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AVALIAO MICROBIOLGICA DA EFICINCIA DE UM PROCESSO DE SANITIZAO DE LATES DE LEITE COM OZNIO

Microbiological evaluation of a milk container sanitizing processing with ozone
Claudia Catelani Cardoso ' Joo Evangelista Fiorini 2 Jos Wilson Brasil Gurjo 3 Luiz Carlos do Nascimento * Luiz Augusto do Amaral 5

RESUMO
Estudou-se a eficincia de um processo de sanitizao de lates plsticos de leite com gua ozonizada sob presso, comparando-se as contagens (NMP) de coliformes totais, E. coli e mesfilos aerbios, pr e ps-lavagem do sistema proposto e do convencional. As amostras foram coletadas da parede e do fundo dos lates, pela tcnica do "Swab". A porcentagem de reduo encontrada mostrou haver diferenas significativas (p < 0,0001) entre as amostras sobre a reduo do nmero de microrganismos nas contagens realizadas do sistema proposto e entre os sistemas quanto ao nmero de microrganismos mesfilos e ao NMP de coliformes totais (ANOVA, teste de Bartlett) Key words: ozone, sanitization, dairy industry, milk, container.

INTRODUO A adeso de sujidades e microrganismos s superfcies e o desenvolvimento do chamado biofilme pode ocorrer em diversos ambientes, gerando problemas econmicos e sade, aumentando a resistncia bacteriana (Holah et ai., 1990) ou ainda diminuindo a ao dos desinfetantes (Dunnsmore et ai., 1981, Maris, 1992, Zottola, 1994; Wong & Cerf, 1995) . A sanitizao consiste em um conjunto de processos empregados para diminuir a contagem microbiana de utenslios usados na indstria de alimentos a fim de eliminar microrganismos patognicos e alteradores de alimentos (Rocha et.al 1985). Pode ser realizada por meios fsicos ou qumicos. Na sanitizao por meios fsicos so empregados calor na forma de vapor; gua quente e a radiao ultra-violeta. (Pinheiro et ai., 1978). Pelo uso de agentes qumicos pode ser empregada uma srie de compostos dotados de poder bactericida, desde cidos orgnicos at agentes umectantes complexos. Na prtica, principalmente por razes econmicas, os compostos clorados; os iodados e os quaternrios de amnia so os mais utilizados (Andrade & Martyn, 1982). Recentemente enfermidades associadas novas cepas de microrganismos tais como a Listeria tem despertado o interesse por novos processos de

sanitizao na indstria de alimentos (Granam, 1997). O gs oznio um deles pois, segundo Torres (1996), sua ao sobre os microrganismos to eficaz quanto a do cloro, alm de no deixar resduos txicos ou carcinognicos nos alimentos, se concentraes adequadas forem utilizadas (Bourbigot et ai, 1986). Alm disso, foi reconhecido como seguro para a higienizao de garrafas de gua {General Recognized As Safe-GRAS) (Graham, 1997) pela Federal Drug Agency americana. O oznio exerce efeito sobre biomateriais e clulas bacterianas atravs da oxidao dos grupos sulfidrila desses, levando destruio dos aminocidos (Mudd et ai, 1969) e do DNA polimerase I e impedindo formao de ligaes (crosslinks) entre o DNA e as protenas (Hamelin et ai, 1977; Chen et ai 1992). Quimicamente o oznio se constitui na forma triatmica e instvel do oxignio, formado pela excitao do oxignio molecular oxignio atmico, em um ambiente energizado que permite a recombinao do oxignio em oznio. um forte agente oxidante, com um potencial de oxi-reduo de 2,07V(Block, 1994). temperatura ambiente um gs de colorao azulada porm, nas concentraes utilizadas com propsitos de desinfeco, sua cor no notada (Rice, 1986). O mtodo de gerao de oznio por descarga corona o mais utilizado para aplicaes

2, 4 Depto de Biologia. Lab. de Biologia e Fisiologia de Microrganismos, Unifenas Alfenas, MG. 3 Consultor de Processos- Rio de Janeiro-RJ. 5 Depto de M. Veterinria Preventiva, UNESP Jaboticabal-SP.

