UNIVERSIDAD DE COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMA DE BACTERIOLOGA Y LABORATORIO CLNICO DOCENTE: JOVANNA ACERO GODOY GUA DE PRCTICAS MICROBIOLOGA AMBIENTAL

PRACTICA N. 3. DIATOMEAS Y FILTRACIN DE MUESTRA DE AGUAS 1- Objetivos: Realizar la implementacin del protocolo para la toma de muestra para algas bentnicas. Determinar la presencia de algas bentnicas en aguas corrientes, correlacionndolo con el estado ecolgico del efluente. Identificar en el laboratorio los microorganismos presentes en las diferentes muestras y realizar su clasificacin taxonmica. Relacionar el grado de contaminacin fecal con la potabilidad del agua de consumo y dems. Determinar la presencia de bacterias de tipo coliformes por medio de la tcnica de filtracin por membrana de muestras de agua. Marco terico

2-

DIATOMEAS:

El termino fitobentos se refiere a los organismos auttrofos que viven asociados a cualquier sustrato del fondo en los ecosistemas acuticos, e incluye

cianobacterias, algas microscpicas (microalga), microalgas y macrfitos. El termino perifiton describe a la comunidad microbitica que vive sobre sustratos sumergidos de diferente naturaleza (sustratos duros, vegetacin acutica viva y muerta); e incluye microalgas, bacterias, hongos y protozoos. Diferentes grupos de algas forman partes del perifiton (diatomeas, cloroficeas, etc), as como las cianobacterias. El termino epliton, epifiton y epipelon se refiere a los sustratos que colonizan las algas, que son sustratos ptreos, vegetacin acutica y sedimento, respetivamente.

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El uso de microalgas bentnicas para evaluar la calidad del agua es una prctica habitual en muchos pases; se consideran tiles para la deteccin y seguimiento de las presiones debido a: eutrofizacin, incremento de materia orgnica, salinidad, acidificacin. La mayora de las microalgas son productores primarios y como tal corresponden a las variaciones de los nutrientes (especialmente del fsforo) en el agua; algunas pueden comportarse como organismos heterotrficos en aguas con aumentos de materia orgnica. Las comunidades de microalgas bentnicas responden al amento de nutrientes (principalmente P y N) en el agua, mediante cambios en su composicin que, en algunos casos, suponen la disminucin de la diversidad, y el aumento de la biomasa; de forma que cuando la masa de agua se eutrofiza los sustratos aparecen cubiertos de ptinas verdes o pardas de algas.

ndice de diatomeas: Las diatomeas son el grupo ms diverso de las microalgas bentnicas; suele constituir el 80-90% de la comunidad perifiton. Son cosmopolitas y sus requerimientos ecolgicos son conocidos para muchas de sus especies, y son los mismos en diferentes regiones geogrficas. Tienen como ventaja adicional la buena manipulacin y conservacin de las muestras, lo que se debe, en parte, al esqueleto de slice -el frstulo- de elevada resistencia y cuyas caractersticas morfolgicas son la base de la identificacin las especies. diatomeas se aplican normalmente en ros; Los ndices de

las diatomeas se consideran el

principal indicador dentro de los productores primarios en los ros.

COLIFORMES:

Debido a que un gran nmero de enfermedades son transmitidas por va fecal-oral utilizando como vehculo los alimentos y el agua, es necesario contar con microorganismos que funcione como indicador de contaminacin fecal. Estos

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deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener una sobrevivencia similar a la de los patgenos intestinales y debe de ser capaces de desarrollarse extra intestinalmente. El grupo coliforme es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, sin embargo, las caractersticas de sobrevivencia y la capacidad para multiplicarse fuera del intestino tambin se observan en aguas potables, por lo que el grupo coliforme se utiliza como indicador de contaminacin fecal en agua; conforme mayor sea el nmero de coliformes en agua, mayor ser la probabilidad de estar frente a una contaminacin reciente. Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no slo sobreviven, sino que se multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado distinto al que recibe en el agua. En productos

alimenticios que han recibido un tratamiento trmico (pasteurizacin, horneado, coccin, etc.), se utilizan como indicadores de malas prcticas sanitarias. Los microorganismos coliformes constituyen un grupo heterogneo con hbitat primordialmente intestinal para la mayora de las especies que involucra. El grupo de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos Gramnegativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con produccin de gas en un lapso mximo de 48 h. a 35C 1C. Este grupo est conformado por 4 gneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella. El grupo de coliformes fecales, est constituido por bacterias Gramnegativas capaces de fermentar la lactosa con produccin de gas a las 48 h. de incubacin a 44.5 0.1C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la ms prominente es Escherichia coli. La demostracin y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivo lquidos y slidos con caractersticas selectivas y diferenciales. Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado dentro de la familia Enterobacteriaceae (bacterias

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entricas), existe como comensal en el intestino delgado de humanos y animales. Sin embargo, hay algunas cepas de E. coli patgenas que provocan enfermedades diarreicas. Estas E. coli se clasifican con base en las caractersticas que presentan sus factores de virulencia nicos, cada grupo provoca la enfermedad por un mecanismo diferente. Las propiedades de adherencia a las clulas epiteliales de los intestinos grueso y delgado son codificadas por genes situados en plsmidos. De manera similar las toxinas son mediadas por plsmidos o fagos. Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli enterotoxignica (ETEC), E. coli enteropatgena (EPEC), E. coli

enterohemorrgica (EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) E. coli enteroadherente difusa (DAEC). Existen otras cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores, las 4 primeras estn implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua contaminados. Escherichia coli enterotoxignica ETEC es reconocida como el agente causal de la diarrea del viajero, la cual se caracteriza por diarreas acuosas con o sin fiebre. Este tipo de infecciones es muy frecuente en pases subdesarrollados y afecta principalmente a los nios. y alimentos

