Captulo 22.

Tcnicas alternativas en farmacologa y toxicologa

ALFONSO ROMERO VIDAL Centro de Investigacin Grupo Ferrer Laboratorios Ferrer Internacional. Barcelona JOAN-ALBERT VERICAT SAGRIST Sanofi-Synthelabo Group Department of Drug Safety Gargenville (Francia)

ESTRATEGIA DE BSQUEDA DE PRODUCTO LA TOXICOLOGA Y LAS ESTRATEGIAS DE BSQUEDA EJEMPLO DE DESARROLLO PRECOZ ENSAYOS IN VITRO TRADICIONALES EJEMPLOS DE TCNICAS IN VITRO EN FARMACOTOXICOLOGIA Cultivos celulares (lneas y cultivos primarios) Cortes de rganos Embriofetotoxicidad Metabolismo y cintica in vitro Sistemas experimentales avanzados in vitro Prediccin y validacin FUTURO PRXIMO O REALIDAD ACTUAL La genmica y la protemica en toxicologa El impacto de la evaluacin precoz y las predicciones informatizadas RESUMEN BIBLIOGRAFA

Tcnicas alternativas en farmacologa y toxicologa

La industria farmacutica, para poder avanzar econmicamente, debe encontrar nuevos productos, activos y libres de efectos indeseables y, lgicamente, que lleguen a comercializarse lo ms rpido posible. La competencia es feroz, las dificultades son cada vez mayores y, en muchas ocasiones, cuando una nueva molcula llega al mercado ya se encuentra pasada de moda, sea por un competidor, o por el desarrollo de compuestos de substitucin de la propia compaa que mejoran las propiedades del primero. En esta situacin de competitividad, cada empresa establece estrategias de bsqueda de producto que le permitan sacar el mejor provecho posible de sus recursos humanos y tecnolgicos, es decir, ser lo ms eficaz posible. ESTRATEGIA DE BSQUEDA DE PRODUCTO Si se pudieran evaluar las estrategias de bsqueda de producto que siguen distintas empresas nos sorprenderamos de lo parecidas y diferentes que pueden llegar a ser a la vez. En el Cuadro 22-1 se resumen algunos de dichos aspectos. En los extremos estratgicos se encuentran, por un lado, la qumica combinatoria y el cribado de alta capacidad, cuyo principal objetivo es poder estudiar miles de molculas en muy poco tiempo, y por otro lado la sntesis de nuevas substancias basada en un conocimiento profundo de ciertos mecanismos de las patologas a tratar.

Estrategia
Tradicional

Comentario
Basada en la experiencia adquirida sobre un tipo de producto o enfermedad determinado. El nmero de productos obtenidos suele ser limitado y la seleccin de candidatos suele hacerse por propiedades puramente farmacolgicas. La investigacin toxicolgica tiende a ser regulativa. Basada en la utilizacin de tcnicas de sntesis de gran capacidad (como la qumica combinatoria) y sistemas de cribado de gran capacidad. Los criterios de seleccin (actividad farmacolgica) son muy restrictivos, lo que da lugar a un nmero reducido de compuestos normalmente prximos a su estado final. La investigacin toxicolgica tiende a ser regulativa. Como la anterior, pero con criterios de seleccin menos restrictivos, lo que da lugar a un gran nmero de productos. La investigacin toxicolgica, asi como otras actividades de desarrollo, intervienen en la seleccin de los candidatos. Despus, con los candidatos seleccionados, se aplica el sistema clsico para mejorar sus propiedades..

Explosiva especfica

Explosiva generalista

Cuadro 22-1. Estrategias de bsqueda de producto. Los comentarios indicados son simplemente un resumen y sin duda no se ajustan a todos los casos intermedios que pueden encontrarse entre las estrategias en uso en la industria farmacutica

Ninguno de estos sistemas tiene el xito asegurado. Sea cual sea la estrategia utilizada, los factores ms importantes para encontrar un buen producto son el azar, quizs en primer lugar, y las ideas. Tal como los presidentes y directores generales de las sociedades farmacuticas dicen en muchos de sus discursos inaugurales o de final de ao, el capital ms importante de una empresa lo constituyen las personas. Es decir, sea cual sea el avance tecnolgico del que se dispone, slo el cientfico capaz de disear un cribado de alta capacidad inteligente o de tomar la delantera a otros en el conocimiento de una enfermedad determinada, y con la intuicin y el coraje necesarios para defender un nuevo concepto, podr aumentar las posibilidades de encontrar una nueva substancia teraputica y economicamente importante.

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LA TOXICOLOGA Y LAS ESTRATEGIAS DE BSQUEDA Considerando las estrategias de bsqueda descritas en el apartado precedente, el papel de la toxicologa ser variable, pero siempre estar en funcin del nmero de productos a estudiar, del conocimiento existente sobre substancias afines y de la necesidad estratgica de asegurar un flujo continuo y estable de nuevas molculas en desarrollo, de acuerdo con los recursos humanos y tcnicos de que se dispone. La qumica combinatoria junto con la evaluacin de libreras qumicas (propias o comerciales) y el cribado de alta capacidad para poder estudiar la actividad farmacolgica de los productos as sintetizados (Cuadros 22-2 y 22-3), da lugar a un gran nmero de molculas, normalmente en forma de mezclas, en proporciones variables, de cada uno de los compuestos sintetizados. De hecho, se considera que la qumica combinatoria puede multiplicar por 10 por 100 el nmero de productos qumicos nuevos.

Concepto
Qumica Combinatoria

Definicion
Sistema de sntesis basado en el uso de plataformas qumicas (esqueletos), que permite la sntesis de un gran nmero de productos al mismo tiempo. Conceptualmente, se permiten todas las reacciones a la vez, sin bloquearse ningn sitio de reaccin. La mezcla de reaccin debe purificarse en sus elementos individuales. La caracterizacin de los productos individuales requiere tecnologa avanzada. Conocimiento de todos los genes transcritos (en general el transcriptoma) en situacin normal y/o patolgica. El genoma humano transcrito debera estar totalmente secuenciado, con las tcnicas y secuenciadores actuales, antes del ao 2007, y las variantes humanas (diversidad) hacia el 2020. La expresin diferencial tejido sano / tejido patolgico permite obtener nuevas dianas teraputicas potenciales. Es el conocimiento del perfil de expresin de proteinas en geles de electroforesis bidimensionales. Se puede considerar que las alteraciones de expresin de genes pueden repararse por procesos de homeostasis y que un efecto fenotpico solo sucede cuando hay cambios en los enzimas o proteinas. La gran cantidad de datos producidos de las interacciones entre la qumica combinatoria y la genmica o la protemica slo pueden ser interpretados mediante sistemas informticos avanzados. La informatica ha permitido el desarrollo de sistemas de anlisis de imagen fundamentales para la protemica y para el establecimiento de sistemas expertos en la prediccin de efectos txicos. La interaccin entre qumica combinatoria y genmica solo pueden hacerse con sistemas automatizados de gran capacidad. De hecho, sin los avances importantes de esta tecnologa, la qumica combinatoria no hubiera podido desarrollarse a nivel industrial.

