PARASITOLOGIA

INTRODUCCION.
La Parasitologa es una disciplina que estudia a organismos eucariontes que viven a expensas de un husped, al que le pueden producir dao. Comprende agentes biolgicos de diferentes formas y tamao, los parsitos se dividen en tres grandes grupos: protozoos, helmintos y artrpodos. La importancia de la disciplina radica en la gran prevalencia de las infecciones en humanos y animales, en la cantidad y heterogeneidad de los agentes biolgicos, en la diversidad de los ciclos biolgicos, y en la distribucin geogrfica de stos agentes en el mundo. La presencia de una infeccin parasitaria se asocia en forma estrecha a factores geogrficos y climticos, as como a factores antropolgicos y sociales de las poblaciones humanas. Actualmente la importancia de las parasitosis ha aumentado con la presencia de inmunodeprimidos, y con el aumento de poblaciones migrantes y de viajeros. Los parsitos se alojan en el aparato digestivo sobre todo en el intestino y una porcin de ellos, las larvas o los huevos son eliminados con las heces, de ah la importancia de esta muestra en el estudio parasitolgico. Los parsitos ms frecuentes en las heces son de tres tipos: helmintos, gusanos tipo scaris o tenia. protozoos, como la giardia lambia y las amebas. oxiuros o lombrices, muy frecuentes en nios pequeos. Los signos de enfermedad por parsitos son muy variados por lo que el medico solicitar el estudio en base a la sospecha clnica y que la tcnica es diferente segn el parsito a estudiar. Es aconsejable realizar varios anlisis simultneamente para aumentar la fiabilidad. Primero realizamos el examen macroscpico de la muestra de heces en el cual observamos directamente parsitos enteros si los hubiere y la consistencia. En el examen microscpico se buscan huevos de helmintos y quistes de protozoos mediante tcnicas de concentracin por flotacin o sedimentacin, tricroma, cuantificacin de huevos, tinciones permanentes, etc.

I.

Material

Envase estril o limpio capacidad 50 cc, boca ancha, de plstico irrompible, hermtico con tapn de rosca, con o sin medio de transporte. A veces es preciso que sea opaco para proteger de la luz o lo cubrimos con papel de aluminio.

Depresor de madera.

II.

Normas generales
por el facultativo.

Envase correctamente identificado segn protocolo acompaado de peticin rellenada

Son suficientes cantidades pequeas de heces, en general 2.5cc de heces formadas o 15-30 cc de heces liquidas. La muestra se traslada al frasco con depresor o tira de cartn. Evitar la contaminacin con orina, sangre, agua o papel higinico. En nios pequeos aislar los genitales con bolsa colectora de orina. No llenar el envase demasiado. Liberar el gas aflojando la tapa. Evitar contaminar el exterior del envase con la muestra y vigilar perdidas, derrames o roturas durante el transporte. Las muestras deben ser remitidas lo antes posible al laboratorio para su procesamiento en las 1-2 horas siguientes a la recogida y si esto no es posible guardar en nevera. En funcin del tipo de anlisis el paciente a veces deber seguir una dieta determinada y evitar o restringir algunos alimentos o frmacos previa consulta mdica los das previos a la toma de la muestra. Solicite instrucciones al laboratorio.

 Tras la obtencin de la muestra reanudar la dieta habitual y el tratamiento. Evitar la ingestin de antidiarreicos o catrticos as como aceites minerales para lubricar las heces porque su composicin altera los resultados. Hay pruebas en las que se precisa proteger la muestra de la luz como en la determinacin de coproporfirinas y cubriremos el frasco con papel de aluminio. MUESTRAS INADECUADAS: Resultan inadecuadas para el examen toda aquellas muestras que: Se han mantenido por ms de 24 hrs a temperatura ambiente. Han sido obtenidas despus de un estudio radiogrfico en el que se utiliz sulfato de bario. Fueron obtenidas con la posibilidad de contaminacin (tomadas directamente del suelo, parques o jardines).

III.

Principales Mtodos y Procedimientos para identificacin de parsitos.

Estos parsitos pueden ser detectados al examinar muestras fecales con las diferentes tcnicas, como son: frotis directo, sedimentacin, flotacin y ELISA fecal. La tcnica de flotacin es la ms utilizada en la prctica clnica. 3.1.-OBTENCIN DE LA MUESTRA 3.1.1. CONDICIONES GENERALES: Los parsitos intestinales del hombre son protozoarios y/o helmintos, llamados comnmente gusanos intestinales (Anexo A). Estos helmintos o gusanos pueden ser cilndricos (nemtodes), anillados o segmentados (cstodes). Para observar los trofozotos, quistes u ooquistes de los protozoarios, as como las larvas y huevos de helmintos, se debe usar un microscopio; en cambio, la mayor parte de los gusanos o helmintos adultos son macroscpicos y su morfologa puede estudiarse directamente, con ayuda de un estereoscopio o una lupa. Los protozoarios intestinales eliminan con las heces sus formas evolutivas (trofozotos, quiste, ooquiste y espora), segn la especie involucrada. Los helmintos intestinales adultos (progltidos de Taenia sp., Enterobius vermicularis y Ascaris lumbricoides) pueden salir al exterior espontneamente o despus del tratamiento.

 3.2.-MUESTRA PARA EXAMEN PARASITOLGICO Los gusanos intestinales se eliminan con las heces. Los mtodos de diagnstico de los parsitos intestinales pueden ser: directo o por concentracin de los elementos parasitarios que se eliminan en las heces. En las heces podemos encontrar formas adultas y microscpicas (huevos, larvas, trofozoitos, quistes, ooquistes y esporas) de los parsitos intestinales; por ello, es importante obtener una buena muestra fecal, as como la conservacin ptima del espcimen. La muestra debe ser obtenida (entre 3 y 6 gramos) lo ms fresca posible (mximo 90 minutos, si se busca Entamoeba histolytica), y depositada en un frasco de boca ancha con tapa rosca y rotulada correctamente con los datos de identificacin. La muestra debe obtenerse antes del uso de medicamentos antiparasitarios, o hasta 2 a 5 das despus de su administracin. Las heces depositadas en el suelo no son las recomendadas para el diagnstico, debido a que pueden contaminarse con formas biolgicas, como por ejemplo: larvas similares a los enteroparsitos del hombre, larvas de nemtodes, huevos de caros o insectos, etc. Si el paciente no es regular en la evacuacin de sus deposiciones y ha evacuado en la noche anterior al examen, se recomienda guardar la muestra en una refrigeradora o en un lugar fresco no expuesto a la luz solar, para que no se alteren las formas parasitarias. Cuando la muestra va a demorar en llegar al laboratorio varias horas o das, se recomienda adicionarle lquido fijador y/o conservador (PAF, PVA, formalina 10%, SAF, acetato de sodio, etc.). En algunos parasitismos relacionados al parasitismo intestinal, es necesario el examen de bilis, esputo, secrecin, biopsia, tejido de necropsia o frotis perianal.

