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Caracterizacin molecular de microorganismos para distintas muestras de suelo de la ciudad de Mxico mediante RAPDs
Cuevas Cosme Juan Carlos, Martnez Len Ral, Prado Rojas Omar, Ramrez Aguilera Edgar Alejandro Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologa- Instituto Politcnico Nacional, Av. Acueducto s/n, Barrio La Laguna, Ticomn, Del Gustavo A. Madero, C.P. 07340, Mxico, Distrito Federal.
RESUMEN En las ltimas dcadas, la tcnica de RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) basada en la tcnica de PCR (Polimerase Chain Reaction) ha sido una de las tcnicas ms usadas en la rama de la biologa molecular, sin embargo esta tcnica se ha tomado tambin para otras ciencias como lo es la ingeniera Ambiental gracias a la identificacin de algunos organismos de gran inters. La tcnica RAPD-PCR consiste en la amplificacin enzimtica de fragmentos de ADN, utilizando cebadores de secuencia arbitraria que hibridan aleatoriamente en todo el genoma. Ello revela la existencia de polimorfismos que son utilizables como marcadores genticos y taxonmicos en todo tipo de organismos, y entre ellos, insectos, dpteros y de microorganismos en suelo, aire y aguas (P. Guairo, 1994) este estudio tiene como objetivos 1. 2. 3. 4. Aplicar el conocimiento terico sobre la tcnica de RAPD para su correcto desarrollo. Realizar la caracterizacin de nuestra muestra de DNA Obtener fragmentos de DNA en regiones aleatorias del genoma. Observar el polimorfismo que se observa entre las distintas muestras.
INTRODUCCION La variabilidad gentica o diversidad molecular, adems de comenzar a tener una importancia para la evolucin, un ejemplo,
para verificar la afinidad y los limites entre especies para detectar formas de reproduccin y estructuras familiares. Para evaluar niveles de migracin y dispersin en poblaciones y para identificar especies en
Muestra 1 2 3 4 5 6 7
Fuente de la muestra Bosques de Nativitas Maceta Parque recreativo Jardn casero Rio de los remedios Gasolinera Huerta (limones)
Las reacciones PCR se realizaron bajo las siguientes condiciones en un termociclador (ver tabla 3 )
Tabla 3 Parmetros y ciclos controlados durante la PCR
Extraccin de DNA Se utilizo muestras de DNA ya extraido previamente (practica 1) el cual se mantuvo en congelacin Amplificacin de fragmentos RAPD La mezcla de reaccin para un total de 25 L contuvo; 2.5 L de dNTPs (200 M) ; Buffer enzima (1X) 2.5 L; 1 L de MgCl 2, Agua estilada 19 L. el contenido apropiado de cada uno de los reactivos ates mencionados son fundamentales para el xito del mtodo Se tomo 18.2 L de la mezcla de reaccin para que se mezclara con 4.0 L del indicador o primer (20 pMol)*; 100 ng de DNA (aproximadamente 2.5 L, pero depender de la concentracin del DNA); 1.5 U de Taq polimerasa (0.3 L). Estas concentraciones y volmenes de reaccin fueron para cada muestra en tubos individuales
Tiempo 1 min 30 seg 30 seg 90 seg 38 seg 30 seg 90 seg 150 seg
Temperatura, C 99 94 35 72 94 35 72 72
Los productos de la amplificacin fueron separados mediante la tcnica de electroforesis en gel de agarosa, aplicndole una corriente elctrica por aproximadamente 1.5 horas, el colorante usado fue Rojo Texas, y con buffer de corrimiento TAE (tris, Acido Actico y EDTA)
Figura 1 Fragmentos de DNA separados mediante electroforesis en ge de agarosa visualizados en luz ultravioleta. a) corrimiento de DNA antes de aplicar la tcnica de RAPD, b) Extraccin y corrimiento de DNA despus de aplicada la tcnica de RAPD,: MPM: Marcador de peso molecular; MPM: Marcador de peso molecular; (1) muestra de bosques de nativitas; (2) muestra de maceta; (3) Parque recreativo; (4) Jardn Casero; (6)Gasolinera; (7) Huerta
En la figura 1a anterior se observa que se la mayora de las muestras presentaban DNA, a excepcin de la muestra 5 , sin embargo despus de aplicar la tcnica de RAPD no se observa corrimiento de DNA en ningno de los pozos, pero se aprecia un ligero corrimiento muy tenue en el carril 6 (muestra de la Gasolinera). Esto se atribuye principalmente a la mala calidad del DNA, ya que el PCR es una reaccin enzimtica, por lo tanto depender de la concentracin de la pastilla del DNA, concentracin de los componentes, y las condiciones de ciclos del PCR cualquier variable en los parmetros antes mencionados, pueden modificar notoriamente los resultados , por lo tanto esta prueba es dependiente de las
condiciones y manejo de los reactivos (Senthil Kumar N., 2011) Se atribuye directamente a la mala calidad del DNA o a la inexistencia del DNA til, ya que en la figura 1b no se observa la presencia del DNA, dado que se usaron las mismas muestras que en la figura 1a se esperara observar por lo menos las mismas bandas que en la figura 1a independientemente si el primer utilizado para RAPD se hibridara con la cadena de DNA, La calidad del DNA es un factor muy importe que siempre definir el xito de la prueba de DNA, la presencia de grandes concentraciones de RNA funcionan como agentes quelantes que secuestran al ion Mg+2, que es el un factor importante para la
Figura 2 Resultados obtenidos para la caracterizacin molecular mediante RAPD de una coleccin de nopal donde Ita, Rey, Car etc, son tipos distintos de Nopales y las flechas muestran la accin de un primer enesos 3 tipos de nopal, porque aumenta su concentracin (visualizado en brillo) con respecto a los otros tres
Bibliografa
C.Mondragon, J. (2013). Caracterizacin molecular mediante RAPDs de una coleccin de nopal de (opuntia spp. cactaceae) del centro de Mxico, como base del mejoramiento gentico. Chapingo . Guirao, P., Beitia, F., & Cenis, J. L. (1994). Aplicacin de la tcnica RAPD-PCR a la taxonoma de moscas blancas (Homoptera, Aleyrodidae).http://www.magrama.gob.es/ ministerio/pags/biblioteca/revistas/pdf_plag as%2FBSVP-20-03-757-764.pdf Senthil Kumar, N., & Gurusubramanian, G. (2011). Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) markers and its application . Science Vision.http://www.sciencevision.org/current _issue/dl/Science%20Vision%20433%20Senthil%20Kumar.pdf