Genmica

Protemica

Bioinformtica

Robtica

Cuadro 22-2. Definiciones de algunos conceptos importantes en investigacin y bsqueda de nuevos productos

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Elementos que intervienen

Qumica combinatoria

Comentarios
De 10.000 a ms de 100.000 compuestos sintetizados por ao. Cada compuesto es disponible a nivel de mg. La pureza del producto puede no ser ideal para realizar los estudios de toxicologa. Las propias consisten en todos los compuestos sintetizados; pueden organizarse sub-libreras representativas para agilizar el screening. Las comerciales suelen consistir en 15000 a 5000 compuestos diferentes. Media de 2500 compuestos/diana/dia/robot.

Libreras qumicas (quimicotecas) Cribado de gran capacidad

Cuadro 22-3. La productividad asociada a las nuevas tecnologas. Sin duda, las tecnologas relacionadas con la qumica combinatoria evolucionan rpidamente y las cifras indicadas en este cuadro estarn obsoletas dentro de poco tiempo

Mediante tcnicas de purificacin de alta resolucin, se logran aislar los productos individuales obtenidos por medio de la qumica combinatoria. Ello origina la primera caracterstica propia de estos procesos de sntesis: la disponibilidad limitada de producto final de reaccin. Asociada a esta caracterstica es necesario considerar la pureza de las substancias sintetizadas, que normalmente es inferior a la de aquellas derivadas de la qumica tradicional. La otra caracterstica importante a considerar es inherente al objetivo de la qumica combinatoria, y es la posibilidad de sintetizar un gran nmero de nuevas molculas en breve tiempo. Es decir, la aplicacin de las tcnicas de qumica combinatoria da lugar a un nmero muy elevado de nuevas molculas, disponibles en cantidades muy reducidas y de calidad limitada, como para poder conducir los estudios habituales de seguridad. Las tcnicas asociadas al High Throughput Screening (HTS) o cribado de alta capacidad permiten seleccionar rpidamente las nuevas molculas que reconocen una determinada diana. Estos sistemas de seleccin son muy eficaces en cuanto a productividad y, por tanto, se pueden llegar a evaluar desde varios millares hasta centenares de millares de productos por mes en una campaa diseada contra una diana concreta. Si consideramos que la probabilidad de encontrar una molcula activa sobre una diana predeterminada es proporcional a la cantidad de productos que se estudian, el HTS proporcionar un importante nmero de compuestos que dan lugar a una seal positiva en el test utilizado. Forma parte de la estrategia especfica de cada industria, el nivel de afinidad por el receptor (10-5M, 10-10M, etc.) para que una respuesta se considere positiva o suficiente. Las substancias que dan este tipo de respuesta reciben el nombre de dianas (o hits). Si stas son confirmadas en un segundo ensayo, diferente del primero, se denominan dianas confirmadas (o confirmed hits). De todas ellas, las que se seleccionan como potenciales candidatos al desarrollo, y que se desean modificar para aumentar su afinidad, se denominan lderes (o leads) (Figura 22-1). Una estrategia habitual, consiste en seleccionar como lderes a los compuestos que han dado la mejor respuesta, dentro de una familia qumica determinada. Los lderes, y en algunos casos las dianas confirmadas, se purifican antes de considerarlos candidatos preferentes al desarrollo. Aunque la estrategia descrita en estas lneas puede parecer altamente selectiva, la actividad bsica consiste en confirmar mediante HTS los resultados obtenidos, utilizando estas mismas tcnicas (Figura 22-2). As pues, para poder seleccionar correctamente los candidatos ms prometedores al desarrollo, se hace necesario aadir criterios adicionales que permitan tomar decisiones (criterios de decisin). Los criterios que cada laboratorio aade son estratgicos, y no existe una receta que sea perfecta, pero se pueden resumir como aquellos que definen algunas de las propiedades bsicas que una molcula debe tener para poder llegar a ser un producto comercial.

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E sq u em a d e I+ D
N e c e s id a d d e p r o d u c t o C o m p le jid a d e x p e r im e n ta l

HTS

S c r e e n in g s te r c ia r io s

E s tu d io s c ln ic o s

L ib r e r a s q u m ic a s

D ia n a s

L d e r e s

C a n d id a to s

D e s a r r o llo P r e c ln y C ln

M ercad o

S c r e e n in g s s e c u n d a r io s

E s tu d io s d e s e g u r id a d
N m er o d e p r o d u c to s a en sayar

Figura 18-1. Esquema de las fases de investigacin y desarrollo en relacin con las nuevas tecnologas. Ntese la necesidad de establecer una buena relacin entre el nmero de productos a ensayar, la cantidad de producto disponible y la complejidad experimental, todo ello con unos recursos humanos y econmicos siempre limitados

LEAD

CANDIDATO AL

Diversificacin

farmacolgica

de candidatos

de candidatos

avanzada de

toxicolgica

qumica del

Sntesis de

productos

Figura 18-2. Representacin de los momentos clave en la evaluacin precoz, donde las tcnicas in vitro son importantes: seleccin de los lderes y seleccin de los candidatos al desarrollo

Entre las las caractersticas que se tienen ms en cuenta son: 1) una actividad relativamente

candidatos

candidato

Seleccin

Seleccin

Seleccin

nuevos

DESARROLLO

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limitada, ya que si una molcula es activa en demasa, puede dar lugar a problemas de dosificacin correcta en las plantas de produccin, de acuerdo a las tcnicas habituales; 2) ausencia de poder mutagnico, o incluso embriotxico, si as se desea; 3) valores de log P1 comprendidos entre ciertos lmites, para permitir una vehiculacin adecuada del producto al rgano deseado; 4) una metabolizacin que de lugar a un nmero adecuado de metabolitos. En general, se trata de criterios ms relacionados con las propiedades que antes eran consideradas de desarrollo, que de fases precoces de investigacin. En cierta manera, ya que no se pueden estudiar todos los productos salidos del HTS, interesa poder descartar prematuramente aquellos que ms tarde podran ser eliminados en las fases ms tardas del desarrollo. Por tanto, si se considera que cada empresa tiene unas lneas o productos que le son caractersticos y que representan la cultura qumica de la misma, cada empresa tendr una base de datos con las razones por las cuales ciertas molculas han sido descartadas o retiradas ms o menos tarde durante el desarrollo. Es importante entonces establecer los modelos experimentales necesarios que permitan encontrar la informacin deseada. Dado que, como se ha dicho anteriormente, la cantidad de producto es limitada y se deben obtener las respuestas lo ms rpido posible, los modelos in vitro sern las herramientas de eleccin en esta fase de la investigacin. EJEMPLO DE DESARROLLO PRECOZ Tal como se ha indicado en pginas precedentes, la integracin de ensayos de evaluacin precoz depende de la estrategia de bsqueda de producto utilizada. La Figura 22-3 muestra esquemticamente el escenario de un desarrollo precoz considerando un parmetro cualquiera.

