Enterococcus spp.

1. Introduo Enterococcus, desde 1984 passou a constituir um gnero e, juntamente com os Streptococcus, Lactococcus, Vagococcus, Abiotrophia, Globicatella e Leuconostoc, faz parte do grupo dos cocos Gram-positivos agrupados em cadeia, anaerbios facultativos e catalase negativa. Estes microrganismos caracterizam-se tambm pela capacidade de crescimento a 10C e 45C e em pH 9,6. Sobrevivem na concentrao de 6,5% de NaCl, a 60C por 30 minutos e tambm fazem hidrlise da esculina na presena de 40% de sais de bile. Alm destas caractersticas, diferenciam-se dos demais gneros pela hidrlise da pirrolidonil--naftilamida (PYR), que ocorre na maior parte das espcies e tambm da leucina--naftilamida (LAP).).

Importncia clnica Os enterococos, alm de serem amplamente distribudos na natureza, fazem parte da microbiota normal do ser humano, principalmente do trato gastrointestinal. Podem ser isolados em indivduos saudveis em outras localizaes como pele, regio peri-anal, via hpato-biliar e em secrees de orofaringe e vaginal. Dentre as espcies descritas, os E. faecalis e E. faecium so os mais associados a manifestaes clnicas. Outras espcies como E. gallinarum, E. casseliflavus, E. durans e E. avium so clinicamente de menor importncia. A associao deste gnero com endocardite bacteriana classicamente conhecida. Por outro lado, denota-se atualmente o isolamento destas bactrias, em diversos stios, causando infeces relacionadas assistncia sade, como:

Infeces do trato urinrio (ITU); Infeces da corrente sangunea (ICS); Infeces de stio cirrgico e intra-abdominais.

No trato urinrio, alm de infeco, podem representar colonizao ou bacteriria assintomtica. Mais raramente, so descritas pneumonias em pacientes debilitados, bem como empiema em portadores de doena heptica, mesmo na ausncia de outras manifestaes respiratrias. As meningites tambm so apontadas como infeces infreqentes, ocorrendo na presena de fatores predisponentes, como o perodo neonatal, alteraes do sistema nervoso, incluindo defeitos anatmicos e procedimentos neurocirrgicos, doenas crnicas de base e, em dados mais recentes, em pacientes portadores da sndrome da imunodeficincia humana (AIDS).

solamento Os mtodos habitualmente padronizados para coleta de sangue, urina, amostras cirrgicas e de outros stios so adequados na suspeita da existncia de enterococos. Pelo fato de serem relativamente resistentes s condies ambientais, no existem recomendaes especficas para o transporte destas amostras. As diferentes espcies de enterococos multiplicam-se bem em gar MellerHinton acrescidos ou no de sangue, ou ainda com outras bases como Brain Heart Infusion (BHI) e outros meios enriquecidos. O gar azida um exemplo de meio enriquecido bastante utilizado para o isolamento destas bactrias, principalmente quando existe a possibilidade da amostra conter concomitantemente bacilo Gram-negativo. Em gar sangue, as colnias, aps 24 h de crescimento, tm aproximadamente 1 a 2 mm de dimetro. Aproximadamente um tero dos Enterococcus faecalis apresentam-se com beta-hemlise em gar contendo sangue humano, coelho ou cavalo, mas so no-hemolticas em sangue de carneiro. As outras espcies so usualmente no-hemolticas. A temperatura adequada de crescimento de 352C e, apesar de algumas cepas crescerem melhor em concentraes aumentadas de CO2 no existe necessidade de atmosfera especial. O uso de meios cromognicos uma opo, uma vez que pode haver liberao do resultado com mais agilidade e ainda permite maior facilidade de isolamento em amostras no puras. Quando se pretende identificar portadores de Enterococcus spp. resistentes vancomicina (VRE), as amostras indicadas so aquelas obtidas atravs de coleta de swab anal, swab peri-anal (mtodo de triagem recomendado pelo Centers for Disease Control and Prevention (CDC) ou fezes. A sensibilidade, do mtodo, est relacionada com a densidade de microrganismos encontrados nas fezes Considerando-se que a flora intestinal se caracteriza por um nmero expressivo de bactrias, necessrio o uso de meios seletivos para o isolamento de VRE em amostras do trato intestinal. A indicao destes meios tem como finalidade promover o desenvolvimento do enterococos e ainda impedir o crescimento de outras bactrias, fazendo com que o trabalho tcnico tenha melhores resultados. A inibio dos outros microrganismos feita com a adio de antimicrobianos especficos para as diferentes espcies. Para tanto, vrios meios podem ser utilizados, como gar sangue de carneiro a 5% sem colistina e cido nalidxico (CNA), ou com colistina e cido nalidxico, Enterococosel e Skirrow ou Karmali. Estes meios so acrescidos com antimicrobianos, sendo a vancomicina na concentrao de 6 g/mL, o mais utilizado.

