DETERMINACIN DE BENZOATO DE SODIO EN LAS BEBIDAS CARBONATADAS (GASEOSAS) Y EXTRACTOS MEDIANTE EL MTODO DE CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTO RENDIMIENTO (HPLC)

INTRODUCCIN

La preservacin por medios qumicos se ha convertido en una prctica cada vez ms importante en la tecnologa moderna de los alimentos y plantas medicinales con el aumento de productos transformados. Estos conservantes se aaden deliberadamente para detener o retrasar las prdidas de productos alimenticios y farmacuticos, debido a los cambios microbiolgicos, enzimticos o qumicos, aumentando as su vida til. El cido benzoico, cido srbico y sus correspondientes sales son generalmente eficaces para controlar el moho e inhiben el crecimiento de la levadura y de una amplia gama de bacterias. La determinacin analtica de estos conservantes no slo es importante para asegurar la calidad, sino tambin para el inters y proteccin del consumidor. El mtodo de anlisis ms comn para la determinacin de cido benzoico (BA) y cido srbico (SA) o benzoato de sodio y sorbato de potasio ha sido la HPLC de fase inversa, aunque otros mtodos de anlisis, tales como TLC, la electroforesis capilar y la cromatografa de gases tambin se han reportado. Este mtodo es importante, ya que en la actualidad hay una tendencia creciente en el uso de combinaciones de conservantes en las bebidas gaseosas y extractos de frutas. El mtodo se aplic al anlisis de estos conservantes en 50 refrescos y 55 extractos de hierbas.

RESUMEN

En el presente estudio, se tuvo como objetivo la determinacin de benzoato de sodio en las bebidas carbonatadas y extractos de frutas utilizando el mtodo de cromatografa lquida de alto rendimiento HPLC. La separacin del benzoato de sodio se realiz en el C18 de la columna usando el tampn acetonitrilo de acetato amnico como fase mvil. La longitud de onda detector se ajust a 254 nm. Separacin de los componentes (benzoato de sodio y sorbato de potasio) se logr en menos de 6 min. Las caractersticas analticas de la separacin, como el lmite de deteccin, lmite de cuantificacin, exactitud, precisin y reproducibilidad fueron evaluadas para el benzoato de sodio (BS) y sorbato de potasio (SP) respectivamente. Se ha demostrado que la concentracin de la SB y PS en las muestras de refrescos es mayor que la IDA (Ingesta Diaria Admisible), incluso para los consumidores normales, basadas en los lmites mximos especificados en las dietas modelos.

FUNDAMENTOS TERICOS

La Cromatografa lquida de altaeficacia o High performance liquid chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografa en columna utilizada frecuentemente en bioqumica y qumica analtica. Tambin se la denomina a veces Cromatografa lquida de alta presin o High pressure liquid chromatography (HPLC), aunque esta terminologa se considera antigua y est en desuso. El HPLC es una tcnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basndose en diferentes tipos de interacciones qumicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatogrfica. Para lograr velocidades de flujo razonables con los empaquetamientos habituales en cromatografa lquida moderna, con un intervalo de tamaos de 3 10 m, se requieren presiones de bombeo de varios centenares de atmsferas. Como consecuencia de esa presin tan alta, el equipo de HPLC tiende a ser mucho ms complejo y costoso que el de otros tipos de cromatografa.

Este mtodo analtico presenta: Elucin por alta presin (hasta 500 atmsferas) Alta resolucin, rapidez y reproducibilidad Purificacin de molculas biolgicas de gran variedad de Propiedades y tamaos.

