SIMPOSIO INTERNACIONAL DE SANIDAD VEGETAL MANEJO INTEGRADO DE VIROSIS Y FITOPLASMOSIS EN CULTIVOS DEL PER

MANEJO INTEGRADO DE VIRUS FITOPATOGENOS

Dr. Javier Romero Cano Departamento de Proteccin Vegetal INIA Madrid, Espaa

Huancayo, Per 21-22 septiembre de 2012

Control
1) Semillas sanas en un medioambiente sano. Cuarentena, inspeccin y certificacin Mtodos de identificacin de material libre de virus 2) Practicas culturales limitando la actividad o eficiencia de los vectores. 3) Plantas resistentes a las infecciones virales. Proteccin cruzada Seleccin de variedades resistentes

Plantas y semillas libres de virus

El origen de una epidemia viral puede estar en la plantacin, especialmente para plantas que se multiplican vegetativamente

Planta infectada

Yemas

Rizomas

Tubrculos

Bulbos

Patrones

Descendencia infectada

Propagacin por semillas botnica

Slo algunos virus se transmiten por semilla botnica se evita as el inoculo primario y la diseminacin internacional en este mundo globalizado. Es esencial para el agricultor disponer de plantas libres de virus

Seleccin Sanitaria
obtener plantas libres de virus Multiplicar en condiciones que no permitan las contaminaciones,

para obtener lotes de semillas (botnica y vegetativa) con la tasa de contaminacin controlada.

Plantas libres de virus de multiplicacin vegetativa

ELECCIN DE LA PLANTA MADRE

En el campo o en una coleccin varietal. En el laboratorio a partir de una planta infectada: o Termoterapia oCultivo de meristemos o Multiplicacin rpida (cultivo de tejidos)

TERMOTERAPIA
Kassanis (1949), obtiene papas sanas de PLRV tratndolas con aire caliente: 20 das a 36 C. El objetivo del mtodo es obtener temperaturas letales para los virus, pero que no lo sean para las plantas. < 40 C. ( Desestabilizacin de las partculas virales o inactivacin de la replicasa viral).

REGLAS GENERALES
-35 40 C con aire caliente. 1 semana a varios meses - 35 50 1C bao de agua caliente. 5 minutos a varias horas El tratamiento puede variar en la misma especie segn el virus. En papa PVY fcil. PVS y PVX difcil Ha sido usado en rosas, frutas, fresas, arbustos ornamentales etc.

CULTIVO DE MERISTEMOS
Morel y Martin (1952), aslan y cultivan in vitro meristemos de dalias y papas obteniendo plantas libres del virus del mosaico de la dalia (caulimovirus) y limpiaron la coleccin francesa de variedades de papa de PVY (potyvirus). Posteriormente se ha trabajado para limpiar de virus plantas de claveles, geranios, ajo, papa, fresa, manzana, ciruelo, vid, etc. O tropicales: orqudeas, yuca, camote, caa de azcar, pia, pltano, etc.

Termoterapia + cultivo in vitro para virus difciles. Quimioterapia (ribavirina [Virazole] 10 a 100 mg/l. + cultivo in vitro para rboles frutales, orqudeas y bulbos. Microinjerto para ctricos, vid, gneros Prunus y Malus.

Hay que controlar bien la sanidad de este material regenerado, utilizando todos los mtodos de deteccin de virus + injerto en verde para vid y fresa.

PRDIDAS DE RBOLES SOBRE PATRN NARANJO AMARGO CAUSADAS POR CTV

Espaa: > 40 x 106 en 45 aos Argentina: 18 x 106 en 15 aos Brasil: 10 x 106 en 12 aos Venezuela: 4 x 106 en 6 aos Florida: 5 x 106 en 50 aos California: 4 x 106 en 50 aos Israel: 3 x 104 en 30 aos Italia: 45 x 104 infectados Cuba: 25 x 104 infectados Chipre 3 x 103 infectados

TOTAL :

> 85 x 106 rboles muertos

El microinjerto ha permitido el remplazo total de los ctricos en Espaa y ahora solo se siembra plantas sobre patrones resistentes y libres de virus.

