XVII CONCURSO UNIVERSITARIO FERIA DE LAS CIENCIAS

CARTULA DE TRABAJO

Biologa
rea

Externa
Categora

Investigacin Experimental
Modalidad

"Regulacin de la expresin gentica de las protenas verde fluorescente y betalactamasa a travs de la insercin del plsmido pGLO en la bacteria E. coli como mecanismo de resistencia a la ampicilina."
Ttulo del trabajo

Aequorea victoria
Pseudnimo de integrantes

NDICE

NDICE
Abreviaturas.. 5 Resumen .7 Marco Terico Ingeniera Gentica8 Clonacin de genes..10 Secuencia de ADN10 Reaccin en cadena de polimerasa10 Biotecnologa .11 Animales transgnicos 11 Plantas transgnicas 11 Bacterias transgnicas 12 Transformacin bacteriana 12 GFP: protena verde fluorescente 13 Gentica Bacteriana 14 Plsmidos 16 Regulacin de la expresin gentica18 Beta-lactamasa y su resistencia a la Ampicilina 19 Regulacin del opern de la L-arabinosa en E. coli..20 Estudios de transformacin de E. coli con plsmidos.22

Planteamiento del problema25 Objetivo General27 Objetivos Especficos27 Hiptesis27 Material y Mtodos 28 Material 28 Accesorios 28 Mtodos Consideraciones previas.29. Consideraciones de seguridad 29 Preparacin del Agar29
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Preparacin de la arabinosa y ampicilina 30

Identificacin de las placas .30

Almacenaje de placas .31 Transformacin bacteriana 31 Preparacin de plsmidos pGLO 33 Transformacin en el laboratorio .33 Resultados . 39 Observaciones de los cultivos de origen.Determinacin del pre-fenotipo.. 39 Observacines de la transformacin gentica de E. coli 40 Eficiencia de la transformacin 41 1. Clculo total del nmero de colonias fluorescentes. 41 2. Determinacin de la cantidad de plsmido pGLO en el cultivo LB/amp/ara.42 Anlisis de Resultados 45 Conclusiones.49 Referencias51 Apndices. Apndice A Medios, soluciones y material biolgico empleado55 Apndice B Glosario de trminos.56 Apndice C Fotografas58

ABREVIATURAS

ABREVIATURAS EMPLEADAS
A: Adenina ADN: cido Desoxirribonucleico Amp: ampicilina araBAD: arabinosa BAD (genes BAD) araC: arabinosa C ARN: cido ribonucleico ATP: Adenosn Trifosfato Bla: Beta-lactamasa C: Citosina CaCl2: Cloruro de Calsio E. coli: Escherichia coli EcoRI: E. coli endonucleasa de restriccin 1 G: Guanina GFP: Protena Verde Fluorescente LB: Luria and Bertani (medio de cultivo) Mg: Magnesio Ori: Origen de replicacin pBAD: Promotor BAD PCR: Reaccin en Cadena de la Polimerasa pGLO: plsmido GLO T: Timina UV: Ultravioleta

RESUMEN

Regulacin de la expresin gentica de las protenas verde fluorescente y betalactamasa a travs de la insercin del plsmido pGLO en la bacteria E. coli como mecanismo de resistencia a la ampicilina RESUMEN
Un gen es un pedazo de cido desoxirribonucleico (ADN) el cual provee las instrucciones para producir una protena especfica, la cual da a un organismo una caracterstica particular. La transformacin gentica ocurre cuando una clula incorpora y expresa dentro de ella un nuevo pedazo de material gentico (ADN). Esta nueva informacin gentica muchas veces provee al organismo de una nueva caracterstica que se puede identificar luego de ocurrida la transformacin. Las bacterias dems de poseer un cromosoma grande, poseen pequeos pedazos circulares de ADN llamados plsmidos. ste es un fenmeno que ocurre de forma natural en muchas bacterias, pero la eficacia del proceso vara enormemente de unas especies a otras. Para que la transformacin tenga lugar, la bacteria tiene que encontrarse en el llamado estado de competencia, que ocurre en determinadas condiciones fisiolgicas; en este estado, la bacteria presenta alteraciones en su pared y membrana celulares, que permiten la entrada de cidos nucleicos en la clula. En el laboratorio se ha conseguido desarrollar tcnicas que inducen el estado de competencia en bacterias que no lo presentan de forma natural, como es el caso de E. coli. Estas tcnicas se basan en diversos tratamientos qumicos o fsicos que producen microporos en la clula, lo que permite la introduccin del ADN exgeno (transformacin) de modo bastante eficiente. Uno de los mtodos fsicos es el choque da calor, consistente en inducir cambios bruscos de temperatura para inducir la apertura de poros en la membrana de la bacteria hacindola permeable. Dicha competencia se puede inducir con tratamientos qumicos utilizando compuestos como el cloruro clcico. Hay que tener en cuenta sin embargo que tras estos tratamientos no todas las clulas del cultivo se hacen competentes. La transformacin en el laboratorio es una tcnica rutinaria de enorme utilidad, que nos permite introducir prcticamente cualquier plsmido en su forma circular o superenrollada en casi cualquier tipo de bacteria. La investigacin que se describe a continuacin conjunta los conocimientos tericos y prcticos de la ingeniera gentica que nos permiti llevar a cabo una transformacin bacteriana. El ADN del plsmido usualmente contiene genes para una o ms caractersticas para la supervivencia de la bacteria. En esta investigacin se introdujo el plsmido pGLO a la bacteria E.coli. El plsmido pGLO, contiene adems un gen que codifica para una protena que le confiere resistencia al antibitico ampicilina (beta-lactamasa) y un sistema especial de regulacin gentica que puede ser usado para el control de la expresin de la protena verde fluorescente (GFP) en clulas transformadas. El gen para la GFP puede ser activado o prendido en clulas transformadas al aadir el azcar arabinosa al medio de cultivo donde crecen las clulas. Se trabaj la seleccin de clones celulares con las caractersticas esperadas de la expresin o ausencia de expresin de los genes marcadores presentes en un plsmido recombinante y se estim la eficiencia de la transformacin.

Palabras clave:
pGLO, GFP, ingeniera gentica, transformacin bacteriana, plsmido, ADN, enzima de restriccin EcoRI, E. coli, resistencia a la ampicilina, sntesis de protenas, estado de competencia.

MARCO TERICO Ingeniera gentica

La ingeniera gentica es la tecnologa que involucra la manipulacin del ADN (cido Desoxirribonucleico) de un organismo para introducir ADN exgeno, es decir, ADN de otro organismo (Biggs, 2007). La manipulacin del material gentico de un organismo o del ADN en general, se puede lograr introduciendo o eliminando genes especficos. Un ejemplo de la ingeniera gentica, es la introduccin en varios organismos de un gen de una protena bioluminiscente llamada protena verde fluorescente (GFP, Green Fluorescent Protein por sus siglas en ingls). La GFP es una sustancia presente de manera natural en las medusas del ocano Pacfico norte llamadas Aequorea victoria, la cual emite una luz verde al exponerse a la luz ultravioleta (Tsien, 1998). Los organismos manipulados con dicho procedimiento se usan en varios procesos, como en el estudio de las expresiones de un gen particular, la investigacin de los procesos celulares, el estudio del desarrollo de cierta enfermedad o la seleccin de rasgos que podran ser benficos para los humanos (Ho, M.W, 1998). En general, la ingeniera gentica puede usarse en el aumento o disminucin de la expresin de genes especficos en organismos seleccionados. Esto tiene muchas aplicaciones, desde la salud humana hasta la agricultura. El genoma de un organismo es el ADN total presente en el ncleo celular. Para estudiar un gen especfico, pueden usarse herramientas especficas para manipular el ADN y aislar genes del resto del genoma. Dichas herramientas son: Enzimas de restriccin: Algunos tipos de bacterias contienen poderosas defensas contra los virus. Estas clulas contienen protenas llamadas enzimas de restriccin que reconocen y se unen a secuencias de ADN especficas. Una enzima de restriccin, tambin llamada endonucleasa, corta el ADN viral en fragmentos despus de penetrar la bacteria. Los cientficos usan las enzimas de restriccin como herramientas para aislar genes especficos o regiones del genoma (Rivera, 2009).

