Actualidad y proyecciones de la inmunohematologa en Chile

T.M. MgCs. Andrs Aburto Almonacid Departamento Laboratorio Biomdico Seccin de Hematologa y Banco de Sangre Laboratorio Nacional y de Referencia de Inmunohematologa

Situacin actual
Provisin de sangre segura y compatible

Tipificar tanto donantes como pacientes

Desigualdad en el desarrollo de la inmunohematologa (crossmatch electrnico) Sistema de gestin de calidad establecido (CS, UMT, BS, LC) Importancia de Reactivos y Controles de Calidad para cada prueba No existe regulacin para el ingreso de reactivos en Chile Validacin y control de calidad de reactivos antes de su uso Control de Calidad de los procedimientos.

Desarrollo PEEC Inmunohematologa

ABO Clasificacin de Grupo Sanguneo ABO/RhD AC Deteccin e Identificacin de Anticuerpos Irregulares PC Pruebas Cruzadas

2007

2008

2009

2010

2011

Piloto ABO/AC
Sistema tradicional

ABO/AC

ABO/AC Piloto PC

ABO/AC/ PC

ABO/AC/ PC

Sistema tradicional

Sistema PDF

Sistema PDF

Portal PEEC

Principales pruebas inmunohematolgicas

Clasificacin ABO y RhD Test Antiglobulina Directa Deteccin de Anticuerpos Irregulares Identificacin de Anticuerpos Irregulares

Pruebas Cruzadas
Titulacin de Anticuerpos Investigacin de posible destruccin inmune de glbulos rojos (RHT, EHRN, AHAI) Fenotipificacin de Antgenos Eritrocitarios

Tcnicas utilizadas en Clasificacin ABO/RhD

Figura 1. Tcnicas usadas por los usuarios para la Clasificacin ABO/RhD PEEC IH 0611
Microplaca 5% Gel 26% Lmina 7%

Tubo Gel Microplaca Lmina

Tubo 62%

164 laboratorios responden la evaluacin

Figura 2. Porcentaje de concordancia en la Clasificacin ABO para el ensayo IH 0611 87,8 88 87 86 85 84 83 IH 0611-1 O IH 0611-2 A IH 0611-3 A Total (n=164) 84,8 87,2 86

Tabla 6. Porcentaje de concordancia de tcnicas usadas por los usuarios en la Clasificacin ABO para el ensayo IH 0611.

ABO Lmina Tubo Gel Microplaca

Total

IH 0611-1 45,5 87,3 100,0 87,5

87,8

IH 0611-2 45,5 86,3 100,0 87,5

87,2

IH 0611-3 18,2 86,3 97,7 87,5

84,8

Total

18,2 85,3 97,7 87,5 86,0

Figura 3. Porcentaje de concordancia en la Clasificacin RhD para el ensayo IH 0611 100 99,4 99,4

Tabla 7. Porcentaje de concordancia de tcnicas usadas por los usuarios en la Clasificacin RhD para el ensayo IH 0611.

100 99 98 97 96 95
IH 0611-1 +

98,8

RhD Lmina Tubo Gel Microplaca

Total

IH 0611-1 100,0 100,0 100,0 100,0

100,0

IH 0611-2 100,0 100,0 97,7 100,0

99,4

IH 0611-3 100,0 100,0 97,7 100,0

99,4

Total

IH 0611-2 (-)

IH 0611-3 +

Total (n=164)

100,0 100,0 95,3 100,0 98,8

Figura 4. Porcentaje de concordancia en la Clasificacin ABO/RhD para el ensayo IH 0611 87,8 88 87 86 85 84 83 82 86,6 84,8 84,1

Tabla 8. Porcentaje de concordancia de tcnicas usadas por los usuarios en la Clasificacin ABO/RhD para el ensayo IH 0611.