E je m p lo d e S c r e e n in g P r e c o z
S e le c c i n p r im a r ia

S e le c c i n s e c u n d a r ia

N o M u t g en o

Sntesis de back-ups

N o T e r a t g e n o

I n a c tiv o S in e fe c to

E le v a d o L ogP

S e le c c i n d e p r o p ie d a d e s in te r e s a n t e s

Figura 18-3. Ejemplo de evaluacin precoz, considerando los dos niveles de seleccin descritos en el texto, as como tres propiedades negativas (mutagnesis, teratognesis, elevado logP) presentes, en parte o totalmente, en los lderes seleccionados durante la primera fase. Con una estrategia de ensayos optimizada, se podr seleccionar el producto de reemplazo adecuado (perteneciente a la misma clase qumica o farmacolgica), libre de todos estos efectos negativos y si la serie de ensayos es suficiente, libre de sorpresas tardas en las fases ms avanzadas del desarrollo preclnico

Parmetro experimental u obtenido por clculo matemtico para representar la solubilidad lipdica de un producto qumico (coeficiente octanol: agua).

CANDIDATO

R ech azo d e p r o p ie d a d e s n e g a tiv a s

AL DESARROLLO

HTS

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A partir de la sntesis qumica, la seleccin clsica se fundamenta en el uso de sistemas de evaluacin farmacolgica que permiten realizar una primera seleccin de las molculas. Segn el nmero de candidatos obtenidos, se introducen criterios de seleccin, incluyendo parmetros toxicolgicos, que permiten seleccionar los lderes. Estas molculas, en funcin de estrategias propias, se deben modificar mediante tcnicas de qumica tradicional para aumentar su eficacia. En este momento, los criterios de seleccin utilizados en la fase precedente, servirn para controlar la aparicin de propiedades negativas. En general, dependiendo del nivel de seleccin utilizado en el mbito farmacolgico, el nmero de candidatos a lder ser ms o menos importante. Asimismo, segn la facilidad relativa de la qumica necesaria para mejorar el lder y la dificultad en aumentar su eficacia, el nmero de potenciales candidatos a desarrollo ser variable. La decisin sobre los tipos de ensayos necesarios en estas fases del desarrollo no es fcil y depende enormemente de la estrategia de bsqueda de producto que se aplique. No obstante, es posible dar algunas ideas tiles: Los ensayos deben ser simples y necesitar pequeas cantidades de producto. Esto es muy importante, ya que el nmero de productos a estudiar ser elevado. Ello tiene un coste directo (el trabajo necesario para realizar los ensayos) y un coste indirecto (el tiempo y trabajo invertido para sintetizar las cantidades necesarias de producto). Se debe evitar la rutina o la generalizacin: la racionalizacin de la investigacin es una necesidad en todos los dominios. Por ello es necesario evitar toda estrategia burocrtica en esta fase del proceso. Estos ensayos no son regulatorios; su funcin es ayudar en la toma de decisiones, y para ello hay que realizar los ensayos indispensables. La acumulacin de resultados, en s misma, en lugar de ser de ayuda para una posterior decisin, puede llegar a convertirse en una dificultad. La mejor estrategia es que los criterios para ello (resultados positivos o negativos en ciertos ensayos) sean establecidos antes de la realizacin de los ensayos, de forma que la tarea sea ms fcil. Los ensayos deben pecar de cierta redundancia: Esto permite confirmar resultados y organizar los ensayos en etapas de complejidad creciente, de manera que se obtenga la mxima eficacia de los recursos obtenidos. Una forma de organizacin (Cuadro 22-4) es utilizar un plan de investigacin en dos fases. Una primera fase de exclusin por propiedades negativas, y una segunda fase que permita confirmar dichas propiedades negativas (en el caso de productos farmacolgicamente muy interesantes) o de asegurar la ausencia de sorpresas retardadas. Es necesaria la autocrtica: Este tipo de ensayos son normalmente realizados por equipos que forman parte de los departamentos de toxicologa, con una tendencia relativamente importante a la rutina y a la rigidez, asociadas a la realizacin de estudios segn las BPL. En esta fase del desarrollo de nuevas substancias, no se desea perder, por resultados incorrectos, ninguna molcula que tenga un buen potencial. De acuerdo a los objetivos prefijados es fundamental preguntarse sobre la validez de los ensayos que se realizan y estar dispuestos a substituirlos, eliminando aquellos poco predictivos y/o aadiendo otros ms eficaces. ENSAYOS IN VITRO TRADICIONALES Adems de la funcin que los ensayos in vitro pueden desempear en la fase de bsqueda y seleccin de nuevos productos, que es sobre la que se ha tratado hasta ahora, existe un reducido nmero de ellos que cumple un importante papel en la fase de desarrollo. Nos estamos refiriendo a los ensayos a corto plazo diseados para evaluar los efectos genotxicos de una sustancia qumica. Desde que Ames diera a conocer en 1973 el protocolo del test que se conoce por su nombre, este ensayo ha

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venido aplicndose sistemticamente en la investigacin toxicolgica pre-clnica de sustancias qumicas como pionero de la experimentacin in vitro. Objetivo de la evaluacin
Potencial mutagnico

Fase de exclusion
SOS chromotest, Ames miniscreen, Ames II Ensayos de mutagnesis en bacteria, rpidos, potencialmente automatizables, y que requieren cantidades muy limitadas de producto. Citotoxicidad clsica Ensayos utilizando lineas celulares o cultivos primarios que permiten clasificar los productos en evaluacin.

Fase de confirmacion
Micronucleo in vitro, test de cometas Ensayos ms complejos, de automatizacin limitada, pero con requerimiento relativamente limitado en producto a ensayar.

Toxicidad general

Citotoxicidad en cortes de rganos, Toxicidad in vivo en animales neonatos, Toxicidad in vivo con dosis mltiplo da la dosis activa Permiten extrapolacin de daos. Son bastante complejos y necesitan recursos humanos relativamente importantes. FETAX test, preteratognesis reducida Ensayos sobre huevos de Xenopus laevis o sobre animales de laboratorio utilizando protocolos reducidos que permiten predecir efectos importantes.

Embriotoxicidad

Test de las "Stem cells", Test de las micromasas Ensayos que comparan la citotoxicidad de clulas cen fase de diferenciacin con clulas adultas para extrapolar efectos especficos.

Cuadro 22-4. Ejemplos de estrategias experimentales para evaluacin precoz de nuevos candidatos. Existen ms ejemplos disponibles en la Bibliografa para poder responder a otras cuestiones que puedan interesar al lector

El test de Ames se basa en la deteccin de mutaciones reversas inducidas por la sustancia a ensayar sobre una cepa auxotrfica histidina dependiente de Salmonella typhimurium. Fue utilizado durante la dcada de los setenta como nico evaluador de mutagenicidad de nuevas molculas. A principios de los ochenta se incorporaron otros ensayos, con lo que se perfil la batera de estudios agudos que, con pequeas modificaciones, ha llegado hasta nuestros das. Lo que resulta de mayor inters en el contexto que se trata en este captulo, es que de los cuatro ensayos aceptados en las Lneas Directrices para definir la genotoxicidad de una sustancia, tres podan ser realizados in vitro. Se trata de los primeros, y por ahora de los nicos, estudios toxicolgicos in vitro validados para formar parte de la toxicologa regulatoria. Los ensayos de genotoxicidad in vitro ms empleados en estos ltimos aos son: a) En el apartado de la demostracin de mutaciones gnicas o puntuales:

Ensayo de mutaciones reversas en Salmonella typhimurium. Ensayo de mutaciones reversas en Escherichia coli. Ensayo de mutaciones gnicas en Saccharomyces cerevisiae. Ensayo de mutaciones gnicas en clulas de mamfero en cultivo: CHO, L5178Y TK+/(este ltimo es actualmente uno de los ms recomendados). Ensayos de transformacin en clulas de mamfero. Ensayo de mutaciones gnicas en Aspergillus nidulans. Ensayo de mutaciones gnicas en Neurospora crassa.