HPLC CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN En la HPLC isocrtica el compuesto pasa por la columna cromatogrfica a travs de la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeas partculas redondeadas con ciertas caractersticas qumicas en su superficie) mediante el bombeo de lquido (fase mvil) aalta presin a travs de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones qumicas o fsicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. El grado de retencin de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composicin de la fase estacionaria y de la fase mvil. El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de retencin y se considera una propiedad identificativa caracterstica de un compuesto en una determinada fase mvil y estacionaria. La utilizacin de presin en este tipo de cromatografas incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro de la columna y reduce as su difusin dentro de la columna mejorando la resolucin de la cromatografa. Los disolventes ms utilizados son el agua, el metanol y elacetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el cido trifluoroactico, que ayudan a la separacin de los compuestos. Una mejora introducida a la tcnica de HPLC descrita es la variacin en la composicin de la fase mvil durante el anlisis, conocida como elucin en gradiente. Un gradiente normal en una cromatografa de fase reversa puede empezar a un 5% de acetonitrilo y progresar de forma lineal hasta un 50% en 25 minutos. El gradiente utilizado vara en funcin de la hidrofobicidad del compuesto. El gradiente separa los componentes de la muestra como

una funcin de la afinidad del compuesto por la fase mvil utilizada respecto a la afinidad por la fase estacionaria. En el ejemplo, utilizando un gradiente agua/acetonitrilo los compuestos ms hidroflicos eluirn a mayor concentracin de agua, mientras que los compuestos ms hidrofbicos eluirn a concentraciones elevadas de acetonitrilo. A menudo, hace falta realizar una serie de pruebas previas con tal de optimizar el gradiente de forma que permita una buena separacin de los compuestos.

DETECTORES DE ABSORBANCIA Muchos detectores de absorbancia son dispositivos de doble haz, en los que uno de los haces pasa por la cubeta de flujo y el otro a travs de un filtro que reduce su intensidad. Para comparar las intensidades de los dos haces se utilizan detectores fotoelctricos contrastados. El cromatograma consiste en una representacin del logaritmo del cociente de las dos seales detectadas en funcin del tiempo. Tambin se utilizan instrumentos de un solo haz. En este caso, las medidas de intensidad del disolvente se almacenan en la memoria de un ordenador y al final se recuperan para el clculo de la absorbancia. La figura muestra el esquema de una celda de flujo en forma de Z para las medidas de la absorbancia de los efluentes de una columna cromatogrfica. A fin de minimizar el ensanchamiento de banda extracolumna, el volumen de estas cubetas ha de ser lo menor posible, de modo que los volmenes se limitan por lo comn de 1 a 10 ML y las longitudes de la cubeta de 2 a 10 mm. La utilizacin de cubetas de este tipo est restringida, en la mayor parte de los casos, a presiones no mayores de unos 600 psi. En consecuencia, a menudo es necesario un dispositivo para reducir la presin.

TIPOS DE HPLC 1. Cromatografa de fase normal La cromatografa de fase normal o "Normal phase HPLC" (NP-HPLC) fue el primer tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la qumica, y se caracteriza por separar los compuestos en base a su polaridad. Esta tcnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase mvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de inters es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza de absorcin aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interaccin entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparacin a la fase mvil) aumenta el tiempo de retencin. La fuerza de interaccin no slo depende de los grupos funcionales del compuesto de inters, sino tambin en factores estricos de forma que los ismeros estructurales a menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La utilizacin de disolventes ms polares en la fase mvil disminuye el tiempo de retencin de los compuestos mientras que los disolventes ms hidrofbicos tienden a aumentar el tiempo de retencin. La NP-HPLC cay en desuso a los aos setenta con el desarrollo del HPLC de fase reversa o Reversed-phase HPLC debido a la falta de reproductibilidad de los tiempos de retencin puesto que los disolventes prticos cambiaban el estado de hidratacin de la silica o almina de la cromatografa.

2. Cromatografa de fase reversa La HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste en una fase estacionaria apolar y una fase mvil de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias ms comunes de este tipo de cromatografa es la silica tratada con RMe2SiCl, dnde la R es una cadena alquil tal como C18H37 o C8H17. El tiempo de retencin es mayor para las molculas de naturaleza apolar, mientras que las molculas de carcter polar eluyen ms rpidamente. El tiempo de retencin aumenta con la adicin de disolvente polar a la fase mvil y disminuye con la introduccin de disolventes mas hidrofobicos. La cromatografa de fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna especificacin adicional. La cromatografa de fase reversa se basa en el principio de las interacciones hidrofbicas que resultan de las fuerzas de repulsin entre un disolvente relativamente