 EcoRI: La enzima EcoRI es una enzima de restriccin que usan ampliamente los cientficos (Rivera, 2009). EcoRI corta especficamente el ADN que contiene la secuencia GAATTC. Los extremos de dichos fragmentos se llaman extremos filosos porque contienen ADN de hebra sencilla complementario. Esta tcnica o la capacidad de algunas enzimas restrictivas de crear fragmentos con extremos filosos es importante porque dichos extremos pueden unirse a otros fragmentos de ADN con extremos filosos complementarios. No todas las enzimas de restriccin crean extremos filosos. Algunas producen fragmentos con extremos desafilados creados cuando la enzima corta justo entre las dos hebras. Esta clase de extremos no tienen regiones de ADN de hebra sencilla y pueden unirse a cualquier otro fragmento con extremos desafilados. Electroforesis en gel: Esta herramienta tiene una conexin con la fsica porque se usa una corriente elctrica para separar los fragmentos de ADN segn el tamao (Roth, 2004). Primero se cargan los fragmentos de ADN en el extremo de un gel cargado negativamente. Al aplicarse la corriente elctrica, los fragmentos de ADN se mueven hacia el extremo positivo del gel. Los fragmentos ms pequeos se desplazan mucho ms rpido que los grandes. El patrn creado en base al tamao del fragmento de ADN puede compararse con fragmentos de ADN conocidos para la identificacin. Al separarse los fragmentos de ADN por electroforesis en gel, pueden retirarse del gel los fragmentos de un tamao especfico y combinarse con fragmentos de ADN provenientes de otra parte. Esta molcula de ADN recin generada con ADN de fuentes distintas se conoce como ADN recombinante. Esta tecnologa permite el estudio individual de los genes. Se necesitan grandes cantidades de molculas de ADN recombinante para poder estudiarlas. Tpicamente, un portador llamado vector, transfiere el ADN recombinante a una clula bacteriana llamada husped. Los plsmidos y los virus son vectores de uso comn. Los plsmidos son molculas de ADN pequeas, circulares y de doble hebra, presentes de manera natural en las bacterias y clulas de levadura, que pueden usarse como vectores por su capacidad de cortarse con enzimas de restriccin (Biggs, 2007). Una enzima llamada ADN ligasa que las clulas de reparacin y replicacin de ADN usan normalmente, une

qumicamente los dos fragmentos de ADN. La ligasa une tanto los fragmentos de ADN con extremos filosos como los desfilados.

Clonacin de genes
Para producir una gran cantidad de ADN plsmido recombinante, las clulas bacterianas se mezclan con ADN plsmido recombinante mediante un proceso conocido como transformacin. Las clulas bacterianas pueden transformarse mediante pulsacin elctrica o calor. Las clulas, incluidas las bacterias, tienen membranas plasmticas; un pulso elctrico corto o un diminuto ascenso en la temperatura, crea temporalmente aberturas en la membrana plasmtica de la bacteria. Estas aberturas permiten que pequeas molculas, como el ADN plsmido recombinante, penetren en la bacteria. Las clulas bacterianas posteriormente hacen copias del ADN plsmido recombinante durante la replicacin celular. A travs de este proceso llamado clonacin, se producen grandes cantidades de bacterias idnticas con molculas de ADN insertadas en cada una de ellas (Galvn, 2005)

Secuencia de ADN
Actualmente, se desconoce la secuencia de nucletidos de la mayora de los organismos. Conocer dicha secuencia del ADN de un organismo o de un fragmento clonado les proporciona a los cientficos informacin valiosa para futuros estudios. La secuencia de un gen puede usarse para predecir su funcin, para comparar genes con secuencias similares de otros organismos y para identificar mutaciones o errores en la secuencia (Biggs, 2007). Como los genomas de la mayora de los organismos se componen de millones de nucletidos, deben usarse primero las enzimas de restriccin para cortar las molculas de ADN que se usan para las reacciones secuenciales.

Reaccin en cadena de polimerasa

(PCR, Polimerase Chain Reaction por sus siglas en ingls) Una vez que se conoce la secuencia de un fragmento de ADN, puede usarse la tcnica llamada reaccin en cadena de polimerasa para hacer millones de copias de
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una regin especfica del fragmento de ADN. El PCR es muy sensible y puede detectar una simple molcula de ADN en una muestra (Weiner, 1995). Es til porque esta simple molcula de ADN luego puede copiarse o amplificarse muchas veces y usarse para el anlisis de ADN. La ingeniera gentica usa las herramientas antes mencionadas para estudiar y manipular el ADN.

Biotecnologa
La biotecnologa, el uso de la ingeniera gentica para hallar soluciones a problemas, hace posible la produccin de organismos que contiene genes individuales de otro organismo (Biggs, 2007). Esto significa que la biotecnologa es aplicar la biologa en el mundo real mediante la manipulacin de organismos vivos, especialmente a nivel gentico, para producir productos benficos. Dichos organismos, manipulados genticamente mediante la introduccin de un gen de otro organismo, se conocen como organismos transgnicos. Estos no slo se usan para la investigacin, sino tambin con finalidades mdicas y agrcolas (Biggs, 2007).

Animales transgnicos
Actualmente, la mayora de los animales transgnicos se producen en laboratorios destinados para la investigacin biolgica. Estos animales se pueden usar para estudiar enfermedades y desarrollar formas de tratarlas; este es el caso de los ratones, las moscas de la fruta y los gusanos redondos Caenorhabditis elegans (Fire, 1986). Otros organismos, como el ganado transgnico, se usan para mejorar el suministro de alimento y la salud humana. En el futuro, los organismos transgnicos podran usarse como fuente de rganos para transplantarse.

Plantas transgnicas
Muchas especies de plantas se crean mediante la ingeniera gentica con el fin de aumentar su resistencia a las plagas virales o de insectos (Biggs, 2007). Los cientficos producen actualmente mediante ingeniera gentica, un algodn resistente a la infestacin de insectos. Los investigadores tambin desarrollan manes y sojas que no causan reacciones alrgicas (Biggs, 2007).

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Otras cosechas se cultivan de manera comercial y se someten a pruebas de campo. Estas incluyen plantas de balata resistentes a un virus que podra matar a la mayora de la siembra africana, plantas de arroz con ms vitaminas y hierro capaces de disminuir la desnutricin, y una variedad de plantas capaces de sobrevivir en condiciones climticas extremas (Biggs, 2007). Otras cosechas posibles son los bananos productores de vacunas contra enfermedades infeccionas como la hepatitis B y plantas productoras de plsticos biodegradables.

Bacteria transgnica
La insulina, hormona segregada por los islotes de Langerhans en el pncreas, que regula la cantidad de glucosa existente en la sangre, las hormonas de crecimiento y las sustancias que disuelven cogulos sanguneos se elaboran mediante bacterias transgnicas (Recombinant DNA, 2004). Las bacterias manipuladas genticamente tambin desaceleran la formacin de cristales de hielo en las cosechas para protegerlas de la escarcha, limpian los derrames de petrleo ms eficientemente y descomponen la basura (Biggs, 2009).

Transformacin Bacteriana
La Transformacin bacteriana se puede definir como la variacin hereditaria de una clula susceptible, originada por la captacin de ADN desnudo libre en el medio, con la posterior recombinacin del exogen con el genoma de la clula en cuestin (endogen). Tras la transformacin, la clula que ha recibido el ADN se suele denominar transformada. (Iez, 1998) Para que la transformacin tenga lugar, la bacteria tiene que encontrarse en el llamado estado de competencia, que ocurre en determinadas condiciones fisiolgicas; en este estado, la bacteria presenta alteraciones en su pared y membrana celulares, que permiten la entrada de cidos nucleicos en la clula (Galvn, 2005). Igualmente, la transformacin bacteriana es una rama de la transformacin y manipulacin gentica, pues lo que se hace es modificar un gen, pedazo del ADN que contiene las instrucciones para crear una protena, en un ser vivo para as lograr un cambio en las caractersticas o estructura del organismo. El objetivo que se le da a estas transformaciones es muy variada, pues se usa desde la agricultura hasta la medicina. Un ejemplo de esto es el maz, que es muchas veces
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modificado genticamente para as poder resistir o ser inmune ante ciertas plagas para as lograr una mayor produccin de producto sin necesidad de estar implementando el uso de pesticidas (Lugo, 2007). Otro ejemplo, usada para reparar desastres causados por el hombre, es la transformacin que se les da a las bacterias para poder digerir petrleo y, si sucede un derrame en el mar por algn accidente u otra causa, usar estas bacterias modificadas para quitar el petrleo del agua para evitar que esta sustancia afecte a la vida marina (Lugo, 2007). Dentro del proceso de transformacin gentica, las enzimas de restriccin o endonucleasas cortan los enlaces fosfodiester del material gentico a partir de una secuencia que reconocen (Rivera, 2006). En otras palabras, las enzimas de restriccin tienen la funcin de romper los enlaces que existe entre los genes; esta propiedad es usada para irrumpir en el ADN de un organismo y cambiarlo. Existen tres tipos de endonucleasas: la Tipo I realiza cortes y modificaciones en el ADN y lo hacen en un punto lejos al del rea de reconocimiento; la Tipo II slo puede cortar, y es muy preciso en el corte, ya que es dentro del rea reconocida; finalmente, la Tipo III, al igual que la Tipo I, realiza cortes y modificaciones, slo que sta los hace dentro del rea de reconocimiento. La Tipo I y III necesitan ATP para trabajar, mientras que la Tipo II slo necesita de magnesio (Mg++).