Comprende las siguientes muestras: heces, bilis o jugo duodenal, esputo, secrecin, biopsia o preparaciones histolgicas, siendo heces, la ms frecuente. 3.2.1 Heces 3.2.1.1 .Caractersticas de la muestra: a. Recipiente o contenedor: boca ancha, con tapa rosca. b. Cantidad: 3 - 6 g.

c. Condiciones ptimas: No estar mezclado con orina, que no exista el antecedente de haber ingerido bario u otros productos de contraste, y llevar la muestra al laboratorio en corto tiempo (de 2 - 4 horas de su obtencin). 3.2.1.2 Registro de datos: Se debe consignar la siguiente informacin: Nombre, edad, sexo, ocupacin, sntomas y signos fecha de inicio de sntomas y diagnstico presuntivo. 3.2.1.3 Procesamiento de la muestra: a. Debe realizarse lo antes posible y en un lugar apropiado (que no le llegue la luz directa). Las muestras diarreicas y las que contienen sangre, deben examinarse en forma macroscpica y microscpica apenas lleguen al laboratorio. b. Se aplicar la metodologa correspondiente (Anexo B). c. Los reactivos y colorantes empleados en el procesamiento deben estar en envases adecuados, mantenerse fuera de los rayos del sol o luz, etiquetados (con nombre y fecha de preparacin), sometidos a un control peridico y con una preparacin proporcional a la demanda . 3.2.1.4 Reporte de resultados Escribir el nombre completo de los parsitos, indicando el estadio evolutivo y su densidad en la muestra. ENVO Y TRANSPORTE DE LA MUESTRA CONDICIONES ESPECFICAS Las muestras deben mantenerse en un ambiente fresco y lejos de la luz solar, se deben evitar las temperaturas extremas o el desecamiento, deben contener cantidades ptimas y estar en frascos o contenedores rotulados y con soluciones conservadoras. Condiciones del envo de la muestra segn el tipo y tiempo de demora en llegar al laboratorio para el diagnstico parasitolgico.

TIEMPO QUE DEMORA EN TIPO DE MUESTRA Esputo, secrecin biliar Contenido duodenal Frotis perianal Secrecin vaginal Tejidos Helmintos 4C T ambiente Formol 10% Nemtodes en alcohol E. histolytica, otros(segn el tejido) Ascaris, Trichuris,Diphyllobothrium, Taenia, Paragonimus y Fasciola, etc. T ambiente T ambiente T ambiente Frotis en lmina T ambiente PAF,Formalina 10% Giardia,Strongyloides,Paragonimus, Fasciola, Ancylostoma o Necator,Microsporidia y otros. Enterobius, Ascaris, Taenia y otros. E.vermicularis. LLEGAR AL LABORATORIO < 24 HORAS T ambiente 24 HORAS PAF, SAF,Formalina 10% Paragonimus, Fasciola, Giardia. AGENTESPARASITARIOS

70%,CstodesyTremtodes en formol 10% Suero Heces 4C T ambiente Hielo seco o congelador PAF, PVA,Formalina 10%, Cary blair,Bicromato de potasio al 2,5%,MIF

E. histolytica, Giardia,Paragonimus, Fasciola y otros. E.histolytica,Giardia,Cryptosporidium,Enterocytozoon, Encephalitozoon y otros.

3.2.1.5. PROCEDIMIENTO
Colocar la muestra elegida en un envase apropiado, rotulado correctamente y en un recipiente secundario (podra ser de plstico u otro material resistente a roturas). Enviar la muestra al laboratorio lo antes posible; en caso fuera fresca, dentro de las 2 a 4 horas de obtenida. Si el envo de la muestra va a demorar ms de un da en llegar al laboratorio, debe guardarse en un fijador conservador, aplicando las medidas de bioseguridad correspondientes. Si se enviara la muestra a otro laboratorio, el personal responsable del envo debe elegir la forma apropiada para la ptima conservacin de sta. Cuando la muestra no rene las condiciones o cantidades ptimas para los anlisis, as como los datos, se recomienda establecer contacto con la persona responsable para efectuar las correcciones respectivas. 3.2.1.6. RECHAZO DE UNA MUESTRA: Es importante controlar cada hoja de pedido y verificar si tiene toda la informacin (etiquetado). De no cumplirse ello, se debe establecer contacto con la persona responsable para efectuar las correcciones necesarias.

Los criterios para rechazar una muestra son los siguientes: No indicar el tipo de muestra o procedencia. No indicar el examen requerido. Demora en el envo al laboratorio. Muestra sin rotular o mal rotulada. Muestra que presente evidencia de haber sido derramada. Recipiente o contenedor inapropiado. Muestra con contaminacin. Muestra escasa o seca en el hisopo o contenedor. Presencia de una sola muestra, a pesar de la presencia de varias rdenes. Volumen o cantidad inadecuada. En casos de rechazar una muestra, el personal de laboratorio debe explicar al solicitante las observaciones y motivos en la ficha de solicitud de diagnstico. Si no fuera posible la obtencin de otra muestra, revisar nuevamente los exmenes realizados.

Tener en cuenta el examen parasitolgico por macroscopa.

3.3. PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO PARASITOLGICO - HECES A) EXAMEN DIRECTO MACROSCPICO Fundamento: Permite observar directamente las caractersticas morfolgicas de los parsitos adultos, enteros o fraccionados, as como los cambios en las caractersticas organolpticas de las heces eliminadas,(color, presencia de sangre y/o moco, consistencia, etc.). Materiales: Suero fisiolgico (Anexo C). Aplicador (baja lengua). Pinza de metal. Coladera de plstico o malla metlica.

Procedimiento: Agregar suero fisiolgico en cantidad suficiente para homogeneizar la muestra. En caso de presencia de parsitos adultos, tamizar o colar la muestra.

Observacin: Observar las caractersticas organolpticas de las heces, tiles para la ayuda diagnstica (consistencia, color, presencia de moco, sangre, alimento sin digerir), as como la presencia de gusanos cilndricos, anillados o aplanados (enteros o parte de ellos).

Progltido grvido de Taenia solium Y Ascaris lumbricoides macho adulto. Resultado: En caso que la muestra no sea normal, es decir, contenga informacin til para el diagnstico (ejemplo: presencia de glbulos rojos, fibras musculares no digeridas, mucus, etc.), se debe adicionar al informe del examen parasitolgico las caractersticas macroscpicas de las heces. B) EXAMEN DIRECTO MICROSCPICO Fundamento: Buscar, principalmente en muestras frescas, la presencia de formas evolutivas mviles de parsitos de tamao microscpico (trofozotos, quistes de protozoos: Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Balantidium coli, etc.; as como larvas o huevos de helmintos: Strongyloides stercoralis, Ancylostomaduodenale, Necator americanus, Trichostrongylus sp., Paragonimus, Fasciola, etc.). Materiales: Lminas portaobjetos. Laminillas cubreobjetos. Aplicador de vidrio o madera. Microscopio ptico. Marcador de vidrio. Suero fisiolgico. Solucin de lugol. Verde brillante. Rojo neutro.

Materiales para la aplicacin del mtodo directo: lminas, laminillas, aplicador, solucin salina y lugol.

Procedimiento: Colocar en un extremo de la lmina portaobjeto una gota de suero fisiolgico y, con ayuda de un aplicador, agregar 1 a 2 mg de materia fecal, emulsionarla y cubrirla con una laminilla cubreobjeto. Colocar en el otro extremo de la lmina portaobjeto, una gota de lugol y proceder a la aplicacin de la muestra fecal como en el prrafo anterior. Con el suero fisiolgico, los trofozotos y quistes de los protozoarios se observan en forma natural, y con lugol, las estructuras internas, ncleos y vacuolas. En algunos casos, se recomienda el uso de colorantes vitales, debido a que no alteran la actividad del trofozoto. Los ms usados son verde brillante 0,2% y rojo neutro 0,01%. Observacin: Observar al microscopio a 10X 40X. No es aconsejable usar objetivo de inmersin (100X), pues se puede ensuciar el microscopio. Recorrer la lmina siguiendo un sentido direccional, ejemplo: de derecha a izquierda, o de arriba a abajo. Resultado: En un formato y en el cuaderno de registro correspondiente, se anotar el nombre de la especie del parsito y su estadio evolutivo, indicando la densidad (nmero de formas parasitarias por campo microscpico) expresado en cruces.