Preseleccin en el viedo Seleccin (Elisa) Estudio sanitario Estudio pomolgico Clon infectado Microinjerto Termoterapia Clon no infectado Conservatorio Pre-multiplicacin Controles peridicos Elisa Multiplicacin Viedo

Seleccin sanitaria de la vid

Los riesgos de la transmisin por semilla

Mas de 100 virus se transmiten por semillas, pero los importante econmicamente no son mas de 40. Problemas en el comercio internacional

Control de semillas
Cantidad a analizar USA semillas de lechuga con LMV: 30,000 granos en 60 grupos de 500 granos. Cada grupo es sometido a anlisis con Elisa. Desinfeccin de granos contaminados con tobamovirus. El virus no esta en los embriones sino en los tegumentos. Necesita desinfeccin 24 h en una solucin 0.2% de HCL y 3g/l de pectinasa. Secar los granos 24 h con calor seco a 80 C . Analizar el poder germinativo.

Niveles de tolerancia
Soja infectada con SMV
1 % de infeccin si la poblacin de pulgones es baja 0.01 % con poblaciones de pulgones alta.

Lechuga infectada con LMV

0.5 % puede ocasionar la prdida total de la cosecha con poblacin de pulgones alta. 0.1 % daran prdidas significativas. En California es aceptable 0.02 % de 30,000 semillas analizadas. Los recursos genticos deben de estar exentos de virus. La transmisin por semilla abre el riesgo de contaminar los recursos genticos durante el intercambio de material. Limpieza de los bancos de genes, cultivo in vitro etc.

EPIDEMIAS
PLANTAS

VIRUS

VECTORES

Para controlarlas se puede actuar directamente sobre el virus: - Reducir las fuentes de virus - Reducir la eficacia de su diseminacin por los vectores Esto solo es posible si se conoce muy bien: - Gama de huspedes del virus - Tipo de relacin-virus-vector - Dinmica de las poblaciones de los vectores

MEDIDAS MEDIDAS PREVENTIVAS PREVENTIVAS

RESISTENCIAS NATURALES

MANEJO INTEGRADO DE VIRUS

OTRAS MEDIDAS

RESISTENCIAS DERIVADAS DE SILENCIAMIENTO PATGENO GNICO

Medidas encaminadas a eliminar focos de contaminacin as como evitar las dispersin viral
1. 2. 3. 4. Deteccin viral. Eliminacin de las fuentes de virus Tratamientos contra vectores virales. Desinfeccin de las herramientas etc.

ELIMINACIN DE LAS FUENTES DE VIRUS Eliminar las malas hierbas (Conocido desde el comienzo de
la virologa vegetal)

Se pueden intercalar los cultivos, sin siembra algunas veces. Variando las fechas de siembra.

Problemas
No se puede eliminar todas las malas hierbas. Ej. Del vecino, de pequeos huertos familiares etc. La utilizacin intensiva de herbicidas, pueden cambiar las poblaciones de malas hierbas (vectores y virus). BIODIVERSIDAD

Erradicacin
Eliminacin de las plantas infectadas. Esta prctica todava se emplea en los campos de produccin de semillas de multiplicacin vegetativa (patatas, bulbos) o en cultivos de frutales, cuando se quiere evitar la introduccin de un determinado patgeno. Sharka en Suiza. CTV en Israel y California.

Perturbar la eficacia de vectores

tratamientos fitosanitarios contra vectores areos. Virus no persistentes eficacia nula. virus persistentes eficaces. uso de aceites minerales (en el caso de virus no persistentes
interfieren en la liberacin de los virus por los pulgones) tratamientos fitopsanitarios contra vectores telricos : hongos, nematodos. Bromuro de metilo, Nematicidas

Desinfeccin de las herramientas de cultivo

Especialmente para luchar contra los virus que se trasmiten mecnicamente. Podas escardas, eliminacin de ramas, injertos etc. Se pueden desinfectar con una solucin al 3 % de fosfato trisdico

Uso de plsticos
Se usan para evitar la presencia de vectores. Algunos plsticos al no dejar pasar la luz UV interfieren en el comportamiento de los insectos.

