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Instrumentacin y Anlisis

Cromatografa.- Introduccin

INTRODUCCIN A LA CROMATOGRAFIA El mtodo ms general para tratar una interferencia, consisten en la separacin fsica del analito. Hoy en da el mtodo ms utilizado con este fin es la cromatografa. DESCRIPCIN GENERAL DE LA CROMATOGRAFIA Abarca un grupo variado e importante de mtodos de separacin, que permiten al qumico separar, aislar e identificar componentes estrechamente relacionados presentes en mezclas complejas; muchas de estas separaciones son imposibles por otros medios. En todos estos mtodos, se emplea una fase estacionaria y una fase mvil. Los componentes de una mezcla se transportan a travs de una fase estacionaria por medio de una fase mvil que fluye; las separaciones se basan en las diferencias de velocidad de migracin entre los componentes de la muestra. Tipos de fases estacionarias En la cromatografa los componentes que se desea separar deben ser solubles en la fase mvil. Deben ser tambin capaces de interaccionar con la fase estacionaria ya sea disolvindose en ella, adsorbindose, o reaccionando con ella en forma qumica. Como consecuencia, durante la separacin los componentes se distribuyen entre ambas fases. a) Cromatografa en columna

La fase estacionaria es un slido finamente dividido sostenido en un estrecho tubo de vidrio o un metal. La fase mvil, que puede ser un lquido o un gas, se obliga a pasar a travs del slido bajo presin o bien se deja percolar por efecto de la gravedad. b) Cromatografa plana

La fase estacionaria puede ser un papel poroso o un slido finamente dividido que se aplica sobre una placa de vidrio. En este caso la fase mvil se desplaza a travs del slido ya sea por accin capilar o bajo la influencia de la gravedad. La fase estacionaria puede tambin ser un lquido inmovilizado inmiscible con la fase mvil. Se emplean diferentes procedimientos para fijar en su lugar la fase estacionaria lquida. Por ejemplo, un slido finamente dividido recubierto por una delgada capa de lquido puede colocarse en un tubo de vidrio o metal, y a travs de este se deja fluir o percolar la fase mvil. Por lo general, el slido no tiene una funcin directa en la separacin y acta slo para sostener en su lugar la fase estacionaria por medio de la adsorcin. Otro procedimiento, consiste en recubrir las paredes internas de un tubo capilar con una delgada capa de lquido y hacer pasar entonces, una fase mvil gaseosa a travs del tubo. Finalmente, la fase estacionaria puede sostenerse en su lugar sobre fibras de papel o sobre la superficie de partculas muy finas aplicadas sobre una placa de vidrio. Cromatografa lineal Todos los procedimientos cromatogrficos, se basan en las diferencias en el grado con el cual los solutos sufren particin entre la fase mvil y la fase estacionaria. Los equilibrios
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relacionados pueden describirse en forma cuantitativa por medio de una constante dependiente de la temperatura, el coeficiente de particin K:

donde Cs es la concentracin analtica total de un soluto en la fase estacionaria y CM es su concentracin en la fase mvil. En el caso ideal, la razn de particin es constante en una amplia gama de concentraciones de soluto; es decir, Cs es directamente proporcional a CM. Pero, con mayor frecuencia no hay relaciones lineales. Las concentraciones en una columna cromatogrfica son por lo general bajas. La cromatografa que se lleva a cabo bajo condiciones tales que K es constante, se denomina cromatografa lineal. Aqu se considera slo este tipo de cromatografa. Cromatografa de elucin lineal En la cromatografa de elucin, una nica porcin de la muestra disuelta en la fase mvil se introduce en la parte superior de una columna, despus de lo cual los componentes de la muestra se distribuyen entre ambas fases. El agregado de una cantidad adicional de fase mvil (el eluyente) hace avanzar columna abajo al disolvente que contiene una parte de la muestra, donde se produce un nuevo proceso de particin entre la fase mvil y las porciones nuevas de la fase estacionaria. Simultneamente, la particin entre el nuevo disolvente y la fase estacionaria tiene lugar en el sitio de colocacin inicial de la muestra. Las continuas adiciones de disolvente desplazan a las molculas del soluto a lo largo de la columna en una serie de transiciones entre la fase mvil y estacionaria. Debido a que el movimiento del soluto puede tener lugar slo en la fase mvil, la velocidad media a la que migra el soluto, depende de la fraccin de tiempo en el que permanece en esa fase. Esta fraccin es pequea para los solutos con relaciones de particin que favorecen la retencin en la fase estacionaria y grande para aquellos en los que la retencin en la fase mvil es ms importante. En condiciones ideales las diferencias resultantes en estas velocidades hacen que los componentes de una mezcla se separen en bandas localizadas a lo largo de la columna. El aislamiento puede lograrse entonces haciendo pasar suficiente fase mvil por la columna para hacer que estas distintas bandas sobrepasen el extremo, donde pueden recogerse; alternativamente, el contenido de la columna puede ser extrado y dividido en porciones que contienen los distintos componentes de la mezcla. El proceso por el cual el soluto es lavado en la columna aadiendo nuevo disolvente se llama elucin. Si se coloca al final de la columna un detector que responda a los solutos y se representa grficamente su seal como una funcin del tiempo (o del volumen de la fase mvil agregada), se obtiene una serie de picos, a lo que se llama cromatograma y til para el anlisis cualitativo y cuantitativo. La posicin de los picos sirve para identificar los componentes de la muestra. Las reas de los picos pueden relacionarse con la concentracin. Teoras de la elucin cromatogrfica Es evidente que el movimiento de los solutos a travs de la columna aumenta la distancia entre las zonas ocupadas por un tipo de sustancia en particular, pero al mismo tiempo tiene lugar un ensanchamiento de las zonas ocupadas (bandas), lo que disminuye la eficiencia de la columna como dispositivo de separacin. El ensanchamiento de la zona es inevitable; sin
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embargo, afortunadamente este proceso es ms lento que la separacin de la zona. De esta forma es posible la separacin neta de ambas especies, siempre que la columna posea una longitud suficiente. Una teora til de la cromatografa debe ser capaz de explicar no slo la velocidad a la cual migran los solutos, sino tambin la velocidad de ensanchamiento de la zona durante la migracin, dado que la limpieza de una separacin depende igualmente de ambos fenmenos.