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b) Para la demostracin de aberraciones cromosmicas: Ensayo citogentico en clulas de mamfero: CHO, CHL o linfocitos humanos. c) Para la demostracin de otros tipos de efectos sobre los cromosomas: Ensayo de intercambio de cromtidas hermanas. Ensayo de recombinacin mittica en Saccharomyces cerevisiae. Lesin y reparacin de ADN en clulas de mamfero. A partir del consenso alcanzado con la ICH S2B (International Conference on Harmonization), cuya entrada en vigor tuvo lugar en marzo de 1998, se admite una batera de tres estudios, salvo en casos especiales en que pueden continuar siendo necesarios los cuatro exigidos anteriormente. De los tres, dos (demostracin de mutaciones gnicas en bacterias, y la evaluacin citogentica de aberraciones cromosmicas o el ensayo del locus tk con clulas de linfoma de ratn) siguen una metodologa in vitro. El hecho de que la investigacin del potencial poder genotxico de una sustancia deba desglosarse en los distintos tipos de efectos posibles, causados por un verdadero abanico de mecanismos, favorece el planteamiento de una batera de ensayos complementarios frente al diseo de estudio nico capaz de abarcar la totalidad de dianas existentes. En esta situacin, las metodologas in vitro, con su facilidad de seleccionar y aislar los efectos o mecanismos especficos que se desean estudiar, resultan idneas. Esta ha sido una de las razones principales por las que este tipo de ensayos haya sido aceptado y validado precozmente, si bien no hay que olvidar que sus conclusiones deben venir siempre avaladas por un estudio a corto plazo in vivo, y, en la mayora de casos, los tests de genotoxicidad vienen seguidos de los estudios de cancerognesis a largo plazo, que son capaces de poner de manifiesto no slo las consecuencias tumorales de la mayora de los efectos genotxicos, sino tambin de los epigenticos. Dejando ya el desarrollo toxicolgico pre-clnico de una sustancia qumica, existen algunos pocos ejemplos ms de uso de ensayos in vitro validados. Uno de los ms tradicionales es el llamado ensayo LAL o de lisado de amebocitos del Limulus polyphemus, utilizado para detectar endotoxinas bacterianas y alternativo al test de pirgenos en conejo albino al que ya, prcticamente, ha sustituido. La adicin del lisado a una solucin que contenga endotoxinas provoca su gelificacin, lo que da como consecuencia una turbidez cuantificable. Este ensayo, si bien presenta algunas limitaciones (concentracin de endotoxinas, posibilidad de contaminacin de material o reactivos, etc.), se recoge en las Farmacopeas de distintos pases como mtodo oficial para Europa, incluida la edicin espaola ya desde 1997. TECNOLOGIAS IN VITRO EN FARMACOTOXICOLOGA Los ejemplos de modelos in vitro, aplicados tanto en el campo de la farmacologa como en el de la toxicologa, consisten en la aplicacin de tcnicas habituales de otras disciplinas (biologa celular o molecular, bioqumica, etc.), para responder a cuestiones especficas o, ms concretamente, comprender los mecanismos de accin farmacolgico o toxicolgico. Para la evaluacin precoz de nuevos compuestos, de los que no se conocen ni sus mecanismos de accin ni sus rganos diana, la seleccin de los mtodos a aplicar va a depender, por un lado de aspectos cientficos y, por otro lado, de aspectos estratgicos. En el Cuadro 22-5 se presentan varios ejemplos de sistemas experimentales. La lista no es exhaustiva, pero el lector interesado podr consultar en obras especializadas. En los apartados siguientes se describen algunos de los modelos in vitro actualmente ms utilizados, intentando mostrar las ventajas y las limitaciones de cada uno de ellos.

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Sistemas estudiados
Testculo y esperma Moduladores endocrinos Embrin y tejidos asociados Irritacin cutnea y ocular Hgado Sistema inmunitario Metabolismo

Referencia
Hinsch et al., 1997 ; Witzmann et al., 1997, Cooke, 1998 Gray, 1998 Maar et al., 1997 ; Spielmann, 1998 Perkins, 1996 ; Prinsen, 1996 ; Kruszewski et al., 1997; Monteiro-Riviere, 1997 Guillouzo et al., 1997; Tyson, 1987; Guillouzo, 1998 Dean, 1997 Wrighton et al., 1995; Yamano y Morita, 1995

Cuadro 18-5. Ejemplos de sistemas estudiados in vitro en toxicologa. Esta lista refleja solo algunos ejemplos. Sin duda, un anlisis ms profundo de la Bibliografa aumentar las referencias del lector interesado en el tema

Cultivos celulares (lneas y cultivos primarios) Histricamente, las clulas han sido los primeros sistemas experimentales in vitro utilizados para estudiar la evaluacin precoz de nuevos compuestos. La razn principal reside en la hiptesis de que cualquier fenmeno o respuesta txica en un rgano o tejido se deba a la suma de todos los efectos individuales sucedidos en cada una de las clulas. En segundo lugar, la evaluacin precoz del potencial mutagnico y/o cancergeno de nuevos productos se realiza mediante ensayos in vitro de valor demostrado. Inherente a ello, se encuentra el aspecto prctico que representa el hecho de necesitar cantidades muy reducidas de producto a ensayar, la rapidez de realizacin de los ensayos, y su coste relativamente reducido. Es evidente que con todas estas caractersticas, los mtodos de evaluacin precoz basados en el uso de cultivos celulares resultan muy interesantes. Dos son los principales modelos celulares de que disponemos: lneas celulares (estabilizadas o inmortalizadas) y los cultivos primarios. Cada uno tiene sus ventajas e inconvenientes (Cuadro 22-6).

Modelo Lineas celulares

Ventajas
Fcil mantenimiento y cultivo. Estabilidad en el tiempo. Elevada reproducibilidad.

Inconvenientes
Capacidades metablicas reducidas o nulas. Distanciadas de la clula verdadera componente del rgano. Normalmente son clulas que han regresionado respecto a su fenotipo normal. Capacidad limitada de crecimiento. Enriquecimiento de un cierto subtipo celular en el rgano inicial. Poco estables durante el periodo de cultivo. Necesidad de animales y relativa complejidad en su aislamiento y cultivo. Diferentes cultivos primarios, pueden presentar subpo-blaciones o fases de diferenciacin distintas, originando problemas de comparacin de datos histricos.

Cultivos primarios En principio, estn muy

prximos a las clulas que forman parte del rgano inicial. Actividad metablica inicial relativamente parecida a la original.