ABO/RhD Lmina Tubo Gel Microplaca

Total

IH 0611-1 45,5 87,3 100,0 87,5

87,8

IH 0611-2 45,5 86,3 97,7 87,5

86,6

IH 0611-3 18,2 86,3 95,3 87,5

84,1

Total

IH 0611-1 IH 0611-2 IH 0611-3 O+ A(-) A+

Total (n=164)

18,2 85,3 93,0 87,5 84,8

Causas de insatisfactoriedad en la Clasificacin ABO/RhD

Figura 5. Motivos de No concordancia en la Clasificacin ABO/RhD Interpretacin 20%

25 laboratorios insatisfactorios (n=164)

Contraprueba 80% Figura 6. Porcentaje de error en la Clasificacin ABO/RhD asociada a las tcnicas utilizadas por los usuarios Microplaca 12,5% Gel 4,7%

Tubo 13,7%

Lmina 72,7%

Tcnica en lmina
De las tcnicas para clasificacin ABO/RhD, es la menos sensible. Slo involucra la parte globular de la clasificacin ABO. No permite detectar discrepancias en la clasificacin ABO. No permite detectar variantes del antgeno D. Por lo tanto: - se puede utilizar slo para reclasificar - Un T.M. no puede generar y cobrar esta

prestacin.

- Un paciente no debiera pagar su clasificacin de grupo por est tcnica.

Reactivos utilizados en la clasificacin globular del sistema ABO

Figura 7. Reactivos anti-A utilizados por los participantes del PEEC IH 0611
Alba Bioscience Bioclone BiosChile Bio-type DG Gel ABO/Rh

Figura 8. Reactivos anti-B utilizados por los participantes del PEEC IH 0611
Alba Bioscience Bioclone

BiosChile
Bio-type DG Gel ABO/Rh

BiosChile 14,6% Scot Health Centre 35,4% Bio-type 6,7%

DG Gel ABO/Rh (2D) Diaclon (Suero clasificador) Human ID-System (Diamed) immuClone Lorne Laboratories

BiosChile 14,6% Scot Health Centre 34,8% Bio-type 6,7%

DG Gel ABO/Rh (2D) Diaclon (Suero clasificador) Human ID-System (Diamed) immuClone

Novaclone 12,2%

DG Gel ABO/Rh (2D) 17,1%

Novaclone
ORTHO Biovue System Reaclon Scot Health Centre Seraclone Slide Test Monoclonal Valtek

Novaclone 12,2%

Lorne Laboratories Novaclone DG Gel ABO/Rh (2D) ORTHO Biovue System 16,5% Reaclon Scot Health Centre Seraclone Slide Test Monoclonal Valtek

Reactivos utilizados en la clasificacin srica del sistema ABO

Figura 9. Reactivos testigos A utilizados por los participantes del PEEC IH 0611

Figura 10. Reactivos testigos B utilizados por los participantes del PEEC IH 0611

Serigrup Diana 14,6%

Affirmagen

Serigrup Diana 14,6%

Affirmagen Biotype Diacell

Referencells 8,5% No utiliza 11,6%

Fabricacin Propia 61,6%

Fabricacin Propia No utiliza

Referencells 8,5% No utiliza 11,6%

Biotype Diacell

Fabricacin Propia 61,6%

Fabricacin Propia

No utiliza
Referencells Serigrup Serigrup Diana

Referencells
Serigrup Serigrup Diana

Existen procedimientos para la fabricacin de los testigos A y B?

Control y validacin de lote de reactivos

1. Controlar en la recepcin: condiciones de embalaje, temperatura y caducidad. 2. Validacin antes que estn disponibles para su uso: a) Chequear la conformidad con los criterios utilizados al licitar. b) Examinar un nmero de frascos al azar, para asegurar: - que el volumen es correcto - que la etiqueta es clara - que el inserto del envase es el correcto c) Evaluar aspecto, especificidad, potencia y avidez.