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Rev. Inst. Latic. "Cndido Tostes", Set/Out, n 310, 54: 13-21, 1999 remoo do oxignio residual tem aumentado e renovado o interesse das indstrias farmacutica c alimentcia pelo oznio, como esterilizante (Gurley, 1985, Torres et ai., 1996). Por ser um oxidante potente, os efeitos txicos do oznio em meio aquoso tm sido estudados (Bourbigot et ai., 1986, Chen et ai., 1992, Filippi, 1997, Menzel, 1984). Alguns estudos evidenciaram que quando doses suficientes de oznio so utilizadas no tratamento da gua, este pode eliminar e evitar o aparecimento de produtos mutagnicos e outros estudos, que o mesmo no possui potencial carcinognico forte. O efeito desinfetante ou esterilizante do oznio, porm, est relacionado demanda orgnica desta gua. A quantidade de oznio aplicada gua, segundo alguns autores, deve ser suficiente para oxidar ambos, ou seja, matria orgnica e microrganismos presentes na mesma (resposta ou efeito total ou nulo) (Gurley, 1985). J Katzenelson et ai (1974) e Kim et ai (1980) consideram que exista uma relao dose resposta para o oznio. Tal fato foi observado tambm por Akey & Walton (1985 e 1980). As concentraes do oznio em gua so reduzidas mais rapidamente em altas temperaturas porm a eficincia bactericida do oznio dissolvido em gua maior em temperaturas acima de 25C, possivelmente devido ao sinergismo entre a oxidao e a destruio trmica. Apesar disso a varivel mais importante para se garantir a efetividade do oznio a quantidade de oznio transferida gua. Na prtica, o oznio aplicado em altas doses (0,5 - 10mg/l) por longos perodos de contato (5 - 15min). Para a esterilizao da gua na indstria farmacutica, por exemplo, utiliza-se de 2 - 5mg/l por um perodo de no mximo 5 minutos (Gurley, 1985). Tendo em vista a importncia da sanitizao para a qualidade do leite e as vantagens que as propriedades desinfetantes do oznio poderiam trazer para a indstria de laticnios, o presente trabalho teve como objetivo primordial avaliar microbiologicamente a eficincia do processo proposto.
MATERIAIS E MTODOS

comerciais onde o oxignio ou o ar passa entre dois eletrodos separados por um meio de cermica dieltrico (Wickranayabe, 1991). Em soluo aquosa o oznio pode atuar sobre vrios compostos orgnicos, como demonstrado abaixo, atravs de duas vias (Hoign, 1985): - por reao direta com as molculas de oznio e - por reao indireta com as espcies radiclicas que so formadas quando o oznio se decompe na gua. O oznio, como outros oxidantes, pode ter sua atividade influenciada pela presena de materiais oxidveis presentes no meio, de microrganismos e de radiao ultra-violeta, entre outros. Trata-se de um gs potente porm instvel que deve ser produzido no local a ser utilizado (Boot, 1991, Hiddink, 1995; Torres, 1996) mais estvel na sua fase gasosa do que aquosa. Sua hemivida na fase gasosa temperatura ambiente de 12 horas enquanto que em soluo aquosa menor que trinta minutos (Torres et ai., 1996). A taxa de decomposio do oznio em solues aquosas aumenta tambm com a turbulncia e em presena de pH alcalino (Block, 1994). Dissolvido em gua, o oznio gera reaes radiclicas e inicas menos arriscadas que as exclusivamente radiclicas produzidas pelo gs, que podem entrar em contato diretamente com o epitlio pulmonar, se inaladas (DaH'Aglo, 1998, comunicao pessoal). O oznio porm, um gs parcialmente solvel em gua e sua autodecomposio produz numerosos radicais livres sendo que o radical hidroxila (OH-) o mais proeminente. medida que o pH de solues contendo oznio dissolvido aumenta, a taxa de decomposio de oznio produzindo radicais livres hidroxilas tambm aumenta tanto que a um pH de 10 o oznio se decompe instantaneamente. Embora os radicais livres hidroxilas resultantes sejam os mais fortes oxidantes estes se decompem em fraes de segundos. Portanto para a produo de gua ozonizada, a presena do oznio molecular necessria para garantir a desinfeco. A hemivida do oznio em soluo aquosa depende tambm da demanda de oznio molecular presente na mesma (Gurley, 1985; Graham, 1997). .Embora o oznio seja doze vezes mais solvel em gua que o oxignio, sua baixa presso parcial faz com que se torne difcil a obteno de muitos miligramas/litro, sob condies normais de temperatura e presso. O oznio deve ser adequadamente distribudo para demonstrar seu efeito esterilizante. Para tanto faz-se necessria a formao de uma fina emulso entre oznio e a gua. Essas emulses podem ser criadas por difuso de bolhas finas; bombas injetoras e por turbinas emulsificantes. Recentemente o melhoramento nos designs modernos dos geradores, a diminuio de custos dos mesmos e os processos de

