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Instituto Politecnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniera Campus Guanajuato

Avance de proyecto: Produccin de cido ctrico como resultado de la conversin de la lactosa con Aspergillus niger en un biorreactor Airlift.

Equipo # 3
Juan Cristbal Garca Garca Yoatzin Uriel Gurrola Reza Alexia Sofa Oliva Gonzlez Lesly Ornelas Lpez Karla Azucena Salazar Morin

Ingeniera de Biorreactores

Profesor: M. en C. Juan Carlos Rodrguez Sierra

Silao, Gto. a 2 de febrero de 2014.

Produccin de cido ctrico como resultado de la conversin de la lactosa con Aspergillus niger en un Biorreactor Airlift.
Objetivo Ejemplificar tericamente un proceso fermentativo con todos los requerimientos y variables a operar, con Aspergillus niger como microorganismo fermentativo, el biorreactor Airlift como recipiente donde se lleve a cabo tal bioproceso y la produccin de cido ctrico a base de suero de leche vacuna.

Justificacin La industria alimenticia genera muchos desechos orgnicos e inorgnicos los cuales pueden contaminar, por lo cual la biotecnologa como ciencia multidisciplinaria es capaz de tratar estos residuos y convertirlos en productos de consumo humano. El suero de leche es de los principales residuos de dichas fbricas con lactosa como fuente de carbono y por tanto un gran nmero de procesos fermentativos para la produccin de alcoholes, diversidad de cidos, glicerol, protenas, etc. El cido ctrico es uno de los principales conservadores de alimentos, por lo cual se decidi elaborar un bioproceso en el que como resultado obtengamos este compuesto. El uso de biorreactores en los bioprocesos es una herramienta muy importante, ya que es donde se lleva la conversin de la materia prima en el producto de inters; en este caso se emplear el biorreactor Airfilt conociendo as su funcionamiento y los requerimientos necesarios para llevar a cabo la conversin. Para la transformacin del sustrato en este caso la lactosa en cido ctrico, se usar como microorganismo Aspergillus niger, ya que presenta la habilidad de fermentar una gran variedad de fuentes de carbono, presentando altos niveles de rendimiento. Marco terico La industria alimenticia genera una gran cantidad de residuos orgnicos e inorgnicos, de caractersticas contaminantes; la biotecnologa es una excelente alternativa en la biodegradacin de estos desechos, convirtindolos en materias primas para la obtencin de importantes productos de consumo. Adems de ser una alternativa de produccin, la biotecnologa es una herramienta para el control de residuos contaminantes. El suero de leche es un medio de cultivo con la lactosa como fuente de carbono, y por ello se utiliza en un gran nmero de procesos fermentativos para la produccin de etanol, cido actico, cido lctico, cido propinico, cido glucnico, cido succnico, cido ctrico, glicerol, protena unicelular, enzimas (-galactosidasa o lactasa), grasas y aceites, butanol y acetona, polisacridos extracelulares y vitaminas, entre otros. (Betancourt, 2003, Snchez et al., 2005). Entre los microorganismos capaces de producir y acumular cido ctrico se encuentran las especies de los gneros Aspergillus, Citromyces, Penicillium, Monilia, Candida y Pichia. Las especies de Aspergillus negros y especialmente Aspergillus niger, son las ms empleadas en este tipo de produccin; las ms efectivas son las que presentan baja actividad de las enzimas isocitrato deshidrogenasa y aconitasa hidratasa y una alta actividad
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de la citrato sintetasa (Grewal and Kalra, 1995, Saniez, 1999, Anastassiadis et al., 2002, Betancourt, 2003). La produccin de metabolitos con hongos filamentosos se ve favorecida cuando se presenta un crecimiento en forma de pellets. En la produccin de cido ctrico con Aspergillus niger los niveles de los nutrientes y las condiciones ambientales, como pH, agitacin, temperatura, iones metlicos, concentracin de fosfato, fuente de nitrgeno y carbono, alcoholes y aditivos, son factores importantes que regulan la morfologa del microorganismo y el proceso fermentativo. Existen dos mtodos principales de produccin de cido ctrico, el cultivo superficial y el cultivo sumergido. En cualquier caso, es importante que los equipos usados sean de aceros inoxidables o impregnados de recubrimientos resistentes. Esto debido a las propiedades corrosivas del cido ctrico y a la gran sensibilidad de la fermentacin a trazas de metales. Generalmente, la inoculacin se efecta con esporas depositadas por aspersin en la superficie del medio depositado en charolas. Estas son posteriormente colocadas en anaqueles dentro de la cmara de fermentacin y ventiladas con aire filtrado. EL aire renueva el oxgeno necesario, remueve el CO2 producido y permite controlar la temperatura dentro de la cmara. La germinacin de las esporas ocurre a los dos das de inoculacin y la fermentacin dura un total de 9 a 12 das. Al final de esto, el micelio es separado por filtracin, lavado para remover el cido ctrico adherido y el lquido obtenido se mezcla con el licor residual antes de llevarse a separacin. En los procesos de cultivo sumergido se pueden usar tanques agitados con mltiples turbinas o fermentadores de torre tipo Airlift. Estos ltimos son favorecidos por mantener una buena oxigenacin a escalas mayores que las obtenidas econmicamente con tanques agitados. As mismo, los Airlift favorecen el crecimiento compacto del micelio en forma de pellets con las consecuentes ventajas de la hidrodinmica del medio. En este tipo de cultivos, la inoculacin se realiza indistintamente con esporas o con cultivo vegetativo crecido separadamente en un tanque alrededor del 10% del volumen del fermentador. Como se usar Aspergillus niger como biocatalizador del sustrato se deben conocer sus caractersticas, siendo estas las siguientes. La clasificacin taxonmica, o jerrquica, del Aspergillus niger lo ubica como especie Aspergillus niger, del gnero Aspergillus, de la familia Trichomaceae, del orden Eurotiales, del filo Ascomycota y perteneciente al reino Fungi. El gnero Aspergillus incluye ms de 185 especies similares al A. niger. Es un hongo muy comn, que se encuentra principalmente en el suelo, en la vegetacin y tambin posible encontrarlo en alimentos en descomposicin, sobre todo de origen vegetal, como frutas y tortillas. Es ampliamente utilizado en la industria alimenticia para producir una serie de enzimas y cidos para usar en los alimentos procesados.
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Es importante conocer algunas de sus caractersticas morfolgicas para su identificacin. Caractersticas morfolgicas: Color de conidios: Negro Mtula: Si/ No Vescula: Globosa. Conidiforo: Liso Otros: Esclerocio.