Cuadro 22-6. Ventajas e inconvenientes de los sistemas celulares ms utilizados. Las propiedades descritas en aqu son proporcionales al conocimiento de los limites de cada modelo experimental y al dominio suficiente de las tcnicas de biologa

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Cuando se considera la toxicidad sistmica, la opinin general sostiene que las lneas suelen ser menos apropiadas que los cultivos primarios, principalmente debido a su reducida capacidad metablica. La Figura 22-4 muestra un estudio de correlacin entre la dosis mxima tolerada (dos o cuatro semanas de tratamiento oral) con la citotoxicidad in vitro utilizando hepatocitos de rata en cultivo. Debe tenerse muy en cuenta, que existen casos en los que no pueden aplicarse estas correlaciones. Citaremos como ejemplo el de los productos cardiotxicos, que no afectan en absoluto a los hepatocitos de rata. Es evidente, entonces, que si un laboratorio cualquiera estuviera interesado en este tipo de productos, el hepatocito en cultivo no sera el modelo de eleccin. Es decir, la validacin de cualquier modelo in vitro para su aplicacin en la rutina debe hacerse de acuerdo a los objetivos propios de cada laboratorio.

C o r r e la c i n v itr o v s v iv o

M T D r a t p .o . ( m g /k g /j; < 4 w k s ) 800 600 400 200 0

200

400

600

800 V it r o IC 1 0 0

1 000

1 200

1 400

1 600

Figura 22-4.Resultados obtenidos en un estudio de correlacin entre la dosis mortal in vitro en hepatocitos de rata y la dosis mxima tolerada (MTD) despus de 2 4 semanas de tratamiento continuo en la rata por la va oral con 23 compuestos pertenecientes a clases qumicas y farmacolgicas diferentes. Se pueden encontrar detalles adicionales se pueden encontrar en Paillard et a.ml., (1999)

De todas maneras, hay datos suficientes (cuadro 22-7) que parecen sugerir globalmente que los ensayos de citotoxicidad, sea cual sea el tipo celular utilizado, muestran una correlacin suficiente con la toxicidad en los animales o con las dosis letales en el hombre. Sin embargo, estas correlaciones son aritmticas y no dan una informacin mecanicista que permita extrapolar mecanismos que, a su vez, permitan extrapolar toxicidades rgano-especficas. Dosis mxima tolerada (18 productos) Sistema celular in vitro
Clulas de hepatoma de ratn Hepa1 clc7 en cultivo Cultivos primarios de hepatocitos de rata 2 Semanas p.o. (9 productos) 0.80 0.92 4 Semanas p.o. (9 productos) 0.51 0.48

Cuadro 22-7. ndices de correlaciones entre citotoxicidad in vitro (determinacin de la supervivencia celular mediante la tcnica de la incorporacin de rojo neutro) y la dosis mxima tolerada obtenidos en el estudio de 18 compuestos farmacolgicamente interesantes pertenecientes a diferentes clases qumicas. Los ndices de correlacin son satisfactorios con los efectos a corto plazo (2 semanas), pero la correlacin tiende a ser irrelevante en tratamientos a ms largo plazo

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El Cuadro 22-7 tambin nos muestra que la toxicidad por tratamiento repetido es ms difcil de predecir mediante los cultivos celulares. Probablemente ello es inherente, por un lado, a la propia simplicidad de los modelos in vitro que son deficientes en complejidad; y, por otro lado, a los parmetros habitualmente utilizados en toxicologa in vitro, que suelen ser parmetros de mortalidad (fenmeno irreversible), poco eficaces para detectar fenmenos sutiles, lentos o acumulativos. Por todo ello, adems de la utilizacin de fibroblastos, se intentan utilizar lneas clulares relacionadas con rganos especficos (de preferencia de origen humano). As, adems de los cultivos de hepatocitos, se utilizan con bastante xito neuronas y clulas renales. Probablemente, a medida que se avance en las tcnicas de mantenimiento de las propiedades rgano-especficas y de supervivencia en lneas y cultivos primarios, la eficacia de estos sistemas experimentales ser cada vez mayor. Cortes de rganos Representan un modelo in vitro interesante. Se trata de un sistema en cultivo que guarda una cierta estructura en el que se mantienen tanto las comunicaciones celulares, como la distribucin de los subtipos celulares. Algunos sistemas permiten un tiempo de cultivo relativamente largo (cortes cerebrales), mientras que otros se degradan rpidamente (cortes de hgado). Ello, probablemente, es debido a la estructura propia del tejido y a las tecnologas existentes para el cultivo de los cortes. Es necesario llegar a un equilibrio entre el espesor del corte, para que se mantenga la estructura tisular, y la dificultad de difusin de nutrientes, oxgeno y productos de eliminacin. Todo ello determina el tiempo de cultivo disponible. Lgicamente, segn la astringencia del estudio que se est realizando, la importancia de estas limitaciones ser ms o menos relativa. Los cortes de rganos permiten una evaluacin muy completa de los efectos de los productos en estudio. En el Cuadro 22-8 se muestran resultados obtenidos con tres productos farmacuticos de referencia sobre cortes de hgado de rata. Es interesante, que la evaluacin histopatolgica de los cortes as como su bioqumica se correlacionan con los resultados obtenidos en el animal in vivo. Producto Paracetamol Hombre
Hepatotoxicidad aguda con necrosis y muerte del individuo Hepatotoxicidad demostrada en regmenes teraputicos, en administracin nica o repetida

Animal
Deplecin de glucgeno, ATP y GSH. Necrosis centrolobular Aumento de las transaminasas y necrosis centrolobular despus de tratamientos con dosis elevadas

Cortes de hgado
Deplecin de glucgeno, ATP y GHS. Necrosis centrolobular Aumento de las transaminasas y de GSSG. Observacin de clulas en apoptosis. Inicialmente, dao periportal que difunde a centrolobular (dilatacin) hasta necrosis Necrosis hepatoctica. Alteraciones mitocondriales y deplecin de ATP

Hepatocitos de rata
Deplecin de glucgeno, ATP y GHS Deteccin de metabolitos reactivos eliminados por el GSH. Observacin de clulas apoptsicas. Efectos sobre REG, ribosomas, ncleo y mitocondrias Alteraciones mitocondriales, peroxidacin de lpidos

Tacrina

Metapireleno

Ausencia de efectos indeseables, aparte de un potencial efecto mutgeno no completamente entendido

Hepatotxico en la rata, con necrosis periportal y proliferacin mitocondrial (potencialmente asociado a su poder cancergeno en la rata)

Cuadro 22-8. Ejemplo de respuestas obtenidas con la utilizacin de cortes de hgado en rata mantenidos en cultivo durante 24 horas (95% de oxgeno, 37 C, incubador rotante) y tratados con tres productos de referencia, en comparacincon sus efectos in vivo