Sueros clasificadores anti-A, anti-B y anti-AB

Especificidad: reacciones positivas y negativas claras N de muestras y GR a usar: GR A B anti-A 2 2 anti-B 2 2 anti-AB 2 2

AB O

2 2

2 2

2 2

Sueros clasificadores anti-A, anti-B y anti-AB

Potencia: el lmite de deteccin de reacciones especficas (sensibilidad)
N de muestras y ttulos mnimos aceptables: GR A B AB 2 (64) anti-A 2 (128) 1 (128) 3 (64) anti-B anti-AB 2 (128) 2 (128) 2 (64)

El reactivo sin diluir debe dar una aglutinacin de 4+

Sueros clasificadores anti-A, anti-B y anti-AB

Avidez: dar reacciones observables en un tiempo dado
Para reactivos destinados a uso en lmina con sangre total

N de muestras y GR a usar:
GR A B AB 3 anti-A 1 1 3 anti-B anti-AB 2 2

Para todos los sueros, la aglutinacin debe ser al menos de 3+ dentro de 1 minuto despus de mezclar

Franco E. Rev Panam Salud Publica/Pan Am J Public Health 13(2/3), 2003.

Franco E. Rev Panam Salud Publica/Pan Am J Public Health 13(2/3), 2003.

Reactivos utilizados en la clasificacin del sistema Rh (Antgeno D)

Figura 11. Reactivos Anti-D utilizados por los participantes del PEEC IH 0611
Alba Bioscience Bioclone BiosChile Bio-type

Figura 12. Reactivos Control D utilizados por los participantes del PEEC IH 0611 DG Gel ABO/Rh (2D) 8,5%
Alba Bioscience

BiosChile 14,0% Scot Health Centre 35,4% Bio-type 6,7%

Cromatest DG Gel ABO/Rh

DG Gel ABO/Rh (2D)

Diaclon (Suero clasificador) Gammaclone ID-System (Diamed) ImmuClone

Fabricacin propia 9,1% No utiliza 72,6% Immucor 4,3%

DG Gel ABO/Rh (2D) DG Gel Anti-D DG Gel Control Fabricacin Propia ID-System (Diamed) Immucor

Novaclone 12,8%

DG Gel ABO/Rh (2D) 17,1%

Lorne Laboratories Novaclone

No utiliza Rh-Hr Control

ORTHO Biovue System

Reaclon Scot Health Centre Seraclone Slide Test Monoclonal Valtek

Sueros clasificadores anti-D y otras especificidades

Especificidad: reacciones positivas y negativas claras
N de muestras y GR a usar:

Anti D
GR D+ GRDGR heterocigotos para antgeno en estudio GR sin el Ag en estudio 2 4

Anti C, E ..

Sueros clasificadores anti-D y otras especificidades

Potencia: el lmite de deteccin de reacciones especficas (sensibilidad)
N de muestras y ttulos mnimos aceptables: Anti D GR D+ GR heterocigotos para antgeno en estudio 4 (32) 4 (>4) Anti C, E ..

Los reactivos sin diluir deben dar al menos una aglutinacin de 3+

Sueros clasificadores anti-D

Avidez: dar reacciones observables en un tiempo dado
Para reactivos destinados a uso en lmina con sangre total N de muestras y GR a usar: Anti D GR D+ 2

Para todos los sueros, la aglutinacin debe ser al menos de 3+ dentro de 1 minuto despus de mezclar

Franco E. Rev Panam Salud Publica/Pan Am J Public Health 13(2/3), 2003.

Controlar la tipificacin del antgeno D

Control de tcnica - Control Positivo (idealmente clulas R1r) - Control Negativo (clulas rr) Debe realizarse en cada corrida de exmenes

Control de reactivo - Control Rh, control D, control del diluyente - Utilizar 2 anti-D de diferente marca y clones

Variantes del antgeno D

D dbil
Variante del antgeno D cuantitativa. Todos los eptopes de D se encuentran dbilmente expresados. Usualmente, no estn asociados a produccin de anti-D. Mutaciones RHD codifican sustituciones aminoacdicas en la regin membranocitoplasmtica de RhD. Tipos usualmente no pueden ser distinguidos serolgicamente. Alrededor de 70 alelos identificados a la fecha. D dbil tipo 1, 2 y 3 son los ms comunes en la poblacin caucsica.

