3 Alternativamente, pode ser utilizada a colorao de Wirst-Konklin (verde malaquita) para corar os corpsculos de incluso cristalina. Os corpsculos de incluso cristalina do Bacillus thuringiensis se apresentam como estruturas tetragonais de cor rosa, enquanto os esporos se coram em verde. 8. COLORAO DE GRAM - CARBOL FUCSINA MODIFICADA POR HUCKER PARA Campylobacter 8.1 Procedimento a) Preparar esfregao dos cultivos suspeitos; b) Deixar secar ao ar e fixar delicadamente passando sobre uma chama de bico de Bunsen; c) Corar pelo mtodo de Gram modificado por Hucker; d) Corar por 1 minuto com cristal violeta oxalato de amnio; e) Lavar com gua; f) Cobrir com lugol por 1 minuto; g) Lavar com gua; h) Descorar com etanol 95% at que saia todo o corante; i) Lavar com gua; j) Contracorar com carbol fucsina por 10 a 20 segundos; k) Lavar com gua; l) Secar e examinar em microscpio de campo claro com objetiva de imerso. Todos os cultivos de Campylobacter se apresentam como bastonetes Gram negativos, curvos ou espiralados, com arranjo tpico em forma de asa de gaivota. Preparo dos corantes de Gram modificados por Hucker para Campylobacter 8.2.1 Soluo Corante Cristal violeta-oxalato de amnio Soluo A Cristal violeta (90-95% de pureza) - 2,0 g Etanol 95% - 200 mL Soluo B Oxalato de Amnio - 8,0 g Etanol 95% - 800 mL Preparo da soluo final Misturar a soluo A e B. Deixar em repouso por uma noite ou mais em temperatura ambiente. Filtrar em filtro de papel grosso. 8.2.2 Preparo da soluo de lugol para colorao de Campylobacter Cristais de iodo ou iodo ressiblimado - 1,0 g Iodeto de potssio - 2,0 g gua destilada - 300 mL 8.2.3 Descorante Etanol 95%

8.2.4 Preparo da carbol Fucsina 0,3% Soluo A: Fucsina bsica - 0,3 g lcool etlico - 10 mL Soluo B: Fenol (cristais fundidos) - 5,0 mL gua destilada - 95 mL Misturar as solues A e B. 9. COLORAO PARA OBSERVAO DE MOVIMENTO BROWNIANO DE ESPOROS (Paenibacillus larvae) a) Preparar o esfregao em uma lamnula limpa; b) Secar ao ar ou sob o calor de uma lmpada; c) Fixar sob o calor de uma lmpada ou fixar passando, rapidamente, por 2 ou 3 vezes, sobre uma chama de bico de Bunsen. Os esporos de P. larvae no se fixam na lamnula; d) Corar com soluo carbol-fucsina por 10 segundos; e) Tirar o excesso de corante, deixando escorrer; f) Cobrir uma lmina de vidro com uma camada fina de leo de imerso e sobre esta colocar a lamnula ainda mida, em posio invertida, preparada conforme descrito acima; g) Observar em microscpio com objetiva de imerso. Os esporos se coram em rosa mais intenso que as clulas e apresentam movimento vibratrio (movimento Browniano). 10. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA ACUFF, G.R. Media, Reagents, and Stains. In: Compendium of Method for the Microbiological Examination of Foods, American Public Health Association. 3. ed. Washington DC. Carl Vanderzant & Don F.Splittsoesser, 1992, p. 1093-1208 BRASIL. Ministrio da Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrria. Secretaria de Defesa Agropecuria. Departamento de Defesa Animal. Manual de mtodos microbiolgicos para alimentos. Coordenao Geral de Laboratrio Animal. 1991/1992 2 reviso. 136p. BRYCE, J.R.; POELMA, P.L. Microscopic Examination of Foods and Care and Use of the Microscope. In: Bacteriological Analytical Manual. 8.ed. Food and Drug Administration. AOAC International, Gaithersburg, USA. 1995. p. 2.01-2.06. CLARRIDGE, J.E.; MULLINS, J.M. Microscopy and Staining. In: Clinical and Pathogenic Microbiology, Howard, B.J. et all. 2nd Ed. Mosby. St. Louis, 1994, p. 101-115. HARMON, S.M.; GOEPFERT, J.M.; BENNETT, R.W. Bacillus cereus. In: Compendium of Method for the Microbiological Examination of Foods, American Public Health Association. 3. ed. Washington DC. Carl Vanderzant & Don F.Splittsoesser, 1992, p. 593-604. HUNT, J.M.; ABEYTA,C. Campylobacter. In: Bacteriological Analytical manual. 8 ed.Food and Drug Administration. AOAC International, Gaithersburg, USA. 1995. p. 7.01 - 7.27. SHIMANUKI, H.; KNOX, D.A.; FURGALA, B.; CARON, D.M.; WILLIAMS, J.L. Diseases and Pests of Honey Bees. In: The Hive and the Honey Bee. J.M.Graham (Ed). Dadant & Sons . Hamilton, Illinois. 1992. P.1083-1150. ANEXO VIII

PROCEDIMENTOS PARA EMISSO DE RESULTADOS CERTIFICADO OFICIAL DE ANLISE (COA) Os resultados das anlises microbiolgicas devero ser emitidos mo, no prprio Certificado Oficial de Anlise (COA) que acompanha a amostra. No COA devero constar as assinaturas do analista e do responsvel pelo setor de microbiologia e seus respectivos carimbos, bem como as datas do incio e trmino das anlises. Caso haja necessidade de se fazer alguma observao pertinente anlise alm do resultado , utilizar o campo destinado a observaes. No caso de rasura durante o preenchimento, danificao ou inutilizao (por qualquer motivo) do COA, substitu-lo por outro em branco, copiando todas as informaes do certificado original. Neste caso, no campo 16, dever constar COA substitudo no laboratrio e a assinatura ou rubrica da pessoa que o substituiu. 2. CDIGOS DAS ANLISES No campo referente aos resultados, dever constar o n de cdigo de cada anlise realizada. Os cdigos a serem usados so os seguintes: M01 - Contagem de Bacillus cereus; M02 - Pesquisa de Paenibacillus larvae subsp. larvae; M03 - Pesquisa de Listeria monocytogenes; M04 - Contagem de Clostridium Sulfito Redutores; M05 - Contagem de Clostridium perfringens; M06 - Contagem de coliformes totais; M07 - Contagem de coliformes termotolerantes; M08 - Contagem de bolores e leveduras; M09 - Contagem padro de microrganismos mesfilos aerbios estritos e facultativos viveis; M14 - Contagem de Staphylococcus aureus; M15 - NMP de Staphylococcus aureus; M16 - NMP de coliformes totais; M17 - NMP de coliformes termotolerantes; M19 - NMP de Vibrio parahaemolyticus; M20 - Pesquisa de Salmonella; M21 - Pesquisa de microrganismos mesfilos aerbios; M22 - Pesquisa de microrganismos termfilos aerbios; M23 - Pesquisa de microrganismos mesfilos anaerbios; M24 - Pesquisa de microrganismos termfilos anaerbios; M25 - Pr-incubao a 35C por 10 dias em produtos enlatados; M26 - Pr-incubao a 55C por 5 a 7 dias em produtos enlatados; M29 - Pr-incubao por 7 dias a 36C em produtos UHT; M30 - Contagem de microrganismos mesfilos aerbios viveis a 30C; M31 - NMP de microrganismos mesfilos aerbios viveis a 30C; M32 - Contagem total de Enterobactrias. 3. EXPRESSO DOS RESULTADOS Os resultados devero ser expressos de acordo com o indicado abaixo:

3.1 Resultados de provas de contagem O resultado final ser expresso em UFC/g ou mL, levando-se em conta a diluio empregada, seguindo as orientaes contidas no Anexo IV, Procedimentos para contagem de colnias, deste Manual. 3.2 Resultados de provas de NMP O resultado final ser expresso em NMP/ mL ou g , ou ainda NMP/100 mL, no caso de anlise de gua de abastecimento e gelo, de acordo com o Anexo III, Procedimentos bsicos de contagem, deste Manual. 3.3 Resultados de provas de pesquisa O resultado final dever ser expresso como: Ausncia ou Presena em 20 mL (P.larvae subsp. larvae). Ausncia ou Presena em 25 g ou mL (outros microrganismos). Ausncia ou Presena em 100 mL (para guas de estabelecimentos exportadores para a Comunidade Econmica Europia). 3.4 Provas de Pr-incubao de enlatados e produtos UHT Expressar o resultado como Alterado ou Sem alterao. 3.4.1 Teste de esterilidade comercial Para as anlises M21, M22, M23 e M24, expressar o resultado como Negativa ou Positiva. 3.5 EMISSO DE RESULTADOS POR LABORATRIOS CREDENCIADOS Cada laboratrio credenciado pela Coordenao de Laboratrio Animal (CLA) para realizao de anlises microbiolgicas dever elaborar um certificado para emisso dos resultados oficiais e submet-los aprovao da CLA, pois estes laboratrios no podero emitir os resultados de anlise no Certificado Oficial do Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento, encaminhado pelo Servio de Inspeo Federal (SIF) juntamente com as amostras oficiais. Os laboratrios credenciados devero seguir os mesmos critrios aqui estabelecidos para a emisso de resultados oficiais. ANEXO IX MEIOS DE CULTURA Meios de cultura desidratados fornecidos por diferentes fabricantes podem apresentar pequenas diferenas em suas composies. Observar atentamente a quantidade necessria de meio desidratado, em gramas por litro de meio a ser preparado, o modo de preparo, o tempo e a temperatura de esterilizao em cada caso. Ao adquirir meios de cultura, observar atentamente a formulao, comparando-a com aquela indicada neste manual. s vezes, as diferentes marcas utilizam diferentes termos para uma mesma substncia. Por exemplo, os termos triptona e tripticase referem-se peptona de casena obtida por digesto triptica ou pancretica. Assim, os produtos gar tripticase soja, gar soja triptona, Caso gar (antigo Casoy) referem-se um produto que contm peptona de casena (obtida por digesto trptica ou pancretica) e peptona de farinha de soja. Como medida de segurana, as substncias componentes dos meios de cultura, das

solues e dos reagentes includas nos anexos esto sinalizados com uma letra, indicando o grupo de risco ao qual pertencem, sendo: N = nocivo; I = irritante; T = txico; H = hidropoluente; P = perigoso para o meio ambiente; C = corrosivo; O = oxidante; F = inflamvel; E = explosivo; M = mutagnico; Co = comburente. Recomenda-se que, antes da manipulao e descarte das referidas substncias, sejam consultadas fichas prprias ou manuais de segurana, visando o reconhecimento dos principais riscos inerentes e das medidas indispensveis para prevenir ou evitar a ocorrncia de acidentes e minimizar os danos sade do usurio e ao meio ambiente. 1. gar azul de toluidina - DNA Pesar separadamente os seguintes ingredientes: gar DNAse - 4,2 g Cloreto de sdio - 1,0 g Tris (Hidroximetil) aminometano(I*). - 0,61 g Soluo de Azul de Toluidina(H) 1 % - 0,92 mL pH 9,00,2 (H) -hidropoluente (I*) - irrita os olhos e a pele Adicionar 100 mL de gua destilada/deionizada aos componentes da formulao, com exceo do azul de toluidina. Agitar com auxlio de basto de vidro at completa dissoluo. Deixar repousar por 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Adicionar a soluo de azul de orto-toluidina. No necessrio esterilizar. Distribuir em placas cerca de 25 mL e deixar solidificar em superfcie plana. 2. gar Bacillus larvae (ABL) Preparar, separadamente, alquotas de 100 mL de gar cereus (PEMBA) base, gar soja triptona e gar estoque de acordo com o descrito neste captulo para cada um dos meios especficos. Fundir os meios e resfriar at 47 1C, mantendo em banhomaria. Em um erlenmeyer estril, com capacidade mnima de 500 mL, misturar: gar cereus (PEMBA) base - 100,0 mL gar soja triptona (TSA) - 100,0 mL gar estoque - 100,0 mL Emulso de gema de ovo a 50% estril (*) - 30,0 mL

Soluo de cido pipemdico(H) 0,2% (**) - 3,0 mL Soluo de cido nalidxico(H) 0,1% (**) - 3,0 mL *) - ltimo ingrediente a ser misturado para evitar a formao excessiva de espuma. (**) - esterilizadas por filtrao (H) - hidropoluente. Homogeneizar bem e distribuir cerca de 20 mL em placas estreis. Deixar solidificar em superfcie plana. Identificar, datar e armazenar adequadamente. Antes do uso, secar as placas invertidas, semi-abertas, em estufa a 45-50C por cerca de 15 minutos. 3. gar Baird-Parker Pesar o gar Baird-Parker de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado e adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar repousar por 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir em frascos apropriados, datar e identificar o volume. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. A composio bsica do gar Baird Parker dever ser a seguinte, por litro de meio: Extrato de carne - 5,0 g Triptona - 10,0 g Extrato de levedura - 1,0 g Piruvato de sdio - 10,0 g Glicina - 12,0 g Cloreto de ltio(N/I).- 5,0 g gar - 20,0 g pH 6,8 0,2 (N) - nocivo por ingesto (I ) - irrita os olhos e a pele Antes do plaqueamento, fundir e resfriar at cerca de 50C. A cada litro de meio base, adicionar 50 mL de emulso de esterilizada por filtrao. Homogeneizar bem e distribuir em placas, tomando o cuidado de evitar a formao de espuma. Antes do uso, secar as placas a 45-50C por cerca de 15 minutos, abertas e invertidas, apoiando a base com a superfcie do gar invertido sobre a borda da tampa da placa. Pode-se ainda utilizar o fluxo laminar para secar as placas de Baird Parker, mantendo-as semi-abertas, sem invert-las, pelo tempo necessrio para a secagem completa de sua superfcie. 4. gar batata glicose 2% Pesar o gar batata glicose 2% de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por cerca de 15 minutos.