A pesquisa foi realizada nas dependncias de uma estao de lavagem de lates de leite, implantada provisoriamente na Horta Comunitria do municpio de Divisa Nova - MG, onde foi instalado um prottipo1' para este fim, e no laboratrio de Pesquisas de Biologia e Fisiologia de Microrganismos da Universidade de AlfenasM.G, onde as amostras foram processadas. O prottipo foi projetado pelo engenheiro qumico Jos Wilson Brasil Gurjo, com tecnologia e equipamentos da empresa White Martins Gases Industriais S/A.

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Rev. Inst. Latic. "Cndido Tostes", Set/Out, n 310, 54: 13-21, 1999 No Laboratrio de Pesquisas foram analisadas 112 amostras de lates de leite de plstico coletadas atravs de swabs, correspondentes a amostragem de 28 lates (2 amostra antes da sanitizao e-2 aps) oriundos das fazendas da regio de Divisa Nova -MG, escolhidos aleatoriamente. Usando a mesma metodologia foram analisados 11 lates submetidos a lavagem convencional no laticnio que recebe lates de leite da regio. Sistema de higienizao de lates de leite por meio de equipamentos com spray com oznio dissolvido em gua O sistema empregado era composto de um reservatrio de PVC, um sistema de dissoluo de oznio, 2 bombas sendo 1 monofsica e uma bomba multi-estgio de alta presso, um gerador de oznio, um bico de pulverizao de ao inox, alm de uma fonte de oxignio puro (White Martins Gases Inds. S/A), de tubos e conexes. A gua ozonizada utilizada na lavagem por pulverizao era proveniente de um reservatrio onde o oznio havia sido introduzido e a concentrao de oznio dissolvido na mesma era mensurada no momento da desinfeco atravs de monitores do tipo residual ozone system (ROS) com instrumento indicador model 26506 e sensor 31.331.15 (Orbisphere Laboratories). O sensor deste instrumento composto por uma clula eletroqumica do tipo Clark onde o ctodo de ouro, o nodo de prata e o eletrlito de brometo de potssio aquoso so isolados da amostra a ser medida por uma membrana impermevel gua porm permevel ao gs, que mede o resduo de oznio por diferena de condutividade. O sistema era acionado 20 minutos antes do incio da lavagem dos lates a fim de se obter a saturao de oznio dissolvido na gua do reservatrio e oscilou entre 3,0 e 4,0 mg/l, em funo das caractersticas da gua e da temperatura ambiente. Manipulao dos lates durante a experimentao e processo de lavagem. Antes da coleta das amostras, o lato era mantido na posio invertida durante dois minutos Tabela 4 - NMP de

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em um suporte (pingadeira) para a drenagem do excesso de lquido e, ento, colocado em suporte adaptado para a coleta das amostras. Aps a coleta da amostra este era transferido para o suporte para a lavagem por meio de equipamentos com "spray", tambm em posio invertida. O processo de lavagem era composto de duas fases. Durante a primeira, um jato de "spray" contendo uma soluo de gua e tensoativo noinico (Liquid Force-Ecolab) (0,2 ml/litro), trocada a cada de 3 lavagens, e que durava 2 minutos, promovia-se a limpeza do lato. Durante a segunda fase, um jato de gua com oznio dissolvido, que durava 2 minutos tambm, promovia a o enxgue e a desinfeco. Procedimento de coleta das amostras dos lates As referidas amostras eram coletadas atravs de "swabs" de algodo esterilizados (APHA, 1978) e a rea testada era delimitada por um gabarito de ao inoxidvel de 20 x 2,5 cm. Duas amostras eram coletadas antes da sanitizao e duas aps sendo uma composta de cinco pontos das paredes e a outra do hemi-crculo do ngulo ("quina") do fundo do lato, de forma que de ambos os pontos fosse amostrada uma rea de 250 cm2, como o preconizado pelo "Standard Methods for Examination of Dairy Products (1978). Anlises microbiolgicas As amostras foram avaliadas quanto ao nmero mais provvel (N.M.P.) de coliformes totais e E. coli e microrganismos mesfilos segundo a metodologia do substrato cromatognico definido, descrita no "Standard Methods for Examination of Water and Wastewater" (EATON et ai, 1995) e registrada no DOI/DIPOA no 013/97, atravs do teste comercial Colilert e Simplate (Idexx Laboratories Inc.). RESULTADOS E DISCUSSO As tabelas a seguir expressam os nmeros de microrganismos por cm2.