Trofozoito de Giardia lamblia con solucin lugol (200X)

C) MTODOS DE CONCENTRACIN Los trofozotos, quistes, ooquistes, larvas y huevos, pueden concentrarse por diversos procedimientos, lo cual permite corroborar el hallazgo del mtodo directo y conocer la intensidad del enteroparasitismo. Estos procedimientos de concentracin pueden ser: flotacin, sedimentacin, o por combinacin de ambos mtodos. La eleccin de cada procedimiento depender de las facilidades del laboratorio, el adiestramiento del personal, la procedencia de la muestra (zona geogrfica), el conocimiento de la prevalencia de los parsitos (zona costea, andina y selvtica o rea rural o urbana), y la especie del parsito que se desea investigar. a) Mtodos de concentracin por sedimentacin: a.1) Tcnica de la sedimentacin espontnea en tubo (Tcnica de concentracin por sedimentacin, sin centrifugacin): Fundamento: Se basa en la gravidez que presentan todas las formas parasitarias para sedimentar espontneamente en un medio menos denso y adecuado como la solucin fisiolgica. En este mtodo es posible la deteccin de quistes, trofozotos de protozoarios, huevos y larvas de helmintos. Materiales: Tubos de vidrio o plstico de 13 x 100, 16 x 150, o tubos de 50 mL de capacidad que terminen en forma cnica. Lminas portaobjetos. Laminillas de celofn recortadas adecuadamente (22 x 22 mm 22 x 30 mm.).

 Solucin fisiolgica. Pipetas de vidrio o plstico. Agua destilada, hervida o de lluvia. Gasa recortada en piezas de 9 x 9 cm. Procedimiento: Tomar una porcin de heces (1 - 2 g) y homogeneizar con suero fisiolgico en un tubo limpio o en el mismo recipiente en que se encuentra la muestra. Colocar una gasa, hundindola en la abertura del tubo y sujetndola con una liga alrededor de ella. Filtrar el homogeneizado a travs de la gasa, llenando el tubo hasta la cuarta parte de su contenido. Agregar suero fisiolgico hasta 1 cm por debajo del borde del tubo. Ocluir la abertura del tubo con una tapa, parafilm o celofn. Agitar enrgicamente el tubo por 15 segundos aproximadamente. Dejar en reposo de 30 a 45 minutos. En caso que el sobrenadante est muy turbio, eliminarlo y repetir la misma operacin con solucin fisiolgica o agua filtrada. Aspirar la parte media del tubo con una pipeta y colocar 1 2 gotas en una lmina portaobjeto. Aspirar el fondo del sedimento con una pipeta y depositar 1 2 gotas del aspirado en los extremos de la otra lmina portaobjeto. Agregar 1 2 gotas de solucin lugol a una de las preparaciones. Cubrir ambas preparaciones con las laminillas de celofn y observar al microscopio Observacin: Examinar primero la preparacin con solucin fisiolgica para observar formas mviles y de menor peso especfico (trofozotos, quistes y larvas) y luego la preparacin con lugol para observar sus estructuras internas, de estos y de otros parsitos de mayor peso especfico (huevos, larvas). Resultado: Informar la presencia de las formas evolutivas de los parsitos. a.2) Mtodo de sedimentacin rpida (TSR, MSR) (Concentracin por sedimentacin sin centrifugacin) (Lumbreras y col. 1962):

Materiales para la aplicacin del mtodo de sedimentacin rpida: vasos, gasa, pipeta de transferencia, desinfectada, etc.

Fundamento: Se basa en la gravidez de los huevos que, por su tamao y peso sedimentan rpidamente cuando se suspenden en agua. Materiales: Copa o vaso de vidrio o plstico, cnico de 150 a 200 mL. Coladera de malla metlica o plstico. Placas Petri o lunas de reloj. Aplicador de madera (1/3 de bajalengua). Pipeta Pasteur. Gasa. Agua corriente filtrada. Microscopio. Procedimiento: Homogeneizar 3 a 6 g de heces con unos 10 a 20 mL de agua filtrada Colocar la coladera y dos capas de gasa en la abertura del vaso y a travs de ella,filtrar la muestra. Retirar la coladera y llenar la copa con agua filtrada hasta 1 cm. debajo del borde, esto es 15 a 20 veces el volumen de la muestra. Dejar sedimentar la muestra durante 30 minutos. Decantar las 2/3 partes del contenido del vaso y agregar nuevamente agua. Repetir los pasos anteriores cada 5 a 10 minutos por 3 a 4 veces, hasta que el sobrenadante quede limpio.

Transferir el sedimento a una placa Petri o luna de reloj, por incorporacin o con ayuda de una pipeta Pasteur.

Observar al estereoscopio o microscopio, a menor aumento.

Observacin: Observar la presencia de huevos. Este mtodo es especialmente til para la bsqueda de Fasciola heptica, Paragonimus sp. y nemtodes como Ascaris lumbricoides (huevo fecundado o no fecundado), Trichuris trichiura, Hymenolepis nana, Diphyllobothrium pacificum, etc.
Huevos oprculados de Paragonimus peruvianus en muestra fresca.

Resultado: Informar de la presencia de huevos o larvas de parsitos. a.3) Tcnica de Faust: Mtodo de sedimentacin y flotacin por centrifugacin con sulfato de zinc al 33,3% y densidad 1180: Fundamento: Se basa en que los quistes y/o huevos de los parsitos flotan en la superficie por ser de menor densidad que el sulfato de zinc a 33,3%, cuya densidad es 1180. Es til para la bsqueda de quistes y/o huevos de parsitos y excepcionalmente se observan larvas. Se recomienda controlar la densidad del sulfato de zinc y usar agua filtrada para el lavado previo de la muestra. Materiales: Gradilla para tubos de ensayo. Tubos de prueba 15 x 150. Tubos de prueba 13 x 100. Lminas portaobjetos. Laminillas cubreobjetos. Embudo pequeo de vidrio.

 Bajalengua o bagueta. Gasa. Sulfato de zinc 33,3%, densidad 1,180 (Anexo C). - Solucin de lugol. Procedimiento: Colocar 1 a 2 g de la muestra de heces en el tubo de prueba 13 x 100 o 15 x 150 y agregar de 7 a 10 mL de agua filtrada o destilada. Realizar una buena homogeneizacin con ayuda del bajalengua o bagueta. Colocar en el tubo, un embudo con dos capas de gasa y filtrar la muestra homogeneizada hasta alcanzar 1 cm por debajo del borde del tubo (opcional). Retirar el embudo y centrifugar de 2 000 a 2 500 r.p.m. de 2 a 3 minutos (opcional). Decantar el sobrenadante, adicionar agua al sedimento, homogeneizar y repetir la centrifugacin 1 2 veces, hasta que el sobrenadante se observe limpio. Eliminar el sobrenadante y agregar la solucin de sulfato de zinc (3-4 mL), homogeneizar y completar con la misma solucin hasta 1 cm del borde del tubo. Centrifugar de 1 a 2 minutos de 2 000 a 2 500 r.p.m. Colocar el tubo en la gradilla y agregar, con ayuda de un gotero, la solucin de sulfato de zinc hasta formar un menisco en la boca del tubo. Colocar una laminilla cubreobjeto sobre el menisco y dejar en reposo de 5 a 6 minutos. Depositar una gota de solucin lugol en la lmina portaobjeto. Retirar la laminilla cubreobjeto, colocarla sobre la gota de lugol o con asa de Kolle colocar 3 4 asadas en la lmina y cubrir con una laminilla cubreobjeto y observar al microscopio. Lectura: Resultado: Informar el nombre y estadio evolutivo encontrado, as como la cantidad de elementos observados por campo. b) Mtodos de concentracin por flotacin: b.1) Sheather Sugar: Mtodo de concentracin por flotacin con centrifugacin en una solucin de azcar: Fundamento: Se basa en la flotacin de quistes, ooquistes y huevos de parsitos en una solucin de azcar que posee mayor densidad que ellos. Esta tcnica es til para la concentracin de quistes y ooquistes de protozoos y huevos de helmintos y se usa como mtodo preferencial en el diagnstico de los coccidios: Cryptosporidium, Cyclospora, Isospora, etc.