polar, un compuesto relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar. La fuerza conductora en la unin del compuesto a la fase estacionaria es la disminucin del rea del segmento apolar del analito expuesto al disolvente. Este efecto hidrofbico est dominado por la disminucin de la energa libre de la entropa asociada con la minimizacin de la interfase compuesto-disolvente polar. El efecto hidrofbico disminuye con la adicin de disolvente apolar a la fase mvil. Esto modifica el coeficiente de particin de forma que el compuesto se mueve por la columna y eluye. Las caractersticas del compuesto de inters juegan un papel muy importante en la retencin. En general, un compuesto con una cadena alquil larga se asocia con un tiempo de retencin mayor porque aumenta la hidrofobicidad de la molcula. Aun as, las molculas muy grandes pueden ver reducida la interaccin entre la superficie del compuesto y la fase estacionaria. El tiempo de retencin aumenta con el rea de superficie hidrofbica que suele ser inversamente proporcional al tamao del compuesto. Los compuestos ramificados suelen eluir ms rpidamente que sus ismeros lineales puesto que la superficie total se ve reducida. Aparte de la hidrofobicidad de la fase inmvil, otras modificaciones de la fase mvil pueden afectar la retencin del compuesto; por ejemplo, la adicin de sales inorgnicas provoca un aumento lineal en la tensin superficial, y como que la entropa de la interfase compuesto-disolvente est controlada precisamente por la tensin superficial, la adicin de sales tiende a aumentar el tiempo de retencin. Otra variable importante es el pH puesto que puede cambiar la hidrofobicidad del compuesto. Por este motivo, la mayora de mtodos utilizan un tampn como el fosfato de sodio para controlar el valor del pH. Estos tampones controlan el pH, pero tambin neutralizan la carga o cualquiera resto de silica de la fase estacionaria que haya quedado expuesta y actan como contra-iones que neutralizan la carga del compuesto. El efecto de los tampones sobre la cromatografa puede variar, pero en general mejoran la separacin cromatogrfica. Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad que las columnas de silica normales. Aun as, muchas columnas de fase reversa estn formadas por silica modificada con cadenas alquil y no se deben utilizar nunca con bases en medio acuoso puesto que stas podran daar el esqueleto de silica subyacente. Las columnas se pueden utilizar en cidos en medio acuoso pero no deberan estar expuestas demasiado tiempo al cido porque puede corroer las partes metlicas del aparato de HPLC.

3. Cromatografa de exclusin molecular La cromatografa de exclusin molecular, tambin conocida como cromatografa por filtracin en gel, separa las partculas de la muestra en funcin de su tamao. Generalmente se trata de una cromatografa de baja resolucin de forma que se suele utilizar en los pasos finales del proceso de purificacin. Tambin es muy til para la determinacin de la estructura terciaria y la estructura cuaternaria de las protenas purificadas. La cromatografa de filtracin molecular es un mtodo de cromatografa en columna por el cual las molculas se separan en solucin segn su peso molecular, o ms precisamente, segn su radio de Stokes. En esta cromatografa, la fase estacionaria consiste en largos polmeros entrecruzados que forman una red tridimensional porosa. A los fines prcticos, la columnas se empaquetan con pequeas partculas esferoidales formadas por esos polmeros entrecruzados. En consecuencia, estas partculas son porosas, y el tamao de los poros es tal que algunas molculas (las demasiado grandes) no podrn ingresar a esos poros, en tanto que otras (las suficientemente pequeas) podrn pasar libremente. Los poros quedan conectados formando una malla o red, lo cual determina una serie de caminos a ser recorridos por las molculas que acceden al interior de esta.

4. Cromatografa de intercambio inico

En la cromatografa de intercambio inico, la retencin se basa en la atraccin electrosttica entre los iones en solucin y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria. Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna. Algunos tipos de intercambiadores inicos son: Resinas de poliestireno, intercambiadores inicos de celulosa y dextranos (geles) Silica porosa o vidrio de tamao de poro controlado.