a)

Teora de los platos

Teora original de la cromatografa, fue capaz de describir las velocidades de la migracin en forma cuantitativa; pero no logr describir los efectos de las numerosas variables que dan lugar al ensanchamiento de las zonas. La teora de los platos, desarrollada originalmente por Martin y Synge considera que una columna cromatogrfica est compuesta por una serie de estrechas capas horizontales y contiguas separadas, denominadas platos tericos. Se supone que en cada plato tiene lugar el equilibrio del soluto entre la fase mvil y la fase estacionaria. El movimiento del soluto y del disolvente, ocurre como una transferencia de un plato al siguiente. La eficiencia de una columna cromatogrfica como dispositivo de separacin mejora a medida que aumenta el nmero de equilibrios es decir, a medida que se incrementa el nmero de platos tericos. En consecuencia el nmero de platos tericos N, se utiliza como una medida de la eficiencia de la columna. Un segundo trmino, la altura equivalente de un plato terico H, tambin sirve para este fin. La relacin entre ambos parmetros es L N H donde L es la longitud del empaque de la columna. Esta ecuacin se sigue aplicando, sin embargo un plato como una entidad fsica no existe en una columna. En consecuencia, el plato y su altura deben ser considerados como criterios de eficiencia de una columna. b) TEORIA CINETICA DE LA CROMATOGRAFIA

La teora cintica de la cromatografa describe con xito los efectos de las variables que afectan el ancho de una banda de elucin as tambin su momento de aparicin en el extremo de una columna. Formas de las zonas La forma gaussiana tpica de un cromatograma puede atribuirse a la combinacin aditiva de los movimientos al azar de los miles de partculas del soluto en la banda o zona cromatogrfica. Ciertas partculas individuales, viajan rpidamente en virtud de su inclusin accidental en la fase mvil durante la mayor parte del tiempo. Otras por el contrario, pueden retardarse debido a que se incorporan en la fase estacionaria durante un tiempo mayor que el promedio. La consecuencia de estos procesos individuales al azar, es la distribucin simtrica de las velocidades alrededor del valor medio, que representa el comportamiento de la partcula media ms comn. El ancho de la zona aumenta a medida que sta se desplaza por la columna debido a que ha existido ms tiempo para la migracin. En consecuencia, el ancho de la zona est directamente relacionado con el tiempo de residencia de la columna e inversamente relacionado
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con la velocidad a la cual fluye la fase mvil.

Fig. 4.1. Determinacin de la desviacin estndar de un pico cromatogrfico. En este caso, W = 4 ; tR es el tiempo de retencin para un soluto retenido por el empaque de la columna, y tM es el tiempo para uno que no lo es. En consecuencia tM es aproximadamente igual al tiempo necesario para que una molcula de la fase mvil pase a lo largo de la columna. Desviacin estndar como una medida del ancho de zona. El ancho de una zona gaussiana se relaciona en forma conveniente con un nico parmetro llamado desviacin estndar ; aproximadamente el 96% del rea bajo esta curva se encuentra dentro de un intervalo de ms menos dos desviaciones estndar ( ) de su mximo. Entonces, una desviacin estndar deducida de un cromatograma sirve como una medida cuantitativa adecuada del ensanchamiento de la zona.

Es til emplear un smbolo para indicar que unidades se emplean; de esta forma se usar para una desviacin estndar en unidades de longitud, y t cuando se trata de unidades de tiempo. En la figura 4-1 se ilustra una forma simple para obtener un valor aproximado de y en un cromatograma experimental. Se trazan las tangentes a ambos lados de la curva de Gauss y se extienden para formar un tringulo con la abscisa. Las intersecciones se producen aproximadamente a 2 del mximo; es decir, W = 4 . Clculo de H y N a partir del ancho de la zona. El ensanchamiento de la zona cromatogrfica se expresa adecuadamente en trminos del cuadrado de la desviacin estndar (la varianza) por unidad de longitud de la columna. Por definicin,
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donde H representa la altura del plato terico en centmetros, es la medida de la eficiencia y L es la longitud de la columna, expresada tambin en centmetros ( debe estar en cm). Otra forma de escribir caractersticas de separacin de una columna, es reemplazando el valor H dado por la ecuacin del nmero de platos tericos, en la ltima ecuacin y despejar para N, L2 N 2
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donde N es el nmero de platos contenidos en una columna de longitud L. Evidentemente, la eficiencia de una columna aumenta a medida que aumenta el nmero de platos y disminuye la altura de cada uno de ellos. Causas del ensanchamiento de la zona. Los picos cromatogrficos se ensanchan por lo general, debido a tres procesos bajo control cintico, la difusin en remolino, la difusin longitudinal, y la transferencia de masa fuera del equilibrio. Las magnitudes de estos efectos estn determinadas por variables controlables tales como la velocidad de flujo, el tamao de la partcula del material de empaque, las velocidades de difusin y el grosor de la fase estacionaria. La relacin entre la eficiencia de las columnas cromatogrficas y la magnitud de estos tres factores es la ecuacin de van Deemter (izquierda) y su versin moderna (derecha), que relaciona la velocidad de flujo u y la altura del plato.

B u

Cu

B u

CS u CM u

En este caso, la magnitud A se relaciona con la difusin en remolino, B con la difusin longitudinal y C con la transferencia de masa fuera del equilibrio.

ANALISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO POR MEDIOS CROMATOGRAFICOS La cromatografa se ha desarrollado como el principal mtodo de separacin para especies qumicas estrechamente relacionadas. Adems, puede utilizarse para la identificacin cualitativa y la cuantificacin de las especies separadas. Anlisis cualitativo Un cromatograma proporciona slo una nica pieza de informacin cualitativa acerca de cada especie en una muestra, es decir, su tiempo de retencin o su posicin en la fase estacionaria despus de un cierto perodo de elucin. Sin embargo la informacin cualitativa obtenible por medio de la cromatografa es pequea en comparacin con los espectros IR, adems la precisin de la abscisa en un espectro es mejor que la del equivalente cromatogrfico (tR). Sin embargo constituye una herramienta muy utilizada para identificar los componentes de mezclas que contienen un nmero limitado de especies posibles cuyas identidades se conocen. Por ejemplo se puede comprobar la presencia o ausencia de 30 o ms aminocidos en un hidrolizado protenico con un grado de certeza relativamente grande en base a las posiciones de estas especies despus de separarlas sobre una placa de cromatografa en capa delgada. Adems la identificacin espectroscpica positiva, es por lo general imposible sobre una mezcla tan compleja como la del ejemplo anterior sin una separacin cromatogrfica preliminar. As, muchas veces, la cromatografa constituye un precursor esencial de los anlisis espectroscpicos cualitativos.

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ANALISIS CUANTITATIVO La cromatografa cuantitativa se basa en una comparacin ya sea de la altura o del rea de los picos cromatogrficos producidos por los analitos en comparacin con uno o ms patrones. Si las condiciones estn perfectamente controladas, ambos parmetros varan linealmente con la concentracin. Anlisis basado en la altura de los picos. La altura de un pico cromatogrfico se obtiene conectando la lnea de base de cada lado del pico por medio de una lnea recta y midiendo la distancia perpendicular entre esta lnea y el pico. Esta medida puede tomarse generalmente con una precisin razonablemente grande y proporciona buenos resultados siempre que las variaciones en las condiciones de la columna no alteren el ancho de los picos durante el perodo necesario para obtener los cromatogramas de la muestra y los patrones. Las variables que se deben controlar cuidadosamente son la temperatura de la columna, la velocidad de flujo del eluyente y la velocidad de inyeccin de la muestra. Adems, es necesario tener cuidado en evitar la sobrecarga de la columna. El efecto de la velocidad de inyeccin de la muestra es particularmente crtico para los picos iniciales de un cromatograma. En estos casos, en que se utiliza una jeringa, los errores relativos van de 5 a 10%.

Calibracin con patrones Un mtodo ms directo para los anlisis cromatogrficos cuantitativos consiste en la preparacin de una serie de soluciones patrn cuya composicin se aproxima a la del problema. Se realizan los cromatogramas para los patrones y se grafican las alturas de las reas de los picos en funcin de la concentracin. Una grfica de estos datos debe proporcionar una lnea recta que pasa a travs del origen; los anlisis se basan en esta grfica. Para lograr la mxima precisin es necesario repetir con frecuencia las calibraciones. Obtenido el cromatograma, se puede medir la altura o el rea del pico cromatogrfico: ALTURA. Cuando el pico es bien definido. AREA. Para lo cual se debe realizar los trazos que se indican en la figura, el rea se determina con la frmula: bh AREA 2 Anlisis basados en el rea de los picos Las reas de los picos son independientes de los ensanchamientos debidos a la temperatura, velocidad de inyeccin o de flujo. Por lo tanto, desde este punto de vista, las reas de los picos constituyen un parmetro analtico mucho ms satisfactorio que sus alturas. Por otra parte, la altura de los picos se mide con mucho ms facilidad y en el caso de los picos estrechos se obtiene una mayor precisin. Muchos instrumentos cromatogrficos modernos, estn equipados con integradores electrnicos, que permiten una estimacin precisa del rea de los picos, con una desviacin estndar de 0.44%.

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Figura 4.2. Anlisis cromatogrfico cuantitativo

Procedimiento de calibracin a) Calibracin directa.- Se prepara patrones y obtiene los cromatogramas.

Inconvenientes: 1 2 b) La seguridad de la cantidad de muestra inyectada. La sensibilidad del detector, debe permanecer constante en cada prueba. Mtodo del estndar interno (estandarizacin directa). Usado en anlisis biomdico: etanol en sangre y esteroides en suero u orina. Se tiene que disponer de una norma o patrn interno; que debe cumplir con los requisitos: 1 tR cercano al componente de inters. 2 Resolucin: R > 1.25; si R = 1, estn separados. Si se cumple con tales, el anlisis es muy til.

Figura 4.3. Procedimientos de calibracin.


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Ejemplos: 1) Determinar testosterona (T) en orina, usando androstano (A) como referencia interna o norma. Los datos aparecen en la siguiente tabla:

Se grfica la relacin de rea del componente a ser cuantificado al rea de la norma Vs. la relacin de peso del componente al peso de la norma. As aparece en la figura 2.b. La relacin de reas de la alcuota de muestra a la norma, permite determinar una relacin peso de muestra (pTx) a peso de norma; igual a 0.5 (pTx/pA) = 0.5 De all, al utilizar los 50 g de norma se obtiene: pTx = 0.5 x 50 g = 25 g de Testosterona. 2) Determinar Alcohol Etlico, con Detector de Ignicin de Flama (FID) y usando como patrn interno la metiletilcetona. Se usa este compuesto porque nos se encuentra en bebidas alcohlicas y sale junto al etanol. No interesa el volumen, tampoco la fluctuacin del detector. c) Normalizacin interna Se usa cuando se necesita informacin aproximada y se asume que todos los componentes han sido eluidos y que el porcentaje (%) de composicin de un componente es: Area Pico % Area Total

Figura 4.4. Mtodo de Normalizacin interna


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Se asume tambin que: % Area = % en peso

En la prctica, la anterior es una ecuacin muy til. Adems cada componente tiene una respuesta caracterstica; primero se debe corregir mediante: Factor de correccin = (rea/peso) Ejemplo: A la muestra desconocida se le aadi 5 mililitros de una solucin conteniendo la norma cuya concentracin es de 100 g/mL. Al cromatografiar la mezcla se encontr que la razn de rea era 8, por lo tanto la razn de peso es 7; calcular la concentracin del desconocido. (Peso componente/peso norma) = 7 (1) (2)

Peso norma = 5 mL x 100 g/mL = 500 g Despejando de (1): Peso componente = 7 x peso norma

Peso componente = 7 x 500 g = 3,500 g o 3.5 mg.