 Materiales: Tubos de ensayo 13 x 100. Lminas portaobjetos.

Laminilla cubreobjetos. Aplicador. Solucin saturada de azcar. Asa de platino. Gradilla para tubos de ensayo. Suero fisiolgico. Embudo de vidrio. Gasa. Procedimiento: Homogeneizar 1 a 2 g de materia fecal en suero fisiolgico. Colocar un embudo de vidrio con una gasa doblada en la abertura del tubo de ensayo y filtrar el material homogeneizado. Centrifugar el tubo con el material homogeneizado a 1 500 r.p.m. durante 2 a 5 minutos. Eliminar el sobrenadante, y agregar la solucin de azcar hasta 1 cm del borde del tubo, agitar hasta disolver el sedimento, centrifugar como en el paso anterior, completar con la solucin de azcar hasta el borde y esperar de 2 a 5 minutos la formacin de un menisco. Con la ayuda del asa de platino, tomar una muestra de la superficie del menisco y colocarla en una lmina portaobjeto, agregar lugol, cubrir con una laminilla y observar al microscopio. En el caso de observar coccidios, de la superficie del preparado, tomar con la asa de platino o con una pinza curva, una muestra para preparar un frotis para teir por el mtodo de Ziehl-Neelsen modificado. Observacin: Esta tcnica es apropiada para la observacin y registro de ooquistes de Isospora, Cryptosporidium,Cyclospora y Sarcocystis

Resultado: Informar la presencia de las formas evolutivas de los parsitos encontrados y su cantidad, expresado en cruces. b.2) Mtodo de Parodi Alcaraz (Mtodo de concentracin por flotacin sin centrifugacin, en solucin sobresaturada de azcar):

 Fundamento: Se basa en la propiedad que tienen los quistes y/o huevos de flotar en la superficie de una solucin saturada de azcar, debido a su menor densidad. El mtodo es til para la deteccin de quistes de protozoarios y huevos de helmintos. Materiales: Tubos de 13 x 100 15 x 150. Lminas portaobjetos. Laminillas cubreobjetos. Solucin saturada de azcar (azcar rubia). F Aplicador de madera (1/3 de baja lengua). - Solucin de lugol. Procedimiento: Colocar 1 a 2 g de heces en el tubo de ensayo. Agregar 3 a 5 mL de la solucin sobresaturada de azcar y homogeneizar con un aplicador. Completar el contenido del tubo con la misma solucin de azcar hasta formar un menisco. Dejar en reposo por 30 minutos. Colocar en contacto con el menisco, una laminilla cubreobjeto que permitir la adherencia por viscosidad de los quistes y huevos. Colocar en la lmina portaobjeto una gota de solucin de lugol. - Retirar la laminilla con sumo cuidado, colocarla sobre la lmina portaobjeto y examinar al microscopio. Lectura: Es conveniente la observacin inmediata a 10X y 40X, pues los quistes y/o huevos suelen deformarse si la densidad de la solucin es demasiado alta. Resultado: Informar los estadios evolutivos de los parsitos encontrados.

c) Mtodo de Ritchie o de sedimentacin por centrifugacin y flotacin (mixto, con fijador) Fundamento: Se basa en la concentracin de los quistes y huevos por sedimentacin mediante la centrifugacin, con la ayuda de formol y ter para separar y visualizar los elementos parasitarios. Materiales: Gradilla de tubos de ensayo. Tubos de ensayo 13 x 100.

Pipetas Pasteur. Lmina portaobjetos. Laminillas cubreobjetos. Hisopos. Solucin de Solucin fisiolgica .

Eter etlico. Lugol. Bajalengua o bagueta. Microscopio binocular. Procedimiento: Colocar en el tubo de ensayo 1 a 2 g de muestra de heces, agregar 8 mL de solucin fisiolgica, homogeneizar y centrifugar a 2 000 r.p.m. por 2 a 3 minutos. Descartar el sobrenadante y repetir varias veces el paso anterior hasta que se observe el sobrenadante limpio. Decantar el sobrenadante, agregar al sedimento 6 mL de solucin de formol al 10%, homogeneizar y dejar reposar 5 minutos, luego de los cuales se agrega 3 mL de ter. Taponar el tubo y agitar cuidadosamente para evitar la salida del material. Eliminar las capas formadas de sobrenadante, de ser necesario, con ayuda de un hisopo. Retirar la tapa, centrifugar el tubo de 2 000 a 3 000 r.p.m. por 3 minutos. Depositar una gota de lugol en la lmina portaobjeto, y con ayuda de una pipeta Pasteur, tomar una porcin del sedimento para mezclarlo con la solucin de lugol. Cubrir con una laminilla cubreobjeto y observar al microscopio.

Aplicacin del mtodo de Ritchie

Observacin: Se pueden observar quistes, ooquistes y huevos de los parsitos. Es poco til para observar trofozotos y larvas. Resultado: Informar el nombre, estadio evolutivo del parsito y la presencia de cristales de Charcot-Leyde. d) Mtodo de Baermann (Mtodo de concentracin por migracin) Fundamento: Se basa en los tropismos positivos: geotropismo, termotropismo e hidrotropismo de los trofozotos de protozoos y larvas de helmintos. Es til principalmente para Balantidium coli y larvas de Strongyloides stercoralis. Materiales: Copas cnicas de 200 a 300 mL. Coladera metlica o rejilla. Pipetas Pasteur. Gasa. Lminas cavadas. Suero fisiolgico. Materiales del mtodo de Baermann: Copa de vidrio, pipetas de transferencia, coladera, lminas y laminillas.

 Procedimiento Colocar la coladera o rejilla metlica con la gasa doblada (2 a 3 capas) dentro de la copa Colocar sobre la gasa, 4 a 6 g de la muestra de heces en fresco. Verter solucin salina a 37C en cantidad suficiente por el borde de la copa. Dejar a temperatura ambiente o en estufa a 28C - 37C de 30 a 50 minutos. Sacar la coladera o rejilla y con ayuda de una pipeta Pasteur obtener 1 mL de sedimento. Colocar el sedimento en una luna de reloj o lmina cavada y observar al microscopio o esteroscopio. Observacin: Observar trofozotos y larvas en movimiento. En algunas ocasiones se pueden observar formas adultas de E. vermicularis macho. Para una mejor diferenciacin de las larvas de los parsitos, realizar el mtodo de Harada-Mori.

Larvas de Ancylostoma/Necator (100x) en movimiento del mtodo de Baermann

Resultado: Informar los estadios evolutivos de los parsitos encontrados.

e) Mtodo cualitativo: Tcnica de Kato o mtodo de concentracin por tamizado: Fundamento: Mtodo que consiste en la diafanizacin o aclaracin de las heces con el uso de glicerina, que permite preparar una capa transparente y observar las formas parasitarias.

Materiales: Lminas portaobjeto. Aplicador. Papel celofn (humectante especial), cortado de 2 x 3 cm y sumergidos en una solucin de glicerina por un perodo no menor de 24 horas. Malla metlica, nylon u organza blanca. Solucin glicerinada con verde de malaquita.

Procedimiento: Tamizar 1 g de la muestra de heces a travs de organza, malla metlica o nylon fino. Extender el tamizado sobre la lmina portaobjeto y cubrir con una laminilla impregnada en glicerina. Comprimir la muestra con el tapn de jebe sobre la laminilla, secar el exceso de glicerina por 30 minutos y observar al microscopio. Observacin: Es una tcnica apropiada para la observacin de huevos de helmintos y algunos protozoarios como Isospora belli.