GFP: Protena Verde Fluorescente

Slo tres aos despus de su descubrimiento y obtencin, la protena verde fluorescente (GFP) que se obtuvo de la medusa Aequorea victoria se convirti en una de las protenas ms explotadas y arduamente estudiadas en la biotecnologa y biologa celular. Su asombrosa habilidad de generar una alta visibilidad y eficiencia en emitir fluorescencia interna es tanto fascinante como til. La alta resolucin de sus estructuras cristalizadas generalmente presentan oportunidades sin precedentes que nos ayudan a entender y manipular la relacin entre su estructura protenica y su funcin espectroscpica. La protena verde fluorescente ha sido utilizada como indicador de expresin gentica y determinador de protenas en clulas intactas y organismos. La protena verde Fluorescente (GFP, Green Fluorescent Protein) es una

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protena codificada por el gen gfp, y dicha protena causa que su portador brille con un color verde fluorescente (Biology of the Cell Lab, 2009). La GFP fue descubierta y sintetizada en de octubre del 2008 por el japons Osamu Shimomura y los estadounidenses Martin Chalfie y Roger Y. Tsien, quienes adems ganaron el premio Nobel por este descubrimiento. Sin embargo, esta protena ya haba sido observada en 1962 en la medusa Aequorea victoria, comnmente llamada medusa cristal, de la cual aislaron la protena en cuestin por los cientficos ya antes mencionados. La protena GFP est siendo utilizada para observar procesos celulares que antes eran invisibles para los cientficos. Esto hace posible un mejor entendimiento y estudio sobre componentes y crecimiento celular directamente adems de que hace posible saber si un medicamento da o no resultados, e, incluso, seguir el periodo de gestacin de un embrin si se le introduce la protena. Por todo lo anterior, el descubrimiento, desarrollo y aplicacin del GFP ha sido comparada con la del microscopio, ya que sus usos son muy similares (Tsien, 1998)

Gentica Bacteriana
La transformacin gentica de una bacteria significa un cambio causado por la insercin de uno o ms genes en un organismo para cambiar sus caractersticas. Las bacterias, por su tamao no haban sido consideradas por los estudiosos genticos hasta hace poco tiempo. Sin embargo, han empezado a ser objeto de inters por su velocidad de reproduccin y su capacidad para adaptarse a diversas condiciones adversas. Toda la informacin gentica esencial para la vida de la clula bacteriana, est contenida en una nica molcula de ADN de doble cadena, circular y covalentemente cerrada, la cual se conoce como cromosoma bacteriano (Betancor, 2001). Esta molcula de ADN, a diferencia de las clulas eucariontes, no se encuentra dentro de un ncleo, sino que est distribuido en el citoplasma. Sin embargo, muchas bacterias tambin cuentan con un ADN extra cromosmico o ADN plsmido. El ADN de una bacteria, es mucho ms largo que la bacteria misma, por lo tanto una bacteria debe enrollar su ADN a una estructura terciaria poder mantenerlo dentro de ella. Por ejemplo, la longitud del ADN de la bacteria E. coli es de 1.2 mm. Gracias a este

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enrollamiento la bacteria es capaz de mantener grandes cantidades de energa, que despus utiliza para procesos internos. La reproduccin de una bacteria es el proceso mediante el cual se transfiere el material gentico a la clula hija. Este proceso comienza con la duplicacin del ADN de la bacteria. A diferencia de las clulas eucariontes que solamente replican su ADN durante una fase de su ciclo celular, las bacterias pueden hacerlo en cualquier fase del mismo. El ADN de una bacteria se divide en un punto llamado horquilla de replicacin y de este punto se parte una replicacin bidireccional, en el que de acuerdo a la secuencia de bases en la hlice, se va creando otra hlice complementaria siguiendo el patrn A-T y G-C. Existen plsmidos capaces de replicarse unidireccionalmente. Al catalizar la unin de las bases nitrogenadas se utiliza la enzima ADN Polimerasa. En el caso de la bacteria E. coli hay tres enzimas polimerasas que participan (I, II y III), sin embargo la enzima ADN Polimerasa III es la que cataliza la replicacin de forma ms representativa. Despus del proceso de transcripcin, la bacteria inicia el proceso de traduccin, en el cual se produce una hlice de ADN complementaria denominada ARN. Una vez que se obtiene la hlice complementaria, sta, con la ayuda del ribosoma, crea cadenas de aminocidos a fin de formar una protena sintetizada. La recombinacin gentica es el proceso mediante el cual elementos genticos contenidos en genomas de diferentes individuos se combinan, para que la bacteria lleve a cabo una nueva funcin o presente un nuevo fenotipo (Betancor, 2001). Este proceso se puede realizar en tres mecanismos diferentes: Transformacin: Es el proceso mediante el cual una bacteria acepta o adquiere ADN que se encuentre en el medio, proveniente de otra bacteria. Transduccin: Este proceso supone la transferencia de ADN de una bacteria a otra a travs de un bacterifago, o un virus capaz de afectar nicamente a las bacterias. A su vez este proceso se divide en dos: la transduccin especializada y la generalizada. La transduccin especializada ocurre cuando el bacterifago porta genes bacterianos y al entrar a la bacteria y contaminarla, se adhiere a su ADN e integra su genoma al cromosoma de la bacteria. La transduccin generalizada ocurre de la misma manera, con la excepcin de que la bacteria es infectada por pequeas partculas virales.
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 Conjugacin: Es el proceso mediante el cual dos bacterias intercambian informacin gentica de manera unidireccional, siempre de una bacteria donadora a una receptora. Mediante este proceso las bacterias intercambian plsmidos. El procedimiento que fue utilizado en esta investigacin con la bacteria E. coli. fue el de transformacin. Para ello se convierten las clulas en competentes es decir, capaces de aceptar ADN ajeno. Algunas bacterias son competentes por naturaleza, sin embargo, no es el caso de la bacteria E. coli, por lo que es necesario transformarla. Para ello se agrega la solucin de transformacin (CaCl2), el cual neutraliza las cargas negativas de la columna de fosfatos del ADN y los fosfolpidos de la membrana celular, permitiendo as que ingrese el plsmido a la clula (Galvn, 2005). Es importante tambin aumentar la permeabilidad de la membrana para que acepte el plsmido con ms facilidad.