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Cromatografa gas-lquido

CROMATOGRAFIA GAS-LIQUIDO En la cromatografa gaseosa los componentes de una muestra vaporizada se fraccionan como consecuencia de la particin entre una fase mvil y una fase estacionaria mantenida en una columna. La cromatografa gas-slido (CGS) representa una subclasificacin en la que la fase fija es un slido; el proceso de particin supone entonces equilibrios de adsorcin gaseosa. En la cromatografa gas - lquido(CGL) la fase estacionaria es un lquido sostenido sobre una matriz slida inerte; aqu son importantes los equilibrios gas-lquido. PRINCIPIOS DE LA CROMATOGRAFIA GAS-LIQUIDO El concepto de cromatografa gas-lquido fue descrito en 1941 por Martin y Synge, a quienes se debe tambin la cromatografa de particin entre lquidos. El principio de la cromatografa de particin gas-lquido y lquido- lquido difieren slo en el detalle de que la fase mvil de la primera es un gas, en vez de un lquido. La muestra se introduce como un gas en la cabeza de la columna; los componentes que tienen una solubilidad finita en la fase lquida estacionaria se distribuyen entre esta fase y la fase gaseosa, segn la ley del equilibrio. Se logra entonces la elucin forzando un gas inerte, como nitrgeno o helio a travs de la columna. La velocidad de los distintos componentes a lo largo de la columna depende de su tendencia a disolverse en la fase lquida estacionaria. Un coeficiente de distribucin que favorezca al disolvente da por resultado una baja velocidad; por el contrario, aquellos componentes cuya solubilidad en la fase lquida es despreciable se desplazan rpidamente por la columna. Tericamente, se obtienen curvas de elucin en forma de campana de Gauss. APARATOS Existen diferentes cromatgrafos de gases de diferente grado de complejidad. Fuente de gas transportador Los gases transportadores deben ser qumicamente inertes: helio, argn, nitrgeno e hidrgeno. El helio es el ms utilizado. Las velocidades de flujo se controlan por medio de un regulador de presin. Las presiones de entrada varan entre 0,7 a 3,5 Kg/cm2 (por encima de la presin ambiental), lo que da lugar a velocidades de flujo de 25 a 50 mL/min. Se pueden establecer las velocidades de flujo por medio de un rotmetro en la cabeza de la columna; pero es ms preciso un medidor de burbujas. Sistema de inyeccin de la muestra La eficiencia de la columna requiere que la muestra sea de un tamao adecuado y se introduzca como un "tapn" de vapor; la inyeccin lenta o las muestras de excesivo tamao producen ensanchamiento de las bandas y empobrecen la resolucin. Se utiliza una microjeringa para inyectar las muestras a travs de un diafragma de caucho o de silicona dentro de una entrada para muestras previamente calentada (50 C por encima del punto de ebullicin del analito), en la cabeza de la columna. En columnas analticas comunes el volumen va de unas pocas dcimas de L hasta 10 L. En las columnas capilares el volumen aproximadamente es 10-3 L en este caso se utiliza un sistema divisor de la muestra, para liberar hacia la cabeza de la columna, slo una pequea fraccin de la muestra es inyectada, el resto se desecha.
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Cromatografa gas-lquido

Las muestras de gas se introducen mejor por medio de una vlvula de muestreo. Las muestras slidas se introducen como soluciones. Columnas En este tipo de cromatografa se utilizan dos tipos de columnas: a) Capilares. Fabricadas de tubos capilares con dimetro interno entre 0,3 a 0,5 nm, cuya superficie interna est cubierta con una pelcula muy delgada ( 1 m) de fase lquida. Presentan una cada de presin despreciable, por lo que pueden tener de 10 a 100 m o ms; la relacin VS/VM vara de 100 a 300, lo que explica en parte sus elevadas eficiencias. Se han descrito columnas de varios cientos de miles de platos tericos. La capacidad para la muestra es baja (<0,01 L), lo que se puede aumentar recubriendo la superficie interior del tubo con un material poroso como el grafito, un xido metlico o un silicato. As se aumenta la superficie interna para soportar mayor cantidad de fase estacionaria (lquido); como tambin la capacidad de la columna. b) Empacadas. Se construyen de tubos metlicos o de vidrio de 1 a 8 mm de dimetro interno, diseadas para sostener empaques slidos desde 2 hasta 20 m de longitud. Los tubos estn plegados o enrollados de modo que se puedan acomodar en forma adecuada dentro de un termostato del instrumento. Son comunes las columnas que poseen relaciones de VS/VM de 15 a 20 y contienen de 30 a 300 platos tericos por decmetro. Las mejor empacadas poseen un total de 20000 platos tericos o ms. Soporte slido para las columnas empacadas. El soporte slido ideal consistira en partculas esfricas, pequeas y uniformes, con buena resistencia mecnica y un rea superficial especfica de por lo menos 1 m 2/g. Adems, el material deber ser inerte a temperaturas elevadas y humedecerse con facilidad con la fase lquida para producir un recubrimiento uniforme. Los soportes ms comunes provienen de las tierras de infusorios. Existen dos tipos de materiales de esta clase, el polvo de ladrillo refractario, comercializado como Chromosorb P, C 22, Sterchamol; posee la mejor resistencia mecnica y la mayor superficie especfica ( 4 m2/g); con la desventaja de ser muy reactivo lo que impide ser utilizado para compuestos polares. La tierra silcea (Kieselgur) es ms frgil y con menor superficie especfica ( 1 m2/g) pero es menos reactiva; se comercializa como Chromosorb W, Celite, Embasel y Celatom.