Aquecer at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de acordo com a necessidade. Identificar e datar. Esterilizar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica do gar batata glicose 2% dever ser a seguinte, por litro de meio: Infuso de 200g de batata - 4,0 g Glicose - 20,0 g Agar - 15,0 g pH 5,6 0,1 Fundir o gar batata e resfriar at a 46-48C. Adicionar cerca de 1,5 mL de soluo aquosa de cido tartrico 10% para cada 100 mL, de forma a baixar o pH at 3,5. Homogeneizar. Verter nas placas cerca de 15 a 20 mL. Deixar solidificar em superfcie plana. Identificar, datar e armazenar adequadamente. Antes do uso, secar as placas a 45-50C por cerca de 15 minutos, abertas e invertidas, apoiando a base com a superfcie do gar invertido sobre a borda da tampa da placa ou em fluxo laminar expondo a superfcie pelo tempo necessrio para a completa secagem. 5. gar crebro-corao (ABHI) Pesar o gar crebro-corao (ABHI) de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado e adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Aquecer at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de acordo com a necessidade e tampar. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos.Armazenar adequadamente. A composio bsica do gar crebro-corao dever ser a seguinte, por litro de meio: Infuso de crebro de carneiro - 12,5 g Infuso de corao - 5,0 g Proteose-peptona - 10,0 g Cloreto de sdio - 5,0 g D (+) glicose - 2,0 g Agar - 15,0 g pH 7,4 0,2 6. gar cereus (PEMBA) Pesar o meio desidratado de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado e adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo.

Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de 90 mL em frascos. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. A composio bsica do gar cereus (PEMBA) base dever ser a seguinte, por litro de meio: Peptona - 1,0 g Manitol - 10,0 g Cloreto de sdio - 2,0 g Sulfato de magnsio - 0,1 g Fosfato de sdio bibsico - 2,5 g Fosfato de potssio monobsico - 0,25 g Azul de bromotimol - 0,12 g Piruvato de sdio - 10,0 g Agar - 14,0 g Ph 7,2 0,2 No momento da utilizao, adicionar a 90 mL de gar base fundido e resfriado a 49-50C: a) 10 mL de emulso de gema de ovo a 50%; b) 1 mL de sulfato de polimixina B(H) a 0,1% esterilizada por filtrao. (H) - hidropoluente Homogeneizar, tomando o cuidado para no formar espuma, e distribuir cerca de 15 mL em placas estreis. Deixar solidificar em superfcie plana. Identificar e datar. Manter as placas sob refrigerao, protegidas de modo a evitar desidratao. Antes do uso, secar as placas a 45-50C por cerca de 15 minutos, abertas e invertidas, apoiando a base com a superfcie do gar invertido sobre a borda da tampa da placa ou em fluxo laminar expondo a superfcie pelo tempo necessrio para a completa secagem. 7. gar Columbia-base Preparar o gar Columbia-base de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por cerca de 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de acordo com a necessidade. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica do gar Columbia-base dever ser a seguinte, por litro de meio: Peptona especial - 23,0 g Amido solvel - 1,0 g Cloreto de sdio - 5,0 g Agar - 15,0 g pH 7,3 0,2

8. gar Columbia-CNA com sangue desfibrinado de carneiro ou de cobaio. Preparar o gar Columbia-base de acordo com o indicado no item anterior, e adicionar 2 mL de soluo 1% de cido nalidxico por litro de meio. Antes da utilizao, fundir o meio e deixar resfriar em banho- maria at 49-50C . Distribuir cerca de 12 mL do gar base em placas de Petri estreis. Deixar solidificar em superfcie plana. Com pipeta, distribuir sobre a superfcie do gar previamente distribudo e solidificado 5 mL de gar Columbia-CNA adicionado de 5% de sangue desfibrinado de carneiro ou de cobaio, tomando o cuidado para que se distribua homogeneamente sobre toda a superfcie. Deixar solidificar e manter sob refrigerao, protegidas de modo a evitar e desidratao, por at duas semanas. 9. gar com extrato de levedura Pesar, separadamente, os componentes do gar com extrato de levedura conforme a formulao abaixo de acordo com o volume de meio a ser preparado. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo. Verificar necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de acordo com a necessidade, tampar e identificar adequadamente. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. A composio bsica do gar com extrato de levedura dever ser a seguinte, por litro de meio: Agar - 20,0 g Extrato de levedura - 10,0 g pH 7,4 0,2 10. gar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA) Pesar o gar cristal violeta vermelho neutro bile de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado e adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar repousar por 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo. Normalmente, no necessrio esterilizar este meio, porm, se for preciso, este meio pode ser autoclavado a 121C 1C por 5 minutos. A composio bsica de gar cristal violeta vermelho neutro bile dever ser a seguinte, por litro de meio: Peptona de carne - 7,0 g Extrato de levedura - 3,0 g Lactose - 10,0 g Cloreto de sdio - 5,0 g Sais biliares n 3 - 1,5 g Vermelho neutro (N*).- 0,03 g Cristal violeta (N/I/H/P)..- 0,002 g

Agar - 15,0 g pH 7,4 0,2 (N*) - nocivo por ingesto, por contato com os olhos e pele (N) - nocivo por ingesto (I ) - pode causar leses oculares graves (H) - muito txico para os organismos aquticos (P) - a longo prazo, pode causar efeitos negativos no meio ambiente aqutico 11. gar cristal violeta vermelho neutro bile glicose(VRBG) Pesar o gar cristal violeta vermelho neutro bile glicose de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar repousar por 15 minutos. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Aquecer at completa dissoluo. Normalmente, no necessrio esterilizar este meio, porm, se for preciso, este meio pode ser autoclavado a 121C 1C por 5 minutos. A composio bsica de gar cristal violeta vermelho neutro bile glicose dever ser a seguinte, por litro de meio: Peptona de carne - 7,0 g Extrato de levedura - 3,0 g Glicose - 10,0 g Cloreto de sdio - 5,0 g Sais biliares n 3 - 1,5 g Vermelho neutro (N*).- 0,03 g Cristal violeta (N/I/H/P.- 0,002 g Agar - 13,0 g pH: 7,4 0,2 (N*) - nocivo por ingesto, por contato com os olhos e pele (N) - nocivo por ingesto (I ) - pode causar leses oculares graves (H) - muito txico para os organismos aquticos (P) - a longo prazo pode causar efeitos negativos no meio ambiente aqutico 12. gar eosina azul de metileno (EMB) Pesar o gar EMB de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Deixar em repouso por cerca de 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo. Distribuir volumes de acordo com a necessidade. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente.

A composio bsica do gar EMB dever ser a seguinte, por litro de meio: Peptona de carne - 10,0 g Lactose - 10,0 g Fosfato de potssio bibsico - 2,0 g Eosina amarela - 0,4 g Azul de metileno (N/H). - 0,065 g gar - 15,0 g pH 7,0 0,2 (N) - nocivo por ingesto (H) - substncia muito perigosa para gua 13. gar esculina Pesar o gar esculina de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por cerca de 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo do gar. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de 3 a 5 mL em tubos. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica do gar bile esculina dever ser a seguinte, por litro de meio: Extrato de carne - 3,0 g Peptona de carne - 5,0 g Esculina - 0,1 g Citrato frrico - 0,5 g Agar - 14,5 g pH 6,6 0,2 14. gar estoque Pesar, separadamente, os ingredientes de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada em sua formulao. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir em tubos volumes que permitam a formao de um bisel longo. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Aps autoclavao, deixar os tubos solidificarem em posio inclinada. Quando o meio for destinado estocagem de culturas referenciais, distribuir em tubos pequenos com tampa de rosca ou em frascos tipo penicilina, deixando solidificar em posio vertical. Armazenar adequadamente.

A composio bsica do gar estoque dever ser a seguinte, por litro de meio: Peptona bacteriolgica - 13,8 g Extrato de levedura - 6,0 g Extrato de carne - 12,2 g Cloreto de sdio - 10,0 g Fosfato de sdio bibsico - 2,0 g Agar - 15,0 g pH 7,4 0,2 15. gar fenilalanina Pesar o gar fenilalanina de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por cerca de 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo do gar. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir em tubos volumes de 3 a 5 mL. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica do gar fenilalanina dever ser a seguinte, por litro de meio: Extrato de levedura - 3,0 g Cloreto de sdio - 5,0 g DL-Fenilalanina - 2,0 g Fosfato de sdio monobsico - 1,0 g Agar - 15,0 g pH 7,3 0,2 16. gar ferro dois acares (gar Kligler) Pesar o gar ferro dois acares de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar repousar por cerca de 15 minutos. Aquecer, sob agitao, at completa dissoluo do meio. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volume compatvel com o tubo disponvel, capaz de, quando inclinado, formar uma base de 3,0 cm de altura e, sobre ela, um bisel de 2 a 3 cm. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. A composio bsica de gar ferro dois acares dever ser a seguinte, por litro de meio: Extrato de carne - 3,0 g Extrato de levedura - 3,0 g Peptona de casena - 15,0 g Peptona de carne - 5,0 g Cloreto de sdio - 5,0 g Lactose - 10,0 g

D (+)Glicose - 1,0 g Citrato frrico - 0,3 g Tiosulfato de sdio - 0,3 g Vermelho de fenol - 0,05 g Agar - 12,0 g pH 7,4 0,2 17. gar ferro dois acares (gar Kligler) sal 3% Proceder conforme o indicado pelo fabricante para o preparo do gar Kligler, acrescentando 25 g de cloreto de sdio a cada litro de meio preparado. 18. gar ferro trs acares (TSI) Pesar o gar TSI de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar repousar por cerca de 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volume compatvel com o tubo disponvel, capaz de formar uma base de 3,0 cm de altura e, sobre ela, um bisel de 2 a 3 cm quando inclinado. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica do gar TSI dever ser a seguinte, por litro de meio: Extrato de carne - 3,0 g Extrato de levedura - 3,0 g Peptona de casena - 15,0 g Peptona de carne - 5,0 g Lactose - 10,0 g Sacarose - 10,0 g D (+) Glicose - 1,0 g Citrato de amnio e ferro - 0,5 g Cloreto de sdio - 5,0 g Tiosulfato de sdio - 0,3 g Vermelho de fenol - 0,024 g Agar - 12,0 g pH 7,4 0,1 19. gar ferro trs acares (TSI) sal 3% Proceder conforme o indicado pelo fabricante para o preparo do gar TSI, acrescentando 25 g de cloreto de sdio a cada litro de meio preparado. A composio bsica do gar gelatina dever ser a seguinte, por litro de meio: Peptona de carne - 5,0 g Extrato de carne - 3,0 g Gelatina - 120,0 g pH 6,9 0,1

20. gar glicose triptona Pesar o gar glicose triptona de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado e adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar repousar por cerca de 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de acordo com a necessidade. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica do gar glicose triptona dever ser a seguinte, por litro de meio: Triptona - 10,0 g Glicose - 5,0 g Prpura de bromocresol - 0,04 g Agar - 12,0 g pH 6,8 0,2 21. gar leite com tiamina (ALT) Dissolver o gar com extrato de levedura, preparado conforme o item anterior, e deixar em banho-maria at atingir 45 a 50C. Em um erlenmeyer estril, com capacidade mnima de 500 mL, misturar a cada 300 mL de gar com extrato de levedura, 100 mL de leite UHT desnatado e 6 mL de soluo de tiamina 0,1% esterilizada por filtrao. Aps homogeneizao, distribuir cerca de 20 mL assepticamente em placas estreis deixando solidificar em superfcie plana. A composio bsica do gar leite com tiamina dever ser a seguinte, por litro de meio: gar com extrato de levedura - 300 mL Leite UHT desnatado - 100 mL Tiamina cloridrato sol. a 0,1% - 6 mL 22. gar lisina ferro (LIA) Pesar o gar lisina ferro (LIA) de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado e adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar repousar por cerca de 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir em tubos, em volumes compatveis com a formao de uma base de cerca de 3 cm e bisel de aproximadamente 2cm quando inclinados. Datar e identificar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica do gar LIA dever ser a seguinte, por litro de meio: Peptona de carne - 5,0 g Extrato de Levedura - 3,0 g

L-lisina - 10,0 g Glicose - 1,0 g Citrato Frrico Amoniacal - 0,5 g Tiosulfato de Sdio - 0,04 g Prpura de Bromocresol - 0,02 g Agar - 12,5 g pH 6,7 0,1 23. gar MacConkey-sorbitol (MCS) Pesar o gar MacConkey-sorbitol (MCS) de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado e adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar repousar por cerca de 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de 100 mL em frascos adequados. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica do gar MacConkey-sorbitol dever ser a seguinte, por litro de meio: Peptona de casena - 17,0 g Peptona de carne - 3,0 g Sorbitol - 10,0 g Cloreto de sdio - 5,0 g Sais biliares - 1,5 g Vermelho neutro (N*) - 0,03 g Cristal violeta (N/I/H/P) - 0,001 g Agar - 13,5 g pH 7,1 0,1 (N*) - nocivo por ingesto, por contato com os olhos e pele (N) - nocivo por ingesto (I ) - pode causar leses oculares graves (H) - muito txico para os organismos aquticos (P) - a longo prazo, pode causar efeitos negativos no meio ambiente aqutico 24. gar manitol-gema de ovo-polimixina segundo Mossel (MYP) Pesar o meio desidratado de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado e adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por cerca de 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de 90 mL em frascos adequados. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos.