Plsmidos
Los plsmidos son estructuras que contienen el ADN de una bacteria, e informacin gentica auxiliar para desarrollar funciones no esenciales, sin embargo, son de mucha ayuda para las bacterias, ya que confieren particularidades fenotpicas que son benficas para la bacteria, como la resistencia y la virulencia. El ADN plsmido normalmente contiene genes para una o ms caractersticas que son benficas para la supervivencia de la bacteria. stos se reproducen de forma independiente y autnoma de los cromosomas, por ello puede existir ms de un plsmido en una misma clula bacteriana. Los plsmidos pueden replicarse unidireccionalmente. Se le denomina replicn a cada unidad de replicacin del ADN el cual contiene todos los elementos requeridos para regular este proceso (Betancor, 2001). Los plsmidos son nombrados a partir de la letra p minscula y un nombre que d informacin acerca de las caractersticas del plsmido En la naturaleza, las bacterias pueden transferir estos plsmidos para compartir las caractersticas benficas. Es ms sencillo la transferencia de plsmidos pequeos que de aquellos que son ms grandes. Dentro de los plsmidos tambin se encuentran unas estructuras llamadas promotores. Un promotor es una secuencia de ADN que funciona, en conjunto con un sitio operador o activador, como un interruptor gentico que determina en qu momento se activa un gen. En el

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momento en que un gen es activado, la enzima ARN Polimerasa empieza el proceso de transcripcin que finaliza con la sntesis de protenas, las cuales son sintetizadas con las nuevas caractersticas. Los plsmidos se pueden clasificar de acuerdo a sus propiedades de transferencia en: Conjugativos: Este tipo de plsmidos causan su propia transferencia de una clula bacteriana a otra, por el hecho de contar con uno o ms genes necesarios para la transferencia de ADN. No conjugativos: Son aquellos que no intervienen en el proceso de transferencia de una bacteria a otra, y slo pueden transferirse si existe un plsmido conjugativo en la misma clula. Durante la transformacin gentica que se realiz en esta investigacin, se utiliz el plsmido pGLO, el cual contiene el gen para la protena GFP, el cual se obtiene a partir del ADN de la Aequorea Victoria (medusa bioluminiscente), un gen que codifica para la enzima b-lactamasa, y un gen para la protena Arabinosa C. El gen de la protena GFP se activa cuando hay presencia de arabinosa en el medio. Los plsmidos que se encuentran adheridos a la membrana de la bacteria o dentro del cromosoma se denominan episomas (Britannica, 2009).Los plsmidos son esenciales en la ingeniera gentica y la biotecnologa, ya que se usan en procedimientos como clonacin y produccin de protenas. Durante estos procedimientos el plsmido es cortado en uno o varios puntos especficos del mismo utilizando enzimas de restriccin. El gen a modificar se inserta dentro de una parte del plsmido. Una vez que el plsmido contiene la informacin gentica que se pretende integrar al cromosoma de una bacteria, se transfiere a sta por medio del proceso de conjugacin. A su vez el plsmido, al entrar en la bacteria, se asocia con el cromosoma de la misma y cambia su informacin gentica, para que la futura sntesis de protenas se realice de acuerdo a lo que se pretende ver en la bacteria.

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Regulacin de la expresin gentica

Es un proceso qumico muy complejo donde intervienen gran cantidad de enzimas mediante el cual, como su nombre lo dice, se afectan y regulan las acciones y productos llevados a cabo por los genes para poder adaptarse a las condiciones del medio ambiente. Los autores Jacob y Monod, con su modelo gentico, explican este mecanismo utilizando conceptos como genes estructurales, el opern y el gen regulador. Los genes estructurales: Ocupan una funcin del ADN. Son los que regulan la formacin de un enzima o de una protena estructural (Glosario.net, 2007). El opern: Unidad gentica formada por varios genes estructurales y por un gen operador que supervisa la actividad de los genes estructurales (Saenz, 2005). El gen regulador: Controla la velocidad con que se traduce otro gen (Biggs, 2007). La sntesis de protenas tambin forman parte de la regulacin de la expresin gentica. La regulacin de esta produccin, tomando en cuenta su proceso conjunto y puede llevarse a cabo en tres niveles: replicacin, transcripcin y traduccin. El mejor estudiado de los 3 niveles es el de la regulacin durante la transcripcin, el cual es muy similar entre bacterias y eucariontes, aunque en stos es un poco ms compleja. Beadle y Tatum expusieron la teora gen enzima que explica que los genes controlan la estructura de las protenas a travs de una enzima especfica (Biopsicologa.net, 2009). En este caso estudiaremos la regulacin gentica especficamente en el plsmido recombinante, el pGLO, que contiene la protena verde fluorescente. Este plsmido contiene los genes que habilitan la replicacin del ADN y la expresin del color verde fluorescente en la bacteria. En la regulacin de dicho plsmido, intervienen genes como: bla: secuencia que codifica para la b-lactamasa, la cual le confiere resistencia a la ampicilina. (Subramaniam, 2009) Ori: secuencia de origen a la replicacin. (Subramaniam, 2009)

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 araC: secuencia que codifica para que una protena especfica se una a un promotor pBAD (Subramaniam, 2009). nicamente cuando la arabinosa se encuentra presente y se une a la secuencia araC, se lleva a cabo la transcripcin y traduccin de la GFP. Promotor pBAD: secuencia que proporciona la seal de inicio de la transcripcin. Genes araBAD: catalizan la conversin intracelular de la arabinosa (Schleif, 2000) Cuando el azcar arabinosa se encuentra presente, los genes que producen las enzimas que son capaces de romperla y metabolizarla empiezan a trabajar. As mismo, cuando el azcar no est, las enzimas no son producidas.

Beta-lactamasa y su resistencia a la Ampicilina

Cada plsmido, contiene un gen o paquete de genes que le dan ciertas habilidades a la bacteria que lo contiene, siendo las ms importantes las de la distincin y la de resistencia a varios agentes antibacterianos. Estos genes son extensamente utilizados para experimentos y prcticas en donde intervienen bacterias recombinantes, principalmente con fines cientficos. La b-lactamasa es una protena producida gracias a enzimas especficas que a su vez se derivan de genes y del proceso de regulacin de la expresin gentica. Esta protena inhibe el efecto de la ampicilina y permite la libre reproduccin de la bacteria expresando las cualidades que adquiri por medio de la transformacin y los genes que contienen sus plsmidos, en este caso, el color fluorescente de la protena GFP. Estudios moleculares revelan que la resistencia a ampicilina es consecuencia de la presencia de una b-lactamasa tipo TEM, se localiza el gen que la codifica en un plsmido conjugativo. Buscando otras causas que justifiquen la resistencia, se encuentran otras b-lactamasas de tipo PSE y OXA y se atribuye la sensibilidad disminuida a la combinacin amoxicilina/cido clavulnico a la presencia de estas enzimas en los aislados junto a las de tipo TEM. (Gerri, 2004).

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Regulacin del opern de la L-arabinosa en E. coli

En una publicacin en 1960, Englesberg y colaboradores concluyeron a partir de una serie de experimentos de gentica clasica que el opern de la arabinosa en la E. coli poda no estar regulado por un mecanismo de control negativo, como los que se haban encontrado en los opernes del fago lambda y el opern de la lactosa. Estos hallazgos genticos iniciales, indicaron la existencia de regulacin positiva e indujeron la realizacin de anlisis genticos ms extensos del sistema del gen de la arabinosa. Estos hallazgos fueron seguidos por investigaciones bioqumicas y confirmaron la existencia de un mecanismo de regulacin positivo. Desde entonces la regulacin positiva ha sido encontrada en muchos sistemas de regulacin en clulas tanto procariticas como eucariticas y aun en los sistemas hallados en el fago lambda y el el lac. Investigaciones posteriores relacionadas con el opern de la arabinosa, describieron la presencia de asas de DNA, mecanismos que ahora se sabe son ampliamente utilizadosen la regulacin gentica. Ms recientemente los detalles por medio de los cuales la protena reguladora del opern de la arabinosa, protena AraC, responde a sta, han sido esclarecidos tanto a escala molecular como anatmica. ste mecanismo conocido como mecanismo de switch-luminoso, involucra la regulacin de enlaces de la posicin de un brazo de la protena. Ya que este mecanismo es relativamente simple, se aceptable considerar que futuros intentos de regulacin de ingeniera por enlaces arbitrarios puedan basarse en el mecanismo de switch-luminoso en otras protenas y enzimas. De cualquier manera, el sistema del opern de la arabinosa es ya de uso prctico en sistemas de expresin de protena porque el promotor AraC provee altos niveles altos niveles de expresin inducida y bajos niveles de expresin no inducida. Este sistema posibilita a la E. coli capturar la pentosa L arabinosa del medio de cultivo usando productos de genes araE y araFGH no enlazados, para despus convertir la arabinosa intracelular a D-xylulosa-5fosfato en un proceso de tres pasos catalizados por los productos de los genes araBAD. (Figura 1). La protena AraC regula la expresin de su propia sntesis y los otros genes del sistema ara. En la presencia de arabinosa, la AraC estimula la iniciacin de sntesis de mRNA a partir de los promotores pE, pFGH, pBAD y pJ, este ltimo, promotor funcin desconocida. En pBAD, la protena AraC no slo acta positivamente al estimular la transcripcin en presencia de arabinosa sino que tambin acta negativamente en
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ausencia de arabinosa para reprimir la iniciacin de la transcripcin; mientras que en pC la AraC acta negativamente en presencia o ausencia de arabinosa. La protena AraC funciona como homodmero. El monmero posee dos dominios, uno que enlaza arabinosa y otro que enlaza DNA. (Figura 2)

Figura 1. Genes que se requieren para la captura y catabolismo de la L-arabinosa en la E. coli, las estructuras de opern, sus localizaciones aproximadas en el mapa gentico circular y los pasos iniciales del catabolismo de la arabinosa mostrando las estructuras intermedias as como los pasos catalizados por los productos del gen opern ara. La AraC acta de manera positiva y negativa sobre pBAD y negativamente sobre pC.