Principales mutaciones D dbil en caucsicos

D parcial
Variante del antgeno D cualitativa. Eptopes de D se encuentran ausentes. Estn asociados a produccin de anti-D contra eptopes ausentes. Mutaciones RHD codifican sustituciones aminoacdicas en la regin externa de RhD. Variantes serolgicamente divididos en categoras DII a DVII. Ms de 65 alelos identificados a la fecha. Algunos nombres compuestos de letras, DAR, DNU, etc.

Mutaciones D parcial

Implicancias transfusionales
Donante D+ Receptor D+ D(-) D dbil S No S D(-) S S S S D dbil S No S No D parcial S No S No

D parcial No

El El El El

receptor D dbil debe tratarse como D+ receptor D parcial debe tratarse como D(-) donante D dbil debe tratarse como D+ donante D parcial debe tratarse como D+

Es critico el estudio para variantes D en donantes Nuestras tcnicas son lo suficientemente confiables para estos fines? Algunos D dbil producen anti-D

Franco E. Rev Panam Salud Publica/Pan Am J Public Health 13(2/3), 2003.

 Debe elegirse un anti-D monoclonal de buena calidad. No se requiere test Du si el laboratorio utiliza de rutina dos reactivos anti-D de diferente origen y que cubren al menos el DVI. No se requiere estudio especial de D parcial (variantes D). Si existe alguna duda en la tipificacin D, es ms seguro sealar al donante como D positivo y al paciente como D negativo. De esa manera los GR del donante slo se administrarn a personas D positivas y no estimularn la produccin de anti-D, y el paciente recibir sangre D negativo.
Orientaciones para Centros de Sangre y UMT

Mtodos utilizados en Deteccin de Anticuerpos Irregulares

Figura 13. Mtodos utilizados en la deteccin de anticuerpos irregulares
PAI LISS 12,2%
PAI salino 6,7%

Gel PAI LISS

Aglutinacin en columna 81,1%

PAI Salino

Mtodo Aglutinacin en columna

Cantidad 73

% 81,1

PAI LISS
PAI salino Total

11
6 90

12,2
6,7 100

90 laboratorios responden la evaluacin

Soportes y clulas utilizadas en Deteccin de Anticuerpos Irregulares

Figura 14. Soportes utilizados en la deteccin de anticuerpos irregulares ORTHO Bio-type Biovue Coombs System 1,1% 24,4% ID-System Tubo (Diamed) 16,7% 2,2% Figura 15. Clulas utilizadas en la deteccin de anticuerpos irregulares

Biotestcell P1, P2 Diacell I y II

DG Gel Coombs 55,6%

Serascan Diana 2 53,3%

Panoscreen I y II 37,8%

Mini Screen 2 Panoscreen I y II Selectogen Serascan Diana 2

Soporte Bio-type Coombs

Cantidad 22

% 24,4

Clulas Biotestcell P1, P2 Diacell I y II Mini Screen 2 Panoscreen I y II Selectogen Serascan Diana 2 Total

Cantidad 2 3 2 34 1 48 90

% 2,2 3,3 2,2 37,8 1,1 53,3 100,0

DG Gel Coombs
ID-System (Diamed) Tubo ORTHO Biovue System Total

50
2 15

55,6
2,2 16,7

1
90

1,1
100

Satisfactoriedad de la Deteccin de Anticuerpos Irregulares

Figura 16. Porcentaje de concordancia en la deteccin de anticuerpos irregulares para el ensayo IH 0611 98,9 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 IH 0611-1 Negativo IH 0611-2 Negativo 98,9 98,9

47,8

IH 0611-3 Positivo

Total (n=90)

Tabla 14. Porcentaje de Concordancia de Tcnicas usadas por los usuarios en la Deteccin de Anticuerpos Irregulares para el ensayo IH 0611.

