Neumocistosis: Pneumocystis jirovecii

INTRODUCCIN
Desde su descubrimiento, y durante muchos aos, Pneumocystis fue considerado un protozoo, aunque pero hoy se reconoce como un hongo atpico. Pneumocystis jirovecii, anteriormente conocido como Pneumocystis carinii f. sp. hominis, contina siendo uno de los patgenos oportunistas ms importantes que afectan a individuos con sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y pacientes con inmunodepresin debida a otras causas, en los que produce una neumona (Pneumocystis pneumonia (PcP), siglas en ingls) grave con una alta tasa de morbilidad y mortalidad. Hace ms de 100 aos de la primera evidencia aportada por Carlos Chagas de la existencia de este microorganismo. A lo largo de este tiempo se han producido importantes avances en el conocimiento sobre la epidemiologa, biologa y gentica de este patgeno; lo cual ha condicionado cambios en su clasificacin taxonmica y en la comprensin de la historia natural de la PcP.

TAXONOMA

La clasificacin taxonmica de Pneumocystis ha sido problemtica desde su descubrimiento y ha cambiado a largo de los aos. Como se ha comentado, tras su identificacin y durante muchos aos Pneumocystis fue considerado un protozoo, debido a sus caractersticas morfolgicas, su resistencia a los antifngicos clsicos y su respuesta al tratamiento con pentamidina La primera evidencia molecular de que este microorganismo es un hongo fue aportada por Edman y otros en 1988. Estos investigadores encontraron que la secuencia nucleotdica del gen 16S del ARN ribosmico de Pneumocystis presentaba mayor similitud a la de los hongos que a la de los protozoos. Otras evidencias importantes se identificaron; entre otras, se destaca la presencia en Pneumocystis de un tercer factor de elongacin en la sntesis proteica, elemento necesario para realizar este proceso en los hongos, que se encuentra ausente en el resto de los organismos eucariotas. Finalmente, la timidilato sintasa (TS) y la dihidrofolato reductasa (DHFR) en Pneumocystis son dos enzimas diferentes, mientras que en los protozoos es una protena con doble funcin. Las tcnicas moleculares tambin evidenciaron que exista una gran heterogeneidad gentica en Pneumocystis, heterogeneidad que est clara y estrictamente correlacionada con la especie del hospedero Para reflejar estas diferencias se propuso en 1994 de forma provisional, mientras se describan o reescriban cada una de las especies del gnero Pneumocystis, un sistema de denominacin trinomial que utilizaba la denominacin Pneumocystis carinii en todos los casos seguida de "forma specialis" (f. sp.). En este sistema, el microorganismo que infecta a los humanos corresponda a Pneumocystis carinii f. sp. hominis, mientras que Pneumocystis carinii f. sp. carinii es una de las especies que infecta a las ratas y Pneumocystis carinii f. sp. murine el que infecta al ratn. Sin embargo, Frenkel en 1976 ya haba propuesto el nombre de Pneumocystis jiroveci para el patgeno que afecta al hombre, en aquel momento el organismo fue clasificado como protozoo y el nombre se encontraba en concordancia con la Nomenclatura Internacional de Cdigos Zoolgicos. Sin embargo, al demostrarse que Pneumocystis perteneca al reino de los hongos, su nombre deba corresponder con la Nomenclatura Internacional de Cdigos Botnicos (ICBN, siglas en ingls). Eso conllev a que cambiara el nombre anterior por el de Pneumocystis jirovecii.

pg. 1

Neumocistosis: Pneumocystis jirovecii

Su ubicacin taxonmica actual es en el Reino: Fungi Phylum: Ascomycota Clase: Pneumocystidomycetes Orden: Pneumocystidales Familia: Pneumocystidacae Gnero:

Pneumocystis jirovecii

Especie:

Por otra parte, se pensaba que exista una sola especie del microorganismo que infectaba a todos los mamferos y, por tanto, se crea que la PcP en la especie humana podra ser una zoonosis y el reservorio cualquiera de los mamferos con los que puede cohabitar el hombre de forma habitual. Sin embargo, estudios genticos con tcnicas de biologa molecular pusieron de manifiesto que existan diversas especies de Pneumocystis con una estrecha afinidad por su hospedero (estenoxenismo). Por otra parte, el desarrollo de tcnicas moleculares para la identificacin de este patgeno ha permitido estudiar mejor su epidemiologa y poner en evidencia que la PcP constituye solo la punta del iceberg de la infeccin por P. jirovecii en la especie humana.