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Figura 2. Estructura del dominio de una de las usbunidades de la protena AraC (a) as como las regiones regulatorias de pC y pBAD en ausencia (b) y en presencia (c) de arabinosa. Los elementos reguladores: O2, L1 Y L2 tienen 17 pares de bases de longitud de secuencia similar a los que se unen a una de las subunidades de AraC y O1 est formado de dos sitios, O1L y O1R, que ligan dos subunidades. En la ausencia de arabinosa la RNA polimerasa no puede unirse a pBAD y pC. La protena receptora del AMP cclico, CRP, est igualmente obstaculizada para enlazarse a su sitio en el DNA. En la presencia de arabinosa, AraC se enlaza primeramente a los sitios adyacentes L1 y L2 lugar de rodear. Como consecuencia la RNA polimerasa tiene acceso libre al pBAD y CRP. En pC y O1 la polimerasa RNA compite por enlazarse.

Estudios de transformacin de E.coli con plsmidos

Para que la transformacin tenga lugar, la bacteria tiene que encontrarse en el llamado estado de competencia, cuando la bacteria presenta alteraciones en su pared y membrana celulares, que permiten la entrada de cidos nucleicos en la clula.

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Actualmente se han descrito 7 tipos diferentes de plsmidos en la E.coli, siendo los ms estudiados el de plsmido recombinante y plsmido de protena fluorescente, el cual constituy nuestro objeto de estudio. Cualquier tipo de experimento de transformacin con plsmidos tiene similar metodologa mas no es exactamente la misma: inducir la bacteria al estado de competencia, someter ambas clulas a un choque trmico e incubar toda la noche. En los resultados de la transformacin recombinante se deberan diferenciar la cantidad de colonias y el color de la misma (azul o blanco). En la fluorescente, como su nombre lo dice, el poder observar con ayuda de luz ultravioleta si la bacteria posee este color brillante. Gracias a los diferentes estudios que se han llevado a cabo, sabemos que para poder experimentar exitosamente la transformacin una bacteria, se necesitan tomar en cuenta varios puntos: 1. Seleccionar un tipo de organismo ideal, ya que: a) Para poder transformarlo por completo genticamente hablando, se necesita insertar el nuevo gen/plsmido en cada una de sus clulas. b) Los resultados se hacen ms evidentes en la descendencia del organismo, por lo que conviene elegir a uno que se reproduzca rpidamente. 2. La meta de dicha transformacin es alterar el fenotipo del organismo, por lo que antes de realizar el experimento es necesario examinar, observar y anotar todo tipo de caractersticas que ste posee. 3. Seguir rigurosamente la metodologa y llevar a cabo el experimento de manera precisa y exacta.

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PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

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PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Actualmente, en el campo de la ciencia se usa cada vez ms la ingeniera gentica con el fin de manipular el ADN de los organismos introducindoles ADN de organismos ajenos. Los organismos manipulados por medio de la ingeniera gentica permiten que los cientficos descubran rasgos beneficiosos para los seres humanos en base al estudio de las expresiones de un gen particular, la investigacin de los procesos celulares o el estudio de enfermedades, entre muchos otros. Las bacterias poseen pequeos pedazos de ADN circular llamados plsmidos, los cuales ayudan considerablemente en el proceso de mover un gen de un organismo a otro. El ADN de un plsmido comnmente contiene genes para una o ms caractersticas que pueden ser beneficiosas para la sobrevivencia de la bacteria. En la naturaleza las bacterias transfieren plsmidos entre ellas permitiendo as compartir genes beneficiosos y adaptarse a nuevos ambientes. En este estudio nos hemos planteado la utilizacin del plsmido pGLO con el fin de modificar de la bacteria E. coli. y observar el efecto de la transformacin bacteriana hacindola resistente a la ampicilina. Dicha transformacin pudo ser monitoreada por la expresin de la protena verde fluorescente en aquellos cultivos resistentes.

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OBJETIVOS
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OBJETIVO GENERAL
Transformar genticamente la bacteria E. coli por medio de la insercin plsmido pGLO para la adquisicin de la caracterstica fenotpica de resistencia a la ampicilina y monitoreo de la transformacin a travs de la expresin de la protena verde fluorescente.

OBJETIVOS ESPECFICOS
1. Comprender y llevar a cabo la insercin de ADN exgeno en una cepa de E. coli competente. 2. Conocer y reproducir las condiciones de esterilidad necesarias para llevar a cabo la transformacin bacteriana. 3. Evaluar los mecanismos de la regulacin de la expresin gentica de la bacteria E. coli utilizando un diseo experimental que permita comparar las condiciones de cultivos necesarias para la expresin de los genes insertados en la cepa bacteriana mediante el plsmido pGLO. 4. Cuantificar la eficiencia de la transformacin realizada.

HIPTESIS
Si el plsmido pGLO que contiene las secuencias genticas que le confieren resistencia a la ampicilina a la bacteria E.coli as como un sistema especial de regulacin gentica es insertado exitosamente mediante un proceso de transformacin bacteriana, entonces dichas caractersticas sern visibles a travs de la expresin de la protena verde fluorescente en las cepas transformadas y sern capaces de crecer en un medio de cultivo que contenga ampicilina.

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MATERIAL Y MTODOS Material

E. coli cepa HB101 K- 12 Liofilizada Plsmido (PGLO) Liofilizado 20 mg Ampicilina, Liofilizada, 30mg L(+) Arabinosa, Liofilizada, 600 mg Solucin Transformadora (50 Mm, CaCl2, ph 6.1), estril, 15 ml Medio de cultivo lquido LB, 10ml Nutriente agar LB en polvo, estril (500ml) Pipetas, estriles, envueltas. Asas para incocular estriles de 10ml, 5 piezas Cajas de Petri, 60 mm, estriles, 5 piezas Microtubos, 2.0 ml (10 cada uno: amarillo, verde, azul, naranja, lavanda, rosa) Gradillas para microtubos.

ACCESORIOS: Lmpara de luz ultravioleta Reloj Horno de Microondas Incubadora 37C Agua a temperatura controlada 1-6 litros Termmetro Probeta graduada de 500 ml Agua destilada, 500 ml Hielo 10 ml de blanqueador Plumones permanentes.