Armazenar adequadamente. A composio bsica do gar manitol-gema de ovo-polimixina segundo Mossel dever ser a seguinte, por litro de meio: Extrato de carne - 1,0 g Peptona de carne e peptona de casena (1:1) - 10,0 g D-manitol - 10,0 g Cloreto de sdio - 10,0 g Vermelho de fenol - 0,025 g Agar - 15,0 g pH 7,1 0,1 Fundir o meio e resfriar em banho-maria at 49-50C. Adicionar a cada 90 mL de gar fundido e resfriado: a) 10 mL de emulso de gema de ovo a 50%; b) 1 mL de soluo de sulfato de polimixina B 0,1% esterilizada por filtrao. 25. gar manitol lisina cristal violeta verde brilhante (MLCB) Pesar o gar MLCB de acordo com volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado e adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar repousar por cerca de 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo. Evitar superaquecimento. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. No autoclavar. Deixar resfriar at 49-50C, em banho-maria. Distribuir em placas estreis. Deixar solidificar em superfcie plana. Identificar, datar e armazenar adequadamente. Manter as placas sob refrigerao, invertidas e protegidas contra desidratao. Antes do uso, secar a superfcie do meio, colocando as placas semi-abertas e invertidas em estufa a 45-50C por cerca de 15 minutos. A composio bsica do gar MLCB dever ser a seguinte, por litro de meio: Extrato de Levedura - 5,0 g Peptona - 10,0 g Extrato de carne - 2,0 g Cloreto de sdio - 4,0 g Manitol - 3,0 g L-Lisina cloridrato - 5,0 g Tiosulfato de sdio - 4,0 g Citrato de ferro e amnio - 1,0 g Verde brilhante (N*) - 0,0125 g Cristal violeta (N/I/H/P) - 0,01 g gar - 15,0 g pH 6,8 0,1 (N*) - nocivo por ingesto, por contato com os olhos e pele (N) - nocivo por ingesto

(I ) - pode causar leses oculares graves (H) - muito txico para os organismos aquticos (P) - a longo prazo, pode causar efeitos negativos no meio ambiente aqutico 26. gar motilidade Pesar, separadamente, os ingredientes de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo. Distribuir em tubos. Identificar e datar. Autoclavar a 121C por 15 minutos. Solidificar em posio vertical. Armazenar adequadamente. A composio bsica de gar motilidade dever ser a seguinte, por litro de meio: Triptose - 10 g Cloreto de sdio - 5,0 g Agar - 5,0 g pH 7,2 0,2 27. gar motilidade-nitrato Pesar, separadamente, os ingredientes de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada em sua formulao. Transferir para recipiente adequado e adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir em tubos. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Deixar solidificar o meio em posio vertical. A composio bsica de gar motilidade-nitrato dever ser a seguinte, por litro de meio: Peptona de carne - 8,6 g Cloreto de sdio - 6,4 g Nitrato de potssio(Co). - 1,5 g Agar - 3,0 g pH 7,0 0,2 (Co) - perigo de fogo em contato com materiais combustveis 28. gar motilidade-nitrato tamponado Pesar, separadamente, os ingredientes de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada em sua formulao. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.

Distribuir em tubos. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Deixar o meio solidificar em posio vertical. A composio bsica do gar motilidade-nitrato tamponado dever ser a seguinte, por litro de meio: Extrato de carne - 3,0 g Peptona de carne - 5,0 g Nitrato de potssio(Co) - 1,0 g Fosfato de sdio bibsico - 2,5 g Agar - 3,0 g Galactose - 5,0 g Glicerina - 5,0 mL pH 7,0 0,2 (Co) - perigo de fogo em contato com materiais combustveis 29. gar motilidade sal 3% Pesar, separadamente, os ingredientes de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada em sua formulao. Transferir para recipiente adequado e adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir em tubos. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Deixar solidificar o meio em posio vertical. A composio bsica de gar motilidade sal 3% dever ser a seguinte, por litro de meio: Peptona de carne - 8,6 g Cloreto de sdio - 30,0 g Agar - 3,0 g pH 7,0 0,2 30. gar Mueller-Hinton sal 3% Pesar o gar Mueller-Hinton de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar repousar por 15 minutos. Aquecer, sob agitao, at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de 100 mL em frascos apropriados. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. A composio bsica do gar Mueller-Hinton sal 3% dever ser a seguinte, por litro de meio: Infuso de carne bovina - 300,0 g Peptona de casena cida - 17,5 g Cloreto de sdio - 30,0 g

Amido - 1,5 g Agar - 17,0 g pH 7,3 0,2 31. gar nutriente Pesar o gar nutriente de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo do gar. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir alquotas de 10 mL em tubos apropriados. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Aps autoclavao, deixar solidificar em posio inclinada, de forma a obter um bisel longo. Identificar, datar e armazenar adequadamente. A composio bsica do gar nutriente dever ser a seguinte, por litro de meio: Peptona - 5,0 g Extrato de carne - 1,0 g Extrato de levedura - 2,0 g Cloreto de sdio - 5,0 g Agar - 15,0 g pH 7,4 0,2 32. gar nutriente com sulfato de mangans Preparar o gar nutriente conforme descrito no item anterior e adicionar 300 mg de sulfato de mangans a cada litro de meio. Fundir o meio e deixar resfriar em banho-maria at 45-50C. Distribuir cerca de 10 mL em tubos. Deixar solidificar de forma inclinada, de maneira a obter um bisel maior ou igual a 4 cm. Identificar, datar e armazenar adequadamente. 33. gar nutriente isento de extrato de levedura Pesar o gar nutriente de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo do gar. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir alquotas de 10 mL em tubos apropriados. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Aps autoclavao, deixar solidificar em posio inclinada, de forma a obter um bisel longo. Identificar, datar e armazenar adequadamente. A composio bsica do gar nutriente isento de extrato de levedura dever ser a

seguinte, por litro de meio: Peptona de carne - 5,0 g Extrato de carne - 1,0 g Cloreto de sdio - 5,0 g Agar - 15,0 g pH 7,4 0,2 34. gar nutriente sal 3% Preparar conforme descrito para o gar nutriente e adicionar 25 g de cloreto de sdio, por litro de meio. Fundir o meio e deixar resfriar em banho-maria at 45-50C. Distribuir em placas ou tubos, conforme a necessidade. Identificar, datar e armazenar adequadamente. 35. gar Oxford (AO) Pesar o meio gar Oxford base de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo do gar. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de acordo com a necessidade. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica do gar Oxford dever ser a seguinte, por litro de meio: gar Columbia base - 39,0 g Esculina - 1,0 g itrato de amnio e ferro III - 0,5 g Cloreto de ltio (N/I) . - 15,0 g pH 7,0 0,2 (N) - nocivo por ingesto (I) - irrita os olhos e a pele Fundir o gar Oxford e resfriar em banho-maria at 45-48C. Dissolver o suplemento seletivo (vial) em 5 mL de etanol/ gua (1:1). Agitar cuidadosamente. Adicionar, a cada 500 mL de meio, 1 vial de suplemento. Distribuir em placas de Petri estreis. Identificar, datar e armazenar sob refrigerao, protegidas da luz e envoltas em sacos plsticos, por at 4 semanas. OBS: O suplemento para o gar Oxford contido em cada vial, comercialmente disponvel, tem em sua composio as seguintes substncias: Cicloheximide - 200 mg Sulfato de Colistina - 10 mg Acriflavina(T). - 2,5 mg Cefotetan - 1,0 mg Fosfomicina - 5,0 mg

(T) - txico por ingesto e por inalao 36. gar padro para contagem (PCA) Pesar o gar padro para contagem de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo do gar. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de acordo com a necessidade. Esterilizar a 121 1C por 15 minutos. Identificar e armazenar adequadamente. A composio bsica do gar padro para contagem dever ser a seguinte, por litro de meio: Extrato de levedura - 2,5 g Triptona - 5,0 g Glicose - 1,0 g Agar - 15,0 g pH 7,0 0,2 37. gar PALCAM (AP) Pesar o gar PALCAM base de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo do gar. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de acordo com a necessidade. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica do gar PALCAM dever ser a seguinte, por litro de meio: gar Columbia base - 39,0 g Extrato de levedura - 3,0 g Esculina - 0,8 g D(-)manitol - 10,0 g Citrato de amnio e ferro III - 0,5 g Glicose - 0,5 g Cloreto de ltio (N/I). - 15,0 g Vermelho de fenol - 0,08 g gar - 13,0 g pH 7,0 0,1 (N) - nocivo por ingesto (I) - irrita os olhos e a pele Fundir o meio e deixar esfriar at 45-48C. Dissolver o suplemento seletivo de cada vial em 2 mL de gua destilada estril e misturar

at completa dissoluo. Adicionar um vial para cada 500 mL de meio. Distribuir em placas estreis, deixando solidificar em superfcie plana. Identificar, datar e armazenar sob refrigerao, protegidas da luz, por at 4 semanas. O suplemento para o gar PALCAM contido em cada vial, comercialmente disponvel, tem em sua composio as seguintes substncias: Sulfato de Polimixina B - 5,0 mg Ceftazidina - 10 mg Acriflavina(T). - 2,5 mg (T) - txico por ingesto e por inalao 38. gar para ensaio de DNAse com verde de metila Pesar separadamente os seguintes ingredientes: gar DNAse - 4,2 g Verde de metila(H). - 0,05g pH 7,30,2 (H) - hidropoluente Adicionar 100 mL de gua destilada/deionizada ao agar DNAse. Agitar com auxlio de basto de vidro at completa dissoluo. Aquecer at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Adicionar o verde de metila. No necessrio esterilizar. Distribuir em placas cerca de 25 mL e deixar solidificar em superfcie plana. 39. gar para esporulao Pesar o gar para esporulao de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por cerca de 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de acordo com a necessidade. Identificar e datar. Esterilizar a 121 1C por 20 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica do gar para esporulao dever ser a seguinte, por litro de meio: Polipeptona - 15,0 g Extrato de levedura - 3,0 g Amido solvel - 3,0 g Sulfato de mangans - 0,1 g Tioglicolato de sdio - 1,0 g Fosfato de sdio bibsico - 11,0 g Agar - 15,0 g pH 7,8 0,1 40. gar para fermentao de carboidratos - base com prpura de bromocresol

Pesar os componentes da formulao de acordo com o volume de meio a ser preparado. Transferir para recipiente adequado e adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar repousar por 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir em frascos, identificar o volume. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. A composio bsica do gar para fermentao de carboidratos dever ser a seguinte por litro de meio: Triptona - 10,0 g Extrato de carne - 5,0 g Prpura de bromocresol(H) (soluo 1,6%) - 2,5 mL Agar - 15,0 g pH 6,7 0,2 (H)- hidropoluente Antes do uso, adicionar ao meio, dissolvido e resfriado a 46-48C, o carboidrato desejado (previamente esterilizado por filtrao), na concentrao e proporo indicadas na tcnica. Verter cerca de 20 mL nas placas. Identificar, datar e armazenar adequadamente. 41. gar Rambach Hidratar a quantidade de meio Rambach, de acordo com o volume de meio necessrio (o meio fornecido em fraes suficientes para preparar 250 mL). Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Aquecer at completa dissoluo. Evitar aquecimento excessivo. Adicionar 1 vial de suplemento para cada 250 mL de meio preparado. Homogeneizar bem. No autoclavar. Resfriar a 49-50C em banho-maria. Distribuir em placas de Petri estreis. Deixar solidificar em superfcie plana. Identificar e datar. Armazenar invertidas, protegidas em sacos plsticos, sob refrigerao. O meio se mantm estvel em temperatura ambiente por 12 horas e em refrigerao por 3 semanas. Antes do uso, secar a superfcie do meio, colocando as placas semi-abertas e invertidas em estufa a 45-50C por cerca de 15 minutos. A composio bsica do gar Rambach dever ser a seguinte, por litro de meio: Peptona - 8,0 g Cloreto de sdio - 5,0 g Desoxicolato de sdio (N). - 1,0 g Mistura cromgena - 1,5 g Propilenoglicol - 10,5 g Agar - 15,0 g pH final: 7,3 0,2

(N) - nocivo por ingesto 42. gar Sahid Ferguson perfringens (SFP) Pesar o gar SFP de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por cerca de 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir em frascos apropriados. Identificar e datar. Esterilizar em autoclave a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica do gar SFP dever ser a seguinte, por litro de meio: Peptona de carne - 15,0 g Peptona de soja - 5,0 g Extrato de levedura - 5,0 g Bisulfito de sdio - 1,0 g Citrato de amnio e ferro III - 1,0 g Agar - 20,0 g pH 7,4 0,2 Para a preparao das placas de gar SFP, incorporar 3 mg de polimixina B e 12 mg de kanamicina, a cada 1000 mL do meio fundido e resfriado a 45-50C. 43. gar sal triptona (T1N1) Pesar separadamente os seguintes componentes: Triptona - 10,0 g Cloreto de sdio - 10,0 g Agar - 20,0 g pH 7,2 0,2 Transferir para recipiente apropriado. Adicionar 1000 mL de gua destilada/deionizada. Deixar em repouso por cerca de 15 minutos. Aquecer, sob agitao, at completa dissoluo do meio. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de 10 mL em tubos de ensaio. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Deixar solidificar em posio inclinada, de forma a obter um bisel de cerca de 4 cm. Identificar, datar e armazenar adequadamente. 44. gar soja triptona (TSA) Pesar o meio desidratado de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado e adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por 15 minutos.