Virosis en clavel
1 A B C D E F G H I J K L 2 3 4 5 6 7 8 9

J. Sanchez Navarro, IBMCP Valencia

10 11 12 13 14 15 16

Jabn (%) 0,1 CarMV CERV CLV CVMV CRSV CIRV + + + + + + 0,5 + + + + + + 1 + + + + + +

Leja (%) 3 + + + 5 + + 7 -

Na 2 + + + + +

PO

NaOH (%) 0,1 + + + + + 0,5 1

Dimanin (%) 0,1 + + + + + + 0,5 + + +

Etanol (%) 25 + + + + + + 50 + + + +

Etanol flameado 1 100 ml -

(%) 5 + + + + + 10 + + + +

NUEVA SOLUCIN DE LIMPIEZA: NaOH 0,5%

30 25

Anlisis Hibridacin Molecular

% de infeccin

20 15 10 5 0 1993 1995 may-96 1997

CarMV CERV

Limpieza con NaOH

30.000 muestras/ao

Virus de la sharka, PPV

Campaa deteccin y erradicacin: 400.000 albaricoqueros y 300.000 ciruelos arrancados en Valencia y Murcia desde 1992.

MEDIDAS PREVENTIVAS

PROTECCIN CRUZADA

RESISTENCIAS NATURALES

MANEJO INTEGRADO DE VIRUS

OTRAS MEDIDAS

RESISTENCIAS DERIVADAS DE SILENCIAMIENTO PATGENO GNICO

PROTECCIN CRUZADA
- El fenmeno de proteccin cruzada fue descrito por McKinney en

1929 en TMV. Quien observ que plantas de tabaco infectadas por una raza green de TMV fueron protegidas de infecciones por otras razas que inducen mosaicos amarillos. - El mtodo se basa en el aislamiento de razas de virus o viroides que inducen sntomas leves en las plantas. - Variantes naturales que muestran sntomas en el campo: CTV o ZYMV. Mutantes inducidos por tratamiento con cido nitroso : TMV o PRSV

Caractersticas de las razas a utilizar en proteccin cruzada

Deben provocar solo sntomas leves y no afectar significa
mente el rendimiento del cultivo a proteger. Debe de ser genticamente estable. No evolucionar a una forma severa. Debe tener un amplio espectro de proteccin y ser eficaz con la mayora posible de razas. Debe de ser fcil de multiplicar, conservar e inocular. Es preferible que no se transmita eficazmente por vectores para evitar todo diseminacin no intencionada.

Limites de la proteccin cruzada

Como todo mtodo de lucha biolgica, puede presentar riesgos. Sinergia con otros virus Sntomas graves en plantas adultas Su especificidad. La proteccin ser mas rpida y eficaz si las dos razas son genticamente cercanas. PRSV una cepa de Hawi protege bien las razas severas de Hawi, moderadamente las de Taiwn y no protege a las de Tailandia.

Mecanismo de la proteccin cruzada

La CP de la raza dbil encapsidara el RNA de la raza severa. El RNA de la raza dbil hibridar con el RNA de la raza severa. la raza dbil impedira el movimiento en la planta de la raza severa. La raza dbil utilizara los factores celulares o los sitios necesarios para la replicacin de la raza severa. Es posible que uno o varios de estos mecanismos propuestos acten simultneamente para impedir la infeccin.

Ejemplos utilizados comercialmente

ToMV Tomate

La raza de ToMV MII 16 obtenida por muta gnesis por cido nitroso y clonado mediante lesiones locales ha sido utilizada 19701985 en diversos pases de Europa, Canad, Japn y Nueva Zelandia. En Francia 13 millones de plantas se inocularon cada ao.

ZYMV

Cucurbitaceas

La raza dbil ZYMV WK es una variante natural de una raza no transmisible por pulgones. Casi no afecta el rendimiento y confiere una proteccin a la mayora de razas del ZYMV. Es usada con mucho xito en muchas regiones del mundo (Europa, Israel, Taiwn, Tonga etc.

PRSV

Papaya

La raza dbil ha sido obtenida por mutagenesis aleatoria con cido nitroso, seguida de un clonaje por lesiones locales. En el campo fue un xito con las razas de Hawi pero no con razas de Taiwn o Tailandia.

CTV

Ctricos

En este sistema es necesario aislar una raza dbil para cada combinacin porta injerto/variedad. En Brasil se han aislado muchas razas naturales y actualmente todas los ctricos de Brasil estn pre-inmunizados, lo que ha permitido salvar millones de rboles. Otros ensayos prometedores se han realizado en USA y Sudfrica.