Patognesis: El microorganismo es capaz de producir dos tipos de toxina. Una toxina termolbil de aproximadamente 89 kDa cuya secuencia, antigenicidad y funcin es similar a la toxina del clera, la otra toxina que produce es termoestable y es de bajo peso molecular (4 kDa) y es capaz de resistir temperaturas de ebullicin hasta por 30 minutos. La infeccin puede ser adquirida por el consumo de alimentos como vegetales frescos (lechuga en ensaladas) y agua. La dosis infectiva para adultos ha sido

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calculada en aproximadamente 10 8

bacterias, por otra parte en jvenes y

ancianos la dosis infectiva puede ser ms baja.

3. Pre laboratorio: Realizar o llevar al laboratorio un atlas con las principales algas bentnicas, microalgas, protozoos, flagelados y dems, presentes en aguas. Defina y dibuje, que es el frstulo, valva, plaura o banda conectiva, cngulo, rafe dibjelo Revise un artculo cientfico donde se analicen coliformes por NMP y por filtracin de membrana.

4. Materiales y mtodos 1 Muestra de agua de ro bien conservada y en diferentes envases, correctamente rotuladas, por grupo. 1 muestra de agua potable. H2O2 peroxido de hidrgeno (estudiantes) Cepillo de dientes duro o cuchillo Frascos de vidrio Etiquetas Microscopios Laminas Laminillas Centrifuga

Pipetas automticas 100 a 1000 ul Puntas azules estriles Puntas amarillas estriles

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Equipo de filtracin por membrana para muestras con su respectivo set de cajas para hidratar y sembrar. 5. Laboratorio
Procedimiento de toma de muestra:

Seleccionar un segmento de ro donde pueda encontrarse un sustrato adecuado para la toma de muestra, debe tener unos 10 m de largo, realizar una descripcin detallada del lugar de muestreo; localizacin, anchura, profundidad, grado de sombra, temperatura, altura sobre el nivel del mar. Seleccin del sustrato: se recomienda muestrear comunidades

(superficiales, parduzcas resbaladizas) que se desarrollen sobre substratos duros estables situados en zonas sumergidas del lecho fluvial como rocas, piedras y cantos rodados de un tamao mnimo de 10x 10 cm. Evitar en la toma de muestras sustratos procedentes de zonas muy sombreadas, zonas emergidas, demasiado cercanas a las orillas; zonas debajo de puentes, con escasa corriente o excesiva corriente

preferiblemente del punto intermedio del ro.

Toma de muestra: Seleccionar como mnimo 5 piedras en zonas adecuadas (inundadas permanentemente, en zonas soleadas, y con aguas corrientes si las hay). Para realizar el muestreo, es conveniente situarse en el punto de mxima corriente e ir recorriendo el ro a contra corriente, para minimizar el efecto de la contaminacin. Eliminar cualquier tipo de contaminacin adherida a los sustratos (detritus orgnicos) limpiando un poco la superficie en la corriente de agua; si el sustrato est cubierto de algas filamentosas intentar desprenderlas.

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Cepillar (o raspar con una navaja) la superficie superior de los sustratos, evitando las superficies de erosin y sedimentacin- Superficie total de muestreo 100 cm2. Introducir el cepillo en el frasco de la muestra que contendr 50 ml de agua. Agitar suavemente, etiquetar y conservar.

Procedimiento en el laboratorio

Centrifugar la muestra en tubos de ensayo a los cuales se le agregar perxido de hidrgeno. Determinacin de las diatomeas: ste mtodo tiene como finalidad la identificacin de las diatomeas a nivel de especie (frente al ndice IDG, ndice Diatmico Genrico, que lleva a cabo la determinacin a nivel de gnero nicamente). Una vez realizada la preparacin de las muestras en el laboratorio, procederemos al contaje. Realizaremos el barrido de la preparacin con el microscopio de contraste de fase, utilizando el objetivo de 100x (es conveniente el uso de objetivo con micromtrico, ya que la identificacin es a nivel de especie y necesitamos que posea medida), aadiendo previamente una gota de aceite de inmersin en el portaobjetos. A medida que vamos realizando el barrido, vamos realizando la identificacin simultneamente, remitindonos a la gua de diversidad. Si el nmero de diatomeas contadas es menor que 400 despus de ver toda la preparacin, es necesario hacer una nueva preparacin a partir del agua de origen, con el fin de completar el contaje. FILTRACION POR MEMBRANA A partir de muestras originales realizar la filtracin por membrana de las mismas segn volmenes determinados y transferir los filtros a cajas de petri con agares que sern hidratados para luego realizar el recuento directo de UFC. Incubar las cajas a 37 C.

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6. Anlisis de resultados Realizar por medio del atlas llevado al laboratorio la correcta identificacin de las diatomeas obtenidas en muestras de agua con sus respectivos dibujos segn observacin en clase. Realice el recuento de UFC/ml una vez realizada la incubacin de muestras.

7. Post laboratorio Consulte y anexe un artculo cientfico en donde se determine la caracterizacin, cuantificacin o identificacin de diatomeas como ndice de calidad de aguas. En ingles superior al 2010.

8. Bibliografa Consultada por el estudiantes