Fase lquida. Las propiedades deseables para la fase lquida en una columna cromatogrfica gas-lquido son 1) baja volatilidad: idealmente, su punto de ebullicin debe ser por lo menos 200 superior a la temperatura mxima de operacin para la columna; 2) estabilidad trmica; 3) inercia qumica y 4) caractersticas de disolvente de tal naturaleza que los valores de y k', para los solutos que han de resolverse, se encuentren dentro de lmites apropiados.

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Cromatografa gas-lquido

Termostatizacin de la columna. La temperatura de la columna es una variable importante por lo que para el trabajo de precisin debe ser controlada dentro de las dcimas de grado. Por tal motivo est dentro de un horno termostatizado. La temperatura ptima de la columna depende del punto de ebullicin de la muestra y del grado de separacin requerido. En general, la resolucin ptima se asocia con la temperatura mnima; pero esto incrementa el tiempo de elucin y de trmino de un anlisis. Sistema de deteccin Los aparatos de deteccin de un cromatgrafo gas -lquido deben responder rpida y reproduciblemente a las bajas concentraciones de los solutos emitidos por la columna. Dado que la concentracin del soluto en el gas portador en cualquier instante es slo unas pocas partes por mil, el detector debe responder a concentraciones uno o dos rdenes de magnitud menores (o ms); adems el paso de un pico por el detector puede durar un segundo o menos, el detector debe en tal breve perodo responder adecuadamente. Conviene adems que el detector tenga respuesta lineal, buena estabilidad en perodos prolongados y respuesta uniforme a una variedad de compuestos. Detectores de conductividad trmica. Catarmetro. Se basa en los cambios de conductividad trmica de la corriente de gas; el sensor consiste en un elemento calentado elctricamente cuya temperatura, a una potencia elctrica constante, depende de la conductividad trmica del gas circundante. El elemento calentado puede ser un hilo fino de platino, oro o tungsteno, o tambien, un termistor semiconductor. La resistencia del hilo o del termistor da una medida de la conductividad trmica del gas; a diferencia del detector de hilo, el termistor tiene un coeficiente de temperatura negativo En los instrumentos para cromatografa se utilizan dos detectores gemelos uno delante (entrada) de la columna y otro detrs (salida); as sus resistencias incorporadas en un puente de Wheatstone se comparan para eliminar la conductividad del gas portador y reducir al mnimo los efectos de la variacin de la velocidad de flujo y la presin en la columna, as como de la energa elctrica. Las conductividades trmicas del hidrgeno y del helio son seis a diez veces mayores que las de la mayora de compuestos orgnicos. As la presencia de pequeas cantidades de tales materiales reducen la conductividad trmica del gas efluente y el detector registra una elevacin de la temperatura. Estos son sencillos, fuertes, baratos, no selectivos, precisos y no destruyen la muestra pero no son tan sensibles comparados al detector de ionizacin de flama (DIF), o al detector de captura de electrones (DCE).

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Cromatografa gas-lquido

AVANCES EN CG LA NOMENCLATURA EN CROMATOGRAFA DE GASES La cromatografa de gases se clasifica primero por el tipo de columnas que se emplean y despus por las categoras de fases estacionarias. En la cromatografa de gases con columna empacada, la fase estacionaria de partculas empacadas dentro de una columna de acero inoxidable y de vidrio que generalmente tiene un dimetro interno (DI) de 2 a 4 mm. La fase estacionaria puede estar formada de diversos materiales slidos porosos cromatografa gas-slido (GSC, gas-solid chromatography)- y el retraso de los analitos se debe a un equilibrio que incluye adsorcin sobre la superficie y desorcin de la misma. Otra alternativa es que las partculas de la fase estacionaria estn recubiertas de algunos de los diversos lquidos de alto punto de ebullicin cromatografa gas-lquido (LGC, liquid-gas chromatography)- La separacin de los analitos depende de las distintas fracciones de tiempo que pasen disueltos en la fase lquida estacionaria. Los componentes ms solubles son retenidos mas tiempo ya que tardan menos viajando en el gas de arrastre. Los mtodos de cromatografa de gases con columna empacada se emplean menos en la actualidad que la cromatografa de gases capilar. Las columnas capilares tienen dimetros internos (DI) de menos de 1 mm y las paredes internas de las columnas suelen estar recubiertas con una pelcula de fase estacionaria. Las columnas con DI de 530 m se llaman de megaporo; y las ms pequeas, con DI de 100 m se llaman de microporo. La razn ms evidente por la cual la cromatografa de gases capilar ha reemplazado a la cromatografa de geases en columna es porque la eficiencia cromatogrfica caracterstica de la primera es de hasta 200 000 platos tericos en comparacin con slo 10 000 o menos para columnas empacadas. Como el nmero de platos tericos se traduce a una mejor resolucin, las columnas capilares permiten separar los componentes con ms rapidez y correr ms muestras en el instrumento, o sea, aumentan la velocidad de proceso de la muestra. Las columnas capilares se clasifican, a su vez, dependiendo de la fase estacionaria con que estn rellenas. Cuando la fase estacionaria es una pelcula de material en la superficie interna de la columna, se dice que es una columna tipo tubular abierta con recubrimiento de paredes (WCOT, wall-coated open tubular). Para aumentar la capacidad de la columna, el rea superficial se aumenta uniendo material de empaque a la pared. Actualmente, hay dos formas de llevar a cabo esto. La columna tubular abierta recubierta con soporte (SCOT, support-coated open tubular) tiene partculas de soporte en la pared. Asu vez, stas estn recubiertas de la fase lquida. La columna tubular abierta de capa porosa (PLOT, porouslayer open tubular) tiene una delgada capa de polmero poroso depositado sobre la superficie interna. Las columnas WCOT y SCOT se emplean para cromatografa gas-lquido. Las columnas SCOT se emplean con ms frecuencia que las WCOT por su mayor capacidad. Las columnas PLOT se emplean para cromatografa gas-slido. La cromatografa de gases capilar es una de las tcnicas de separacin ms poderosas que existen actualmente para resolver los componentes de mezclas complicadas.