Isospora belli con colorante temporal eosina (400x)

D) MTODO CUANTITATIVO DE KATO KATZ (ANLISIS CUANTITATIVO = hpg) Fundamento: Se basa en la tcnica de Kato y que permite cuantificar la presencia de huevos de helmintos. Se expresa en nmero de huevos por gramo de heces (hpg). 5.4.2 Materiales: Lminas portaobjetos 2,5 x 7,5 cm. Papel absorbente (toalla o peridico). Aplicador. Papel de celofn impregnado con glicerina y verde de malaquita. Molde de plstico con perforacin central de 6 mm de dimetro. Malla metlica, nylon u organiza de color blanco de 0,09 mm.

Materiales del mtodo de Kato - Katz: lmina perforada, aplicador, nylon/organza o malla metlica.

Procedimiento: Con un aplicador (bajalengua) transferir la muestra fecal (0,5-1g) sobre el papel absorbente. Colocar una malla o nylon de 2 x 3 cm. sobre la muestra. Con el aplicador del kit comprimir la malla para tamizar la muestra. Colocar el molde de plstico sobre la lmina portaobjeto y rellenar la perforacin con la muestra tamizada. Levantar el molde dejando el cilindro de la muestra en la lmina portaobjeto.

Colocar la laminilla glicerinada con verde de malaquita sobre la muestra y con ayuda de un tapn de jebe presionar sobre la laminilla, buscando extender la muestra.

Dejar para la diafanizacin a temperatura ambiente de 30 a 45 minutos.

Observacin: Observar los huevos de helmintos, tal como se muestra. Resultado: El nmero de huevos encontrados en la lmina se multiplica por k (k= 24), el resultado es el nmero de huevos por gramo de heces (hpg). Huevos Ancylostoma /Necator y Trichuris trichiura por el mtodo de Kato Katz (400X)

E) MTODOS DE COLORACIN PARA PROTOZOARIOS E.1) Mtodo de Ziehl-Neelsen (modificado para observacin de coccidias: Cryptosporidium y otros) Fundamento: Se basa en el comportamiento cido-resistente de la cubierta de estos parsitos, los cuales se tien de rojo y destacan sobre un fondo verde o azul, dependiendo del colorante de contraste usado. Materiales: Lminas portaobjetos. Laminillas cubreobjetos. Soporte de varillas de vidrio para coloracin de lminas portaobjeto. Estiletes o pinzas punta curva. Fuscina fenicada. Verde de malaquita o azul de metileno acuoso. Metanol. Hidrxido de sodio al 4%.

Alcohol cido.

Procedimiento: Colocar las lminas portaobjetos sobre el soporte de las varillas de vidrio. Con el estilete o pinza curva hacer un frotis de heces en la lmina portaobjeto y dejar secar. Fijar la lmina con alcohol metlico de 2 a 5 minutos y dejar secar. Agregar hidrxido de sodio sobre el preparado por un minuto, eliminar el exceso y lavar con agua. Cubrir la lmina con la fucsina fenicada (previa agitacin del frasco) por 5 minutos, diluida previamente en agua al tercio (1 mL colorante y 2 mL de agua). Lavar suavemente la lmina portaobjeto con agua corriente. Decolorar con alcohol-cido, cubriendo el portaobjeto por unos segundos hasta quitar el colorante. Lavar suavemente el portaobjeto con agua. Colocar como colorante de contraste verde de malaquita 1% o azul de metileno 1-1,4% durante 5 minutos, diluidas previamente al tercio. Lavar la lmina suavemente con agua corriente y dejar secar a temperatura ambiente. Realizar el montaje con cytoseal, blsamo de Canad o Permount, usar una laminilla cubreobjeto y observar el microscopio. Observacin: Los ooquistes de Cryptosporidium, Isospora y Cyclospora aparecen de un color rojo fucsia sobre un fondo verdoso (con verde de malaquita) o azul (con azul de metileno). En algunos casos, no se colorean bien, pero la refringencia caracterstica permite diferenciarlos.

 Resultado: Informar los estadios evolutivos de los parsitos encontrados. E.2) Coloracin Gram y coloracin tricrmica (para microsporidios). Fundamento: Se basa en la identificacin de esporas de Enterocytozoon, Encephalitozoon, etc. por la combinacin de las coloraciones Gram y tricrmica.

Materiales: Lminas portaobjetos. Laminillas cubreobjetos. Colorante chromotrope. Coloracin Gram. Cristal violeta. Yodo de Gram. Pinza o estilete punta curva. Alcoholes 85% y 95% y xilol. Mechero de alcohol. Microscopio binocular. Placas Petri 10 x 150 mm.

Procedimiento: Preparar el set de placas Petri 10 x 150 mm. Realizar un frotis fino en una lmina o laminilla y dejar secar. Fijar el frotis pasndolo 3 veces por una llama, un segundo de tiempo por vez. Agregar el colorante cristal violeta y esperar 1 minuto. Enjuagar en agua corriente y eliminar totalmente el agua. Adicionar el yodo de Gram por 30 segundos, remover el exceso con el decolorante y enjuagar con agua. Agregar el colorante chromotrope por 5 minutos de 50C a 55C. Pasar por el decolorante (alcohol 90% y cido actico 1%) de 1 a 3 segundos. Pasar por alcohol 95% y por alcohol etlico absoluto por 1 minuto. Pasar un minuto por xilol buscando que la coloracin sea adecuada para visualizar el parsito. Realizar el montaje y observar al microscopio.

 Observacin: Observar al microscopio a 10X y 40X. Para observar al microscopio a 100X, cubrir con aceite de inmersin. Se observan las esporas de Enterocytozoon, Encephalitozoon, Nosema, etc., que aparecen de un color rosado o rojo tenue o fucsia sobre el fondo verde o azul.

Resultado: Informar los parsitos encontrados. E.3) Coloracin Trichrome (Gomori Wheatley). Fundamento: Permite colorear las estructuras internas de los protozoos para su caracterizacin. Esta tcnica utiliza muestras de heces frescas, preservadas con PVA o fijadas con Schaudinn. Es un mtodo rpido y de utilidad en el estudio de Entamoeba, Giardia, Balantidium, Cyclospora y otros protozoarios.

Materiales: Lminas portaobjetos. Laminillas cubreobjetos. Asa de platino. Estilete curvo o pinza curva. Agua destilada. Tintura de Yodo. Cytoseal o blsamo de Canad. Alcoholes 85%, 90% y 95% y absoluto. Xilol. Colorante chromotrope. cido actico. Solucin Schaudinn. Frascos coplin o placas Petri.

Materiales para la coloracin tricrmica: colorante, pinza, porta-laminillas (tapn de jebe), laminillas y placas Petri.

 Procedimiento: Preparar un set de placas Petri 15 x 150 mm con los reactivos correspondientes, sujetar la laminilla con el porta-laminillas y con el estilete o pinza curva hacer el frotis fino de la muestra sobre la laminilla. Fijar la muestra con solucin Schaudinn por 2 a 5 minutos. Pasar por alcohol 70% con 2 3 gotas de tintura de yodo. Pasar por un minuto por alcohol 70%. Pasar por el colorante chromotrope de 8 a 15 minutos. Pasar por alcohol 90% con cido actico al 1% de 10 a 15 segundos y ver tono de coloracin. Pasar por alcohol 95% y alcohol absoluto durante 3 minutos. Pasar por xilol de 1 a 5 minutos. No debe verse opaco. Realizar el montaje con cytoseal, blsamo de Canad o Permount.

Observacin: Observar con objetivo de inmersin 100X. El citoplasma de los parsitos se tien de color verde y el ncleo de color rosado. Trofozotos de Balantidium coli con macroncleo, con coloracin tricrmica (200X). Observar los macroncleos visibles.