Aquecer at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de 100 mL em frascos adequados. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. A composio bsica do gar soja triptona dever ser a seguinte, por litro de meio: Triptona (Peptona de casena-digesto trptica ou pancretica) - 15,0 g Peptona de farinha de soja - 5,0 g Cloreto de sdio - 5,0 g Agar - 15,0 g pH 7,3 0,2 45. gar soja triptona (TSA) com CaCl2 e eritrcitos lavados de carneiro Manter frascos com 200 e 100 mL de TSA base, preparado conforme o item anterior, em banho-maria a 45C. Usar 200 mL dos frascos para preparar placas com uma camada base de cerca de 10 mL. Deixar solidificar em superfcie plana. A 100 mL de TSA base, adicionar 5 mL de eritrcitos lavados de carneiro e 1 mL de uma soluo de cloreto de clcio 1M, mantendo o meio em banho-maria a 45C no mximo por 15 minutos. Pipetar uma segunda camada de 5 mL de gar TSA com eritrcitos de carneiro e cloreto de clcio sobre a camada base solidificada. 46. gar soja triptona (TSA) sal 3% Preparar o gar soja triptona de acordo com as recomendaes contidas neste captulo e adicionar 25 g de cloreto de sdio para cada litro de meio. 47. gar tiosulfato-citrato-sacarose-sais biliares (TCBS) Pesar o gar tiosulfato-citrato-sais biliares-sacarose (TCBS) de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por cerca de 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. No autoclavar. Distribuir, assepticamente, volumes de 15 mL em placas de Petri previamente esterilizadas. Antes do uso, secar a superfcie do meio, colocando as placas semi-abertas e invertidas em estufa a 45-50C por cerca de 15 minutos. A composio bsica de gar tiosulfato-citrato-sais biliaressacarose dever ser a seguinte, por litro de meio: Extrato de levedura - 5,0 g Peptona de carne - 5,0 g Peptona de casena - 5,0 g Tiosulfato de sdio - 10,0 g Citrato de sdio - 10,0 g Bile - 5,0 g

Sacarose - 20,0 g Colato de sdio - 3,0 g Cloreto de sdio - 10,0 g Citrato frrico - 1,0 g Azul de bromotimol - 0,04 g Azul de timol - 0,04 g Agar - 15,0 g pH 8,6 0,2 48. gar tirosina Pesar, separadamente, os ingredientes de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada em sua formulao. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de 100 ou 50 mL em frascos adequados. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. A composio do gar tirosina base dever ser a seguinte, por litro de meio: Extrato de carne - 8,6 g Peptona - 1,0 g Agar - 15,0 g pH 7,0 0,2 A 100 mL do meio base, fundido e resfriado a 45-50C, adicionar 10 mL de soluo aquosa estril de tirosina a 5% e misturar bem. Distribuir cerca de 10 mL em tubos de ensaio estreis, agitando para evitar a separao da tirosina. Este meio tambm pode ser distribudo em placas. 49. gar triptose (AT) Pesar o meio gar triptose de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Adicionar a cada litro de meio 2 mL de soluo de cido nalidxico a 1%. Homogeneizar. Deixar repousar por 15 minutos. Aquecer, sob agitao, at completa dissoluo do meio. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir pores de 100 e 50 mL em frascos apropriados. Aquecer at completa dissoluo. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C, por 15 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica do gar AT dever ser a seguinte por litro de meio: Bacto triptose - 20,0 g Cloreto de sdio - 5,0 g

Dextrose - 1,0 g Extrato de levedura - 6,0 g gar - 15,0 g pH 7,4 0,2 (N) - nocivo por ingesto 50. gar Triptose com cido nalidxico (ATN) Preparar o AT de acordo com o item anterior. Adicionar a cada litro de meio 2 mL de soluo de cido nalidxico a 1%. Homogeneizar. 51. gar triptose sulfito cicloserina (TSC) Pesar o gar TSC de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar repousar por 15 minutos. Aquecer, sob agitao, at completa dissoluo do meio. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir em frascos. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica de gar TSC dever ser a seguinte, por litro de meio: Peptona de carne - 15,0 g Peptona de soja - 5,0 g Extrato de levedura - 5,0 g Bisulfito de sdio - 1,0 g Citrato de amnio e ferro III - 1,0 g Agar - 20,0 g pH 7,4 0,2 No momento do uso, fundir o gar e resfriar at 46-48C em banho-maria. Incorporar ao meio fundido e resfriado 10 mL de uma soluo a 5% de cicloserina esterilizada por filtrao, por cada litro de meio. 52. gar uria Pesar o gar uria base de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Homogeneizar at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir em frascos. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica do gar uria dever ser a seguinte, por litro de meio: Peptona de Carne - 1,0 g Fosfato de potssio monobsico - 2,0 g

D+Glicose - 1,0 g Vermelho de fenol - 0,012 g Cloreto de sdio - 5,0 g Agar - 12,0 g pH 6,8 0,2 Antes do uso, fundir o gar uria e resfriar at 50C em banho-maria. Assepticamente, adicionar 50 mL de soluo de uria 40% esterilizada por filtrao, por litro de meio. Distribuir de acordo com o uso. 53. gar verde brilhante vermelho de fenol lactose sacarose(BPLS) Pesar o gar BPLS, de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por cerca de 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de acordo com a necessidade. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica do gar BPLS dever ser a seguinte, por litro de meio: Peptona de carne - 5,0 g Peptona de casena - 5,0 g Extrato de levedura - 3,0 g Lactose - 10,0 g Sacarose - 10,0 g Cloreto de sdio - 5,0 g Fosfato de sdio bibsico - 2,0 g Verde brilhante (N). - 0,0125 g Vermelho de fenol - 0,08 g Agar - 12,0 g pH 6,9 0,1 (N) - nocivo por ingesto Antes do uso, aps dissoluo do meio e resfriamento at cerca de 50C, adicionar a cada 100 mL de meio 0,1 mL de soluo de novobiocina a 4%. Distribuir em placas estreis. Deixar solidificar em superfcie plana. Manter as placas sob refrigerao, invertidas e protegidas contra desidratao. Antes do uso, secar a superfcie do meio, colocando as placas semi-abertas e invertidas em estufa a 45-50C por cerca de 15 minutos. 54. gar xilose-lisina-desoxicolato (XLD) Pesar o gar XLD de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado.

Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por cerca de 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo. Evitar superaquecimento. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. No autoclavar. Distribuir em placas estreis. Deixar solidificar em superfcie plana. Antes do uso, secar a superfcie do meio, colocando as placas semi-abertas e invertidas em estufa a 45-50C por cerca de 15 minutos. A composio bsica do gar XLD dever ser a seguinte, por litro de meio: Extrato de levedura - .3,0 g L(+)Lisina - 5,0 g Lactose - 7,5 g D(+)Xilose - 3,5 g Sacarose - 7,5 g Cloreto de sdio - 5,0 g Desoxicolato de sdio - 2,5 g Vermelho de fenol - 0,08 g Tiosulfato de sdio - 6,8 g Citrato de amnio e ferro III - 0,8 g Agar - 13,5 g pH 7,4 0,2 55. gar XLT4 Pesar o gar XLT4 de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por cerca de 15 minutos. Adicionar 4,6 mL do suplemento (soluo a 26-28% de Tergitol-4/Tetradecylsulfato de Sdio) a cada litro de meio preparado. Aquecer at completa dissoluo, evitando superaquecimento. OBS. O meio no deve ser mantido mais do que 45 minutos a 50C para evitar formao de precipitados. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. No autoclavar. Distribuir em placas estreis. Deixar solidificar em superfcie plana. Antes do uso, secar a superfcie do meio, colocando as placas semi-abertas e invertidas em estufa a 45-50C por cerca de 15 minutos. A composio bsica do gar XLT4 dever ser a seguinte, por litro de meio: Extrato de levedura - 3,0 g Proteose peptona - 1,6 g L-Lisina - 5,0 g Lactose - 7,5 g D + Xilose - 3,75 g Sacarose - 7,5 g

Cloreto de sdio - 5,0 g Vermelho de fenol - 0,08 g Tiosulfato de Sdio - 6,8 g Citrato de Amnio e Ferro III - 0,8 g gar - 18,0 g pH 7,4 0,2 56. gua peptonada alcalina para Vibrio cholerae (APHA 3a ed.) Pesar o meio gua peptonada alcalina de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante ou compondo a formulao no laboratrio. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por 15 minutos. Alcalinizar at pH 8,6 0,2 Distribuir volume de 10 mL em tubos. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica da gua peptonada dever ser a seguinte por litro de meio: Peptona - 10,0 g Cloreto de sdio - 10,0 g pH 8,6 0,2 57. Caldo para fermentao de carboidratos - base com prpura de bromocresol Pesar o caldo base de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Homogeneizar at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de 90 mL em frascos apropriados. Este meio base pode ser autoclavado a 121 1C por 15 minutos. Nesse caso, a soluo de carboidrato a ser adicionada dever ser previamente esterilizada por filtrao. Aps a adio dos carboidratos, distribuir 3 a 10 mL em tubos estreis apropriados. Identificar os tubos com informao sobre o carboidrato que foi adicionado ao meio. Manter sob refrigerao at o momento do uso. OBS: Quando o meio base no for autoclavado, prepar-lo conforme instrues acima e adicionar, a cada frao de 90 mL, 10mL da soluo a 5 ou 10% do carboidrato desejado (ver instrues especficas sobre o preparo das solues de carboidratos no captulo de solues e reagentes deste anexo. Esterilizar por filtrao, dispensando de 3 a 10 mL diretamente em tubos estreis. A composio bsica do caldo para fermentao - base com prpura de bromocresol dever ser a seguinte por litro de meio: Extrato de carne - 3,0 g Peptona - 10,0 g Cloreto de sdio - 5,0 g Prpura de bromocresol - 0,04 g

pH 7,0 0,2 58. Caldo crebro-corao (BHI) Pesar o meio caldo crebro-corao (BHI) de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Homogeneizar at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir 10 mL em tubos com tampa de rosca. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica do caldo crebro-corao (BHI) dever ser a seguinte, por litro de meio: Infuso de crebro de carneiro - 12,5 g Infuso de corao de boi. - 5,0 g Proteose-peptona - 10,0 g D (+) glicose - 2,0 g Cloreto de sdio - 5,0 g Fosfato dissdico - 2,5 g pH 6,6 0,2 59. Caldo crebro-corao concentrao dupla-sal 0,65%-extrato de levedura 0,6%(BHI-SE) Pesar 2 vezes a quantidade de meio caldo crebro-corao (BHI) indicada pelo fabricante, adicionando 1,5 g de Cloreto de sdio e 6,0 g por litro de meio a ser preparado. 60. Caldo crebro-corao nitrato (BHI-NO3) Pesar o meio caldo crebro-corao, de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Adicionar 1,5 g de nitrato de potssio(Co) para cada litro de meio. (Co) - perigo de fogo em contato com materiais combustveis 61. Caldo crebro-corao-sal 0,65%- extrato de levedura 0,6%(BHI-SE) Pesar o meio caldo crebro-corao (BHI), de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Adicionar 1,5 g de Cloreto de sdio e 6,0 g de extrato de levedura, por litro de meio a ser preparado. 62. Caldo Crebro-corao tiamina (BHI-T) Pesar o meio caldo crebro-corao (BHI), de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Antes do uso, adicionar, em cada tubo com 10 mL, 0,2 mL de soluo aquosa de tiamina a 0,01%, esterilizada por filtrao. 63. Caldo de carne cozida (CCC) Em cada tubo selecionado para uso, distribuir 10 mL de gua destilada/deionizada e 1 g