Anlisis de muestras La cromatografa de gases es el mtodo de eleccin para separar y analizar compuestos orgnicos con puntos de ebullicin inferiores a 250C y los gases fijos; ambos grupos tienen presin de vapor suficientemente altas de manera que pueden ser transportados por la fase mvil gaseosa. Sin embargo, no es la presin de vapor baja lo que impide el uso de la cromatografa de gases, sino la descomposicin. Cuando se separan materiales de alto punto
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de ebullicin, los compuestos pueden descomponerse en la columna a las temperaturas necesarias para obtener el cromatograma en un tiempo razonable. Por otra parte la descomposicin trmica antes de la cromatografa puede ser de utilidad. En la CG con pirlisis, el analito se descompone deliberadamente a altas temperaturas y se efecta la cromatografa de los productos de descomposicin. Los picos que aparecen en el cromatograma de gas por pirlisis constituye una huella digital del analito. Es difcil realizar anlisis cuantitativos con CG por pirlisis, pero este mtodo se emplea de manera rutinaria para comprobar lotes de materiales complejos como pinturas, fracciones pesadas de petrleo o plsticos. En el otro extremo de temperaturas, las columnas de CG pueden enfriarse para efectuar separaciones de materiales de bajo punto de ebullicin, como metano o H2. Se efecta la cromatografa de gases de estos materiales en condiciones que van desde la temperatura ambiente hasta la del hielo seco, -80 C. Tambin es posible realizar anlisis cromatogrficos de ciertos grupos de compuestos tanto por CG como por CL. Algunos ejemplos son azcares, cidos grasos y aminocidos. Como para realizar cromatografa de gases se requieren muestras voltiles es necesario derivatizar este tipo de compuestos. Esto se lleva a cabo mediante una reaccin con los grupos qumicos que ocasionan presin de vapor baja (punto de ebullicin alto) para producir compuestos que se vaporicen ms fcilmente. Un ejemplo sencillo de derivatizacin es la transformacin de un cido carboxlico en su ter metlico: por ejemplo, el cido hexanoico, C5H11COOCH3 (p.eb. 127,3 C). Tambin se emplea la derivatizacin haciendo reaccionar los componentes para dar grupos qumicos que producen respuestas fuertes en el detector del instrumento. Un ejemplo es agregar cloros (como el grupo CCl 3) al emplear un detector de captura de electrones que es altamente sensible a los halgenos. Tanto la CL como la CG se pueden emplear para separar productos orgnicos de punto de ebullicin moderadamente alto (<200 C). Para compuestos con punto de ebullicin superior a 200 C, es ms probable que se elija la cromatografa de lquidos.

Muestras e introduccin de muestras Las muestras para cromatografa de gases pueden ser gases, lquidos o slidos. Las muestras slidas y lquidas deben vaporizarse de alguna forma. Cuando las muestras slidas se vaporizan con facilidad se efecta la cromatografa de los componentes moleculares. Sin embargo, si los slidos se descomponen, slo ser posible analizar los productos de descomposicin para caracterizar la muestra. Para lograr mejores separaciones las muestras deben inyectarse en el menor tiempo posible. Un tiempo de inyeccin mayor provoca bandas ms anchas al inicio de la separacin. El tiempo de inyeccin para una muestra lquida o slida tambin incluye todo el periodo que tarde la muestra en vaporizarse. El tiempo de vaporizacin se reduce inyectando las muestras en una regin que est ms caliente que la columna, y lo suficientemente caliente para vaporizar las muestras lquidas con rapidez sin pirlisis. Esta regin ms caliente y las partes asociadas en la cabeza de la columna se llaman el inyector y la evaporacin rpida de la muestra se llama evaporacin instantnea. La temperatura ptima para el inyector se determina experimentalmente, pero en general es igual o mayor que la temperatura mxima que la columna alcanza durante la separacin. Usualmente las muestras se inyectan con una jeringa. El mbolo de sta se empuja a mano (inyeccin manual) o empleando un impulsor elctrico o neumtico (inyeccin automtica). La inyeccin automtica suele ser ms precisa y permite desviaciones estndar relativas de tan slo 0,1 por ciento. La mezcla se introduce con la jeringa al inyector, o bien otra alternativa es introducirla
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directamente a la parte superior de la columna ( inyeccin directa en columna). La eleccin entre estos dos mtodos a menudo depende del dimetro de la columna. Cualquiera de ellos es eficaz para columnas empacadas, pero la introduccin de la muestra es un proceso delicado en columnas capilares de menos de 1 mm de dimetro por dos motivos: primero, el corte transversal abierto del capilar es muy pequeo y, segundo, la muestra debe ser pequea para no sobrecargar la fase estacionaria y provocar distorsin en la banda. Debe haber presente suficiente fase estacionaria para interaccionar con todos los componentes de la mezcla de analitos a la vez. Para mantener la cantidad de muestra dentro del nivel correcto, se emplea un tipo especial de inyector que reduce la cantidad de muestra que llega a la cabeza de la columna capilar: el inyector divisor o sin divisin (split/splitless inyector). Las muestras con concentracin de analito adecuadamente baja se inyectan en el modo no divisor (splitless), y son transportadas a la columna por el gas de arrastre como en un inyector normal. Cuando se emplea el modo de divisin (split), el gas de arrastre fluye continuamente por la entrada a razn de 50 a 1000 veces la velocidad con la que fluye por la columna. El exceso de flujo se deja escapar y slo penetra una fraccin de la muestra a la columna. Columnas La eleccin de dimetro, longitud y fase estacionaria dependen en un principio de que se realice cromatografa en columna o capilar. En la tabla 4.1 se mencionan algunas cifras de mrito para columnas empacadas y columnas capilares. La eleccin de fase estacionaria para la mayor parte de las muestras se realiza basndose en informacin especfica (por ejemplo, la polaridad) de cada tipo de fases estacionaria y en las condiciones especficas para diversos tipos de muestras, que se encuentran en los catlogos de los fabricantes y en manuales. Tabla 4.1 Comparacin de las caractersticas de una columna empacada tpica y una columna capilar
DI de la columna Longitud de la columna Dimetro de partcula (dp) Grosor del recubrimiento Platos tericos/m Nmero tpico de platos tericos totales (N) Capacidad total (g/componente) rea superficial de la fase estacionaria (m2) Gasto volumtrico (mL/min) Gasto lineal (cm/s) Empacada 3 6 mm 13m 120 185m -1 000 5 000 1 000 5 000 100 0,2 20 100 10 50 WCOT y SCOT 0,10 0,53 mm 30 50 m -0,1 0,5 m 1 000 8 000 25 000 200 000 0,05 5 10-6 10-7 0,5 5 20 - 50 PLOT 0,32 0,53 mm 30 50 m -12 25 m 1 000 8 000 25 000 200 000 0,05 5 10-6 10-7 5 10 50 - 100