E. coli 1 cm2 da parede e do fundo de lates de leite, pr e ps-lavagem com oznio. NMP de E.coli/cm2 Pr-lavagem Ps-lavagem 0* 0* 100 100 0,3 0,1 0,9x10' 0,3x10' Porcentagem de Redu o

PAREDE FUNDO

Os nmeros expressos significam a mdia EPM de n=26 amostras. *P<0,0001, teste"t"deStudent.

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Pg. 16 Tabela 5

Rev. Inst. Latic. "Cndido Tostes", Set/Out, n 310, 54: 13-21, 1999 NMP de coliformes totais / cm2 da parede e do fundo de lates de leite, pr e ps lavagem com oznio. NMP de coliformes totais/cm2 Pr-lavagem PAREDE FUNDO Ps-lavagem 95,82 99,83 Porcentagem de Reduo

Os nmeros expressos significam a mdia EPM de n=26 amostras. *p<0,0001, teste"t"de Student. **p<0,0002, teste"t"de Student. Tabela 6 - NMP de microrganismos mesfilos/cm2 da parede e do fundo de lates de leite, pr e ps lavagem com oznio. NMP mesfilos (UFCs/cm2 ) Pr-lavagem PAREDE FUNDO Os nmeros expressos significam a mdia EPM de n=28 amostras. *p<0,01, teste"t"de Student. **p<0,0018, teste"t"de Student. Tabela 7 - NMP de microrganismos mesfilos/cm 2 da parede de lates de leite, pr e ps-lavagem lavagem pelo sistema convencional (tipo tnel) e pelo proposto. NMP mesfilos (UFCs/cm2 ) Pr-lavagem Convencional Proposto * F= 4,823 (ANOVA) p<0,0041, Bartlett. Tabela 8 - NMP de E.coli/ cm2 da parede de lates de leite, pr e ps pelo lavagem pelo sistema convencional. NMP /cm2 Pr-lavagem E.coli 0* Ps-lavagem Porcentagem de Reduo Ps-lavagem 99,07 98,37 Porcentagem de Reduo Ps-lavagem 98,37 99,72 Porcentagem de Reduo

Os nmeros expressos significam a mdia EPM de n=ll amostras *p<0,0001, teste"t"de Student. Tabela 9 - NMP de coliformes/cm2 da parede de lates de leite, pr e ps-lavagem lavagem pelo sistema convencional (tipo tnel) e pelo proposto. NMP me&im (UFCs/cm2) Pr-lavagem Convencional Proposto *=teste "t" de student p<0,0015 F= 13,649 (ANOVA), p<0,0001, Teste de Ps-lavagem Porcentagem de Reduo

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Observa-se nas tabelas acima que a menor porcentagem de reduo do sistema proposto foi obtida para o nmero de coliformes totais da parede dos lates. A presena do biofilme, que segundo Shin-Ho-Lee & Frank (1991) e Stickler et a/.(1989) pode se formar em um perodo relativamente curto, pode ter influenciado os resultados levando a uma contaminao inicial muito alta. Mesmo assim os resultados foram significativos em nvel de 1%. Houve diferena significativa tambm entre os processos como pode ser notado na figura seguinte: A lavagem pelo sistema convencional promoveu redues significativas quanto ao NMP de coliformes totais e E.coli (teste "/" de Student) porm no promoveu reduo significativa do nmero de mesfilos aerbios. Segundo a APHA, a superfcie ps-sanitizao deve conter no mximo 2 UFC/cm2 de microrganismos mesfilos. Considerando este valor, a contaminao inicial deveria ser no mximo de 2,08 x IO2. Para a realidade nacional, ANDRADE et ai.(1995) propuseram o valor mximo de microrganismos mesfilos/cm2 igual a 50 e nesta tica deveramos partir de no mximo 5,2 x IO3. Houve diferena significativa entre as amostras coletadas no laticnio (que sofreram a lavagem convencional) e as coletadas na miniestao. O tempo de permanncia do leite nos lates pode ter influenciado tais resultados. Os resultados com o oznio em relao aos microrganismos mesfilos mostraram que as porcentagens de reduo (RD) foram mais satisfatrias que as obtidas por Rocha et ai (1985) na sanitizao batedeiras de manteiga com vapor (RD=86,10) e por Rocha et ai (1986) na sanitizao de tanques de coagulao de queijo (RD=53,76), tambm com vapor. Ressalta-se