ETIOLOGA

Organismo: Pneumocystis jirovecii es un hongo atpico, extracelular, ubicuo, unicelular, no cultivable y con marcado estenoxenismo. Usualmente se encuentra restringido a los pulmones, aunque se ha demostrado su presencia en otras regiones del cuerpo. En la actualidad se han registrado casos de PcP en todos los continentes del mundo, excepto en la Antrtica. Ciclo de vida: El ciclo de vida de Pneumocystis ha sido revisado recientemente, pero la ausencia de proliferacin de este hongo atpico en medios de cultivos tradicionales ha impedido esclarecer detalles importantes. Estn interrelacionadas en el ciclo de vida 3 principales formas morfolgicas: las trficas, las esporocticas y los quistes maduros. Cada una de ellas difiere en cuanto a tamao, dimetro de la pared celular, as como con filopodio (proyecciones citoplasmtica). Tambin otras diferencias como la forma del estadio, presentes en el ciclo de vida, varan desde irregular en la forma trfica, hasta ovoide en el resto de las formas morfolgicas. Se considera que las formas trficas son el estadio ms abundante en el ciclo de vida del organismo, que representa de 90 a 95 % de la poblacin de Pneumocystis en el pulmn del paciente infectado. En 1984, se observ la formacin del complejo sinaptonmico en el ncleo de esporocitos tempranos, lo que sugiere la divisin mittica del ciclo sexual. Con estas y otras evidencias importantes, se sugiere un ciclo de vida peculiar, donde tanto la forma asexual como sexual se plantean como modo de multiplicacin del patgeno.

pg. 2

Neumocistosis: Pneumocystis jirovecii

Microbiologa: El principal obstculo en el conocimiento de la biologa y para el estudio gentico de Pneumocystis radica en su carencia de crecimiento continuo en medios de cultivo in vitro. Lo esencial que ha ayudado a esclarecer algunas cuestiones sobre la biologa de Pneumocystis ha sido el desarrollo de modelos animales de neumocistosis. Varios mamferos han servido como ejemplo, donde se ha logrado desarrollar la PcP. Estos experimentos son de suma importancia para estudios bioqumicos, evaluaciones de frmacos y para la visualizacin microscpica del ciclo de vida del patgeno. La carencia de ergosterol en la membrana es otra caracterstica fenotpica de inters en Pneumocystis, que lo diferencia del resto de los hongos. Este lpido es el principal esterol en la membrana de los hongos, en cambio Pneumocystis presenta colesterol, encontrado fundamentalmente en las membranas de los mamferos. La ausencia de ergosterol en su membrana explica su resistencia natural a anfotericina B.

pg. 3

Neumocistosis: Pneumocystis jirovecii

Prevalencia e incidencia: Hasta 1980 la PcP no era frecuente y se asociaba con sndromes de inmunodeficiencias o situaciones de intensa inmunosupresin, particularmente con la quimioterapia del cncer. En la pandemia del VIH, la neumocistosis emergi como la enfermedad ms comn definitoria de sida en los pases industrializados. Antes de la introduccin de la profilaxis, 60 % de los pacientes con sida eran identificados por presentarla. Adems, se estim que hasta 80 % de los pacientes con recuentos de linfocitos CD4+ menores que 200 clulas/mm3 podan desarrollar esta enfermedad. En la era de la terapia antirretroviral de gran actividad (TARGA) ha existido una franca disminucin de muchas infecciones oportunistas y la PcP no es una excepcin. Actualmente la neumocistosis ha adquirido una importancia creciente, sobre todo, en sujetos inmunodeprimidos no infectados con el VIH, como pacientes con cncer, hemopatas malignas, afecciones inflamatorias crnicas donde se utiliza tratamiento con frmacos inmunodepresores y receptores de transplante de cualquier tipo, en especial de rganos slidos. La incidencia de la enfermedad entre estos grupos de pacientes puede alcanzar hasta 40 %, con 50 % de mortalidad. En dos investigaciones seroepidemiolgicas se ha puesto de manifiesto que la primoinfeccin por Pneumocystis se produce en los primeros aos de la vida y constituye una circunstancia muy frecuente. La identificacin del microorganismo por mtodos moleculares como la PCR ha permitido demostrar la presencia del patgeno en diferentes muestras biolgicas sin manifestaciones clnicas ni radiolgicas de neumona; ese fenmeno se conoce como colonizacin. Este hecho ha revolucionado la epidemiologa de la PcP porque estas personas pueden actuar como reservorio del microorganismo y transmitirlo a otros