Viroides RNAs satlites (CMV)

Virus de la tristeza de los ctricos

Fotografia Dr. J. Bov/INRA. CSD- So Paulo-Brasil, 2003. Romn et al., 2004. Plant Dis. 88, 453

467

TSWV

Tospovirus

 Begomovirus spp., Crinivirus spp., TICV y ToCV estn en la lista de alerta

de la EPPO PepMV cuarentena en semillas TYLCV cuarentena en USA. Control de mosca blanca i) insecticidas eficientes, ii) invernaderos antiinsectos, iii) variedades resistentes. Tomate con resistencia a TYLCV, ToIV y ToMarV existen comercialmente, pero cultivares con resistencia a crinivirus spp. No estn todava disponibles. TSWV el gen de resistencia SW5 es ampliamente usado, pero el problema reside en razas que vencen la resistencia y nuevas especies que estn apareciendo. Para el PepMV el control es medidas higinicas, ya que no hay variedades resistentes.

Las enfermedades emergentes aparecen por: 1) Nuevas especies virales 2) Virus conocidos de otros cultivos que infectan nuevos huspedes 3) Virus que incrementan rpidamente su incidencia 4) Virus antiguos que reemergen debido al cultivo de variedades viejas que no tienen los genes de resistencia. 5) El comercio global de semillas, flores o plantas que muchas veces son portadoras de insectos u otros vectores contaminados.

MEDIDAS PREVENTIVAS

PROTECCIN CRUZADA

RESISTENCIAS NATURALES

MANEJO INTEGRADO DE VIRUS

OTRAS MEDIDAS

RESISTENCIAS DERIVADAS DE SILENCIAMIENTO PATGENO GNICO

Bean common mosaic potyvirus BCMV

Bean common mosaic necrotic potyvirus BCMNV

Gen de resistencia I

Genes de resistencia aislados

El gen N que confiere una resistencia de hipersensibilidad al TMV en
distintas especies de Nicotianas. Este gen a sido transferido a tomate donde induce resistencia a TMV.

El gen Rx de patata que confiere una resistencia extrema la PVX. Ambos genes tienen una organizacin similar a otros genes de
resistencia de las plantas a otros tipos de patgenos, conteniendo elementos conservados como repeticiones ricos en leucina y diversos dominios kinasas. Los genes de resistencia a virus no tienen un dominio de unin a la membrana, lo que indica que los productos del gen interaccionan con el virus cuando este est en la clula.

MEDIDAS PREVENTIVAS

PROTECCIN CRUZADA

RESISTENCIAS NATURALES

MANEJO INTEGRADO DE VIRUS

OTRAS MEDIDAS SILENCIAMIENTO GNICO

RESISTENCIAS DERIVADAS DE PATGENO

La teora de la resistencia derivada del patgeno expresada por Sanford and Johston (1985) propone que determinadas secuencias gnicas del propio patgeno insertadas en el genoma del husped y capaces de expresarse de froma constitutiva en este, pueden dar lugar a una proteccin frente a la infeccin por el agente patgeno. - La primera demostracin de esta resistencia fue con TMV (1986). - Posteriormente se expresaron las CP de PVX, CMV, AMV, TRV etc. - Las protenas del movimiento de diversos virus - Diversas replicasas virales. - Genes naturales de resistencia (N, Sw5) - RNAs satlites: CMV, TRSV. - Expresin de anticuerpos (plantibodies).

TRANSFORMACIN DE PLANTAS

Clula de Agrobacterium

Resistencia a kanamicina

Repeticiones de 25 pb Gen forneo Plsmido recombinante

La bacteria invade las heridas (donde se ha cortado la hoja) Las plantas resistentes a la kanamicina contienen el gen forneo

Los fragmentos de hoja son transferidos a placas de agar con hormonas de crecimiento y kanamicina

Las plantas se regeneran a partir de los segmentos de hoja

-20 trabajos(1987-2002) usando la CP de CMV en 6 huspedes diferentes, el grado de resistencia descrito es de 0.0 % - 100% - En 1994 una lnea de calabaza ZW20 transformada con la CP de ZYMV y WMV , fue la primera PTRVs aceptada para su plantacin en campo. - Posteriormente se acept la lnea CZW3 (3 CP= CMV, ZYMV,WMV) - En 1998 Papaya ring spot virus . - desde entonces se han experimentado en campo muchas PTRVs: cereales, frutales, pastos, leguminosas y hortcolas. Pero solo han sido aceptadas dos papas que son resistentes a PVY y PLRV. - No obstante, actualmente solo hay dos PTRVs comerciales: CZW3 y PRSV. Las lneas de papa fueron abandonadas por su productor, principalmente debido al rechazo de la industria.