ainda que o sistema proposto utilizou uma deterso mais branda (a base de tensoativo no-inico) que as dos experimentos citados anteriormente e partiu de uma contaminao inicial superior. Houve diferena significativa (ANOVA, teste de Bartlett) entre o sistema proposto e o sistema convencional quanto a reduo do NMP de coliformes totais e ao nmero de microrganismos mesfilos. O sistema simples e necessitar de no mximo um funcionrio para oper-lo, o que levar a realizao de lavagens contnuas e a reduo do tempo entre elas. Tal fato poder tambm otimizar os resultados uma vez que a formao do biofilme ser inibida. O sistema proposto poder lavar adequadamente lates de plstico que podero ser utilizados em maior quantidade que os de ferro, diminuindo assim de 15 para 3 quilogramas de peso/ lato a ser transportado. Ainda em relao ao transporte, como o sistema proposto poder ser implantado em ncleos prximos aos produtores rurais, os mesmos no devero obrigatoriamente ser lavados no laticnio diminuindo assim custos com o transporte por longas distncias e, indiretamente, o tempo de permanncia do leite dentro dos lates. Nesses ncleos poder funcionar uma pequena plataforma de recebimento com um resfriador comum (tanque de espanso) e o leite, sendo resfriado mais rapidamente, ter uma melhoria na sua qualidade (SANTOS.1995). Outro fato a ser destacado que o leite poder ser transportado pelo prprio produtor e se for inapropriado o mesmo poder reaproveit-lo em sua propriedade. Geralmente o transporte do leite, seja ele aprovado ou no pela indstria, custa ao produtor 7% da cota de leite fornecida, o que significa uma grande perda para o produtor rural.

2000

Lavag* m

gura - Anlise comparativa do NMP de coliformes totais pr e ps-lavagem (oznio x convencional) P=13,649(ANOVA), p<0,0001, teste de Barlett. * EPM, respectivamente: 239,42; 28,76; 359,61 e 359,48.

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Rev. Inst. Latic. "Cndido Tostes", Set/Out, n 310, 54: 13-21, 1999 se disso que os lates lavados pelo sistema convencional tm maior probabilidade de desenvolver o biofilme nos lates. CONCLUSO Segundo anlises estatsticas utilizando-se os testes /-Student, os resultados de reduo dos microrganismos pesquisados promovidos pelo processo, proposto mostraram-se estatisticamente significantes. Testes, em uso, da eficicia microbiolgica do processo convencional de sanitizao de lates de leite devem ser realizados periodicamente uma vez que os resultados obtidos nesse trabalho indicaram que o processo convencional no reduziu significativamente o NMP de mesfilos aerbios. Tal fato pode comprometer a qualidade do leite. O perodo de permanncia menor do leite, nos lates submetidos lavagem com oznio, promoveu diferenas significativamente menores nas cargas microbianas iniciais, quando comparado aos submetidos lavagem convencional. O processo proposto pode ser uma alternativa vivel durante o perodo,de transio entre o lato e os tanques de refrigerao (tanques de espanso), principalmente por seus aspectos econmicos e ecolgicos. SUMMARY Food processing requires good hygienic procedures that guarantee the final quality of products, avoid early deterioration and respect consumers health. These procedures are called sanitization and are composed of two phases: cleaning and disinfection. During this process applied to food recipients, the chemical products used as sanitizers can accumulate in the product or can be ineffective due to the presence of organic material. Ozone has some characteristics that make it attractive for use as sanitizer in food processing. It's higher oxidant potential, FDA's recognization as safe (GRAS) for bottled disinfection and production of normal oxidation products with less deleteriuous effects than the by-products of chlorine treatment are some examples of ozone's advantures. Therefore the efficiency of a sanitizing processing of milk plastic containers with ozonized water was studied. This was accomplished by comparing the average number of aerobic mesophils, E. coli and total coliform counts before and after washing and also with the conventional processing method. The samples were collected from the inner side walls and the inside bottom of the containers using the 'Swab" technique. A significant reduction ("t"-