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Mtodos
Consideraciones previas Para transformar genticamente un organismo, debimos insertar nuevos genes en cada clula de dicho organismo. Por tal motivo, elegimos utilizar la bacteria E.coli. que es un organismo unicelular y que pudo exitosamente ser utilizado como receptor para los nuevos genes insertados ya que el material gentico solo debi ser insertado en una nica clula. Debido a que algunos cientficos afirman que despus de una transformacin gentica exitosa, las caractersticas adquiridas pueden ser transmitidas de generacin en generacin se utilizo una bacteria, que es un organismo que se reproduce rpidamente y que permiti de este modo, una veloz reproduccin para determinar si las caractersticas adquiridas por medio de la transformacin, pudieron ser heredadas. Consideraciones de seguridad Como en cualquier experimento, la seguridad es un asunto de suma importancia, por eso es que se eligi un organismo que no produjera toxinas o compuestos que hicieren a la gente enfermar. El organismo debi ser uno que se pudiera reproducir dentro del laboratorio, pero que le fuera imposible la vida dentro de l. Utilizamos un organismo no patgeno. Incapaz de infectar plantas y animales.La bacteria Escherichiacoli (E.coli) cepa HB101; K-12, fue el organismo que mejor se acopl a nuestras necesidades, ya que est compuesta por una clula que se reproduce constantemente cada 20 minutos, y es un organismo no patgeno incapaz de resistir condiciones fuera de un laboratorio Preparacin del Agar Las placas de agar se prepararon tres das antes hasta su uso. Para preparar el agar, se agreg 500 ml de agua destilada en un vaso Erlenmeyer, adems del contenido entero del paquete de nutriente agar LB. Se agit el vaso hasta
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de realizar el experimento. Se

dejaron afuera a temperatura ambiente durante dos das y despus se refrigeraron

disolver el agar, y se calent hasta hervir en un horno de microondas. Se repiti el calentamiento y la agitacin tres veces hasta que el agar se encontr completamente disuelto. Cuando todo el agar se disolvi, se dej enfriar (aprox. 50 C). Preparacin de la arabinosa y ampicilina Con una pipeta estril se agregaron 3 ml de solucin de transformacin directamente al vaso que contena el azcar arabinosa para hidratarlo. Se agregaron tambin 3 ml de solucin de transformacin al vaso que contena el antibitico para hidratarlo. Identificacin de las placas Las 5 placas de agar se marcaron de la siguiente manera: 2 placas como LB, 2 placas como LB/amp y 1 placa como LB/amp/ara. Se virti el agar LB (12 ml) en las 2 placas marcadas como LB. Una vez colocado el nutriente en las placas se dejaron enfriar.

Se agreg la ampicilina hidratada al nutriente agar LB sobrante. Agitamos para mezclar. Se verti en las placas marcadas como LB/amp usando la tcnica antes mencionada.

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Por ltimo, agregamos la arabinosa hidratada al nutriente agar LB sobrante que contiene ampicilina. Agitamos rpidamente y vertimos en las 2 placas marcadas como LB/amp/ara usando la tcnica ya mencionada.

Almacenaje de placas Despus de que las placas estuvieron durante dos das en temperatura ambiente se guardaron en un refrigerador hasta ser usadas.

Transformacin bacteriana Usando una pipeta estril, se hidrat el E. coli HB101Iofilizado agregando 250 l de solucin de transformacin directamente al recipiente. Se dej el recipiente durante 5 minutos en temperatura ambiente. Se colocaron las bacterias rehidratadas en el refrigerador hasta que fueron utilizadas.

SOLUCINTRANSFORMADORA

E.coliLIOFIZADA

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Se sembraron las bacterias en las palcas de cultivo con el mtodo de rayado con el propsito de cubrir la superficie slida con bacterias para generar colonias individuales de bacterias de una suspensin concentrada. a) Con el asa estril tocamos la suspensin y raspamos las placas. Se debi hacer con una secuencia y solo 4 rayas o cuadrantes. Se nos recomend que estuvieran separados o muy bien distinguidos para que las colonias se reprodujeran correctamente. b) Para las lneas subsecuentes, el objetivo fue usar tanta superficie en la placa, como fuera posible. Se comenz la siguiente lnea del otro lado de la placa y se rasp adelante y hacia atrs durante diez veces. c) Giramos la placa y repetimos el procedimiento d) Giramos de nuevo e hicimos la ltima raya de bacterias.

Se colocaron los platos boca abajo dentro de la incubadora a 37 C.

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Preparacin del plsmido pGLO Con una pipeta estril se agregaron 250 l de solucin de transformacin al plsmido de ADN pGLO.

SOLUCINTRANSFORMADORA

PLSMIDOLIOFILIZADOpGLO

Transformacin en el laboratorio

1. Se marc un micro tubo como +pGLO y otro como pGLO.

2. Abrimos los tubos y con una pipeta estril transferimos 250l de solucin de transformacin (CaCl2).

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3. Se colocaron los tubos en hielo.

HIELO

4. Utilizando un asa estril se recogi una colonia de bacterias individual de la placa de inicio y tomando el tubo marcado como +pGLO se introdujo el asa en la solucin de transformacin que se encontraba en el tubo. Se mezcl ligeramente hasta que las bacterias se mezclaron con la solucin. Colocamos el tubo de nuevo en el hielo. Usando una nueva asa estril repetimos el paso con el tubo marcado como -pGLO.

5. Se examin la solucin del plsmido de ADN pGLO con luz ultravioleta. Sumergimos una nueva asa estril en el tubo que contena el ADN. Se observ el asa y nos aseguramos de que hubiera un anillo de solucin de ADN. Se introdujo el asa en el tubo marcado +pGLO, cerramos el tubo y lo regresamos al hielo. Cerramos tambin el tubo pGLO. No se introdujo plsmido en ste.

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PLSMIDO

6. Los tubos se incubaron en hielo durante 10 minutos asegurndonos de que todos tuvieran contacto completo con el hielo.

BASE

HIELO

7. Mientras los tubos estaban en el hielo, se marcaron las placas de agar de la siguiente manera: una con LB/amp +pGLO; una LB/amp/ara: +GLO; una LB/amp: -pGLO; y por ltimo una LB/amp/ara: -pGLO.

8. Usando las gradillas de unicel transferimos ambos tubos: el +pGLO y el pGLO a un bao de agua con una temperatura de 42 C durante exactamente 50 segundos. Nos aseguramos de introducirlos hasta el fondo y que todos tuvieran contacto con el agua caliente. Cuando pasaron los 50 segundos los regresamos al hielo y se incubaron durante 2 minutos.

BAODEAGUA

HIELO

42CPOR50seg.

HIELO

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9. Quitamos los tubos del hielo y los colocamos en la estacin de trabajo. Abrimos un tubo y usando una pipeta nueva y estril agregamos 25 l de nutriente LB al tubo y lo cerramos. Repetimos este paso con todos los tubos. Se dejaron durante 10 minutos a temperatura ambiente.

NUTRIENTE LB

10. Tapamos y agitamos todos los tubos. Usando una nueva pipeta estril para cada uno de los tubos, agregamos 100 l de la mezcla de bacterias y plsmido en cada una de las suspensiones y el control.

11. Utilizando una nueva asa estril para cada placa. Esparcimos cada superficie de los platos.

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12. Juntamos y cerramos las placas. Se colocaron en la incubadora a 37c hasta el siguiente da.

Consltese el Apndice C para la descripcin fotogrfica del procedimiento empleado.

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RESULTADOS
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RESULTADOS

1. Observaciones de cultivos de origen. Determinacin del prefenotipo.

Es de vital importancia mencionar, que la meta de una transformacin gentica es cambiar las caractersticas visibles de un organismo (fenotipo). Antes de cambiar algn fenotipo de un organismo, a travs de un examen visual se debe determinar el prefenotipo. Con este objetivo, realizamos las observaciones siguientes en las colonias de E. coli de origen antes de llevar a cabo la transformacin gentica (Figura 3). a) Se observaron colonias de color blanco, de alrededor de 3mm de dimetro en la superficie de la placa con agar las cuales presentaron un tomo amarillento o blanco nacarado. b) Se observaron alrededor de 20 colonias de bacterias semejantes y distribuidas de manera uniforme sobre el medio de cultivo. La distancia entre las diferentes colonias de bacterias observadas fue de aproximadamente 3 o 4mm una de otras, en algunos casos las colonias de unan unas con otras. c) Se observaron los platos de cultivo con la ayuda de la lmpara de luz UV y se determin que stas no posean caractersticas fluorescentes.

Figura 3. Cultivo de inicio de E. coli. 39

2. Observaciones de la transformacin gentica de E.coli

Tabla 1. Platos de agar +pGLO, LB/amp
En este plato se sembraron bacterias transformadas con el plsmido pGLO. Se sembraron en agar LB con ampicilina

Imgenes

Observaciones Se contaron 320 colonias de bacteria de color blanco y sin exposicin de fluorescencia cuando fueron expuestas a luz UV.

Platos con transformacin

+pGLO, LB/amp/ara
En este plato se sembraron bacterias transformadas con el plsmido pGLO. Se sembraron en agar LB con ampicilina y arabinosa.

Se observaron 360 colonias de bacteria de color blanco pero, al ser expuestas a luz UV, mostraron un color verde fluorescente brillante.