En CGL otro factor que se puede modificar es la cantidad de fase lquida presente. As, el hecho de usar ms fase lquida tiene un efecto doble: primero, la capacidad aumenta, de modo que se pueden usar cantidades de muestra ms grandes. Una mayor cantidad de muestra conduce en general a mejor cuantificacin, mejor lmite de deteccin y mayor intervalo medible de las concentraciones de analito en la muestra. Sin embargo, a medida que se dispone de ms fase estacionaria y los analitos pasan ms tiempo disueltos en ella, el tiempo de retencin aumenta, de modo que es necesario balancear la capacidad con el tiempo de anlisis. En columnas capilares, el dimetro de la columna y el espesor de la capa de fase estacionaria son crticos para determinar que tan bien se establece el equilibrio entre la fase estacionaria y la fase mvil y, por tanto, la calidad de la separacin. La fase lquida de las columnas empacadas se mide por el porcentaje de carga, que es la medida en peso/peso de fase estacionaria comparado con el peso total del empaque. La cantidad de fase estacionaria
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disponible tambin est en funcin del dimetro de las partculas. Los dimetros de las partculas se expresan en trminos de tamao de malla del empaque. Este nmero define el tamao de los huecos de mallas estndar que se emplean para filtracin de polvos. A medida que el nmero es ms alto, hay ms lneas en la malla y las partculas de empaque sern ms pequeas. Por ejemplo, las partculas de malla 80/100 pueden atravesar la malla 80, pero quedan atrapadas en la malla 100, y tienen un dimetro aproximado de 150 a 175 m. Temperatura La temperatura es crucial para las separaciones en cromatografa de gases, por lo cual es conveniente lograr un control de 0,5 C. La temperatura afecta las posiciones de los equilibrios de distribucin de los analitos entre el gas de arrastre mvil y la fase estacionaria y as como la rapidez con que se establecen los equilibrios. Cuando se aumenta la temperatura de la columna se acelera la elusin y se alcanza ms rpido el equilibrio entre la fase mvil y la estacionaria. La temperatura ptima se determina teniendo en cuenta la resolucin necesaria y el deseo de reducir el tiempo de separacin. Para lograr resultados ptimos, la separacin se verifica a temperatura constante (separacin isotrmica) o con programacin de aumento de temperatura. El aumento de temperatura en el curso de la separacin se llama gradiente de temperatura. En cromatografa de gases un gradiente de elucin implica un gradiente de temperatura. El gradiente puede tener diversas formas. Hay rampas lineales de temperatura o se puede proceder por diversas rampas o mesetas. Este aumento de temperatura permite analizar con puntos de ebullicin y caractersticas muy variables en periodos ms breves. Observe que el gradiente de temperatura es una variacin de temperatura con el tiempo, dT/dt; no es un gradiente de temperatura a lo largo de la columna. La temperatura ms alta en el curso de la separacin no slo depende de la descomposicin de la muestra que se mencion con anterioridad, sino que tambin hay que tener la estabilidad y la presin de vapor de las fases estacionarias lquidas. La fase estacionaria lquida en s puede vaporizarse, descomponerse, o ambas cosas, y el material ser expulsado de la columna. Esto se llama sangrado de la columna, lo cual constituye una descripcin grfica. Para efectuar una separacin especfica, el extremo inferior del intervalo de temperatura se determina por las propiedades de la fase estacionaria y los analitos componentes. En el caso extremo, a temperaturas excesivamente bajas, todos los compuestos inyectados se quedan simplemente en la entrada de la columna o en la parte superior de la fase estacionaria y dejan de desplazarse. A temperaturas un poco ms altas, pero aun demasiado bajas el proceso de adsorcin y desercin es lento y los picos se ensanchan. Gasto de la fase mvil En la tabla 4.1 se indican los gastos caractersticos de diversas columnas de cromatografa de gases. Mientras que las columnas empacadas generalmente se operan con gastos de dcimas de mililitros por minuto (en algunos casos de hasta 200 mL/min), las columnas capilares normalmente operan con gastos desde menos de 1mL/min hasta un pico de aproximadamente 5 mL/min. El incremento del gasto a menudo acelera la elusin sin ejercer ningn efecto importante en la resolucin. Detectores En cromatografa de gases se dispone de diversos detectores que indican los cambios en la composicin del eluyente. En la tabla 4.2 se mencionan los ms empleados, junto con una breve sinopsis de sus cifras de mrito, que incluyen sus lmites de deteccin y sus intervalos lineales. Inclusive en CGL capilar y con columnas de baja capacidad que requieren de muestras pequeas, es posible efectuar determinaciones de ppm que requieren cuantificaciones de 10-10 g de los componentes de muestras reales. Esta masa de 10 -10 g es la
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que se integra en toda la banda. En cualquier momento la cantidad presente en el transductor es menor y el lmite de deteccin se indica en g s -1 o en unidades ms pequeas, como pg s-1. Como es de imaginar, los detectores no son igualmente sensibles a todos los compuestos. Por ejemplo, dos de los ms comunes, el detector de ionizacin de llama y el de captura de electrones, tienen selectividades bastante distintas. Otro detector menos complicado, el de conductividad trmica, responde a un nmero muy amplio de compuestos pero es el menos sensible de los que se emplean en la actualidad. Al combinar el poder de separacin cromatogrfica con la capacidad de identificacin de la espectrometra de infrarrojo o la espectrometra de masas se obtienen herramientas poderosas para el anlisis de muestras complicadas. Las respuestas del espectrmetro de infrarrojo y del espectrmetro de masas son especficas para cada componente aunque se eluyan en una misma banda. Si el componente es un compuesto conocido es muy probable que los algoritmos de bsqueda de patrones ayuden a identificarlo y tambin se podr efectuar un anlisis cuantitativo mediante tcnicas de combinacin o hbridas. Las combinaciones son, respectivamente, cromatografa de gases con deteccin de infrarrojo con transformada de Fourier, que se abrevia CG/FTIR (Fourier-transform infrared detection), y cromatografa de gases con espectrometra de masas, que se abrevia CG/EM. Tabla 4.2 Propiedades de algunos detectores para cromatografa de gases
Tipo Lmite de deteccin aproximado (g s-1) -5 10 10-6 10-12 10-14 Intervalo lineal aproximado 103 104 106 107 102 103 Comentarios