4. Identificao O diagnstico do gnero Enterococcus spp., bem como das diferentes espcies, pode ser feito em diversos nveis de complexidade. Apesar de no haver caractersticas fenotpicas que diferenciem totalmente o gnero Enterococcus de outros gneros relacionados, a presena de cocos Gram-positivos dispostos aos pares ou em cadeias, catalase negativa com prova de PYR positiva, crescimento em caldo de NaCl a 6,5% e hidrlise da esculina so provas presentes na maioria das espcies do gnero Enterococcus. Com provas de PYR (Figura 6), hidrlise da esculina positiva (Figura 7) e crescimento em caldo de NaCl a 6,5% (Figura 8), so provas presentes na maioria das espcies do gnero Enterococcus. gar bile-esculina Princpio: Esculina presente no meio hidrolizada, formando esculetina e dextrose. A esculetina reage com sais de ferro presentes no meio tornando-o enegrecido. Tem por finalidade diferenciar Enterococcus spp. e Streptococcus bovis (Streptococcus do grupo D) de Streptococcus spp. Procedimento:

Inoculam-se 2 a 3 colnias a serem testadas em base contendo bileesculina; Incubam-se a 352C por at 72 h.

Interpretao: Presena de cor enegrecida no meio indicativa da presena de hidrlise, isto , uma prova positiva. NaCl 6,5% Princpio: Capacidade do microrganismo crescer em altas concentraes de sal. Tem por finalidade diferenciar Enterococcus spp. de Streptococcus spp. Procedimento:

Inoculam-se 2 a 3 colnias a serem testadas em um caldo BHI suplementado com 6,0% de NaCl (com ou sem indicador); Incubam-se a 352C por at 72 h.

Interpretao: A turvao ou mudana de cor (no caso de adio de indicador) indicativa de crescimento bacteriano.

xistem diversos testes convencionais que levam identificao das espcies de Enterococcus e gneros relacionados, classificando-o em cinco diferentes grupos fisiolgicos. Estes incluem a hidrlise da arginina (Figura 9), a deteco da produo de cido a partir de diferentes carboidratos: arabinose ( Figura 10), sorbitol (Figura 11), manitol (Figura 12), rafinose, sorbose e sacarose, utilizao do piruvato de sdio, motilidade (Figura 13) e produo de pigmento.

Figura 9 - Arginina

Figura 10 - Arabinose

Figura 11 - Sorbitol

Identificao A produo de cido a partir de metil-a-D-glucopiranosdeo (MGP) auxilia na diferenciao do E. faecium, E. gallinarum e E. casseliflavus. Considerando que para fins de controle e preveno de infeces, as espcies de E. faecium e E. faecalis necessitam rapidamente ser distinguidas de E. gallinarum e E. casseliflavus, a fermentao da xilose outro teste de valor. Apesar de todos os enterococos fermentarem a xilose, pelo fato de os E. gallinarum possurem a enzima pr-formada, a reao para esta espcie ocorre com maior rapidez, permitindo leitura em duas horas. Alguns testes comerciais, baseados em caractersticas bioqumicas, tm utilizao para o diagnstico e identificao das espcies dos enterococos como o API 20 STREP (bioMrieux), o sistema BD BBL Crystal (Becton Dickinson Cockeysville) e identificao de enterococos (PROBAC do Brasil). Como observado na Figura 14.

Figura 14 - Enterococcus faecium, arginina+, arabinose+, sorbitol-, motilidade- e manitol+ Os mtodos automatizados tambm so usualmente utilizados para a identificao e deteco rpida da resistncia antimicrobiana dos enterococos. Dentre os mais utilizados destacam-se o Vitek system e Vitek (bioMerieux), MicroScan (Siemens) e Phoenix (BD). O desempenho dos mtodos automatizados vem sendo constantemente observado, incluindo diversas alteraes nos painis e cartes, alm de adaptaes no software. A acurcia tem-se mostrado melhor para E. faecalis, oferecendo maior dificuldade para E. faecium e outras espcies. Para deteco de resistncia, podem ser utilizados os mtodos manuais qualitativos (disco-difuso) e quantitativos com micro ou macrodiluio. Do ponto de vista de rotina diria no laboratrio de microbiologia, uma opo a metodologia epsilomtrica do E-test (AB Biodisk, Solna, Sweden). A concordncia de deteco de resistncia vancomicina pelos mtodos automatizados melhor para o fentipo VanA, a exemplo de outras metodologias. Por fim, as metodologias moleculares tambm so utilizadas tanto para diagnstico de VRE direto da amostra, bem como para caracterizao genotpica da bactria.