-pGLO, LB/amp
En este plato se sembraron bacterias que no fueron transformadas con el plsmido pGLO. Se sembraron en agar LB con ampicilina.

No se observ crecimiento de bacterias.

-pGLO, LB Platos de control

En este plato se sembraron bacterias que no fueron transformadas con el plsmido pGLO. Se sembraron en agar LB sin ampicilina

Se observ un crecimiento mucho mayor que en el resto de los cultivos, pero las bacterias no formaron colonias bien definidas, pues llenaban todo el plato. Se observ el cultivo de color blanco. Al ser expuestas a luz UV, no mostraron fluorescencia.

Las imgenes presentadas son un ejemplo representativo de tres experimentos

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Eficiencia de la transformacin
Para determinar la eficiencia de la transformacin (la cantidad de clulas de E.coli exitosamente transformadas), fue necesario seguir meticulosamente una serie de pasos. Este procediiento es de vital importancia en algunos tipos de terapias que involucren genes. Por ejemplo cuando clulas extradas del paciente se transforman y se regresan al paciente. Entre ms clulas transformadas se produce mayor cantidad de protena se aprovecha para el tratamiento. 1. Clculo total del nmero de colonias fluorescentes Fue necesaria la divisin del cultivo en cuadrantes para facilitar el conteo de las colonias (Figura 4).

Figura 4. Plato de cultivo con bacterias transformadas para conteo de colonias

Nmero total de colonias =

360
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2. Determinacin de la cantidad de plsmido pGLO en el cultivo LB/amp/ara Para realizar este clculo fueron necesarios dos datos; a) cantidad total de plsmido pGLO al inicio de la transformacin y; b) cantidad total de plsmido pGLO (en la bacteria) que se perdi en el medio de cultivoLB/amp/ara. a) Cantidad total de plsmido al inicio La cantidad total de plsmido pGLO al comienzo del experimento es igual al producto de la concentracin multiplicado por el volumen total utilizado o lo que es lo mismo pGLO(g)=(concentracin del plsmido (g/l) x (volumen de pGLO)) En este experimento se usaron 10l de plsmido pGLO a una concentracin de 0.08g/l lo que significa que cada microlitro de solucin contena 0.08 g de plsmido pGLO. Cantidad total de plsmido pGLO utilizado al inicio del experimento =

0.08
b) Cantidad total de plsmido pGLO (en la bacteria) que se perdi en el medio de cultivo Debido a que no todo el plsmido agregado a las clulas bacterianas, se perdi en el medio de cultivo, es necesario encontrar que fraccin de plsmido se encontraba esparcido en el medio de cultivo. Para hacer esto, es necesario dividir el volumen de plsmido entre el volumen total del liquido contenido en el frasco marcado como +pGLO con la siguiente frmula Fraccin de plsmido utilizado = Volumen contenido en el plato de cultivo Volumen total en el tubo +pGLO

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Nosotros esparcimos 100ul de clulas con plsmido pGLO de un frasco contenedor con un volumen de 510ul Fraccin de plsmido en el cultivo =

0.2
Para resolver la pregunta inicial que era determinar la cantidad de plsmido pGLO en el cultivo LB/amp/ara se necesit multiplicar la cantidad total de plsmido usado en el experimento por la fraccin de plsmido utilizado en el cultivo LB/amp/ara Cantidad de plsmido en el cultivo = cantidad de plsmido total x fraccion de plsmido

Cantidad de plsmido utilizado =

0.16
Nmero de colonias en el cultivo Microgramos de pGLO en el cultivo 360 0.16ug

Se utiliz la informacin de la tabla anterior para conocer la eficiencia de la transformacin Eficiencia de la transformacin = Nmero total de colonias en el cultivo Cantidad de plsmido en el cultivo

EFICIENCIA DE LA TRANSFORMACIN=

2250 transformantes/g
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ANLISIS DE RESULTADOS
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ANLISIS DE RESULTADOS
La transformacin bacteriana de la cepa E. coli K-12 se llev a cabo mediante la insercin del plsmido pGLO que contiene un gen que codifica para la produccin de la enzima beta-lactamasa que le confiere resistencia a las En los cuatro platos de transformacin, las bacterias que ms se asemejan al cultivo de E. coli inicial se encontraron en el plato marcado como LB, al cual no se le aadi el plsmido pGLO. Las bacterias transformadas se encontraron en los platos: LB/amp y LB/amp/arabinosa, a los cuales se les aadi el plsmido pGLO. Estas bacterias tomaron las caractersticas del plsmido y las expresaron eficazmente, ya que mostraron resistencia a la ampicilina gracias a la produccin de la enzima betalactamasa y en el plato de cultivo que contena arabinosa, las bacterias brillaron verde fluorescente bajo la luz ultravioleta debido a la activacin de esta caracterstica en presencia del azcar. Los antibiticos que se emplean para combatir infecciones bacterianas son de dos tipos: bactericidas, los cuales matan a las bacterias y bacteriostticos, los cuales inhiben el crecimiento bacteriano. La presencia de colonias en el plato de cultivo que contena ampicilina y en el cual se agreg E. coli, sugiere que la bacteria desarroll resistencia a la ampicilina. Para demostrar que efectivamente se llev a cabo la transformacin bacteriana, se compararon los platos marcados con LB/amp, en los cuales uno contena el plsmido pGLO y el otro no. Las bacterias presentes en el plato no tratado con el plsmido no crecieron. Por el contrario, las bacterias tratadas con el plsmido expresaron resistencia a la ampicilina y por lo tanto fueron transformadas genticamente. El uso de platos de control fue necesario para demostrar los resultados finales, as como para interpretarlos. En este experimento, los dos platos a los que no se les aadi el plsmido pGLO (-pGLO) actuaron como control. La comparacin entre el plato LB/amp sin pGLO y el mismo plato con el plsmido, demostr que la transformacin produjo colonias de bacterias que pueden crecer an en presencia del antibitico ampicilina. Por otra parte el plato de control LB, al cual no se le aadi el plsmido y que se asemeja al cultivo de E. coli inicial, puede ser comparado con cualquiera de los platos LB/amp para demostrar que se requiere el plsmido pGLO para que las bacterias

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crezcan ante la ampicilina. Sin el uso de estos controles, no se podra saber si las colonias de bacterias realmente fueron transformadas. Por otro lado, se describi una caracterstica en los platos de cultivo de bacterias que no fueron transformadas genticamente si los comparamos con el plato inicial de E. coli. Esta caracterstica es el color, ya que en todos los platos con bacterias, bajo luz normal, stas aparecieron del mismo color blanco que en el inicio. Sin embargo, tambin hubo caractersticas que cambiaron debido a la transformacin como: el color bajo la luz ultravioleta del plato LB/amp/arabinosa y la resistencia a la ampicilina de los platos con el plsmido pGLO. Mediante estos resultados, podemos concluir que los cultivos de bacterias en los platos con plsmido pGLO, expresaron correctamente el gen de la beta-lactamasa, el cual confiere a las bacterias resistencia a la ampicilina. Cuando expusimos la alcuota del plsmido pGLO original y el cultivo de E. coli inicial a la luz ultravioleta, observamos que estos no brillaba. Por lo tanto, podemos decir que la fuente de fluorescencia no fue ni el plsmido pGLO original ni el cultivo de bacteria original. Esto indica que la caracterstica fluorescente slo se adquiere a travs de la expresin de la protena verde fluorescente en la bacteria despus de la transformacin. La insercin de un mecanismo de regulacin gentica como lo es la sustitucin de los genes ara BAD (que codifican para las enzimas que metabolizan el azcar) por el gen que codifica para la GFP, demuestra, que es posible seguir con un biomarcador fluorescente la transformacin efectiva de la colonia de bacterias ya que nicamente en presencia de la arabinosa se expresa dicha protena. La evidencia final para demostrar que la transformacin gentica se llev a cabo es la siguiente: 1. Hubo presencia de colonias de bacterias en los platos transformados con el plsmido pGLO (LB/amp y LB/amp/arabinosa). 2. Hubo ausencia de colonias en el plato LB/amp que no fue transformado con el plsmido, por lo que estas bacterias no fueron resistentes a la ampicilina. 3. Las colonias de E. coli en el plato LB/amp/arabinosa brillaron de color verde fluorescente bajo la luz ultravioleta, ya que fueron transformadas genticamente y la arabinosa activ esta caracterstica.