Conductividad trmica (DCT) Ionizacin de llama (DIF) Captura de electrones (CE o DCE) Fotometra de llama (DFF) Nitrgeno-fsforo Fotoionizacin (DFI) Detector Hall

10-13 10-8 10-14 10-8 10-12

102 105 107 105

10-11

105

Espectrmetro de 10-12 a masas (EM) Infrarrojo de 10-10 102 Molculas polares transformadas de Fourier (IRTF) a. Variable y dependiente del tipo de espectrmetro de masas y tambin del tipo de compuestos que se analizan. UNT M.Sc. Segundo M. Miranda Leyva Fac. Farmacia y Bioqumca

Detector universal. Mide cambios en la conductividad del calor. Detector universal. Mide corrientes inicas de pirlisis Detector selectivo para compuestos con tomos de afinidades electrnicas altas. Detector selectivo para compuestos que contienen S, P. Selectivo para compuestos que contienen N, P. Universal (con cierta selectividad debida a la identidad del gas en la lmpara. Detector especfico para compuestos que contienen halgenos, S o N. Detector universal.

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Resumen: Cromatografa

RESUMEN: LA CROMATOGRAFIA Con el trmino cromatografa se engloba una serie de tcnicas en las que los componentes de una muestra son transportados por una fase mvil (gas lquido), a travs de una fase estacionaria (lquida slida) que los retiene selectivamente haciendo que eluyan a tiempos distintos, permitiendo su deteccin individual. La cromatografa se puede clasificar en dos grandes ramas, segn la fase mvil que se emplee, sub-dividindose stas a su vez de acuerdo al medio en que se realiza la separacin. Una clasificacin general de los distintos tipos se muestra en el siguiente cuadro:

El campo de la aplicacin de cada tipo de cromatografa est fijado por sus caractersticas principales, debiendo compatibilizarse estas con las de los compuestos a analizar, para determinar cul es la tcnica ms adecuada a emplear en el anlisis. Esto origina que pese a ser tcnicas parecidas, sean tiles en la solucin de problemas distintos, convirtindose ms bien en tcnicas complementarias. As, mientras que por Cromatografa de gases (CG) analizamos compuestos voltiles, con la cromatografa lquida separamos aquellos compuestos polares y no polares de baja volatilidad. El advenimiento de la cromatografa lquida de alta performance HPLC, por sus siglas en ingls, basada en el empleo de columnas de pequeo dimetro rellenas con micropartculas y de altas presiones para el flujo de solventes; ampla enormemente los campos de aplicacin de esta tcnica analtica. Como una primera orientacin presentamos una comparacin de los dos grupos principales de las tcnicas cromatogrficas, en funcin de las principales caractersticas de la muestra que tienen un carcter limitante para el uso de cada una de estas tcnicas

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Resumen: Cromatografa

Tabla. Comparacin de CG con HPLC


CG
. Volatilidad de la muestra. . Es crtica la estabilidad molecular de la muestra. - Por proceso trmico. - Contra catalizadores. . Slo para compuestos de peso molecular menor a 500. . No se recupera la muestra generalmente. . .

HPLC
Solubilidad de la muestra. No es crtica la estabilidad de la muestra molecular, por no usarse altas temperaturas. No hay limitacin en el peso molecular de los compuestos. Fcil recuperacin de la muestra.

. .

De aqu podemos concluir que la cromatografa de gases es la va ms adecuada cuando se desea analizar compuestos voltiles, siempre que sean estables trmicamente; mientras que si se trata de compuestos polares, la cromatografa lquida nos brinda una mejor solucin, al no ser su baja volatilidad un factor limitante.

Estas diferencias y limitaciones se relacionan con las diferentes variables que controlan el proceso en cada uno de los instrumentos empleados por estas tcnicas. Cada tipo de cromatgrafo es gobernado por un conjunto diferente de variables, esto se comprueba fcilmente al comparar esquemticamente las partes principales que debe tener un sistema CG y el HPLC. En un primer anlisis encontramos que en el cromatgrafo de gases ser necesario controlar la presin y temperatura del gas de arrastre; mientras que en el de lquidos se deber controlar la composicin y flujo del solvente.

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