EPIDEMIOLOGA

pg. 4

Neumocistosis: Pneumocystis jirovecii

individuos susceptibles. La colonizacin por P. jirovecii es frecuente en pacientes con infeccin por el VIH. Se ha descrito prevalencia desde 46 hasta 68 %, destacndose como factores de riesgos los niveles de CD4+ < 50 clulas/mm3, la ausencia de quimioprofilaxis con cotrimoxazol, el tabaquismo y la ciudad de residencia. Otro grupo importante de pacientes colonizados son aquellos con enfermedad pulmonar crnica, donde la prevalencia de colonizacin oscila desde 21,5 % en los pacientes con como lo son: fibrosis qustica (FQ) enfermedad pulmonar obstructiva crnica (EPOC) enfermedades pulmonares intersticiales Un mejor conocimiento de la epidemiologa de la PcP resulta esencial para poder trazar estrategias correctas, para la prevencin de la neumona por Pneumocystis en las poblaciones de riesgo donde este patgeno acta. Reservorio: El ADN de Pneumocystis ha sido detectado en muestras ambientales pero nunca se ha podido visualizar la presencia de organismos completos con tcnicas microscpicas. Se ha comunicado la existencia de material gentico de Pneumocystis en aguas de charcas y en el aire circundante en huertos; incluso en muestras obtenidas en habitaciones de pacientes con PcP, suponindose su capacidad infectiva. Sin embargo, ningn reservorio ambiental ha sido encontrado hasta ahora, aunque no puede excluirse esta posibilidad. Se pudo demostrar que la PcP en el hombre es una antroponosis, donde el nico reservorio es el ser humano. En primera instancia, los individuos que estn colonizados pueden estar en riesgo de desarrollar la enfermedad. Por otra parte, estos individuos pueden actuar como reservorio del microorganismo y ser potencialmente transmisores del patgeno a sujetos susceptibles. Adems, en pacientes colonizados por P. jirovecii la utilizacin prolongada de quimioprofilaxis puede seleccionar cepas de este patgeno con mutaciones que han sido asociadas con la resistencia a los frmacos de eleccin para su tratamiento. Por ltimo, la simple presencia de este hongo atpico en el pulmn puede estimular una respuesta inflamatoria por el husped y de esa manera ocasionar daos pulmonares. Transmisin: El modo de transmisin de P. jirovecii ha sido un aspecto interesante y no menos debatido en la epidemiologa de este microorganismo a lo largo de varias dcadas. Dos hiptesis fundamentales se han planteado: la reactivacin de un foco latente del microorganismo en el cuerpo humano la adquisicin reciente de la infeccin. En la actualidad, gracias a evidencias moleculares, los estudios abogan por la adquisicin reciente ms que por la reactivacin de una infeccin latente Se ha demostrado que el genotipo presente en el momento del diagnstico del paciente corresponda al lugar de residencia actual y no a su lugar de nacimiento. Si hubiese sido una reactivacin de una infeccin latente, el genotipo resultante del individuo coincidira con el existente en su lugar de nacimiento. Adems, se han encontrado cepas mutantes en el gen que codifica la DHPS, enzima diana de las sulfonamidas utilizadas para la profilaxis y el tratamiento de la PcP, en pacientes que nunca haban sido expuestos a estos frmacos; lo que sugiere una adquisicin reciente de la infeccin desde otros individuos que haban sido sometidos a una presin selectiva por el frmaco en cuestin. El modo exacto de transmisin de un individuo a otro no ha sido del todo esclarecido y la forma infectiva del parsito an no se identifica; en el caso de

pg. 5

Neumocistosis: Pneumocystis jirovecii

Pneumocystis se propone un modelo de transmisin similar al de Mycobacterium tuberculosis. Se plantea la va area como vehculo, considerando que las formas trficas del parsito, con un tamao de 2 a 4 m, similar al bacilo tuberculoso (1-3 m), pueden ser expectoradas por el paciente infectado y mediante gotitas de Pflugge adquiridas por los sujetos susceptibles. Se ha debatido mucho sobre la cuestin del perodo de incubacin de la infeccin por Pneumocystis, el mismo puede estar comprendido entre las 3 y 12 semanas.