Transgenic papaya inoculated with PRSV from Hawaii (left) and nontransgenic papaya inoculated with PRSV from Hawaii (right). Note the resistance of transgenic papaya

Papaya was discovered in Puna in May 1992. (Left) Infected trees were cut in attempts to control spread of virus. Picture taken in May 1992. (Right) By late 1994, PRSV had spread throughout the Puna district and was out of control. Many orchards were abandoned because of severe virus infection. Picture taken in February 1995

Puna papaya test field started in 1995. Yellow plants are papaya ringspot infected; plants on right are Rainbow papayas.

Aerial view of transgenic papaya test field in Puna, showing block of healthy transgenic 'Rainbow' surrounded by severely infected nontransgenic 'Sunrise' papaya. Photo by S. Ferreira.

QUE HA PASADO CASI 25 AOS DESPUS?

-TMV : Powell et al 1986. - Actualmente existen plantas transgnicas con resistencia virus a nivel experimental de la mayora de virus de importancia econmica. - En el campo estn sembrados algunos ejemplos en plan experimental, pero en plan comercial solo se siembra papayo y calabacn. - Prximamente se van a comercializar en diversos pases: -Ciruelos en USA PPV - papa en argentina PVY - Arroz en India RTBV - Judas en Brasil BGMV

POSIBLES RIESGOS DEL USO DE PLANTAS TRANSGNICAS RESISTENTES A VIRUS.

-Recombinacin entre el transgen y un virus diferente. - Pasaje con el polen de plantas transgnicas a malas hierbas relacionadas, amentando la resistencia en las malas hierbas. - Transmisin de virus no relacionados por trans-encapsidacin. - Sinergismos con virus no relacionados. - Exposicin de nuevos alergenos o protenas txicas.
Despus de 25 aos de experiencia ninguno de estos supuestos ha sido realmente probado.

Por qu no han funcionado las plantas transgnicas resistentes a virus?

Rechazo del consumidor a los productos provenientes de

plantas transgnicas.

Rechazo de las compaas biotecnolgicas: No son rentables.

Dificultad y tiempo para conseguir la aprobacin.

Rechazo de la sociedad a las plantas transgnicas.

Posibles riesgos en la naturaleza por la proliferacin de las plantas transgnicas.

MEDIDAS PREVENTIVAS

PROTECCIN CRUZADA

RESISTENCIAS NATURALES

MANEJO INTEGRADO DE VIRUS

OTRAS MEDIDAS SILENCIAMIENTO GNICO

RESISTENCIAS DERIVADAS DE PATGENO

El silenciamiento gnico postrancripcional (PTGS) es un mecanismo de degradacin de RNA dependiente de homologa de secuencia, que acta como un sistema natural de defensa de las plantas frente a infecciones virales. Se conoce adems, que el RNA bicatenario (dsRNA) constituye el inductor de esta respuesta de defensa adaptativa y altamente conservada en la evolucin.

Los virus de plantas codifican protenas capaces de suprimir el silenciamiento por RNA. Se han identificado mas de 50 supresores del silenciamiento, en casi todos los grupos de virus conocvidos Potyvirus . HC-Pro CMV: 2b TMV: 30K

El sinergismo de dos virus en una planta (observado en 1920) est relacionado con la supresin del silenciamiento gnico.

Parece que en la proteccin cruzada el mecanismo que acta es el silenciamiento gnico.

Experimentalmente se est ensayando este sistema para producir plantas resistentes a virus.

MEDIDAS PREVENTIVAS

PROTECCIN CRUZADA

RESISTENCIAS NATURALES

MANEJO INTEGRADO DE VIRUS

OTRAS MEDIDAS

RESISTENCIAS DERIVADAS DE SILENCIAMIENTO PATGENO GNICO

Medidas culturales
- Erradicacin de plantas enfermas - Uso de plsticos de colores en los invernaderos - Control qumico de vectores - Uso de semillas libres de virus : patata, hortcolas - Uso de plantas libres de virus. Frutales, banano, vid, - Limpieza de los rastrojos y malas yerbas que pueden ser reservorios de las virosis.

MEDIDAS MEDIDAS PREVENTIVAS PREVENTIVAS

PROTECCIN CRUZADA

RESISTENCIAS NATURALES

MANEJO INTEGRADO DE VIRUS

OTRAS MEDIDAS SILENCIAMIENTO GNICO

RESISTENCIAS DERIVADAS DE PATGENO