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Los clculos de Eficiencia de transformacin, resultan, por lo regular, en nmeros muy grandes. Es por eso que utilizan un mtodo ms corto para referirse a ella; la notacin cientfica. El reporte en notacin cientfica de la eficiencia de transformacin en este experimento fue de 2.25 x 103. La eficiencia de la transformacin, es un valor cuantitativo usado para mostrar la efectividad al momento de insertar un plsmido en una bacteria. El resultado, representa el nmero de colonias transformadas producidas por microgramo de plsmido agregado.

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CONCLUSIONES
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CONCLUSIONES

La transformacin gentica bacteriana se realiz a travs de la transferencia de un plsmido a la bacteria E. Coli, para que est adquiriera resistencia a la ampicilina. El proceso fue confirmado satisfactoriamente a travs del mecanismo de regulacin del opern de la arabinosa cuya construccin gentica permite observar la produccin de la protena verde fluorescente en las bacterias transformadas. El mtodo que se utiliz para transformar genticamente las bacterias es relativamente sencillo, obtenindose resultados comprobables sin necesidad de procesos sofisticados. Se confirm que las caractersticas que proporcionan los plsmidos le otorgan ventajas a la bacteria, las cuales son tiles en la supervivencia de las bacterias en ambientes hostiles. A partir de esta investigacin comprendimos la importancia que tienen los procesos de ingeniera gentica en la vida actual. Desarrollamos una investigacin dirigida que nos permiti seguir los pasos de un mtodo cientfico formal y comprendimos a travs de ella la importancia de su aplicacin en la ciencia moderna.

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REFERENCIAS
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APNDICES

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APNDICE A
MEDIOS, SOLUCIONES Y MATERIAL BIOLGICO EMPLEADO Solucin de transformacin CaCl2 50 mM, pH 6.1 Medio de cultivo LB Triptona 10 g/l NaCl 5g/l Esterilizar en autoclave. Almacenar en fro. Material biolgico Se utiliz la estirpe de Escherichia coli HB101 K-12 y el plsmido pGLO que incluye el sitio de clonacin mltiple dentro de la secuencia del gen de -lactamasa.

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APNDICE B
GLOSARIO DE TRMINOS
Agar Provee un medio slido para el crecimiento de la bacteria. Contiene mezclas de carbohidratos, aminocidos, nucletidos, sales, y vitaminas. Seleccin de antibitico El plsmido utilizado para insertar genes en la bacteria tambin contiene el gen de la beta-lactamasa que provee resistencia a la ampicilina. Dicha protena es producida y secretada por bacterias que contengan dicho plsmido. La beta-lactamasa inhibe el efecto de la ampicilina y permite el crecimiento y reproduccin de la bacteria. Solo bacterias que cuenten con el plsmido que expresa la beta-lactamasa podrn sobrevivir en presencia de ampicilina. A esto se le llama seleccin de antibitico. Arabinosa Carbohidrato que las bacterias usan normalmente como fuente de alimento. Beta-Lactamasa Protena que provee resistencia al antibitico ampicilina. Es producida y secretada por bacterias que han sido transformadas con un plsmido que contiene el gen para la beta-lactamasa. Inhibe el efecto de la ampicilina presente en el plato Agar y permite el crecimiento y la expresin de genes adquiridos por la bacteria, en este caso el GFP. Biotecnologa Aplicacin de la Biologa en el mundo real a travs de la manipulacin de organismos vivos, especialmente a nivel gentico. Clonacin Proceso mediante el cual se hace crecer clulas genticamente idnticas provenientes de una sola clula. ste puede ser alcanzado siguiendo la divisin mittica de una clula transformada. Colonia Conjunto de bacterias genticamente idnticas creciendo en un plato agar. A dichas bacterias se les llama clones. Medio de Cultivo Cualquier sustancia o preparado utilizado para cultivar microorganismos. Los medios lquidos y slidos se refieren a LB (Luria Bertani) y agar, hechos a partir de un extracto de levadura. Se conforman de carbohidratos, aminocidos, nucletidos, sales, vitaminas, y todos aquellos nutrientes necesarios para el crecimiento de la bacteria. Cuando calentados, forman un gel slido. Ingeniera gentica La manipulacin del material gentico (ADN) de un organismo a travs de la insercin o eliminacin de genes especficos. Regulacin gentica Proceso qumico mediante el cual se afectan y regulan las acciones y productos llevados a cabo por los genes, principalmente para poder adaptarse a las condiciones del medio ambiente. Un buen ejemplo son los genes envueltos en el transporte y la metabolizacin de alimentos. Protena verde fluorescente Green Fluorescent Protein (GFP), por sus siglas en ingls, es originalmente extrada de la medusa Aequorea victoria. El gen para producirla fue recientemente clonado. Su conformacin nica de tres dimensiones causa que al ser expuesta a luz ultravioleta, libere energa en forma de luz color verde. Plsmido Una molcula circular de ADN, capaz de replicarse de forma autnoma y de llevar uno o ms genes que codifican de manera especfica.

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pGLO Plsmido que contiene la protena GFP y los genes que codifican para la creacin de la beta-lactamasa. AND recombinante Proceso de cortar y combinar fragmentos de ADN para alterar su estructura y/o funcin. Tcnica estril Minimizar la posibilidad de contaminacin bacteriana durante un experimento, utilizando cuidadosas tcnicas de laboratorio e higiene.

Sembrado Proceso de esparcir un asa de siembra con bacteria a travs de un plato agar. Vector Molcula de ADN de replicacin autnoma donde fragmentos de ADN ajeno se insertan y se propagan, por ejemplo, un plsmido.

Agradecimientos: A la Dra. Lourdes Ma. Barrera por su asesora y motivacin para la realizacin de esta investigacin. A la Dra. Isabel Sada Ovalle por su asesora en el laboratorio de Inmunoqumica del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias.

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APE ENDICE C FOTO OGRAFA AS

a)

b)

c)

d)

Serie 1. 1 Obtencin n de colonias s individuales de E. coli. a) Se resuspendi r el e plsmido pGLO p en solu ucin de trans sformacin b) ) Con el asa estril tocam mos la susp pensin y raspamos las placas. c) Se debi hace er con una secuencia s y solo 4 rayas s o cuadra antes. Se nos s recomend que estuvieran separado os o muy bie en distinguido os para que las colonia as se reprodu ujeran correc ctamente. Par ra las lneas subsecuente es, el objetivo o fue usar tan nta superfi icie en la plac ca, como fuer ra posible. Se e comenz la siguiente lne ea del otro lad do de la placa ay se rasp p adelante y hacia atrs durante d diez veces. v Giram mos la placa y repetimos el e procedimien nto .Giram mos de nuevo e hicimos la a ltima raya de bacterias s. d) Se colocaron los pla atos boca aba ajo dentro de la incubad dora a 37 C durante toda la noche.

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Fotogr rafa 2. Prepa aracin del rea de traba ajo

a)

b)

Serie 3. 3 Observaci iones de pre-transformac cin. a) Cult tivo inicial de e E. coli. b) Se S observ el e cultivos de e E. coli. inic cial con luz ultravioleta u pa ara determ minar sus prop piedades. c) se s observ el l vial ambar que q contena el plsmido para p comprob bar que tam mpoco posea a propiedades fluorescente es.

c)

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grafa 4. Conj jugacin del l plsmigo pG GLO con una a colonia de bacterias de e E. coli inici ial Fotog

Fo otografa 5. In ncubacin en n un bao de e agua a 42C C durante 50 0 segundos (Tcnica ( de choque de calor, paso1)

F Fotografa 6. Incubacin en e hielo dura ante 2 minut tos inmediata amente desp pus de la incub bacin en el bao b de agua (Tcnica de d choque de e calor, paso2)

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a)

b)

c)

d)

Serie 7. 7 Sembrado o de bacterias s transforma adas a) Iden ntificacin de placas segn n el diseo ex xperimental b) b Con un asa a estril se sembraron las bacteri ias en las placas con el medio correspo ondiente distr ribuyndolas en la superfic cie c) Apilado o de plac cas para su id dentificacin y almacenaje e d) incubaci n durante tod da la noche a 37C.

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