En general los intercambiadores inicos favorecen la unin de iones elevada carga y radio pequeo. Un incremento en la concentracin del contra-in (respecto a los grupos funcionales de la resina) reduce el tiempo de retencin. Un incremento en el pH reduce el tiempo de retencin en las cromatografas de intercambio catinico mientras que una

disminucin del pH reduce el tiempo de retencin en las cromatografas de intercambio aninico. Este tipo de cromatografa es ampliamente utilizado en las siguientes aplicaciones: purificacin de agua, concentracin de componentes traza,Ligand-exchange chromatography, Ion-exchange chromatography of proteins, High-pH anion-exchange chromatography of carbohydrates and oligosaccharides, etc.

5. Cromatografa basada en bioafinidad Este tipo de cromatografa se basa en la capacidad de las sustancias biolgicamente activas de formar complejos estables, especficos y reversibles. La formacin de estos complejos implica la participacin de fuerzas moleculares como las interacciones de Van der Waals, interacciones electrostticas, interacciones dipolo-dipolo, interacciones hidrofbicas y puentes de hidrgeno entre las partculas de la muestra y la fase estacionaria.

PARTE EXPERIMENTAL

Reactivos Qumicos: Benzoato de sodio (> 99%), sorbato de potasio cido actico glacial y metanol que se obtuvieron de Merck (Darmstadt, Alemania). Acetonitrilo que se obtuvo de Caledon (Georgetown, Canad). Acetato de amonio que se ha obtuvo de Mallinckrodt Chemical obras (St. Louis). El agua utilizada para preparar el tampn y las soluciones estndar por el sistema de agua UHQ-II-MK3 de purificacin Millipore (High Wycombe, Buck, Reino Unido).

Equipos: El anlisis cromatogrfico se llev a cabo en un cromatgrafo de lquidos de alto rendimiento Dionex (Mnchen, Alemania y Sunnyvale, CA, EE.UU.) equipado con una bomba Dionex P680 y un inyector Dionex Rodyne Valre. La columna analtica que opera a temperatura ambiente fue de ACE C18-A3681, 250 x 4,6 mm ID desde Dionex, y el anlisis que implica la deteccin UV se realiz en un detector de absorbancia UVD Dionex 170U/340U UV / Vis. El Chromeleon (versin 6.60, 2002, Dionex) se utiliz como software para controlar el sistema.

Condiciones cromatogrficas: La fase mvil compuesta por una mezcla de tampn de acetato amnico y acetonitrilo se ajust a (40: 60). El tampn se prepar disolviendo 3,84 g de acetato de amonio en un litro de agua y ajustando el pH a 4,4 con cido actico. Antes del uso, el efluente se filtr a travs de un filtro de membrana de 0,45 mm y desgasific en un bao de ultrasonidos. La separacin se logr con elucin isocrtica a un caudal de 0,8 ml/min y 50 L de muestra se inyecta en el sistema cromatogrfico.

Curva de calibracin de las soluciones estndar: Las soluciones estndar mixtas que contienen 1, 2, 5, 10, 20 y 40 mg/L de benzoato de sodio y 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, y 4 mg/L de sorbato de potasio fueron preparados. 50 l de cada estndar fue inyectada. Las reas de los picos de los analitos (y) se graficaron frente a la concentracin respectiva (mg/L) de SB y PS (x). El anlisis de regresin se utiliz para determinar la pendiente, la ordenada al origen y los coeficientes de correlacin de las parcelas estndar.

Preparacin de la muestra: Las bebidas carbonatadas y los extractos de frutas se filtraron a travs de una membrana de 0,45. Si la concentracin del conservante en la bebida y el extracto de frutas es ms alta que la concentracin que se utiliza para construir la curva de calibracin, la muestra es diluida en agua.

Las muestras: Este estudio se realiz en 50 bebidas (gaseosas) y 55 extractos de frutas. Algunas muestras fueron compradas en los supermercados.