Deteccin Aglutinacin en columna PAI LISS PAI salino

Total

IH 0611-1 98,6 100,0 100,0

98,9

IH 0611-2 98,6 100,0 100,0

98,9

IH 0611-3 54,8 9,1 33,3

47,8

Total

98,6 100,0 100,0 98,9

Controles para Deteccin, Identificacin de Anticuerpos y Pruebas Cruzadas Positivo Suero con un anticuerpo dbil. Ej. suero Anti-D dbil frente a clulas R1r (RhD positivo).

Negativo

Suero con anticuerpos negativo Ej. suero AB inerte.

Agregar a los TAI negativos los GR recubiertos con IgG Se debe usar un suero de paciente o donante y NO antisuero comercial

Satisfactoriedad de la Identificacin de Anticuerpos Irregulares

Figura 17. N de laboratorios adscritos al subprograma deteccin e identificacin de anticuerpos irregulares

90 100 80 60 40 20 0 25

Deteccin

Identificacin

Figura 20. Porcentaje de concordancia para el material de control IH 0611-3

80 60 40 20 0 IH 0611-3 Anti-Jkb 76

Soportes y clulas utilizadas en Identificacin de Anticuerpos Irregulares

Figura 18. Soporte utilizado en la identificacin de anticuerpos irregulares Tubo Bio-type 4,0% Coombs 4,0%

DG Gel Coombs 92,0% Figura 19. Clulas utilizadas en la identificacin de anticuerpos irregulares Resolve Panocell 4,0% 4,0%

Identisera 4,0%

Identisera Diana 88,0%

Control para la Identificacin de Anticuerpos

Como no hay un control para asegurar la actividad de todos los antgenos presentes en el panel de identificacin se debe: Usar en paralelo un anticuerpo dbil de especificidad conocida, para probar todas las clulas del panel durante su perodo de conservacin.

Mtodos utilizados en Pruebas Cruzadas

Total 93 171 % 54,4 100

Participantes Total Adscritos IH

Figura 21. Mtodo utilizado por los laboratorios en las pruebas cruzadas

PAI salino 6,5%

PAI LISS 20,4%

Centrifugacin inmediata 1,1%

Gel

PAI LISS
Aglutinacin en columna 72,0%

PAI Salino Centrifugacin inmediata

Satisfactoriedad de la Pruebas Cruzadas

Figura 22. Porcentaje de concordancia de las pruebas cruzadas para el envo IH 0611 97,8 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 83,9 66,7

92,5

0
IH 0611-1 Compatible IH 0611-2 Compatible IH 0611-3 Incompatible Total (n=93)

IH IH IH IH

0611-1 0611-2 0611-3 0611-4

PACIENTE: NIO DE 5 AOS, ANEMIA DREPANOCTICA PACIENTE: HOMBRE DE 77 AOS, INFARTO AGUDO AL MIOCARDIO PACIENTE: MUJER DE 25 AOS, ANEMIA POR DFICIT DE HIERRO UNIDAD DE GLOBULOS ROJOS DISPONIBLE PARA PRUEBAS CRUZADAS

O+ A(-) A+ anti-Jkb O+

Tabla 15. Informe regional para los participantes del ejercicio PEEC IH 0611 distribuido el 14 de junio de 2011.