 Resultado: Informar el nombre del parsito y su estadio evolutivo. E.4 .Coloracin de May Grnwald: Utilidad: Colorea protozoarios, principalmente flagelados. Materiales: Lminas portaobjetos. Laminillas cubreobjetos. Estilete o pinza curva. Colorante May Grnwald. Alcohol metlico. Blsamo de Canad.

Procedimiento: Con la ayuda de un estilete o una pinza curva, realizar el frotis de la muestra fresca en la lmina o laminilla y dejar secar. Fijar el frotis con unas gotas de alcohol metlico, cubriendo la muestra por 5 minutos. Cubrir el frotis con el colorante (diluido al 1/2 1/3 con agua destilada) durante 15 minutos. Lavar con agua corriente y dejar secar. Realizar el montaje con cytoseal o blsamo de Canad y observar al microscopio.

Observacin: Observar la lmina con objetivo de inmersin. Los protozoos se observan con su citoplasma de color azul claro y los ncleos de color prpura

Trofozoto de Giardia lamblia coloreado con May Grnwald (1000X)

Resultado: Informar el nombre del parsito y el estadio evolutivo. E.5) Coloracin de hematoxilina frrica de Heidenhain. Utilidad: Colorea protozoarios, principalmente amebas y flagelados. Materiales: Lminas portaobjetos. Laminillas cubreobjetos. Frasco coplin o placas Petri. Estilete o pinza curva. Colorante de hematoxilina. Cytoseal o blsamo de Canad. Alcoholes 50%, 70%, 85%, 95% y absoluto en placas petri. Solucin Schaudinn. Solucin mordiente de sulfato de fierro y amonio. Tintura de yodo. Solucin fisiolgica. Microscopio binocular.

Materiales para la realizacin de la coloracin hematoxilina frrica de Heidenhain: colorante, bicloruro de mercurio, porta-laminillas (tapn de jebe), pinza punta curva y placas Petri.

 Procedimiento:

Preparar un set de placas petri 100 x 150 mm o el frasco Coplin con los reactivos correspondientes, y con ayuda de un estilete o pinza curva hacer un frotis fino en la lmina o la laminilla, esta ltima sujeta al porta-laminilla. Si la muestra es dura, hacer una emulsin previa en solucin fisiolgica, realizar el frotis y pasar en solucin Schaudinn por 3 a 5 minutos. Pasar por alcohol 70% ms 1 a 2 gotas de tintura de yodo por 5 minutos. Pasar por alcohol 70% y 50% de 5 a 10 minutos cada vez.

Pasar por agua corriente por 5 a 10 minutos. Pasar por la solucin mordiente 2% de 5 a 10 minutos y enjuagar con agua corriente. Pasar por colorante por 5 a 10 minutos (1 mL de solucin colorante hematoxilina y 9 mL de agua). Lavar con agua y pasar por una segunda solucin de mordiente al 2% para decolorar, observando la intensidad de la coloracin. Lavar con agua corriente a chorro continuo de 10 a 15 minutos. Deshidratar pasando por alcohol 70%, 85%, 95% y absoluto, de 10 a 15 minutos cada uno. Aclarar con xilol agitando el frotis, montar con cytoseal o blsamo de Canad y observar al microscopio. Observacin: Observar con objetivo de inmersin 1000x. El citoplasma de los parsitos se observan de color azul oscuro y los ncleos de color morado intenso a negruzco.

Trofozotos de Giardia lamblia y Chilomastix mesnili, coloreados con hematoxilina frrica de Heidenhain (1000X)

Resultado: Informar el nombre del parsito y el estadio evolutivo. F) MTODOS DE COLORACIN PARA HELMINTOS F.1) Coloracin Carmn clorhdrico. Utilidad: Coloracin de estructuras internas de especmenes adultos o segmentos de ste. Se usa de preferencia para el estudio de cstodes y tremtodes, ya que los nemtodes suelen deformarse con el montaje. La muestra debe ser lo ms fresca posible. Materiales: Lminas portaobjetos. Laminillas cubreobjetos. Pinza de punta fina. Cytoseal o blsamo de Canad. Alcohol 70%, 85%, 95% y absoluto. Creosota de la Haya o xilol. Colorante Carmn. cido clorhdrico. Agua destilada. Pabilo. Placas petri conteniendo colorante, decolorante, alcoholes de 70%, 85%, 95% y absoluto.

Materiales para la coloracin Carmn clorhdrico: colorante, especmenes aplanados, placas petri y pinza.

Procedimiento: Los progltidos de cstodes y los adultos de tremtodes son lavados y aplanados, colocndolos entre dos lminas, sujetndolos con pabilo o usando pesas sumergindolos en formol al 10%. En caso de estar fijados en formol 10%, se lavan con agua corriente durante 10 a 30 minutos y luego se realiza el aplanamiento del vermex o gusano. Colocar el gusano en alcohol 70% durante 10 a 20 minutos. Pasar por el colorante Carmn durante 5 a 10 minutos. Pasar por alcohol cido controlando la coloracin al estereoscopio. Deshidratar el espcimen pasando por alcohol 85%, 95% y absoluto, durante 10 minutos en cada uno. Pasar por la creosota o xilol, controlando al estereoscopio o microscopio la coloracin apropiada. Secar el exceso de creosota con papel filtro y realizar el montaje con blsamo de Canad. Observacin: La observacin y estudio de la morfologa del ejemplar se realiza macroscpicamente e incluso slo usando el estereomicroscopio.

Huevos de Dipylidium caninum en cpsula ovgera paquetes coloreados con Carmn clorhdrico (40X)

 Resultados: Informar el nombre del parsito y su estadio evolutivo. F.2) Coloracin de Bonilla, Naar y Beloy. Utilidad: Las larvas de los nemtodes absorben el colorante, permitiendo diferenciar sus estructuras internas. Materiales: Lminas portaobjetos. Laminillas cubreobjetos. Alcohol 25%, 30%, 70%, 85% y 95%. Solucin rojo de Congo. Solucin de salicilato de metilo.Lminas excavadas. Blsamo de Canad o cytoseal. Pipeta Pasteur. Placas Petri 60 x 90 mm conteniendo los alcoholes.

Procedimiento: Preparar un set de placas Petri 60 x 90 mm conteniendo los reactivos correspondientes y colocar las larvas en alcohol 25% - 30% con unas gotas de solucin de rojo de Congo por 20 a 30 minutos. Controlar por la observacin microscpica el color de las larvas. Deshidratar la muestra, pasndola por alcohol 70%, 85%, 95% y absoluto, de 20 a 30 minutos en cada uno. Colocar en solucin de salicilato de metilo durante 3 minutos. Colocar los especmenes en cytoseal, blsamo de Canad o Permount y observar al microscopio. Lectura: Los especmenes y sus estructuras internas se tien de color rojo.

 Resultado: Informar el nombre del parsito y su estadio evolutivo. F.3) Coloracin hematoxilina frrica de Delafield. Utilidad: Se usa en casos de cstodes y tremtodes. Permiten colorear estructuras internas de especmenes adultas o fragmentadas del mismo. Materiales: Lminas portaobjetos. Laminillas cubreobjetos. Alcohol de 25%, 30%, 70%, 85% y 95%. Hematoxilina frrica. Blsamo de Canad o cytoseal. Pipeta Pasteur. Placas Petri 150 x 100 mm conteniendo los alcoholes.

Procedimiento: Preparar un set de placas Petri 60 x 90 mm o 100 x 150 mm conteniendo los reactivos correspondientes, dependiendo de los especmenes a colorear. Los tremtodes y cstodes fijados con formol 10% se lavan en agua corriente. Diluir el colorante stock de 8 a 10 gotas en agua destilada y colocar los especmenes (35 mL por placa) por 12 horas. Lavar con agua corriente y pasar por agua (segundos), dependiendo del espcimen. Pasar por alcohol 50%, 30% y 10% por 10 minutos en cada uno y pasar por agua corriente el tiempo necesario para sacar el exceso de colorante. Deshidratar en alcohol 10%, 30%, 50%, 70%, 85%, 95% y 100% cada uno, por 10 minutos. Pasar dos veces por xilol, montar con blsamo de Canad y observar al microscopio.