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Desafortunadamente, las condiciones de cultivo son relativamente duras, ya que se necesita una tensin de oxgeno muy elevada (entre 60 % y 90 %). Estas condiciones experimentales, que parecen ser necesarias para mantener un grado suficiente de oxigenacin de las capas celulares internas del corte, pueden provocar reacciones fisicoqumicas espontneas que pueden dar lugar a entidades reactivas u oxidantes diferentes de aquellas que suceden en los tejidos, donde se da una hipoxia relativa. Embriofetotoxicidad La evaluacin del poder embriotxico de xenobiticos ocupa un lugar cada vez ms relevante en las fases iniciales de la investigacin toxicolgica. Para la industria farmacutica y la autoridad regulatoria, parece cada vez ms importante incluir mujeres en los ensayos clnicos de fase I. El resto de los estudios sobre la reproduccin suelen realizarse en fases ms tardas del desarrollo del frmaco, ya que son costosos y no son limitantes para la autorizacin de puesta en el mercado. En esta situacin se vuelve necesario intentar predecir cualquier efecto indeseado lo ms pronto posible. Existe un buen nmero de modelos alternativos para estudiar el efecto de nuevos productos sobre el desarrollo fetal. Todos ellos se han desarrollado en origen, para explicar el mecanismo de accin de txicos conocidos, o para disponer de sistemas experimentales por medio de los cuales sea posible el estudio del desarrollo embrionario. Algunos de ellos son tcnicamente muy simples, mientras que otros son muy complejos. Unos cubren una parte del ciclo embrionario, ms o menos corta, otros son de tipo global (Figura 22-5), y mientras algunos pueden dar lugar a mucha informacin, otros se contentan con ofrecer resultados cualitativos. De todas formas, sean ms o menos eficaces, todos ellos adolecen de la limitacin de no disponer de sistema placentario, simplificando enormemente la complejidad del sistema fetal. Ciertos modelos para estudios de embriofetotoxicidad se encuentran en fase de estudio y validacin, con el fin de incluirlos en reglamentaciones internacionales de mbito europeo.

E j e m p l o s d e e n s a y o s i n v it r o p a r a e v a lu a r e m b r io t o x i c i d a d
F e c u n d a c i n S e g m e n ta c i n B la s t u la c i n G a s t r u l a c i n

O r g a n o g n e s is H is t o g n e s is

G a m eto s

F a s e e m b r io n a r i a

F a s e fe ta l

F e t a x T e s t (D e s a r r o ll o d e lo s h u e v o s d e X e n o p u s la e v i s ) C it o t o x i c id a d e n l a li n e a D 3 d e c l u la s g e r m in a l e s e n s u d i f e r e n c i a c i n a c a r d i o m i o c it o s C u lt iv o d e e m b r i n d e r a t a (d i a s 1 1 y 1 2 d e g e s t a c i n ) in v i tr o C u lt iv o d e c l u la s d e b r o t e s d e e x t r e m i d a d e s d e e m b r i n d e r a t a i n v it r o o t e s t d e m i c r o m a s a s ( d ia 1 3 d e g e s t a c i n )

Figura 22-5. Representacin de algunos de los diferentes tests de embriotoxicidad disponibles y su integracin en la embriognesis

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Metabolismo y cintica in vitro No hay muchos sistemas experimentales que permitan realizar estudios cinticos y de metabolismo in vitro. Uno de los ms representativos es el ensayo de permeabilidad celular sobre clulas de intestino CaCo-2. Este test, muy simple, junto con los datos fisicoqumicos de las molculas en estudio y de modelos informticos basados sobre la cintica de productos de referencia, permite desarrollar sistemas integrativos de prediccin de la cintica de los productos en evaluacin. Estas predicciones son muy importantes para poder dar su justo valor a los resultados obtenidos en los ensayos de citoxocidad, sea cual sea la complejidad del modelo utilizado. Avances importantes suceden en el desarrollo de modelos para la barrera hematoenceflica, que representa un problema importante en farmaco-toxicologa in vitro. A nivel de metabolismo se dispone de un nmero importante de sistemas experimentales in vitro para permitir extrapolar potenciales rutas metablicas. Con el desarrollo de las tcnicas de biologa molecular, se han podido clonar la mayor parte de genes que realizan las diferentes reacciones metablicas, poniendo a disposicin de la comunidad cientfica un gran nmero de sistemas experimentales, que van desde bacterias o levaduras, hasta el uso de todos los otros sistemas experimentales de toxicidad celular. Si los datos obtenidos en estos sistemas experimentales se aaden a los resultados obtenidos en la conduccin de los ensayos descritos en las secciones precedentes, se generan los llamados sistemas integrados de prediccin, cuyos resultados pueden ser de alto valor prctico. Sistemas experimentales avanzados in vitro La evolucin de la biotecnologa ha dado lugar al desarrollo de sistemas experimentales ms sofisticados que permiten un intento de abordaje de estudios de toxicidad a largo plazo, mediante metodologas in vitro. Un ejemplo de este tipo de mtodos es el tecnomouse (Figura 22-6), que en un principio se haba desarrollado para la produccin de anticuerpos in vitro a partir de hibridomas en cultivo. Actualmente se est explorando su potencial aplicacin como modelo de toxicologa in vitro para estudios a largo plazo. Este sistema consiste en un mximo de 5 cartuchos cilndricos de fibra cava que simulan el sistema capilar animal. Las clulas se encuentran en el exterior de estas fibras (espacio extracapilar), mientras que los nutrientes y gases (el medio de cultivo) circulan a travs de dichas fibras (espacio intracapilar). El sistema de difusin a las clulas es tan prximo, que stas consumen el oxgeno directamente, permitiendo una mayor tasa metablica y, por consecuencia, una supervivencia ms larga. Con tcnicas de control no invasivas se pueden determinar diversos parmetros para evaluar el efecto de los xenobiticos sobre las clulas. Existe la confianza de que estos sistemas permitan, en un futuro, la realizacin de estudios crnicos in vitro, muy necesarios para mejorar las predicciones previas a los estudios regulativos.

Figura 22-6. Fotografa del tecnomouse (Hanley et al., 1999) en estudio en el ECVAM. Foto cortesa de la Dra. Pilar Prieto (ECVAM, Ispra, Italia)

Prediccin y validacin

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La utilizacin de los ensayos in vitro requiere que se validen en forma correcta. No hay duda que si aceptamos sin dificultades que los ensayos en animales no son completamente predictivos de aquello que puede suceder en el hombre, tenemos, asimismo, que aceptar que la complejidad de los sistemas animales es mucho ms elevada que cualquier mtodo in vitro utilizado. Es por sto, que a los sistemas in vitro se les pide una estricta y adecuada validacin (ver Captulo 20 y tambin la Figura 22-7).

D De es sa ar rr ro ollo llo y yC Co on nv va alid lid a ac ci in nd de eu un nN Nu ue ev vo oE En ns sa ay yo o

((B Ba alls lls y yF Fe en ntte em m,, 1 19 99 97 7))
D De essa ar rr ro ollo llo d de ell n nu ue ev vo oe en nssa ay yo o (L (La ab bo or ra ato tor rio io d de eO Or rig ige en n))
O Ob bjjeettiv ivo od deell een nsa say yo o S u n e c e sid a d S u n e c e sid a d S Su ua ap plic lica accii n na all eest stu ud dio io d dee cco om mp pu ueest sto oss q qu um mic ico oss re rele lev va an ntteess R Ra accio ion na all p pa arra a su su in incclu lusi si n n een nu un np prro og grra am ma ad dee cco on nv va allid ida accii n n D isp o n ib ilid a d d e u n p r o t o c o lo e x p e r im e n t a l D isp o n ib ilid a d d e u n p r o t o c o lo e x p e r im e n t a l D Deesa sarrrro oll llo od dee u un nm mo od deelo lo d dee p pre red dic iccci in n.. O Op pttim imiza izaccii n nd deell p prro otto occo olo lo D Deem mo ost strra acci in nd dee lla a ttra ran nsfe sfera rab biilid lida ad d in intteerla rlab bo orra ato tori rio o O Op pttim imiza izaccii n nd deell m mo od deello od dee p pre red dic icccii n n F Fa ase se p pre reli lim min ina arr ((P Prro od du uccto toss d dee cco on nttro roll d dee cca alid lida ad dd dee lo loss p pa art rtic icip ipa an nttees) s) F Fa ase se d dif ifin initiv itiva a ((E Est stu ud diio op prin rinccip ipa al) l) E Eta tap pa ass p pri rin nccip ipa ale les: s:
D oo ss d ss, , rreeccoo le lis Dis isee oo d deel l es estu tud dio io;; sseele lecccci in n, , d dis istr trib ibu ucci in n yy een nssaayy dee los los p prrood du uccto to lecccci in n yy aan naa lisis is d dee lo loss d to ss;; eevvaalu cci iaa d oo yy u d daa to luaacci in nd dee la la eefic ficaa deel l een nssaayy uttilid ilidaad dd deel l m moo deelo lo d dee p prreed dic iccci in n. .