Figura 1. Aspergillus niger.

La mayora de los hongos crecen en medios de cultivo con un alto contenido de carbohidratos y en condiciones de pH que van de 5 a 6. Comnmente las cepas de A. niger empleadas son de un medio de cultivo aislado y controlado, en este caso ser as. Para reanimar la cepa es necesario inocularla primeramente en un medio en el cual pueda reproducirse fcilmente, uno de los medios de cultivo ms empleados para el crecimiento de hongos es el agar papa dextrosa (PDA). Medio de cultivo empleado: Agar PDA (papa dextrosa). Componentes para 1 L. Papas peladas y cortadas 200g Dextrosa (glucosa) 20g Agar 17g

Cocinar las papas peladas y partidas en 500 mL de agua durante una hora, simultneamente disolver agar en otro recipiente de agua (calentandolo a bao mara). Una vez pasada la hora filtrar con gasas la solucin de papa, mezclar el filtrado con el agar disuelto en agua y aforar a 1000mL. Esterilizar en autoclave a 15 lb. Tambin puede conseguirse el extracto de papa mediante un proveedor, como medio nutritivo agar PDA, para la preparacin del agar se siguen las instrucciones del proveedor. Se ha observado que se obtiene un alto rendimiento en la produccin de cido ctrico cuando existe una alta acumulacin de este en el micelio, que puede estar asociada con una alta concentracin de glucosa y de oxgeno disuelto en el medio lquido (Papagianni, 2007; Wolschek y col., 1999). Es importante entonces conocer la ruta metablica que sigue el Aspergillus niger, bsicamente para conocer que sustratos necesita para la produccin de cido ctrico, y para observar si existen subproductos que puedan interferir en la cuantificacin de este. La siguiente imagen se muestra un mapa simplificado de la ruta metablica que sigue A. niger para degradar glucosa.