O sistema proposto pode substituir o sistema de lavagem convencional, tipo tnel que o utiliza o vapor como sanitizante, e consequentemente as caldeiras, movidas a gs ou carvo o que promover um impacto ambiental menor. Soma-se a isso que a poluio decorrente deste processo convencional, causada pela utilizao de detergentes fortes, tambm ser diminuda. EIROA (1998) acredita que o vapor um excelente agente para a indstria de alimentos porm, quando utilizado sobre superfcies altamente contaminadas, pode coagular os resduos orgnicos formando uma crosta que impede a penetrao do calor e adverte que quando utilizado para sanificar equipamentos, a temperatura deve ser mantida a 93,3 C durante pelo menos 5 minutos. Baseado no exposto e conhecendo os dados operacionais do sistema de lavagens convencional (onde a durao da desinfeco com o vapor de alguns segundos) acreditamos que esse tempo provavelmente seja insuficiente para promover uma desinfeco eficiente uma vez que os valores encontrados na avaliao do sistema convencional so ainda relativamente elevados, mesmo tendo promovido redues significativas. Ressalta-se ainda que o sistema proposto promoveu um tempo de contato de contato de 2 minutos da gua ozonizada a uma concentrao de aproximadamente 4 mg/l. Segundo Restaino et ai (1995) a utilizao de gua ozonizada a uma concentrao de 0,19mg/l promoveu a inativao instantnea de mais de 5 logs do nmero de UFC de E.coli de. Depreende-se portanto que existe a possibilidade da reduo do tempo de contato e da concentrao utilizados neste trabalho, o que tornar o sistema mais rpido e vantajoso. Outro aspecto importante a ser observado que segundo Greene (1993) o sistema de sanitizao com oznio reduz custos, pois aps a sua instalao a manuteno tm custos menores que os sistemas que utilizam compostos clorados e, como no necessita da desinfeco trmica, o consumo de energia tambm reduzido. Considerando que um lato mal higienizado segundo PINHEIRO et ai (1978) pode adicionar at 8x 10* UFC/ml ao leite e a reduo mdia de microrganismos mesfilos obtidas pelo processo proposto foi de 99,04%, esse nmero poderia ser reduzido para 7,6 x IO4 o que com certeza j contribuiria muito para a qualidade final do produto. A reduo do NMP de coliformes totais promovida pelo processo convencional foi de 74,12%. Segundo Speers and Gilmour (1985), as bactrias gram negativas, como o caso dos coliformes, tem maior facilidade de adeso s superfcies e consequentemente maior chance dar incio a formao do biofilme. Depreende-

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Student test) of the investigated microorganisms was found in the post-wash samples as compared to the pre-wash counts. A significant reduction was also found when compared to the average number of aerobic mesophils and total coliforms of the walls with the conventional method (ANOVA- Bartlett test). REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Standards methods for the examination of dairy products. 14.ed. Washington: 1978. ANDRADE, N. J.; MOSQUIM, MCA . V.; CHAVES, J.B.P. AND TEIXEIRA, M.A. Efeito da concentrao e do pH na ao sanitizante de solues diludas de hipoclorito de sdio comercial. Revista do ILCT, 40 (240) :73-83, 1985. ANDRADE, N.J. & MACEDO, J. A .B. Higienizao na indstria de alimentos. Ed. Varela. So Paulo,p.l67, 1996. AKEY, D. H. 1982 Lethality of ozone for the biting gnat.Culicoides variipennis: Fumigation of a biological safety cabinet for arbovirus reseach. J. Encin. Entomol. 75: 387-392. AKEY, D. H. WALTON, T. E. (1985). LiquidPhase Study of ozone inactivation of Venezuelan Equine Encepholamyelitis Virus. Appl. Microbiol. 50, 882-886. BARTH, M. M., ZHOU, C, MERCIER, J., and PAYNE, F. A. 1995. Ozone storage effects on anthocyanin content and fungai growth in blackberries. J. Food Sei. 60: 1286-1288. BLOCK, S.S.(Ed.) In: Disinfection, Sterilization and Preservation. 4.ed. Philadelfia, PA; Lea & Febiger, 1991, 1162p. BRINK, D.R.; LANGLAIS, B. and RECKHOW, D. A. In: Ozone in water treatment. Application and engineering. Lewis Publishers, 1986.
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