Regin I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII RM XIV XV TOTAL

Nombre Regin Tarapac Antofagasta Atacama Coquimbo Valparaso O'Higgins Maule Biobo Araucana Los Lagos Aysn Magallanes Metropolitana Los Ros Arica y Parinacota

Adscritos 3 14 6 6 20 10 13 20 6 5 4 4 54 3 3 171

% 1,8 8,2 3,5 3,5 11,7 5,8 7,6 11,7 3,5 2,9 2,3 2,3 31,6 1,8 1,8 100,0

Responde 3 13 6 5 18 9 13 20 6 5 4 4 53 3 3 165

% 1,8 7,9 3,6 3,0 10,9 5,5 7,9 12,1 3,6 3,0 2,4 2,4 32,1 1,8 1,8 100,0

No Responde 0 1 0 1 2 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 6

% 0,0 16,7 0,0 16,7 33,3 16,7 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 16,7 0,0 0,0 100,0

Distribucin de errores en Servicios de Sangre y Laboratorios Clnicos para la evaluacin PEEC IH 0611

Servicios de Sangre Participantes ABO RhD Deteccin Identificacin 93 93 83 25 Errores 5 1 40 6 % 5,4 1,1 48,2 24,0

Laboratorios Clnicos Participantes 75 75 12 0 Errores 21 1 7 % 28,0 1,3 58,3 -

PC

87

28

32,2

10

80,0

ABO
5 Errores
5 Procedimiento
3 Testigos 2 Discrepancia

ABO
21 Errores
21 Procedimiento
17 Testigos 4 Discrepancia

3 Interpretacin

Validacin de Reactivos Comerciales de Inmunohematologa

Certificar: Sueros clasificadores: - anti-A - anti-B - anti-AB - anti-D Suero Antiglobulina Humana Evaluar: Especificidad Sensibilidad Actividad Anti-Complemento Potencia

Comparacin PEEC Internacionales

CAP (USA)
N Envos/ao N Muestras Niveles Clasificacin ABO/RhD Deteccin e Identificacin de Anticuerpos Irregulares Pruebas Cruzadas Prueba Antiglobulina Directa Fenotipificacin de antgenos eritrocitarios 2-3 5 de GR y 5 de suero 9 S S

UKNEQAS (Inglaterra)
4-6 3 pacientes y 3 donantes 2 S S

FBA (Argentina)
2

BEQAPI (Brazil)
4 2 de GR y 2 de suero

SETS (Espaa)
3 2 pacientes y 2 donantes 2 S S

CECI (Mxico)
4 1 paciente y 1 donante 3 S S

ISP (Chile)
3 3 pacientes y 1 donante 1 S S

1 S No

1 S S

S S

S S

No No

S S

S S

S S

S No

No

No

Kits Moleculares para Inmunohematologa

Product ABO-TYPE Description for ABO blood group typing (8 PCR mixes) Unit Size 10 tests REF 6640

ABO-TYPE variant for ABO blood group typing including rare A and B variants (16 PCR mixes)

10 tests

6641

RH-TYPE

for RHD/RHCE typing (C, Cw, c, D, DEL, E, e) (13 PCR mixes) for typing rare RHD variants (partial D) (15 PCR mixes)

10 tests

6645

Partial D-TYPE

10 Tests

6646

Weak D-TYPE

for typing weak 10 tests D types 1, 2, 3, 4.0/4.1, 4.2, 5, 11, 15, 17 (8 PCR mixes) for typing RHD zygosity (DD,Dd,dd) (2 PCR mixes) 10 tests

6647

D Zygosity-TYPE

6648

Proyecciones Laboratorio Nacional y de Referencia Inmunohematologa

Uniformar criterios y establecer procedimientos nacionales para clasificacin ABO/RhD, deteccin e identificacin de anticuerpos irregulares y pruebas cruzadas. Identificar variantes D dbiles y parciales prevalentes en Chile. Validar uso ABO/RhD. de reactivos comerciales para la clasificacin

Eliminar el uso de la tcnica en lmina para el informe formal de clasificacin ABO/RhD.

Implementar las evaluaciones PEEC de Prueba de Antiglobulina Directa y Fenotipificacin de Antgenos Eritrocitarios.

No enve las muestras de este ejercicio o comente los resultados con otro Laboratorio

Gracias