CLNICA
Formas de presentacin: se reconocen las siguientes formas clnicas de neumocistosis: 1) Asintomtica, puede ser tanto infantil como del adulto inmunocompetente y representa la mayor parte de las infecciones 2) Neumocistosis infantil y al finalizar este conflicto, afect a nios desnutridos y hacinados 3) Formas respiratorias espordicas en inmunodeficientes, sera la forma ms comn en la cnica y la observada en los pacientes VIH positivos 4) Neumocistosis extrapulmonar, es poco frecuente y se caracteriza por fiebre, astenia, anorexia, prdida de peso, hepatoesplenomegalia, intesticiopata pulmonar y lesiones papulosas o nodulares en la piel Sntomas y signos: La PcP se presenta casi siempre con fiebre, tos y disnea de esfuerzo. La tos normalmente es seca y no productiva. La disnea al inicio es a esfuerzo moderado, por lo que puede pasar inadvertida y progresar de modo gradual. La fatiga es una de las principales quejas en los pacientes con infeccin, mientas que el dolor torcico, los escalofros y la sudoracin nocturna son menos frecuentes. La hemoptisis tambin se ha registrado en los pacientes aquejados por esta infeccin. Por otra parte, la exploracin clnica puede mostrar taquicardia, cianosis, y crepitantes finos en la auscultacin de los afectados. La presentacin clnica de la PcP difiere en sus caractersticas entre individuos con infeccin VIH de aquellos inmucomprometidos por otras razones. De manera general los pacientes con infeccin por VIH presentan un desarrollo subagudo con sntomas ms prolongados de la infeccin; tpicamente incluyen el establecimiento de tos seca y disnea con fiebre o sin esta de 1 a 2 semanas de evolucin. En el examen fsico puede apreciarse taquipnea, taquicardia y, en ocasiones cianosis; pero la auscultacin torcica en general es normal, presentndose a veces algunos sibilantes. La presencia de hipoxemia desencadenada con el ejercicio es otro elemento presente en este tipo de sujetos. Hasta 27 % de los individuos con infeccin por VIH que desarrollan PcP pueden presentar una insuficiencia respiratoria que requiera ventilacin mecnica. En cambio, en pacientes sin infeccin por VIH, la enfermedad tiene un comienzo ms rpido con pocos das de desarrollo clnico y mayor gravedad, caracterizada frecuentemente con una marcada hipoxemia. Un ejemplo interesante lo constituyen los individuos con trasplantes, en los cuales la infeccin se presenta a menudo con un cuadro clnico fulminante consistente en fiebre, tos, disnea e insuficiencia respiratoria. En la poblacin de individuos con trasplantes cardaco-pulmonares los sntomas pueden estar ausentes debido a la denervacin del pulmn trasplantado. Se realizaron comparaciones de dos grupos de pacientes con infeccin por VIH y sin esta, encontraron que:

pg. 6

Neumocistosis: Pneumocystis jirovecii

Los pacientes seropositivos presentaban una mayor tensin arterial de oxgeno y un menor gradiente alvolo-arterial. estos individuos los lavados broncoalveolares contenan una significativa menor cantidad de neutrfilos en comparacin con los sujetos seronegativos al VIH. Manifestaciones extrapulmonares: P. jirovecii puede diseminarse desde el pulmn a otros rganos e inducir lesiones secundarias viscerales. Las lesiones pulmonares pueden ser indetectables cuando las localizaciones extrapulmonares son diagnosticadas, como ocurre en la histoplasmosis diseminada y en otras micosis respiratorias causadas por hongos dimorfos. Ganglios linfticos, bazo, hgado, corazn y mdula sea son los rganos afectados con ms frecuencia; aunque este patgeno se ha encontrado tambin en cerebro, pncreas, timo, tiroides, retina, coroides, odo externo y medio, apndice, piel y otros rganos. Las lesiones extrapulmonares son en general nodulares, que evolucionan hacia la necrosis y la calcificacin; pueden evidenciarse en algunos casos mediante TAC. Entre 2 y 3 % de los pacientes con infeccin por VIH y PcP podran desarrollar esta forma clnica que, por otra parte, resulta excepcional en individuos seronegativos al VIH, donde solo se ha encontrado en estudios post mortem.