Figura 1. La red metablica simplificada en la que se basa el modelo estructurado de Aspergillus niger, que incorpora al ciclo de los cidos tricarbixlcos o ciclo de Krebs (CAT), a la ruta de las pentosas-fosfato (PF), a la ruta EmbdenMeyerhof-Parnas (EMP) o glicolisis y a las reacciones que producen biomasa, que han sido agrupadas (Reyes & Gonzlez, 2013)

Se puede observar que la fuente de carbono necesaria es la glucosa, por lo cual se emplear el suero de leche para la elaboracin del producto de inters. El cido 2-hidroxi-1,2,3-propano tricarboxilico es comnmente conocido como cido ctrico su importancia en la industria es debido a tres de sus propiedades, acides, sabor y formacin de sales. Toma los valores de pH de 3.2, 4.7 y 6.4.
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Puede ser extrado del jugo de frutas ctricas agregndole oxido de calcio o citrato de calcio que es un precipitado insoluble que se puede recolectar por filtracin. Es principalmente producido por fermentacin. La fermentacin de glucosa del A. niger resulta ser ms econmica que la obtencin por sntesis qumica pues requiere de poco sustrato para obtener una mayor cantidad de producto. Las sales que forma, llamadas citratos, con el cobre, hierro, manganeso, magnesio y calcio son la razn de que sea usado en procesos industriales. Tiene propiedades antioxidantes en grasas y aceites. Da un sabor de acidez y mejora los sabores de otros alimentos. Algunas ms de las aplicaciones del cido ctrico se muestran en la Figura 3.

Figura 3. Aplicaciones del cido ctrico. Se muestra el tipo de industria, la propiedad que aprovecha, el uso que se le da y el porcentaje del diferente tipo de mercado (Kristiansen, et al, (2002)).

Utilizar cepas de hongos filamentosos tiene la ventaja de que pueden tolerar altas concentraciones iniciales de azcares lo cual hace posible que la conversin sea rpida. La produccin en lote es una de las ms comunes, se comienza introduciendo el inoculo activado (Aspergillus niger). El sustrato suele tener una concentracin de 10-15%. Toma cerca de 5 das en fermentar en condiciones aireadas a 30C, se provee de una agitacin en el medio. Se debe controlar los niveles de trazas de hexocianoferrato de potasio en el medio
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formadas en el proceso. Pellets de cido ctrico son formados, el dimetro ideal de estos pellets es de 1.2 a 2.5 mm pasado este tiempo. El recipiente donde se llevar a cabo el bioproceso mencionado es el biorreactor Airlift, del cual sus caractersticas se muestran a continuacin. El termino reactor airlift (ALR) cubre un amplio rango de reactores con agitacin neumtica. La diferencia de columnas de burbujeo y Airlift es que en la columna solo sube el gas y en el Airlift se recircula.

Figura 2. Biorreactor Airlift.

El Airlift es un reactor de al menos dos fases, con una gran diferencia de densidad entre ellas, cuya agitacin es neumtica.

Posee un deflector que lo divide en dos zonas conectadas hidrulicamente en el fondo y en la parte superior. Slo en una de estas zonas se suministra gas, zona de ascenso. La mayor zona con suministro de gas (ascendente) respecto de aquella sin suministro (descendente) provoca una diferencia de la densidad media del fluido entre ambas zonas, induciendo una circulacin del lquido con un patrn cclico definido, con direccin hacia arriba en la zona de ascenso y hacia abajo en la zona de descenso. El airlift es un biorreactor ideal para microorganismos y cultivos que requieren de una agitacin suave. Configuraciones External loop vessels. La circulacin y recirculacin toman lugar a travs de dos conductos separados y distintos. Baffled (Internal loop vessels). Los deflectores estn estratgicamente colocados en un solo recipiente, para crear los canales de circulacin necesarios.