Lectura: La observacin de los especmenes se realiza en forma microscpica o con el uso del microscopio estereoscopio. Resultado: Informar el nombre del parsito y su estadio evolutivo. G) FIJADORES Y/O CONSERVADORES: Los fijadores sirven para preservar protozoarios, sin que se modifiquen las estructuras internas, sobre todo cuando las muestras no pueden ser procesadas inmediatamente.

G.1) PAF (phenol-alcohol-formol). Utilidad: Conserva las estructuras de los parsitos (trofozotos, quistes, huevos y larvas), pudindose incluso observarse en semanas o meses (6) sin que haya ocurrido deterioro alguno. Es recomendable mantener el fijador preparado en frascos color caramelo. Adems, permite observar el material al microscopio. Materiales: Fijador PAF. Tionina o azure A (Omethilene azure A). Agua destilada. Hisopo. Tubos de centrfuga de 15 mL. Aplicadores. Tritn NE. ter. Embudo de vidrio. Solucin fisiolgica (Anexo C).

Procedimiento: La muestra de heces se mezcla con el fijador en un recipiente en la proporcin 1:1. Para la observacin microscpica: Mezclar bien la muestra fijada en PAF y con ayuda de un embudo y una gasa doblada en un tubo de 15 mL, colar de 3 a 4 mL del material fijado. Agregar solucin salina hasta un volumen de 12 mL y centrifugar a 1800 r.p.m. por 3 minutos. Decantar el sobrenadante y obtener un sedimento de 0,5 mL; si es menor, agregar de la muestra filtrada una cantidad suficiente y volver a centrifugar para obtener el volumen del sedimento deseado. Decantar el sobrenadante y completar 12 mL con solucin fisiolgica, emulsionar con el aplicador y centrifugar a 1800 r.p.m. por 3 minutos. Repetir el centrifugado y lavar de 2 a 3 veces ms. Agregar 2 mL de solucin fisiolgica al sedimento final, emulsionar y obtener una gota del sedimento con una pipeta Pasteur y colocarla en una lmina portaobjetos. Agregar una gota del colorante tionina o azure A, cubrir con una laminilla cubreobjetos y examinar al microscopio.

Tambin puede obtenerse una muestra para la observacin microscpica, mediante el siguiente procedimiento: Al sedimento emulsionado y sobrante del procedimiento anterior, agregar 10 mL de solucin fisiolgica y una gota de Triton NE. Mezclar, agregar 2 mL de ter, tapar con un tapn de jebe o de corcho, agitar suavemente y destapar. Centrifugar a 2 000 r.p.m. por 3 minutos, decantar y eliminar los detritus de las paredes del tubo mediante un aplicador cubierto de algodn. Agregar al sedimento 1 2 gotas de solucin fisiolgica, mezclar y obtener del fondo del tubo con una pipeta Pasteur una gota que se colocar en una lmina portaobjeto. Agregar una gota de colorante tionina o azure A, cubrir con una laminilla y observar al microscopio. Observacin: Observar los elementos parasitarios: el citoplasma se ve de color azul y el ncleo azul oscuro. Resultado: Informar el nombre del parsito y su estadio evolutivo (Seccin 10). G.2) PVA (Polivinil alcohol = alcohol polivinlico). Utilidad: Fija y preserva, principalmente los trofozotos y quistes de protozoarios, por tiempo muy prolongado sin modificacin importante de su morfologa. Materiales: Solucin fijadora - conservadora de PVA. Aplicador. Viales de vidrio de 3 a 4 mL. Lminas portaobjetos. Procedimiento: Colocar en una lmina portaobjetos 1 2 mg de muestra, secar el frotis, agregar 2 3 gotas de PVA y secar o guardar hasta por 3 meses para colorearlos, o agregar al frasco que contiene la muestra v/v 1 a 4 mL. Generalmente se puede preservar pormeses y cuando se considere conveniente se realizar la coloracin con Trichrome Gomor Wheatley. G.3)MIF (merthiolate - yodo - formol). Utilidad: Fija y colorea simultneamente los quistes y huevos de parsitos, permitiendo la observacin inmediata de la muestra.

. Materiales: Solucin MIF. Viales de vidrio de 3 a 4 mL. Aplicador.

Procedimiento: Colocar 1 2 mL de la solucin MIF en el vial con ayuda del una pipeta. Para la observacin microscpica, colocar 1 2 mL o su equivalente de la muestra fresca de heces, mezclar y observar al microscopio. Observacin: Observar los parsitos teidos de color amarillo oro. Resultado: Informar el nombre del parsito y su estadio evolutivo (Seccin 10). G.4 )Fijadores para preservar y enviar helmintos adultos. Utilidad: Conserva ejemplares adultos para su estudio morfolgico, su preservacin en museos o para contar con muestras de referencia. Los ms usados suelen ser formol al 10%, AFA (cido actico Formol- Alcohol) o SAF (Acetato sodio - cido actico - formol). Materiales necesarios: Formol 10%. Solucin AFA .

Alcohol 70%. Glicerina 5%. Lminas portaobjetos. Pabilo o pesas de metal segn modelo. Frascos boca ancha 150 200 mL. Placas petri 150 x 100 mm y 240 x 200 mm. Procedimiento: a. Coleccin y lavado de los helmintos: Todo espcimen aislado del hospedero debe mantenerse fresco (agua o suero fisiolgico) en un frasco con tapa. Los adultos colectados son lavados varias veces con solucin fisiolgica, para eliminar la mucosidad y otras sustancias adheridas al cuerpo del helminto. Finalmente, se lava con agua para permitir el relajamiento del parsito

 Calentar a 55C de temperatura, alcohol de 70%, formol 10% AFA, para que con la fijacin los ejemplares queden estirados y pueda observarse sus estructuras internas. b. Fijacin: Para una conservacin apropiada usar formol 10% (para cstodes y tremtodes) o una mezcla de alcohol 70% (para nemtodes), ambos con glicerina 5%. Todos los frascos deben ser rotulados, indicando el nombre del parsito, procedencia, localizacin y fecha de coleccin. Para la identificacin, en ocasiones se requiere hacer el aclaramiento con lactofenol. c. Aplanamiento: til para cstodes y tremtodes. Se les coloca entre lminas y se las ajusta con el pabilo para favorecer su aplanamiento Se sumerge en formol 10% o AFA de 1 a 3 das, luego del cual se puede colorear o conservar como pieza de museo en formol 10% y glicerina 5%. Los tremtodes como Fasciola y/o Paragonimus pueden prepararse y conservarse siguiendo los pasos dados para los cstodes. Fasciola heptica adulto despus del aplanamiento

IV.-IDENTIFICACION DE PAARSITOS E INTERPRETACION CLINICA. PARASITOS: Tenemos: 1) NEMATODOS: Gusanos redondos, tenemos:

 Ascaris lumbricoides: Se observan huevos miden aprox. 45-75 x 30-50 mm, presenta una clula rodeada por tres capas, tambin se presentan larvas. Producen una patologa de dolor de estmago y desnutricin. Forma de transmisin Las personas infectadas con lombrices intestinales, al realizar sus necesidades en el suelo, depositan los huevecillos del parsito por medio de la materia fecal. Las personas ingieren los huevos por las manos sucias, el polvo, el agua, los alimentos contaminados y se termina de desarrollar en el intestino delgado. Las complicaciones de la ascariasis se dan cuando las lombrices se renen en un lugar fijo del intestino, ocasionando una obstruccin intestinal. En los nios las lombrices pueden invadir el hgado, la cavidad peritoneal y el apndice produciendo su muerte. Las lombrices pueden llegar a la glotis (abertura triangular entre las cuerdas bucales) Y producir sofocacin o asfixia en los nios. Las larvas de ascaris tambin invadir las vas respiratorias y provocar hemorragias o inflamacin en los pulmones. Las personas con ascariasis pueden tener sntomas variables, algunas veces son leves o pueden estar ausentes; el primer signo es la salida de lombrices en las heces o vomitadas, una infeccin grave puede producir trastornos digestivos, dolores abdominales, vomito, intranquilidad y alteracin del sueo