P Pr re e-c -co on nv va ali lid da ac ci in n (E (Esstu tud dio io iin nfo for rm ma all iin nte ter rlla ab bo or ra ato tor rio io))

C Co on nv va ali lid da ac ci in n ((in inc cllu uy ye en nd do ou un ne esstd tdio io a ac cie ieg ga ass))

E Ev va alu lua ac ci in n iin nd de ep pe en nd die ien nte te d de ell e en nssa ay yo o P Pr ro op po ossic ici in nr re eg gu ulla ato tor riia ay y ssu ub bm mis isi in na a la lass A Au uto tor riid da ad de ess..

Figura 22-7. Esquema de todas las etapas y requisitos que contempla el ECVAM para que un nuevo ensayo in vitro pueda ser considerado una alternativa vlida para su posible inclusin en la lista de ensayos regulativos. Ntese la complejidad del proceso y, por tanto, los aos de trabajo necesarios para llegar a disponer de un nuevo mtodo

Hay que tener en cuenta que la validacin es un proceso complejo y variable, que depende de los objetivos buscados. Mientras un laboratorio especfico, que se preocupa principalmente de la seleccin de candidatos, va a interesarse en el mecanismo subyacente al fenmeno txico estudiado, el regulador estudiar la correlacin con los datos in vivo existentes, la transferencia entre laboratorios, y la reproducibilidad del mtodo en laboratorios diferentes. Se comprende fcilmente que un slo ensayo no puede sustituir la complejidad del sistema experimental in vivo, por lo que se sigue la estrategia de intentar validar mtodos que puedan substituir algunos aspectos o etapas de los estudios principales en el animal. As pues, toda aproximacin in vitro a la prediccin de la toxicidad, debe considerar una batera de ensayos diferentes tendientes a cubrir el mximo de respuestas posibles, y permitir la confirmacin transversal de los resultados. Ello es necesario para poder establecer los riesgos pertinentes a un producto determinado y, en su caso, establecer el perfil del mismo. FUTURO PRXIMO O REALIDAD ACTUAL La investigacin en los dominios de la biologa celular y molecular, la bioqumica y la informtica estn revolucionando la investigacin en biologa. Asimismo, la seleccin temprana de las nuevas molculas est dando lugar a un aumento considerable en los datos obtenidos en relacin a las mismas, permitiendo el desarrollo de sistemas de anlisis de estructura-actividad en toxicologa.

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La genmica y la protemica en toxicologa Si bien la toxicologa ha consisitido principalmente en la conduccin de ensayos regulatorios, bien descritos en la legislacin, y cuyos resultados son siempre explicados por evaluaciones anatomopatolgicas, las nuevas tecnologas estn comenzando a entrar en dicha disciplina. Si bien queda mucho por hacer, los toxiclogos de hoy en da comienzan a pensar en expresin de genes, perfiles de expresin, bsqueda de marcadores interesantes, en genmica y en protemica. En pocas palabras, se confa que, algn da, cualquier cambio (fenmeno txico) en respuesta a un xenobitico se podr predecir por la expresin diferencial de genes (genmica) y/o por los perfiles 2D de protenas. El Cuadro 22-9 muestra algunos ejemplos de dichas tecnologas. No existe an una base de datos suficiente como para predecir cul ser la capacidad de estas tecnologas para hacer avanzar a la toxicologa. Probablemente falta todava mucho trabajo por hacer. La toxicologa experimental, si bien es mayoritariamente descriptiva, tiende a intentar explicar las observaciones halladas. Estas nuevas tecnologas, muy sensibles, permiten observar muchos cambios a la vez (en expresin de genes o en las protenas), algunos de ellos de funcin desconocida. As pues, antes de poder sacar todo el provecho a estas tcnicas, se deber avanzar en el conocimiento de las disciplinas bsicas. Otro aspecto muy interesante asociado a estas tcnicas es su elevada sensibilidad y capacidad de respuesta. Estas tcnicas detectan cambios de expresin a nivel de genes o de sus protenas. Pero ello es un fenmeno natural, ya que cualquier cambio ambiental o fisiolgico normal da lugar a un cambio en la expresin de los genes y de sus protenas. Sin duda, se necesita tiempo para crear las bases de datos pertinentes para discernir entre los cambios correspondientes a una respuesta txica y los que estn relacionados con un fenmeno fisiolgico de adaptacin general al medio. No hay que olvidar que muchas de estas tecnologas se aplican sobre sistemas experimentales in vitro, y es bien sabido que estos sistemas experimentales responden muy exageradamente a los cambios ambientales. El impacto de la evaluacin precoz y las predicciones informatizadas La evaluacin precoz de un gran nmero de nuevas molculas, ms o menos congenricas, permite extrapolar correlaciones estructura actividad (SAR, del ingls Structure-Activity Relationships). Como ejemplo, en la Figura 18-8 se muestran unos resultados de mutagnesis obtenidos en el estudio de nueve molculas congenricas de estructuras muy prximas sobre dos cepas de Salmonella typhimurium (TA98 y TA1537), comnmente utilizadas en el test de retromutacin en bacterias o test de Ames. Es evidente, que con el conocimiento actual sobre la gentica de estos sistemas experimentales, estamos en situacin de establecer hiptesis mecanstico-estructurales que permitan hacer sugerencias a los qumicos encargados de la sntesis de nuevos productos. Asimismo, con los avances de la informtica se han desarrollado un buen nmero de sistemas expertos (Cuadro 22-10) que permiten establecer predicciones sobre la toxicidad de los productos an no sintetizados. Estos sistemas se encuentran todava en fases precoces de su desarrollo. Sin embargo, a medida que los industriales incorporen informacin en los mismos, no hay duda de que sern cada vez ms eficaces.