Resultados: Los tiempos de retencin para el SB y PS son alrededor de 4,9 y 5,6 minutos respectivamente. El orden de elucin es (1) benzoato de sodio (tiempo de retencin, 4,98 min) y (2) sorbato de potasio (tiempo de retencin, 5,67 min). Los valores encontrados en la separacin y la resolucin de la columna, indican que el mtodo analtico propuesto en este trabajo separa completamente los analitos. El lmite de deteccin (LD) se define como el pico ms pequeo detectado con una altura de la seal tres veces la de la lnea de base mientras que el lmite de cuantificacin (LC) se refiere al nivel ms bajo de analito que puede determinarse con un grado aceptable de confianza. Importantes caractersticas analticas del mtodo se resumen en la Tabla 1.

Fig. 1 - Ilustra el cromatograma de una solucin estndar, que contiene 40 mg / L de benzoato de sodio y 4 mg / Ll de sorbato de potasio

La fiabilidad del mtodo cromatogrfico fue probado para la determinacin de las mismas mezclas estndar que se almacenaron en un refrigerador, pero analizados sobre un perodo de 1 mes. Los resultados se muestran en la Tabla 2. Se encontr una desviacin estndar relativa (R.S.D.) de menos del 4%, que no slo indica la alta reproducibilidad del mtodo, sino que tambin indica que estos conservantes son estables durante al menos 1 mes cuando se almacena en el refrigerador. La identificacin de los picos de los conservantes en diversas muestras se bas en la comparacin entre los tiempos de retencin de los compuestos estndar y se confirm

por adicin de conocidos compuestos estndar para la muestra. La cuantificacin se basa en el mtodo del patrn externo usando las curvas de calibracin provistos por el anlisis de regresin lineal.

Tabla 1 - Caractersticas analticas del mtodo HPLC Parmetro Lmite de deteccin Limite de cuantificacin Preservativo Benzoato de sodio Sorbato de Potasio 0.05 0.005 0.1 0.01

Tabla 2 - Reproducibilidad inter-diaria sobre la determinacin de mezclas estndar de benzoato de sodio y sorbato de potasio (ndas = 6) | Benzoato de sodio Sorbato de potasio Concentracin Concentracin Desviacin Concentracin Desviacin (mg/L) media SD estndar media SD estndar (mg/L) relativa (RSD) relativa (RSD) (ndas = 6) (ndas = 6) 10 11.02 0.40 3.63 10.71 0.20 1.90 20 20.60 0.29 1.41 20.07 0.21 1.04 40 39.44 0.20 0.51 39.79 0.09 0.23

Cromatograma de bebida carbonatada (gaseosa) Multi-Fruit

Cromatograma de bebida carbonatada (gaseosa) Sour Cherry

Cromatograma de un extracto (jugo de naranja)

Tabla 3 Determinacin de Benzoato de sodio y sorbato de sodio en bebidas carbonatadas y extractos (ndas = 25) Bebida Benzoato de Sodio Sorbato de Potasio Gaseosa de Limn Concentracin RSD(%), n=25 Concentracin RSD(%), n=25 media SD media SD (mg/L) (mg/L) 163.8 3.6 2.2 263.8 5.7 2.2 Jugo de naranja 2312.7 174.9 7.5 No detectado No detectado

Resultados obtenidos:

DISCUCIN DE RESULTADOS

El mtodo de cromatografa lquida de alto rendimiento (HPLC) simplifica considerablemente el anlisis, ya que otros mtodos requieren mucho trabajo de pre-tratamiento, tales como la destilacin al vapor con mltiples pasos, diversas extracciones en fase slida, etc. La reduccin de su coste y el tiempo (4-6 minutos) comprende tambin un mayor nivel de sensibilidad y un menor nivel de LD (Lmite de deteccin) y LC (Lmite de cuantificacin). Esta informacin muestra que la concentracin de benzoatos y sorbatos en las muestras de bebidas como gaseosas es mayor que la IDA (Ingesta Diaria Admisible) incluso para los consumidores normales, basadas en los lmites mximos especificados en las normas de cada pas y en las dietas modelo dadas por la OMS Organizacin Mundial de la Salud en el 2000. El uso del benzoato debe ser regulada y se utilizan slo como un medio para controlar la levadura en concentraciones no superiores a las necesidades reales.

BIBLIOGRAFA

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