do granulado (ou conforme a indicao do fabricante). Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica do caldo de carne cozida dever ser a seguinte por litro de meio: Msculo cardaco de boi - 454,0 g Proteose peptona - 20,0 g D (+) Glicose - 2,0 g Cloreto de sdio - 5,0 g pH 7,4 0,1 64. Caldo de Enriquecimento para Listeria (LEB) Pesar os componentes da formulao do meio LEB de acordo com o volume de meio a ser preparado. Transferir para recipiente adequado.Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Agitar at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de 225 mL. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos.Esfriar logo aps a esterilizao e manter sob refrigerao. A composio bsica do caldo LEB dever ser a seguinte, por litro de meio: Proteose peptona - 5,0 g Triptona - 5,0 g Extrato de carne purificado - 5,0 g Extrato de levedura - 5,0 g Cloreto de sdio - 20,0 g Fosfato de potssio monobsico - 1,35 g Fosfato de sdio bibsico - 12,0 g cido Nalidxico sol. a 1% - 2,0 mL pH 7,4 0,2 Imediatamente antes do uso adicionar 0,25 mL de soluo aquosa a 1,0% de acriflavina cloridrato (T) por frasco de 225 mL. (T) - txico por ingesto e por inalao 65. Caldo de enriquecimento para Listeria (UVM) Pesar o meio UVM de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Agitar at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir em frascos, volumes de 225 mL.Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos.Esfriar logo aps a esterilizao e manter sob refrigerao. A composio bsica do caldo UVM dever ser a seguinte, por litro de meio: Proteose peptona - 5,0 g

Triptona - 5,0 g Extrato de carne purificado - 5,0 g Extrato de levedura - 5,0 g Cloreto de sdio - 20,0 g Fosfato de potssio monobsico - 1,35 g Fosfato de sdio bibsico - 12,0 g Esculina - 1,0 g pH 7,4 0,2 Imediatamente antes do uso, assepticamente adicionar 1 vial de suplemento especfico para cada 500 mL de caldo. Na ausncia do suplemento vial, adicionar 1,2 mL de soluo aquosa a 1,0% de acriflavina cloridrato (T) e 2 mL de cido nalidxico soluo 1% em NaOH 0,1N (esterilizadas por filtrao) por litro de caldo. (T) - txico por ingesto e por inalao (N) - nocivo por ingesto OBS: Algumas marcas j contm os suplementos. Outras contm o cido nalidxico, necessitando apenas a complementao com acriflavina. O contedo do suplemento vial para o caldo UVM, comercialmente disponvel, o seguinte: Acriflavina(T/H).- 6,0 mg cido nalidxico(N/H) .- 10,0 mg gua destilada ou deionizada - 5,0 mL (T) - txico por ingesto e por inalao (N) - nocivo por ingesto, e em contato com a pele e com olhos (H) - hidropoluente classe 3 66. Caldo EC Pesar o caldo EC de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Agitar at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de 10 mL em tubos de ensaio previamente preparados com tubos de Durhan invertidos. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. A composio bsica de caldo EC dever ser a seguinte, por litro de meio: Peptona - 20,0 g Lactose - 5,0 g Bile bovina - 1,5 g Cloreto de sdio - 5,0 g Fosfato de potssio bibsico - 4,0 g Fosfato de potssio monobsico - 1,5 g pH 6,9 0,2

67. Caldo EC com novobiocina (EC + n) Pesar o caldo EC de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Aps preparo e autoclavao, adicionar, a cada tubo com 10 mL de meio, 0,5 mL de uma soluo de novobiocina a 4 mg/mL. 68. Caldo experimental para anaerbios segundo R.F.Corseuil (caldo Rogert) Pesar separadamente os seguintes ingredientes: Peptona - 20,0 g Extrato de levedura - 5,0 g Extrato de carne - 3,0 g Glicose - 12,5 g Cloreto de sdio - 5,0 g L-cistena - 0,5 g Caldo de fgado - 500 mL pH 7,6 0,2 Transferir para recipiente adequado. Adicionar 500 mL de gua destilada/deionizada. Agitar at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Autoclavar a 121 1C por 20 minutos. OBS. Para preparar o caldo de fgado, ferver durante uma hora o fgado bovino modo na proporo de 500g para cada litro de gua. Filtrar em papel filtro, fracionar em alquotas de 500 mL e congelar at a sua utilizao. Pode-se substituir o extrato de carne e a gua destilada por caldo de carne, previamente preparado da mesma forma que o caldo de fgado, utilizando-se msculo bovino. 69. Caldo Fraser Pesar o caldo fraser base, de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Misturar at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de 10 mL em tubos. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Resfriar imediatamente aps a autoclavao. Armazenar sob refrigerao. A composio bsica do caldo Fraser dever ser a seguinte, por litro de meio: Proteose peptona - 5,0 g Triptona - 5,0 g Extrato de carne - 5,0 g Extrato de levedura - 5,0 g Cloreto de sdio - 20,0 g Fosfato de potssio monobsico - 1,35 g Fosfato de sdio bibsico - 12,0 g Esculina - 1,0 g Cloreto de ltio (N/I).- 3,0 g pH 7,2 0,1

(N) - nocivo por ingesto (I) - irrita os olhos e a pele Imediatamente antes do uso, adicionar assepticamente a cada tubo 0,1 mL do suplemento (vial) dissolvido em 5 mL de gua/etanol 1:1. * O vial comercialmente disponvel contm suplemento suficiente para 500 mL de meio. A composio do vial a seguinte: Citrato de Amnio e Ferro III - 250 mg Acriflavina - 12,5 mg cido Nalidxico - 10 mg OBS: Algumas marcas deste meio j incluem em sua formulao uma ou mais das substncias do suplemento. Nesse caso, os componentes ausentes na formulao devero ser adicionados individualmente na seguinte proporo: para cada tubo de 10 mL do caldo: - 0,1 mL da soluo de citrato de amnio e ferro III a 5%; - 0,25 mL de soluo de acriflavina cloridrato a 0,1%; - 0,2 mL da soluo de cido nalidxico a 0,2%. Manter o meio protegido da luz. 70. Caldo gelatina fosfato sal (GPS) Pesar separadamente os seguintes componentes: Gelatina - 10,0 g Cloreto de sdio - 10,0 g Fosfato de potssio bibsico - 5,0 g pH: 7,2 0,2 Transferir para recipiente apropriado. Adicionar 1000 mL de gua destilada/deionizada. Aquecer, sob agitao, at completa dissoluo do meio. Distribuir de acordo com a utilizao. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. 71. Caldo Glicose-sal 3%-teepol (GSTB) Pesar o meio caldo glicose sal 3% teepol, de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Homogeneizar at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir 10 mL em tubos com tampa de rosca. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica do caldo glicose-sal 3%-teepol dever ser a seguinte, por litro de meio: Extrato de carne - 3,0 g Peptona - 10,0 g

Cloreto de sdio - 30,0 g Glicose - 5,0 g Violeta de Metila - 0,002 g Teepol - 4,0 mL pH 8,8 0,2 72. Caldo glicose triptona (caldo dextrose triptona) Pesar o meio glicose triptona, de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Homogeneizar at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de 10 mL em tubos com tampa de rosca. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica do caldo dextrose triptona dever ser a seguinte, por litro de meio: Triptona - 10,0 g Glicose - 5,0 g Extrato de carne - 5,0 g pH 6,7 0,2 73. Caldo Horie arabinose violeta de etila (HAEB) Pesar separadamente os seguintes ingredientes: Peptona - 5,0 g Cloreto de sdio - 30,0 g Extrato de carne - 3,0 g Violeta de Etila - 0,001 g Azul de Bromotimol - 0,03 g Transferir para recipiente adequado. Adicionar 900 mL de gua destilada/deionizada. Agitar at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Preparar separadamente 100 mL de uma soluo aquosa a 5% de arabinose, esterilizar por filtrao e adicion-la assepticamente aos 900 mL do caldo. Distribuir assepticamente 10 mL em tubos estreis de 15 x 180 mm. 74. Caldo lauril sulfato de sdio simples Pesar o caldo lauril sulfato de sdio de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Agitar at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de 10 mL em tubos de ensaio contendo tubos de Durhan invertidos.

Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. A composio bsica de caldo lauril sulfato de sdio dever ser a seguinte por litro de meio: Triptona - 20,0 g Lactose - 5,0 g Cloreto de sdio - 5,0 g Lauril sulfato de sdio - 0,1 g Fosfato de potssio bibsico - 2,7 g Fosfato de potssio monobsico - 2,75 g pH 6,8 0,2 75. Caldo lauril sulfato de sdio concentrao dupla Seguir o procedimento do caldo simples (item anterior), dobrando a quantidade dos ingredientes para o mesmo volume de gua. 76. Caldo lisina descarboxilase Pesar o caldo lisina descarboxilase de acordo com o volume de meio a ser preparado. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Homogeneizar at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir 5 mL em tubos de ensaio. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 10 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica do caldo lisina dever ser a seguinte, por litro de meio: Peptona - 5,0 g Extrato de levedura - 3,0 g Glicose - 1,0 g L-Lisina - 5,0 g Prpura de bromocresol - 0,02 g pH 6,1 0,2 77. Caldo ONPG Preparar a soluo de gua peptonada 1% de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante ou compondo a formulao de acordo com as orientaes contidas neste anexo. Ajustar o pH, se necessrio. Distribuir em frascos. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Esfriar e reservar. Preparar a soluo de ONPG dissolvendo 0,6 g de O-nitrofenil-Beta-D-Galactopiranosdeo em 100 mL de soluo 0,01 M de Fosfato de Sdio Bibsico. Esterilizar por filtrao. Manter sob refrigerao, envolvido em papel alumnio. Preparo do Caldo ONPG: Misturar assepticamente 25 mL da soluo ONPG em 75 mL da gua peptonada. Distribuir 0,5 mL do caldo em tubos esterilizados.

OBS: no usar se ficar amarelo. Validade: 30 dias sob congelamento. 78. Caldo ONPG sal 3% Preparar a soluo de gua peptonada 1% de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante ou compondo a formulao de acordo com as orientaes contidas neste captulo. Adicionar 25,0 g de cloreto de sdio por litro de meio. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Esfriar e reservar. Preparo do Caldo ONPG sal 3%: Misturar assepticamente 25 mL da soluo ONPG em 75 mL da gua peptonada-sal 3%. OBS. Ver preparo da soluo de ONPG item anterior. 79. Caldo peptonado sem sal Pesar, em recipiente apropriado, o seguinte componente: Peptona (ou triptona) - 10,0 g gua destilada/deionizada - 1000 mL pH 7,4 0,2 Agitar at a completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de 10 mL em tubos de ensaio. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. 80. Caldo peptonado sal (3%, 6%, 8% ou 10%) Pesar, em recipiente apropriado, os seguintes componentes: Peptona (ou triptona) - 10,0 g Cloreto de sdio para atingir a concentrao desejada - qsp gua destilada/deionizada - 1000 mL pH 7,4 0,2 Agitar at a completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de 10 mL em tubos de ensaio. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. 81. Caldo Rappaport Vassiliadis Pesar o caldo Rappaport Vassiliadis, de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Agitar at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir 10 mL em tubos de ensaio.

Identificar e datar. Autoclavar a 115 1C por 10 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica do caldo Rappaport Vassiliadis dever ser a seguinte, por litro de meio: Peptona de soja - 5,0 g Cloreto de sdio - 8,0 g Fosfato de potssio monobsico - 1,6 g Cloreto de magnsio* - 40,0 g Verde malaquita* (N).- 0,04 g pH 5,2 0,2 (N) - nocivo por contato com a pele e por ingesto * - algumas marcas de meio Rappaport Vassiliadis no incluem cloreto de magnsio e verde malaquita em sua formulao. Ao utilizar este meio, verificar a necessidade de suplementao. OBS. O meio preparado pode ser estocado em refrigerao por at 7 meses (Vassiliadis et al. 1985) 82. Caldo selenito cistina Pesar o caldo selenito cistina, de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Aquecer, se necessrio, at no mximo 60C, para completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir 10 mL em tubos de ensaio. No autoclavar. Usar imediatamente aps o preparo. Descartar o meio que no for utilizado. A composio bsica do caldo selenito cistina dever ser a seguinte, por litro de meio: Peptona de casena - 5,0 g L (-) cistina - 0,01 g Lactose - 4,0 g Fosfato de sdio bibsico - 2,0 g Bi-selenito de sdio (T) - 4,0 g pH 7,0 0,2 (T) - txico por inalao e ingesto / pode ter efeitos cumulativos 83. Caldo soja triptona (TSB) Pesar o caldo TSB, de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Agitar, com auxlio de basto de vidro ou agitador magntico, at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de acordo com a necessidade. Identificar e datar.

Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica do caldo TSB dever ser a seguinte, por litro de meio: Triptona (peptona de casena-digesto pancretica) - 17,0 g Peptona de farinha de soja - 3,0g D(+) glicose - 2,5 g Cloreto de sdio - 5,0 g Fosfato de potssio bibsico - 2,5 g pH 7,3 0,1 84. Caldo soja triptona (TSB)- NaCl 10% - piruvato de sdio 1% Pesar o caldo TSB de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Adicionar 95,0 g de cloreto de sdio e 10,0 g de piruvato de sdio, por litro de meio a ser preparado. 85. Caldo telurito manitol glicina segundo Giolitti-Cantoni Pesar o meio caldo teluritomanitol-glicina de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Homogeneizar at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir 19 mL em tubos com tampa de rosca. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica do caldo telurito manitol glicina dever ser a seguinte, por litro de meio: Triptona - 10,0 g Extrato de carne - 5,0 g Extrato de levedura - 5,0 g Cloreto de ltio (N/I).- 5,0 g D - manitol - 20,0 g Cloreto de sdio - 5,0 g Glicina - 1,2 g Piruvato de sdio - 3,0 g pH 6,9 0,2 (N) - nocivo por ingesto (I) - irrita os olhos e a pele No momento da utilizao, adicionar 0,1 mL de uma soluo de telurito de potssio a 1% a cada tubo de meio. OBS. O meio base (sem a adio de telurito de potssio) pode ser armazenado por duas semanas sob refrigerao. 86. Caldo tetrationato Pesar o caldo tetrationato base de acordo com o volume de meio a ser preparado,

respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Aquecer brevemente, at 60C no mximo, e resfriar rapidamente. Distribuir assepticamente em tubos estreis. Identificar, datar e armazenar adequadamente. No autoclavar. A composio do caldo tetrationato base dever ser a seguinte, por litro de meio: Peptona de casena - 2,5 g Peptona de carne - 2,5 g Mistura de sais biliares - 1,0 g Carbonato de clcio - 10,0 g Tiosulfato de sdio - 30,0 g pH 8,4 0,2 No momento do uso, adicionar 20 mL de soluo iodoiodeto e 10 mL de soluo verde brilhante a 0,1%, por litro de meio. OBS. Ao dispensar o meio, certifique-se de que qualquer precipitado formado esteja suspendido. Este meio apresenta-se turvo e verde, com sedimento branco de carbonato de clcio. 87. Caldo Triptose Fosfato (TPB) Pesar o caldo TPB de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Aquecer, se necessrio, at no mximo 60C, para completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes conforme a necessidade. Identificar e datar. Autoclavar a 115 1C por 10 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica do Caldo Triptose Fosfato dever ser a seguinte, por litro de meio: Triptose - 20,0 g Glicose - 2,0 g Cloreto de sdio - 5,0 g Fosfato de sdio bibsico - 2,5 g pH 7,3 0,2 88. Caldo uria Pesar o caldo uria de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Homogeneizar at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Esterilizar por filtrao, distribuindo volumes de cerca de 3 mL diretamente em tubos estreis. Identificar, datar e armazenar adequadamente.

A composio bsica do caldo uria dever ser a seguinte, por litro de meio: Extrato de levedura - 0,1 g Fosfato de potssio monobsico - 9,1 g Fosfato de sdio bibsico - 9,5 g Uria - 20,0 g Vermelho de fenol - 0,1 g pH 6,8 0,1 89. Caldo Verde brilhante bile lactose 2% Pesar o caldo Verde brilhante bile lactose 2%, de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado e adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Agitar at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de 10 mL em tubos de ensaio com tubos de Durhan invertidos. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. A composio bsica de caldo Verde brilhante-bile 2%-lactose dever ser a seguinte, por litro de meio: Peptona - 10,0 g Lactose - 10,0 g Bile Bovina - 20,0 g Verde brilhante (N).- 0,0133 g pH 7,4 0,2 (N) - nocivo por ingesto 90. Caldo Verde brilhante-bile-lactose 2% - MUG (BRILAMUG) Pesar o caldo Brila-MUG de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Misturar at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de 10 mL em tubos de ensaio com tubos de Durhan invertidos. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica do caldo Brila-MUG dever ser a seguinte, por litro de meio: Peptona - 10,0 g Lactose - 10,0 g L-triptofano - 1,0 g Bile concentrado - 20,0 g Verde brilhante (N).- 0,0133 g 4 - Metilumbeliferil - - D- glicurondeo - 0,1 g pH 7,2 0,1 (N) - nocivo por ingesto 91. Caldo vermelho de fenol - base (para fermentao de carboidratos)

Pesar o caldo vermelho de fenol - base de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Agitar at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de 90 mL em frascos. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos ou esterilizar por filtrao aps a adio da soluo de carboidrato. A composio bsica de caldo vermelho de fenol base dever ser a seguinte, por litro de meio: Proteose peptona - 10,0 g Extrato de carne - 1,0 g Cloreto de sdio - 5,0 g Vermelho de fenol - 0,018 g pH 7,4 0,2 Adicionar aos frascos com 90 mL de meio autoclavado e resfriado a 45-50C 10 mL de soluo de carboidrato esterilizada por filtrao; caso se opte por no autoclavar o meio base, adicionar a soluo de carboidrato e esterilizar a mistura por filtrao. As solues de carboidratos devero estar em concentrao final de 5,0 a 10,0 g por litro de meio. O preparo das solues de carboidratos poder ser verificada no captulo Reagentes e Solues, deste Anexo. Distribuir em tubos, de acordo com a necessidade. Tampar e identificar os tubos. Manter sob refrigerao at o momento do uso. 92. Caldo Vermelho de fenol sal 3% Preparar o caldo vermelho de fenol base de acordo com o indicado, adicionando 30 g de cloreto de sdio por litro de meio. 93. Caldo vermelho de fenol sal 3%-lisina Preparar o caldo vermelho de fenol-sal de acordo com o indicado. Adicionar 1 mL de soluo de lisina a 10% esterilizada por filtrao a cada tubo com 10 mL de meio bsico. 94. Caldo VM-VP Pesar o caldo VM-VP de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Agitar at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de 10 mL em tubos de ensaio. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. A composio bsica de caldo VM-VP dever ser a seguinte, por litro de meio: Proteose peptona - 7,0 g Glicose - 5,0 g

Fosfato de potssio bibsico - 5,0 g pH 6,9 0,2 95. Meio gelatina Pesar o gar gelatina, de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante ou compondo a formulao. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Deixar em repouso por cerca de 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo. Distribuir volumes de acordo com a necessidade. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica do gar gelatina dever ser a seguinte, por litro de meio: Peptona de carne - 5,0 g Extrato de carne - 3,0 g Gelatina - 120,0 g pH 6,9 0,1 96. Meio gelatina sal 3% Preparar o gar gelatina de acordo com o item anterior, adicionando 30 g de cloreto de sdio por litro de meio. 97. Meio leite com ferro Preparar uma soluo 2% de sulfato ferroso heptahidratado e adicionar, lentamente, 50 mL desta soluo a um litro de leite integral. Autoclavar a 118 1C durante 12 minutos. Observao: este meio deve ser preparado imediatamente antes do uso. A composio bsica do meio leite com ferro dever ser a seguinte: Leite integral - 1000 mL Sulfato ferroso heptahidratado - 1,0 g gua destilada - 50 mL 98. Meio lactose-gelatina Pesar os componentes de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo estabelecida na formulao abaixo descrita. Suspender os componentes no volume de gua destilada/deionizada. Deixar em repouso por 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo. Distribuir em tubos. Autoclavar a 121 1C por 10 minutos. Antes do uso colocar o meio em banho-maria a 50-70C por 2 horas para eliminar o oxignio. A composio bsica do meio lactose gelatina dever ser a seguinte, por litro de meio: Triptose - 15,0 g

Extrato de levedura - 10,0 g Lactose - 10,0 g Vermelho fenol - 0,05 g Gelatina - 120,0 g pH 7,5 0,2 99. Meio O/F (Hugh-Leifson) sal 3% Pesar o meio OF glicose de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante, adicionando 30 g de cloreto de sdio por litro de meio a ser preparado. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar repousar por 15 minutos. Aquecer, sob agitao, at completa dissoluo do meio. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de 4 mL em tubos de ensaio. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. A composio bsica de meio OF glicose dever ser a seguinte, por litro de meio: Triptona - 2,0 g Cloreto de sdio - 5,0 g Fosfato de potssio bibsico - 0,3 g Azul de bromotimol - 0,08 g Glicose - 10,0 g Agar - 2,0 g pH 6,8 0,2 100. Meio SIM Pesar o meio SIM de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por cerca de 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de 10 mL em tubos. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. A composio bsica do meio SIM dever ser a seguinte, por litro de meio: Peptona de casena - 20,0 g Peptona de carne - 6,6 g Citrato de amnio e ferro III - 0,2 g Tiosulfato de sdio - 0,2 g gar - 3,0 g pH: 7,3 0,1 101. Meio tioglicolato Pesar o meio tioglicolato de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a

proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Homogeneizar. Deixar em repouso por cerca de 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de 10 mL em tubos. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. OBS.: Algumas marcas deste meio, vendidas na forma desidratada, no incluem o gar em sua formulao. Nesses casos, dever ser adicionada quantidade de gar que, no meio pronto, corresponda a 0,75 g/L. A composio bsica do meio tioglicolato dever ser a seguinte, por litro de meio: Peptona casena - 15,0 g Extrato de levedura - 5,0 g D(+) glicose - 5,5 g L(+) cistena - 0,5 g Cloreto de sdio - 2,5 g Tioglicolato de sdio - 0,5 g Resazurina sdica - 0,001 g Agar - 0,75 g pH 7,2 0,2 102. Soluo salina 0,85% Pesar 8,5 g de cloreto de sdio. Transferir para um recipiente adequado. Adicionar 1L de gua destilada/deionizada. Agitar com auxlio de basto de vidro at dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir de forma a garantir o volume desejado aps a autoclavao. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Identificar, datar e armazenar adequadamente. 103. Soluo salina 2% Pesar 20,0 g de Cloreto de sdio. Transferir para um recipiente adequado. Adicionar 1L de gua destilada/deionizada. Agitar com auxlio de basto de vidro at dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir de acordo com a utilizao, de forma a garantir o volume desejado aps a autoclavao. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Identificar, datar e armazenar adequadamente. 104. Soluo salina fosfatada tamponada pH 7,2 (PBS)

Preparo das solues estoque: Soluo fosfato de potssio monobsico (KH2PO4) 0,15M Dessecar o KH2PO4 a 110C por 1 (uma) hora. Pesar 20,41g do sal e dissolver em gua deionizada. Completar o volume para 1000 mL em balo volumtrico. Soluo fosfato de sdio bibsico (Na2HPO4) 0,15M Dessecar o Na2HPO4 a 130C por 2 (duas) horas. Pesar 21,29g do sal e dissolver em gua deionizada. Completar o volume para 1000 mL em balo volumtrico. A composio bsica da soluo salina fosfatada tamponada dever ser a seguinte, por litro: Cloreto de sdio - 1,7 g Soluo fosfato de potssio monobsico 0,15M - 24 mL Soluo de fosfato de sdio bibsico 0,15 M - 76 mL gua destilada/deionizada - qsp 1000 mL pH 7,2 0,2 Distribuir volumes conforme a necessidade. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. 105. Soluo salina peptonada 0,1% Pesar separadamente os seguintes componentes: Cloreto de sdio - 8,5 g Peptona - 1,0 g gua destilada/deionizada - 1000 mL pH 7,0 0,2 Transferir para recipiente adequado. Agitar com auxlio de basto de vidro at dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir de forma a garantir o volume desejado aps a autoclavao. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. 106. Soluo salina peptonada 0,1%-sal 3% Seguir o procedimento do item anterior, adicionando 30 g de Cloreto de sdio por litro de soluo. 107. Soluo salina peptonada 1% tamponada (ISO 6579, 1993) Pesar, separadamente, os ingredientes de acordo com a formulao,respeitando a proporo adequada para o volume de meio a ser preparado. Transferir para um recipiente adequado e adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Agitar com auxlio de basto de vidro at completa dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir 225 mL em frascos erlenmeyer com capacidade para 500 mL. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. A composio bsica da soluo Salina peptonada 1% tamponada dever ser a seguinte, por litro:

Peptona de carne - 10,0 g Cloreto de sdio - 5,0 g Fosfato de sdio bibsico anidro (Na2HPO4) - 3,5 g Fosfato de potssio monobsico anidro (KH2PO4) - 1,5 g pH 7,0 0,2 108. Soluo salina peptonada 1% tamponada, adicionada de 0,02% de tween 20 Preparar o meio de acordo com o descrito para soluo salina peptonada 1% tamponada. A cada litro da soluo, adicionar 0,2 mL de Tween 20 (concentrao final 0,02%). Distribuir alquotas de 100 mL em frascos. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. 109. Soluo salina peptonada 1% tamponada adicionada de 1% de tween 80 Preparar o meio de acordo com o descrito para soluo Salina peptonada 1% tamponada. A cada litro da soluo, adicionar 10,0 mL de Tween 80 (concentrao final 1%). Distribuir alquotas de 225 mL em frascos e tampar. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente. 110. Soluo salina peptonada 1% tamponada, adicionada de vancomicina, cefsulodin e cefixime Preparar a soluo salina peptonada 1% tamponada (ISSO 6579, 1993) conforme descrito no item anterior. Transferir para um recipiente adequado e adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente. Imediatamente antes do uso, adicionar, a cada litro de meio, as solues abaixo relacionadas, esterilizadas por filtrao: 1 mL de soluo de vancomicina a 0,8%; 1 mL de soluo de cefixime a 1%; 1 mL da soluo de cefsulodin a 1%. REAGENTES E SOLUES GRUPOS DE RISCO DAS SUBSTNCIAS Como medida de segurana, as substncias componentes das solues e reagentes constantes do Anexo IX esto sinalizados com uma letra, indicando o grupo de risco ao qual pertencem, sendo: N = nocivo; I = irritante; T = txico; H = hidropoluente; P = perigoso para o meio ambiente; C = corrosivo;

O = oxidante; F = inflamvel; E = explosivo; M = mutagnico. Recomenda-se que, antes da manipulao e descarte das referidas substncias, sejam consultadas as fichas prprias de cada substncia ou os manuais de segurana, visando ao reconhecimento dos principais riscos inerentes e das medidas indispensveis para prevenir ou evitar a ocorrncia de acidentes e minimizar os danos sade do usurio e ao meio ambiente. Quando houver manipulao de materiais corrosivos, usar sempre luvas adequadas e mscaras; sendo material txico, utilizar sempre a cabine qumica. CONVENES As solues preparadas por meio da dissoluo do reativo em lcool, seguida ou no da adio de gua destilada/deionizada, neste anexo sero denominadas como soluo alcolica. Ex.: Alfa-naftol soluo alcolica 5%. As solues preparadas por meio da dissoluo do reativo em gua destilada/deionizada, neste anexo sero denominadas como soluo aquosa. Ex.: Novobiocina soluo aquosa 4%. As solues preparadas por meio da dissoluo do reativo em meio alcalino ou cido, neste anexo sero acompanhadas da indicao do diluente usado para sua preparao. Ex.: cido nalidxico soluo 2% em NaOH 0,1 N. Alfa-naftilamina soluo 0,5% em cido actico 5N. Onde houver a indicao Esterilizar por Filtrao utilizar filtro com membrana de 0,22 micrmetros previamente preparado e esterilizado. PREPARO DE REAGENTES E SOLUES 1. cido actico 5N Adicionar 28,75 mL de cido actico glacial(C/F) a 71,25 mL de gua destilada/deionizada. Armazenar em frasco de vidro. Identificar e datar. (C) - corrosivo / provoca queimaduras graves (F) - inflamvel 2. cido clordrico 0,01N Adicionar a 10 mL de cido clordrico 0,1N quantidade de gua destilada/deionizada suficiente para completar 100 mL. Usar vidraria volumtrica para a preparao. Armazenar em frasco de vidro. Identificar e datar. 3. cido clordrico 0,1N Adicionar a 10 mL de cido clordrico 1N quantidade de gua destilada/deionizada suficiente para completar 100 mL. Usar vidraria volumtrica para a preparao. Armazenar em frasco de vidro.

Identificar e datar. 4. cido clordrico 1N Dissolver 82,3 mL de cido clordrico fumegante(C/I) (concentrao 37%) em volume de gua destilada/deionizada suficiente para completar 1000 mL. Armazenar em frasco de vidro. Identificar e datar. (C) - corrosivo / provoca queimaduras (I) - irrita as vias respiratrias 5. cido nalidxico soluo 0,1% em PBS pH 7,2 Transferir 10 mL da soluo de cido nalidxico 1% para balo volumtrico de capacidade para 100 mL e completar o volume com tampo fosfato pH 7,2. Esterilizar por filtrao. Distribuir em alquotas de 20 mL, em frascos de vidro estreis identificados e datados. Manter a -20C por at 6 meses. Manter uma das alquotas sob refrigerao, para uso dirio. Usar 1 mL desta soluo para cada 100 mL de gar ABL. 6. cido nalidxico soluo 1% em NaOH 0,1N Pesar 1,0 g de cido nalidxico(N), colocar em balo volumtrico de 100 mL e adicionar NaOH 0,1 N, agitando para dissoluo, at completar o volume. Distribuir em frasco plstico identificado e datado, e manter protegido da luz. 7. cido nalidxico soluo 2% em NaOH 0,1 N Pesar 2,0 g de cido nalidxico(N), colocar em balo volumtrico de 100 mL e adicionar NaOH 0,1 N, agitando para dissoluo, at completar o volume. Distribuir em alquotas de 10 mL, em frascos plsticos identificados e datados, protegidos da luz. Manter a -20C por at 12 meses. Manter uma das alquotas sob refrigerao para utilizao diria. (N) - nocivo por ingesto 8. cido peractico soluo aquosa 0,02% Diluir 6,5 mL de cido peractico(C/I/E) (produto comercial a 15%) em 5 litros de gua destilada/deionizada. Manter em frasco de plstico identificado e datado. Utilizar a soluo preparada, no mximo, em 48 horas. (C) - corrosivo / provoca queimaduras (I) - irritante para o aparelho respiratrio, pele e olhos (E) - potencialmente explosivo 9. cido pipemdico soluo 0,2% em PBS pH 7,2 Transferir 10 mL da soluo de cido pipemdico 2% para balo volumtrico de capacidade 100 mL e completar o volume com tampo fosfato pH 7,2. Esterilizar por filtrao. Distribuir em alquotas de 20 mL, em frasco de vidro estril identificado e datado. Manter a -20C por at 6 meses.

Manter uma das alquotas sob refrigerao, para uso dirio. Usar 1 mL desta soluo para cada 100 mL de gar ABL. 10. cido pipemdico soluo 2% em NaOH 0,1N Pesar 2,0 g de cido pipemdico e adicionar NaOH 0,1N at que se dissolva completamente. Transferir para balo volumtrico de capacidade para 100 mL e completar o volume com NaOH 0,1N. Distribuir em frasco plstico identificado e datado, e manter protegido da luz, sob refrigerao. 11. cido sulfanlico soluo 0,8% em cido actico 5N Dissolver 0,8 g de cido sulfanlico(N) em 100 mL de cido actico 5N. Manter em frasco de vidro, protegido da luz, sob refrigerao. (N) - nocivo por ingesto, por inalao e por contato com a pele 12. cido tartrico soluo aquosa 10% Pesar 10 gramas de cido tartrico(I). Transferir para um recipiente adequado. Adicionar 90 mL de gua destilada/deionizada. Agitar com auxlio de basto de vidro at dissoluo. Esterilizar por filtrao. Distribuir em frasco de vidro estril. Identificar, datar e manter sob refrigerao, protegido da luz. (I) - irrita a pele 13. Acriflavina soluo aquosa 0,25% Pesar 0,25 g de acriflavina(T) em frascos separados com capacidade para 100 mL. Completar os volumes a 100 mL com gua destilada/deionizada. Esterilizar por filtrao. Distribuir em frasco de vidro estril. Identificar, datar e manter sob refrigerao, por at 4 semanas. (T) - txico por ingesto e por inalao 14. Acriflavina soluo aquosa 1% Pesar 1,0 g de acriflavina(T) em frasco apropriado. Completar o volume para 100 mL com gua destilada/deionizada. Esterilizar por filtrao. Distribuir em frasco mbar estril. Identificar, datar e manter sob refrigerao por at 4 semanas. (T) - txico por ingesto e por inalao 15. Acriflavina soluo aquosa 2% Pesar 2,0 g de acriflavina(T) em frasco apropriado. Completar o volume para 100 mL com gua destilada/deionizada. Esterilizar por filtrao. Distribuir em frasco de vidro estril. Identificar, datar e manter sob refrigerao, por at 4 semanas. (T) - txico por ingesto e por inalao

16. Alfa-naftilamina soluo 0,5% em cido actico 5N Dissolver 0,5 g de alfa-naftilamina(T) em 100 mL de cido actico 5N. Identificar, datar e manter sob refrigerao, protegido da luz. (T) - txico por ingesto e por contato com a pele 17. Alfa-naftol soluo alcolica 5% Pesar 5,0 g de alfa-naftol(N/I) e dissolver em 100 mL de etanol. Identificar, datar e manter sob refrigerao, protegido da luz. (N) - nocivo por contato com a pele e por ingesto (I) - irrita as vias respiratrias e a pele / risco de leses oculares graves 18. Azul de toluidina soluo aquosa 1% Pesar 1,0 grama de azul de orto-toluidina. Transferir para um recipiente adequado. Adicionar 100 mL de gua destilada/deionizada. Agitar com auxlio de basto de vidro at dissoluo. Identificar, datar e armazenar sob refrigerao, protegido da luz. 19. Carboidratos-solues Para as provas de fermentao de carboidratos, recomenda-se o uso das solues nas concentraes de 5,0 g ou 10 g por litro de meio. Arabinose 10%; Glicose 10%; Manitol 10%; Maltose 10%; Rafinose 10%; Ramnose 5%; Sacarose 10%; Xilose 5%I. Dissolver 5 ou 10 g do carboidrato desejado em 100 mL gua destilada/deionizada. Esterilizar por filtrao. Distribuir volumes de 10 ou 20 mL em frascos estreis. Identificar e datar adequadamente. Manter sob refrigerao. 20. Cefixime soluo aquosa 1% Dissolver 1,0 g de cefixime em 100 mL de gua destilada/deionizada. Esterilizar por filtrao. Distribuir em alquotas de 10 mL, em frasco de vidro estril identificado e datado, protegido da luz. Manter a -20C por at 2 meses. Manter uma das alquotas sob refrigerao, para utilizao diria. 21. Cefsulodin soluo aquosa 1% Dissolver 1,0 g de cefsulodin em 100 mL de gua destilada/deionizada. Esterilizar por filtrao. Distribuir em alquotas de 10 mL, em frasco de vidro estril identificado e datado, protegido da luz. Manter a -20C por at 2 meses. Manter uma das alquotas sob refrigerao, para utilizao diria.

22. Cicloserina soluo aquosa 5% Pesar 1,0 g de cicloserina e dissolver em 20 mL de gua destilada/deionizada. Esterilizar por filtrao. Identificar, datar e armazenar sob refrigerao, protegido da luz. 23. Cloreto de clcio 1 M Dissolver 11,09 g de CaCl2 (I) p.a em 100 mL de gua destilada/deionizada, usando balo volumtrico. Esterilizar por filtrao. Distribuir em alquotas de 10 mL, em frasco de vidro estril identificado e datado. Manter em temperatura ambiente. Usar 1 mL/100 mL de meio para obter uma concentrao final de 10mmol de cloreto de clcio. (I) - irritante para o aparelho respiratrio, pele e olhos 24. Cloreto frrico soluo aquosa 10% (prova de TDA) Pesar 10,0 g de cloreto frrico(C) frasco adequado. Adicionar quantidade de gua destilada/deionizada suficiente para completar 100 mL. Identificar, datar e armazenar sob refrigerao. (C) - corrosivo 25. Cloreto de Magnsio 40% Cloreto de Magnsio - 40,0 g gua destilada ou deionizada q.s.p. - 100 mL 26. Cloreto de Potssio 0,1N Cloreto de Potssio - 7,5 g gua destilada ou deionizada q.s.p. - 1000 mL Acidificar a pH 4,0 com soluo de HCl 1N 27. Cloreto de Potssio 3 M Cloreto de Potssio - 24,4 g gua destilada ou deionizada q.s.p. - 100 mL Dessecar o KCl em estufa a 110C por 2 horas. Acrescentar a gua destilada/deionizada fervida. 28. Desoxicolato de sdio soluo 0,5% Pesar separadamente, em recipiente adequado, os seguintes componentes: Cloreto de sdio - 0,85 g Desoxicolato de sdio - 0,5 g Adicionar 100 mL de gua destilada/deionizada. Agitar at a completa dissoluo. Esterilizar por filtrao, em membrana filtrante de 0,22 m. Armazenar sob refrigerao. 29. Emulso de gema de ovo 50% No havendo emulso comercialmente disponvel, escolher ovos com casca perfeita e