Trichuris trichura: El huevo mide de 50-55 x 22-25 mm Tiene la forma de baln de ftbol americano, produce anemia intensa, dolores abdominales, prolapso rectal

ocasional. Es el parsito conocido como tricocfalos, que produce la enfermedad conocida tricuriasis. Forma de transmisin Las personas infectadas que no usan la letrina sanitaria, contaminan el suelo con materia fecal, que contiene los huevecillos del parsito. Con el calor, la humedad del suelo y la sombra, los huevos maduran y se convierten en embriones del parsito. Este proceso lleva tres semanas. Las personas, principalmente los nios, pueden ingerir los embriones del parsito, por medio de las manos sucias, el polvo, el agua, los alimentos, las frutas, y los objetos contaminados. Los embriones del tricocefalos ingeridos bajan al estmago y llegan al intestino grueso, donde se concierten en gusanos adultos. En el intestino grueso los gusanos se pegan a las paredes, se alimentan y se multiplican, produciendo malestar estomacal intermitente, diarrea, prdida de peso y anemia. La tricuriasis afecta principalmente a nios y adultos.

Uncinarias: Tienen una forma elptica, estn cubiertas de una membrana lisa, transparente y fina, mide de 60 - 40 x mm producen anemia. Parasitosis intestinal producida por nematodos: Ancylostoma duodenale,A. ceylanicum, A. braziliense,A. caninum y Necator americanus. La vida media de estos gusanos adultos, que miden un centmetro de longitud, es de unos seis aos. Las primeras manifestaciones clnicas en aparecer se observan a nivel de la piel por donde penetr el parsito, produciendo una erupcin en la zona, con hinchazn, enrojecimiento y una intensa picazn. Como

consecuencia del rascado, puede infectarse con otros microorganismos. Cuando los parsitos alcanzan los pulmones pueden desencadenar fiebre, disnea y tos. Posteriormente, presentan dolor abdominal, nuseas, diarrea y pirosis, como consecuencia de la llegada del parsito al intestino. El signo fundamental que caracteriza a esta enfermedad, es la anemia que produce por las persistentes prdidas sanguneas a nivel intestinal (palidez y fatiga). En los casos ms graves, la piel puede adoptar una coloracin amarillo terroso, acompandose de astenia, edema en los prpados y en los pies, diarreas, distensin del abdomen y retraso en el crecimiento en los nios. Ancylostoma duodenale Huevo de Necator americanus

Strongyloides stercolaris: Se observan larvas. Este parsito facultativo tiene cuerpo filiforme, esfago recto y extremo posterior aguzado. La hembra parsita mide 2 mm de longitud. Los huevos inmersos en la submucosa del intestino delgado son ovalados y miden alrededor de 50 m de longitud. Las hembras y machos de vida libre presentan bulbo esofgico evidente; la primera mide 1 mm de longitud. Las larvas filariformes, formas infectantes, miden alrededor de 600 m de longitud, tienen esfago recto y extremo posterior ligeramente bifurcado, en tanto que las larvas rabditoides, formas diagnsticas, tienen menor tamao y bulbo esofgico prominente. En intestino delgado (duodeno y yeyuno), los parsitos adultos femeninos, larvas y huevos se encuentran en submucosa superficial y criptas; estas formas son causa de trauma, descarga mucosa y ulceraciones. Los trastornos fisiolgicos incluyen esteatorrea, sndrome de malabsorcin, enteropata con prdida proteica, de lpidos y vitaminas liposolubles,

desequilibrio hidroelectroltico e leo paraltico. La eosinofilia es un hallazgo frecuente en sujetos inmunocompetentes, as como elevaciones de IgE especfica y no especfica. La severidad de la infeccin intestinal en sujetos inmunocompetentes, aguda o crnica, depende de la carga parasitaria y la respuesta celular. Debe tenerse en cuenta la posibilidad de coinfeccin (geohelmintos, protozoos, otros). En casos leves, puede ser subclnica. Es caracterstico el grado de "armona" entre Strongyloides stercoralis y el hospedero inmunocompetente y bien nutrido; en estos sujetos (poco frecuentes) la infeccin puede persistir durante aos, en gran parte debido a la autoinfeccin, sin producir signos/sntomas. Las manifestaciones clnicas pueden ser las de una lcera pptica. Otros signos y sntomas prevalentes son: nusea y vmito, malestar abdominal, episodios de diarrea y constipacin. Es importante considerar la carga parasitaria. En casos severos (asociados con frecuencia a hiperinfeccin) se presenta aumento de las manifestaciones clnicas pulmonares y digestivas. La migracin larvaria por el sistema respiratorio con la consiguiente ruptura de capilares y microhemorragias intraalveolares y la reaccin de hipersensibilidad ante las larvas puede dan lugar a neumonitis eosinoflica, bronconeumona, abscesos, y patologa obstructiva asociada a strongyloidiasis pulmonar en individuos con alto riesgo.

 Enterobius vermiculares (Oxyurus): Los huevos son ovoides con una cara convexa y una plana, presenta una membrana interna y delicada y otra gruesa hialina y mamelonada, mide de 50-60 x 20-30 mm. Produce prurito en la regin perianal, insomnio, cambios de conducta.

2) CESTODOS: Gusanos planos, tenemos: Taenia: Los huevos miden 20-30 x 30-40 mm, son ovoides con membrana gruesa, amarillenta que se encuentra estriada en forma de empalizada y encierra un embrin de seis ganchos poco visibles. Produce trastornos nerviosos. T. solium

Hymenolepis nana: Huevos ovoides, mide aprox. 50 mm tiene una membrana interna y una externa, tambin puede causar trastornos nerviosos. 3) PROTOZOARIOS: Amebas, tenemos:

 Entamoeba histoltica: Se observan quistes miden aprox. 20 mm se observa con cuatro ncleos. Pueden causar lesin de la mucosa intestinal.

Entamoeba coli: Son quistes ms grandes que los de histoltica, tiene ms de cuatro ncleos. Es considerada como no patgena.

Endolimax nana: Los quistes son ovalados miden de 6 - 10 mm presentan de uno a cuatro ncleos. Es un parsito comensal exclusivo del intestino humano, es decir, vive a expensas del hombre, mas no le ocasiona dao. Aunque no causa enfermedades en el hombre .Su presencia es un buen marcador de contaminacin oral-fecal por los alimentos o agua.

 Gardia lamblia: Es una ameba en forma de pera simtricamente lateral, con un extremo ancho y redondeado, el quiste presenta cuatro ncleos y dos cuerpos parabasales, produce una diarrea amarillenta y vmito.

4.-TREMATODOS: Forma de hoja plana

Fasciola heptica: Dao en hgado. Quistes.

LINKOGRAFIA: www.gefor.4t.com/parasitologa endolima nana.html . e or. t.com parasitolo ia endolima nana.html . e or. t.com parasitolo ia endolima nana.html . e or. t.com parasitolo ia endolima nana.html . e or. t.com parasitolo ia endolima nana.html .msaludjuju . ov.ar n ectolo ia docs ... O LO .p...

BIBLIOGRAFIA:
Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnstico de los parsitos intestinales del hombre. Parasitosi Humanas.David Botero Marcos Restrepo.