Secciones Todos los airlift independientemente de su configuracin, tienen cuatro secciones. Riser El gas es inyectado en el fondo a esta seccin donde el flujo del gas y liquido van predominantemente hacia arriba.

Downcomer Es paralela al riser y est conectado a l en el fondo y hasta arriba. El flujo del gas y del lquido van predominantemente hacia abajo. Base Es una zona donde el riser y el downcomer se conectan, el diseo de esta seccin puede influenciar la subida de gas, la velocidad del lquido y el fluido de la fase slida. Separador de gas Es la seccin de la parte alta del reactor, conecta el riser y el downcomer, facilitando la recirculacin del lquido y la retirada del gas.

Ilustracin 3. Partes que conforman el Biorreactor Airlift.

Factores que influyen en la operacin. Soporte.- Que es el medio de cultivo, que debe ser barato, eficiente y estable. Temperatura.- Depender de las condiciones de operacin del microorganismo pH.- Depender de las condiciones de operacin del microorganismo Velocidad de flujo de entrada del gas.- Es un parmetro muy importante, dado que regula el rgimen de flujo dentro del biorreactor, as como la transferencia de masa entre las fases. Tiempo de Residencia de la Fase Gaseosa.- Est directamente relacionado con el flujo de entrada, mientras mayor sea el tiempo de residencia, mayor ser el contacto entre el contaminante y los microorganismos degradadores. Una velocidad de flujo de gas alta, reduce la eficiencia de la degradacin.
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Control de la biomasa.- Esta se destaca debido a su relacin directa con la eficiencia de eliminacin del gas contaminado.

Referencias Garca, G., Quintero, R. & Lpez, M. (2004) Biotecnologa alimentaria, Editorial Limusa, Mxico, D.F. Lpez, C., Zuluaga, A., Herrera, S., & Ruiz, A. &. (noviembre de 2006). Produccin de cido ctrico con Aspergillus niger NRRL 2270 a partir de suero de leche. Dyna, 73(150), 39-57. Reyes-Ocampo, M. Gonzalez-Brambila y F. Lopez-Isunza. Un anlisis del metabolismo de A. Niger creciendo sobre un sustrato slido. Revista Mexicana de Ingeniera Qumica. http://www.redalyc.org/pdf/620/62028007005.pdf Aspergillus niger. Recuperado el 1 de febrero de 2014 de: http://www.ehowenespanol.com/clasificacion-del-aspergillus-niger-sobre_47007/ Morfologa de Aspergillus niger. Recuperado el 1 de febrero de 2014 de: http://www.unsa.edu.ar/matbib/hongos/04htextoaspergilos.pdf Aspergillus niger. Recuperado el 31 de enero http://www.gefor.4t.com/hongos/aspergillusniger.html de 2014 de:

Betancour Garcs, A. (2003). Obtencion de cido ctrico a partir de suero de leche por fermentacin en cultivo lquido. Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ingenieria y Arquitectura, Ingeniera Qumica, Manizales. Kristiansen, B., Mattey, M., & Linden, J. (2002). Citric Acid Biotechnology. Taylor & Francis e-library. Najafpour, G. D. (2007). Biochemical Engineering and Biotechnology. Amsterdam, Paises Bajos: Elsevier. Escobar A., Claudio, Bravo R., Loreto, Diseo y caracterizacin hidrodinmica de un reactor Airlift, Universidad de Chile, Santiago de Chile. Recuperado el 17 de agosto de 2013 de: http://www.ciiq.org/varios/peru_2005/Trabajos/I/1/1.1.05.pdf J.C. Merchuck., M.Gluz. Biorreactor, air-lift reactors. Ben-Gurion University of the Negev. Beer-Sheva, Israel.

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