MTODOS DE DIAGNSTICO
Exmenes de laboratorio: Los exmenes de laboratorio de rutina no son tiles para el diagnstico de la PcP y frecuentemente reflejan las alteraciones producidas por la enfermedad subyacente del paciente. Diferentes estudios han mostrado valores elevados de lactato deshidrogenada (LDH) en sueros de pacientes con esta enfermedad (sensibilidad 82-100 %). No obstante, su interpretacin debe ser muy prudente y cautelosa, porque tambin existen casos confirmados con valores normales. Por otra parte, la determinacin srica de 1-3 -D-glucano, el principal componente de la pared celular de muchos hongos, es una prueba til para el diagnstico de la candidiasis y la aspergilosis invasiva, pero tambin puede emplearse para la PcP. En este sentido. Por otra parte, existe una posible asociacin entre el aumento de los niveles de la protena C reactiva y la gravedad de la infeccin, con un peor pronstico para los paciente con infeccin VIH y PcP que tienen niveles ms elevados de esta protena en sangre. Para el diagnstico microscpico de P. jirovecii las muestras clnicas ms empleadas son: Lavados broncoalveolares (LBA) Esputo inducido Biopsia pulmonar y transbronquial Examen directo al fresco sin tincin La observacin de los exudados espumosos provenientes del alvolo pulmonar de pacientes con PcP, que muestran una morfologa microscpica de "panal de abejas", esto ltimo se produce por la ocupacin de la luz alveolar por un exudado proeinceo, con aspecto de panal de abejas, lo que lleva histolgicamente a un aumento de espesor de los tabiques interalveolares ocasionado pr edema, proliferacin de los nemonocitos de tipo II y presencia de mononucleares.

pg. 7

Neumocistosis: Pneumocystis jirovecii

Mtodos de tincin Varios mtodos de visualizacin microscpica para identificar Pneumocystis han sido descritos en la literatura. Para biopsias y autopsias resultan de mucha utilidad las tcnicas de tincin convencionales (hematoxilina y eosina), as como las especiales (metenanima de plata de Grocott-Gomori, giemsa, azul de toluidina O, Papanicolaou, Gram Weigert y blanco de calcoflor) para todo tipo de muestra clnica. La metanamina de plata de Gomori-Grocott tie de color oscuro la pared de los quistes de Pneumocystis y permite la cuantificacin del patgeno en la muestra. Esta tcnica fue considerada de referencia para la identificacin de P. jirovecii en los B.A.L., pero actualmente ya no se la sigue tomando como tal. Tambin, el Azul de toluidina muestra afinidad por los componentes de la pared del quiste. El azul de toluidina por su parte, colorea de violeta rojizo los componentes de la pared y los investigadores lo han empleado como tcnica de cribado en los laboratorios al resultar ms rpida que la plata metenamina. La Giemsa permite identificar tanto los quistes como los trofozoitos, colorea los ncleos de ambas formas de color rosado y contrasta con el azul que adquiere el citoplasma. La prueba de Papanicolaou es una tcnica muy empleada por los citohistopatlogos, que puede generar informacin importante para detectar Pneumocystis. Por otra parte, el blanco de calcoflor es una tincin fluorescente, rpida y til en cualquier tipo de muestras. Esta tcnica contrasta los elementos micticos con gran claridad, debido a la unin de esta sustancia a la quitina de la pared fngica. Adems, requiere menor entrenamiento para el diagnstico de PcP que el examen directo en fresco, sin embargo, tiene falsos positivos con fibras vegetales, colgeno o elastina.

pg. 8

Neumocistosis: Pneumocystis jirovecii

Gomori-Grocott

Gram-Weigert

Azul de Toluidina O Giemsa: Trofozoitos con ncleos prpura y citoplasma celeste (derecha), los quistes no se tien, pero si los CIQ (izquierda)