lavar com gua morna. Secar, imergir em etanol a 70GL durante cerca de 10 minutos ou em soluo de cido peractico a 0,02% por cerca de 15 minutos. Secar com toalha estril. Quebrar a casca assepticamente e separar a gema da clara, transferindo a gema para frasco estril. Adicionar o mesmo volume de soluo salina 0,85%. Misturar bem, at a completa homogeneizao da soluo. Pasteurizar a emulso obtida durante 30 minutos a 63 2C em banho-maria, com agitao suave e freqente. Realizar o controle de esterilidade da emulso de gema de ovo conforme abaixo especificado: Inocular 0,1 mL da emulso de gema de ovo em um tubo contendo caldo BHI. Incubar a 36 1C por 48 horas. Aps incubao, repicar com ala para a superfcie seca de gar Baird Parker e PCA incubar a 36 1C por 48 horas. Verificar a presena de crescimento bacteriano. Em caso de crescimento, descartar a emulso. 30. Eritrcitos lavados de carneiro A partir de sangue de carneiro desfibrinado, fazer tripla lavagem dos eritrcitos com PBS pH 7,2 estril, centrifugando a 14.000 rpm por 30 minutos a cada lavagem. Re-suspender em volume de PBS igual ao volume original de sangue. Identificar, datar e armazenar sob refrigerao. 31. Etanol 70% (Etanol 70o GL) Adicionar 271 mL de gua destilada a 729 mL de etanol(F) 96 GL. Armazenar em frasco de plstico, identificar e datar. (F) - facilmente inflamvel 32. Hidrxido de potssio soluo aquosa 40% Pesar 40 g de hidrxido de potssio (KOH)(C) e dissolver em 100 mL de gua destilada/deionizada. Identificar, datar e manter em frasco plstico, em temperatura ambiente. (C) - corrosivo / provoca queimaduras graves 33. Hidrxido de sdio soluo aquosa 1N Pesar 40g de hidrxido de sdio(C) em recipiente adequado e adicionar quantidade de gua destilada/deionizada suficiente para completar 1000 mL. Identificar, datar e manter em frasco plstico, em temperatura ambiente. (C) - corrosivo / provoca queimaduras graves 34. Hidrxido de sdio soluo aquosa 40% Pesar 40g de hidrxido de sdio(C) em recipiente adequado e adicionar quantidade de gua destilada/deionizada suficiente para completar 100 mL. Identificar, datar e manter em frasco plstico, em temperatura ambiente. (c) - corrosivo / provoca queimaduras graves

35. Novobiocina soluo aquosa 1,25% Dissolver 1,25 g de novobiocina em volume de gua destilada/deionizada suficiente para completar 100 mL. Esterilizar por filtrao e manter protegido da luz, sob refrigerao. Utilizar a soluo por at um ms do preparo. 36. Novobiocina soluo aquosa 4% Dissolver 4,0 g de novobiocina em volume de gua destilada/deionizada suficiente para completar 100 mL. Esterilizar por filtrao e manter protegido da luz, sob refrigerao. Utilizar a soluo por at um ms do preparo. 37. Oxitetraciclina soluo 1% (para gar OGY) Pesar 500 mg de Oxitetraciclina. Transferir para balo volumtrico de 50 mL de capacidade. Completar o volume com cido clordrico (HCl) 0,1 N. Agitar com auxlio de basto de vidro at dissoluo. Esterilizar por filtrao. Distribuir 10 mL em frascos de vidro estril. Identificar e datar. Manter a -20C, protegido da luz. Manter uma alquota sob refrigerao para o trabalho rotineiro, protegida da luz. 38. Perxido de hidrognio soluo aquosa 3% (10V) O perxido de hidrognio 3% pode ser adquirido em farmcias ou pode-se preparar a soluo 3% a partir de perxido de hidrognio(C/I/E) 20V ou 100V conforme abaixo: A partir de perxido de hidrognio(C/I/E) 100V (= 30%): pesar 10g do perxido e diluir para 100 mL com gua destilada/deionizada. Perxido de hidrognio(C/I/E) 20V (= 6%): medir em proveta 50 mL do perxido e completar o volume a 100 mL com gua destilada/deionizada. Identificar e datar. Manter sob refrigerao, protegida da luz. (C) - corrosivo / provoca queimaduras (I) - extremamente irritante s vias respiratrias e olhos (E) - potencialmente explosivo 39. Prpura de bromocresol soluo alcolica 1,6 % Adicionar a 1,6 g de prpura de bromocresol quantidade de etanol suficiente para completar 100 mL. Identificar e datar. Manter sob refrigerao, protegido da luz. Manter sob refrigerao. 40. Reagentes para a colorao de esporos Soluo A. Verde malaquita soluo aquosa 5% Verde malaquita(N).- 2,5 g gua destilada ou deionizada - 50 mL (N) - nocivo por contato com a pele e por ingesto Misturar e deixar em repouso durante uma noite para dissolver. Identificar, datar e armazenar protegido da luz. Soluo B. Safranina soluo alcolica 2,5%

B.1. Soluo estoque Safranina O - 50 g Etanol(95%)(F) - 2000 mL (F) - facilmente inflamvel Identificar, datar e armazenar protegido da luz. B.2. Soluo de trabalho Soluo estoque de safranina O - 300 mL gua destilada ou deionizada - 2700 mL Identificar, datar e armazenar protegido da luz. 41. Reagentes para colorao de Gram A. Cristal violeta fenicada soluo alcolica 4% Soluo A1: Cristal violeta(N/I/H/P) - 0,4 g lcool (F) - 10 mL (N) - nocivo por ingesto (I ) - pode causar leses oculares graves (H) - muito txico para os organismos aquticos (P) - a longo prazo pode causar efeitos negativos no meio ambiente aqutico (F) - facilmente inflamvel Soluo A.2: Fenol fundido(T/C) - 1 g gua destilada ou deionizada - 100 mL (T) - txico por contato com a pele e por ingesto (C) - corrosivo / provoca queimaduras Misturar A.1 e A.2. Identificar, datar e armazenar protegido da luz. Usa-se, no diluda, na colorao de Gram. B. Soluo aquosa de lugol B.1. Soluo estoque Cristais de iodo(N/I) (ou iodo ressublimado(N/I)) - 25 g Iodeto de potssio - 50 g gua destilada ou deionizada - 500 mL (N) - nocivo por inalao (I) - irrita a pele, olhos e mucosas Misturar e deixar em repouso at dissoluo. B.2. Soluo de trabalho Soluo estoque de lugol - 100 mL gua destilada ou deionizada - 1400 mL Identificar, datar e manter protegido da luz. C. Fucsina fenicada

Fucsina bsica - 1,0 g lcool a 95(F) - 10 mL Fenol fundido(T/C) - 5,0 g gua destilada ou deionizada - 100 mL (F) - facilmente inflamvel (T) - txico por contato com a pele (C) - corrosivo / provoca queimaduras Identificar, datar e manter protegido da luz 42. Reativo de Kovacs Pesar 5,0 g de para-dimetil-amino-benzaldedo em recipiente adequado. Dissolver em 75 mL de lcool isoamlico. Adicionar 25 mL de cido clordrico. Identificar, datar e manter protegido da luz, sob refrigerao. 43. Reativo de Ehrlich Pesar 2,0 g de para-dimetil-amino-benzaldedo em recipiente adequado. Dissolver em 190 mL de lcool etlico (absoluto). Adicionar 40 mL de cido clordrico concentrado. 44. Reativo para Oxidase I - N,N,N,N-tetrametil-parafenilenodiamina. Dissolver 0,5g de N' N' N' N' - tetrametil-parafenilenodiamina em 50 mL de gua destilada/deionizada. Distribuir volumes de 5 mL em frascos de cor mbar ou envoltas em papel alumnio. Identificar e datar. Manter a -20C. A alquota em utilizao deve ser mantida sob refrigerao, protegida da luz. No utilizar o reativo se este apresentar colorao azul. 45. Reativo para Oxidase II - Oxalato de para-amino-dimetilanilina Pesar 0,5g de oxalato de paramino-dimetilanilina(N/H), em recipiente apropriado. Adicionar 50 mL de gua destilada/deionizada. Agitar at completa dissoluo. Distribuir volumes de 5 mL em frascos de cor mbar ou envoltas em papel alumnio. Identificar e datar. Manter a -20C. A alquota em utilizao deve ser mantida sob refrigerao, protegida da luz. No utilizar o reativo se este apresentar colorao vermelha ou marrom. 46. Sangue desfibrinado de carneiro, coelho, cobaio ou cavalo Coletar o sangue em frasco com prolas de vidro (estreis), movimentando suavemente at que a fibrina fique aderida s prolas. Deixar repousar em temperatura ambiente por 1 a 2 horas. Separar o sangue desfibrinado e distribuir em frascos estreis. Guardar sob refrigerao. No utilizar sangue desfibrinado que apresente evidncias de contaminao ou hemlise. 47. Sangue de cavalo desfibrinado lisado Proceder como no item anterior, utilizando somente sangue recentemente colhido. Congelar por 1 a 2 dias. Para lisar e/ou manter, misturar e distribuir 100 mL em frascos de polipropileno estril. Congelar a -20C.

Descongelar e recongelar uma vez mais. O congelamento inibe a absoro de oxignio pela hemoglobina. Manter sob congelamento, descongelando a cada vez que necessite. Pode ser descongelado e recongelado vrias vezes. Usar o sangue por at 6 meses. 48. Soluo aquosa de iodo-iodeto Dissolver 8,0 g de iodo(N/I) e 10 g de iodeto de potssio em 40 mL de gua destilada/deionizada. Manter em frasco escuro, em local fresco. (N) - nocivo por inalao (I) - irrita a pele, olhos e mucosas 49. Telurito de potssio 3,5% Pesar 3,5 g de telurito de potssio(T/I). Transferir para um balo volumtrico de 100 mL. Adicionar aproximadamente 50 mL de gua destilada/deionizada. Agitar at completa dissoluo. Completar o volume com gua destilada/deionizada. Esterilizar por filtrao. Distribuir em frasco estril. Tampar adequadamente. Identificar, datar e armazenar sob refrigerao. Usar a soluo estocada entre 0 e 5C por 6 meses. (T) - txico por ingesto (I) - Irrita os olhos e a pele 50. Tiamina cloridrato soluo 0,01% Pesar 100mg de tiamina e transferir para o balo volumtrico de capacidade para 100mL e completar o volume com gua destilada/deionizada. Transferir 5mL da soluo de soluo 0,1% para um balo volumtrico de capacidade para 50mL e completar o volume com gua destilada/deionizada. Esterelizar por filtrao. Distribuir em frascos estereis. Manter protegida da luz, em refrigerao por at tres meses. 51. Tiosulfato de sdio 2% Tiosulfato de sdio 2,0g. gua destilada/deionizada q.s.p. 100mL 52. Tirosina suspenso aquosa 5% Pesar 5,0g de torosina em recipiente adequado. Adicionar 100mL de gua destilada/deionizada A tirosina no deve dissolver e, na soluo deixada, a tirosina deve decantar. Misturar bem de forma que a tirosina fique homogeneamente distribuda na suspenso e imediatamente distribuir volumes de 10mL em frascos apropriados. Tampar Esterelizar em autoclave a 121 1C por 15 minutos 53. Tween 80 Tween 80 80mL gua destilada/deionizada q.s.p. 1000mL Adicionar o Tween 80 gua morna, sob agitap. Cuidar quando acrescenter a gua.

54. Vancomicina soluo aquosa 0,8% Dissolver 200mg de vancomicina em 25mL de gua para laboratrio/deionizada. Esterelizar por filtrao. Dispensar em frasco de vidro estril Manter sob refrigerao, protegida da luz. 55. Vaselina Dissolver a vaselina em um copo de Becker sob fogo indireto usando tela de amianto, e distribuir em frascos de Erlemeyer na quantidade pedida. 56. Vaspar Composio por 1 Kg de vaspar: Vaselina slida 400g; Parafina 600g; Pesar separadamente a parafina e a vaselina ; Misturar as duas partes e dissolver no fogo indireto utilizando tela de amianto; Aquecer at completa fuso; Homogeneizar; Distribuir em frascos apropriados; Autoclavar a 121 1C por 45 minutos Identificar, datar e armazenar em temperatura ambiente 57. Verde brilhante soluo aquosa 0,1% Dissolver 0,1g de verde brilhante (N) quantidade de gua destilada/deionizada. Esterelizar por filtrao, dispensando em frasco adequado. Identificar e datar. Manter sob refrigerao, protegido da luz. (n) nocivo por ingesto 58. Verde malaquita, soluo aquosa 5% Adionar a 5,0g de verde malaquita (N) quantidade de gua destilada/deionizada suficiente para completar 100mL. Identificar, datar. Manter sob refrigerao protegido da luz. 59. Vermelho de fenol soluo aquosa 1% Dissolver 1,0g de vermelho de feno em 100mL de gua destilada/deionizada Identificar, datar. Manter sob refrigerao protegido da luz. 60. Vermelho de metila soluo alcoolica 0,06% Pesar 0,04 de vermelho de metila e dissolvar em 60mL de etanol absoluto (F). Identificar, datar. Manter protegido da luz em local fresco. (F) Facilmente inflamvel ESTE TEXTO NO SUBSTITUI O PUBLICADO NO DIRIO OFICIAL DA UNIO DE 18/09/2003, SEO 1, P.14.

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