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Sociedad
CHIPS A BASE DE OLIGONUCLETIDOS Affimetrix, Santa Clara, CA, USA. Baylor College of Medicine. Houston, TX, USA. Englehart Institute of Molecular Biology, Mosc, Rusia. Hyseq, Suunyval, CA, USA. Nanogen, San Diego, CA, USA. Protogene Laboratories. Palo Alto, CA, USA. Sequenom, San Diego, CA, USA. BRAX, Cambridge, UK. Gene Trace Systems, Menlo Park, CA, USA. CHIPS A BASE DE CDNA Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK. General Scanning Inc, Watertown, MA, USA. Genetic Microsystems Inc., Woburn, MA, USA. Genomic Instrumentation Services Inc., Menlo Park, CA, USA. Genomic Solutions, Ann Arbor, MI, USA. Telechem International, San Jos, CA, USA. Incyte, Synteni Technology, Palo Alto, CA, USA. P. Brown Lab, Stanford University, CA, USA.

Concepto

Sntesis de alta densidad de oligonucletidos mediante fotolitogra- fa in situ. Sistema basado en la deteccin de mutaciones mediante la extensin de primers en fase slida. Oligonucletidos preparados en array unidos a soportes de acrilamida sobre cristal. Sistema de arrays para HTS que utiliza membranas flexibles. Sistema de hibridacin acelerada gracias a la aplicacin de campos elctricos. Sntesis automatizada en serie de oligonucletidos de 50 mer mediante un sistema pulstil piezoelctrico tipo ink jet. Caracterizacin de DNA hibridizante mediante espectrometra de masas.

Empresas que comercializan sistemas automticos robotizados para la preparacin de arrays, asi como lectores de chips.

Sistema capilar para la preparacin de arrays con hibridacin con sondas a dos colores. Distribucin mediante sistema pulstil piezoelctrico tipo ink jet. Sitio web http//cmgm.stanford.edu/pbrown/mguide/index.htlm para la construccin de robots para la preparacin de arrays, asi como de protocolos experimentales para la preparacin de dichos arrays y las hibridaciones necesarias.

Cuadro 22-9. Las tecnologas de los chips de DNA

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% d e la p o te n c ia m u ta g n ic a s u p e ri o r 120 100 80 60 40 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 TA1537 TA98

C o m p u e s to c o n g e n r ic o (# )

Figura 22-8. Ejemplo de resultados obtenidos con una serie de ocho compuestos congenricos (estructuralmente muy prximos) en el test de Ames. Los resultados muestran una distribucin diferentes de las potencias mutagnicas en las dos cepas mostradas. Este tipo de resultados puede dar lugar a interesantes hiptesis sobre mecanismos de accin en relacin con la estructura de las molculas que pueden ayudar a los qumicos en el diseo de nuevas molculas carentes de ciertas propiedades negativas (mutagnesis en este caso)

Sistema CASE

Estrategia Computer Automated Structure Evaluator Identifica y registra subestructuras molculares que muestran correlaciones con la presencia usencia de fenmenos txicos y ciertos descriptores moleculares (logP, energas orbitales, cargas atmicas) Toxicity Predicted by Komputer Assisted Technology Como CASE pero con ms descriptores (cargas y densidades electrnicas, electronegatividad residual, polaridad efectiva, rasgos topolgicos, descriptores de forma y de subestructuras adicionales).

TOPKAT

COMPACT Computer-Optimized Molecular Analysis of Chemical Toxicology Basado en la determinacin aritmtica de una estructura 3D y, a la vez, en el diseo de una estructura electrnica, que permiten la prediccin computerizada del metabolismo dependiente de los citocromos P450, as como su correlacin con los fenmenos de carcinognesis. DEREK Deductive Estimate of Risk derived from Existing Knowledge Aproximacin cualitativa basada en una serie de reglas derivadas de la investigacin cientfica y de la experiencia

Cuadro 22-10. Algunos de los sistemas expertos hoy disponibles para la prediccin de la toxicidad de los productos qumicos

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RESUMEN Hacia donde va la toxicologia in vitro? En estas pginas hemos hablado de lo que se hace o se puede hacer mediante tcnicas in vitro para seleccionar los mejores candidatos, intentando, al mismo tiempo, excluir aquellos ms nocivos. Simultneamente, las tcnicas in vitro, que en principo son ms mecanicistas y ms sensibles que los ensayos in vivo, permiten avanzar en el estudio de los fenmenos txicos a dosis de tratamiento ms fisiolgicas y menos irracionales que aquellas que an se exigen en los estudios regulatorios. No hay que olvidar, que cualquier modelo experimental, incluido el animal, es un modelo imperfecto (un modelo no es la realidad, es una aproximacin a la realidad) y que, incluso, en los estudios regulatorios in vivo pueden pasar inadvertidos riesgos para la especie humana. Por eso, para intentar corregir dicho inconveniente de los modelos in vivo, se utilizan mrgenes de seguridad muy elevados. Los mtodos alternativos no sern verdaderamente aceptados hasta que la toxicologa no resuelva el problema de las pequeas dosis mediante una revolucin tecnolgica en su campo. A pesar de todo, la incorporacin de los mtodos alternativos en la reglamentacin internacional nunca ser una tarea fcil ni rpida. Tal como un responsable regulador suizo indic en una conferencia en Zurich sobre mtodos alternativos en 1993, las verdaderas alternativas no son otra cosa que revoluciones y las revoluciones no pueden incorporarse en la legislacin vigente hasta el da en que dejan de serlo. BIBLIOGRAFA Balls M y Fentem JH (1992). The use of basal cytotoxicity and target organ tests in hazard identification and risk assessment. ATLA 20, 368-388 (1992). Balls M . Mechanistic approaches and the development of alternative toxicity test methods. Environ. Health Perspect. 106, 453-457 (1998). Blaauboer BJ, Balls M, Barratt M, et al. 13th Meeting of the scientific group on methodologies for the safety evaluation of chemicals (SGOMSEC): Alternative testing methodologies and conceptual issues. Environ. Health Perspect. 106, 413-418 (1998). Blaauboer BJ, Barratt M y Houston JB. The integrated use of alternative methods in toxicological risk evaluation. ECVAM integrated testing strategies task force report 1. ATLA 27, 229-237 (1999). Brown NA, Spielmann H, Bechter R, et al. Screening of chemicals for reproductive toxicity : the current alternatives. The report and recommendations of an ECVAM/ETS workshop (ECVAM workshop 12). ATLA 23, 868-882 (1995). Coecke S, Rogiers V, Bayliss M, Castell J, et al. The use of long-term hepatocyte cultures for detecting induction of drug metabolising enzymes: The current status. ATLA, 27, 579-638 (1999). Combes R, Balls M, Curren R, et al. Cell transformation assays as predictors of human carcinogenicity. The report and recommendations of ECVAM workshop 39. ATLA 27, 745-767 (1999). Cooke BA. In vitro models for the investigation of reproductive toxicology in the testis. Adv. Exp. Med. Biol. 444, 95-102 (1998). Dean, JH. Issues with introducing new immunotoxicology methods into the safety assessment of pharmaceuticals. Toxicology 119, 95-101 (1997). Ekins S. Past, present, and future applications of precision-cut liver slices for in vitro xenobiotic metabolism. Drug Metabol. Rev. 28, 591-623 (1996). Ekwall B, Clemedson C, Ekwall B, et al. EDIT: A new international multicentre programme to develop and evaluate batteries of in vitro tests for acute and chronic systemic toxicity. ATLA 27, 339-349 (1999). Fubini B, Aust AE, Bolton RE, et al Non-animal tests for evaluating the toxicity of solid xenobiotics. ATLA 26, 579-617 (1998).

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