Inmunoflorescencia directa (ID) Esta tcnica utiliza anticuerpos monoclonales especficos contra determinantes antignicos de la pared de los quistes y trofozoitos de P. jirovecii. Tiene una sensibilidad cercana a 100 % y una especificidad alrededor de 96 %. Los anticuerpos monoclonales tienen mayor sensibilidad y especificidad en las muestras de esputo inducido que las tcnicas de tincin convencionales, pero esta diferencia es mucho menor cuando se emplean muestras de LBA. Hay que sealar que la ID es ms cara y consume ms tiempo para brindar un resultado que las tcnicas de tincin convencionales. Adems, pueden existir reacciones cruzadas de antgenos de Pneumocystis con antgenos de Aspergillus sp. y de Paracoccidioides brasiliensis (dependiendo de la zona endmica en cuestin). Mtodos moleculares basados en la utilizacin de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) La poca sensibilidad de las tcnicas de tincin en muestras obtenidas de forma no invasiva y su menor sensibilidad en situaciones con poca carga parasitaria, as como el elevado costo de la ID, han obligado a desarrollar nuevas alternativas diagnsticas para P. jirovecii. Los mtodos moleculares basados en la PCR, son una opcin fiable y eficaz para los laboratorios con acceso a estas tcnicas. Se pudo demostrar que la presencia de citosina en la posicin 85 del gen mt LSU rRNA se asociaba con una evolucin favorable de la PcP. Por otra parte, mutaciones en el gen que codifica para la DHPS pueden indicar posible resistencia a las sulfamidas. Resultados sumamente tiles si se considera que las pruebas de susceptibilidad frente a frmacos no se encuentran disponibles para el patgeno por la carencia del cultivo microbiolgico.

pg. 9

Neumocistosis: Pneumocystis jirovecii

Recientemente la utilizacin de la PCR en tiempo real en muestras clnicas y tejidos facilita la obtencin de un resultado ms rpido y reduce la posibilidad de contaminacin en las muestras.

TRATAMIENTO Y PROFILAXIS
Desde hace aos, por su alta eficacia y disponibilidad en forma oral e intravenosa, la asociacin a dosis fijas de trimetoprima y sulfametoxazol (cotrimoxazol) constituye el frmaco de eleccin, tanto para el tratamiento como para la profilaxis de la PcP en pacientes con infeccin por VIH y sin sta. Por otra parte, en estos ltimos aos se han detectado mutaciones del gen de la DHPS homlogas, de las que en otros microorganismos inducen resistencia a este grupo de frmacos. Existen alternativas al cotrimoxazol para el tratamiento y la profilaxis de la PcP, que incluyen la dapsona, la pentamidina, entre otras; pero la informacin disponible sobre su eficacia es ms limitada.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Enrique Caldern Sandubete, Yaxsier de Armas Rodrguez, Virginia Cap de Paz- Pneumocystis jirovecii: cien aos de historia- REV CUBANA MED TROP 2011;63(2):97-116 James R. Stringer, Charles B. Beard, Robert F. Miller, and Ann E. Wakefield- A New Name (Pneumocystis jiroveci) for Pneumocystis from Humans. Emerging Infectious Diseases Vol. 8, No. 9, September 2002 Calderon EJ, Gutirrez-Rivero S, Durand-Joly I, Dei-Cas E. Pneumocystis infection in humans: diagnosis and treatment. Expert Review Anti-Infective Therapy. Morris A, Wei K, Afshar K, Huang L. Epidemiology and clinical significance of Pneumocystis colonization. J Infect Dis. 2008;197:10-7. Ng VL, Yajko DM, Hadley WK. Extrapulmonary pneumocystosis. Clin Microbiol Rev. 1997;10(3):401-18. Bava AJ, Cattaneo S, Bellegarde E. Diagnosis of pulmonary pneumocystosis by microscopy on wet mount preparations. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 2002;44(5):279-82. Procop GW, Haddad S, Quinn J, Wilson ML, Henshaw NG, et al. Detection of Pneumocystis jiroveci in respiratory specimens by four staining methods. J Clin Microbiol. 2004;42(7):3333-5. Robberts FJ, Liebowitz LD, Chalkley LJ. Polymerase chain reaction detection of Pneumocystis jiroveci: evaluation of 9 assays. Diagn Microbiol Infect Dis. 2007;58(4):385-92. Ripamonti C, Orenstein A, Kutty G, Huang L, Schuhegger R, Sing A, et al. Restriction Fragment Length Polymorphism Typing Demonstrates Substantial Diversity among Pneumocystis jirovecii Isolates. J Infect Dis. 2009;200(10):1616-22. Esteves F, Gaspar J, Marques T, Leite R, Antunes F, Mansinho K, et al. Identification of relevant single-nucleotide polymorphisms in Pneumocystis jirovecii: relationship with clinical data. Clin Microbiol Infect. 2010;16:878-84.

pg. 10