. Resistncia Resistncia penicilina A resistncia dos estafilococos penicilina comeou a ser descrita poucos anos aps o advento e uso de penicilina e est relacionada produo de uma enzima predominantemente extracelular denominada penicilinase. Na dcada de 1950, esta ocorrncia era freqente nos isolados nosocomiais limitando o uso da penicilina na prtica clnica. Esta enzima sintetizada pelos estafilococos aps exposio aos beta-lactmicos, que hidrolisa o anel betalactmico e inativa o antimicrobiano. Esta enzima codificada pelo gene blaZ, sendo regulada por dois genes regulatrios: blaR1 (antirrepressor) e blaI (repressor). Resistncia oxacilina O principal mecanismo de resistncia est relacionado alterao do stio de ao dos beta-lactmicos, ou seja, alterao das protenas ligadoras de penicilinas denominadas PBPs. As PBPs so enzimas importantes na sntese da parede bacteriana. A presena de enzima alterada, denominada PBP2a ou PBP2, leva a baixa afinidade da oxacilina pelo local de ligao na parede celular da bactria com conseqente inatividade. Estas alteraes so codificadas pelo gene mecA, que faz parte de um elemento gentico mvel encontrado em todos os isolados com este tipo de resistncia, denominado cassete estafiloccico do cromossomo mec (SCCmec). Este elemento genmico composto pelo complexo do gene mec, que codifica resistncia oxacilina, e pelo complexo do gene ccr, que codifica recombinases responsveis pela sua mobilidade e podem conter outros genes de resistncia para outros agentes antimicrobianos. Desta maneira, muito freqente que a resistncia oxacilina esteja acompanhada por resistncia a outras classes de antimicrobianos, como clindamicina, eritromicina e tetraciclina, levando muitas vezes a poucas opes teraputicas.

Resistncia A deteco laboratorial desta resistncia denominada clssica pode ser prejudicada se as condies do teste no forem rigorosamente padronizadas. Os pontos crticos mais importantes so: tempo de incubao de 24 horas, temperatura de incubao de 30 a 35C e ajustes do meio de cultura com a adio de cloreto de sdio a 4%. A expresso da resistncia clssica tambm pode apresentar variao entre homognea (todas as colnias expressam resistncia) e heterognea (apenas parte das colnias expressam resistncia), desta maneira dificultando a interpretao do teste de sensibilidade. A oxacilina a droga representante deste grupo por ser a mais resistente degradao e a mais sensvel para deteco de heterorresistncia. Dentro desta classe de drogas, temos tambm:

Meticilina; Nafcilina; Cloxacilina; Dicloxacilina.

Quando um isolado for resistente oxacilina, deve ser considerado resistente a todas as drogas desta classe. Staphylococcus aureus resistente oxacilina denominado de ORSA (oxacillin resistant S. aureus) ou MRSA (methicillin resistant S. aureus). Trs mecanismos podem estar envolvidos na resistncia oxacilina, sendo que as caractersticas fenotpicas so distintas e apresentadas no Quadro 4.

Resistncia Resistncia aos glicopeptdeos A resistncia aos glicopeptdeos pode ser expressa por dois diferentes fentipos:

VISA (S. aureus com resistncia intermediria vancomicina); VRSA (S. aureus resistente vancomicina). Os mtodos laboratoriais mais utilizados, disco difuso e automao, no so capazes de detectar esta resistncia.

So recomendados testes de triagem com gar Brain Heart Infusion (BHI) acrescido de 6 g/mL de vancomicina e 4% de NaCl e mtodos quantitativos com determinao da concentrao inibitria mnima (CIM) por microdiluio em caldo, diluio em gar ou Etest. Os isolados suspeitos devem ser enviados para laboratrios de referncia, sendo importante conservar a

bactria original sem muitos repiques e rpido congelamento. Nestes casos, a retirada da presso seletiva do antimicrobiano em repiques sucessivos em meios de cultura sem antimicrobiano levar a diminuio da CIM com insucesso nos testes confirmatrios posteriores. VISA ou GISA (Glycopeptide Intermediate S. aureus): A ao do glicopeptdeo inibir a sntese da parede bacteriana (peptideoglicano) por interao com seu precursor D-alanil-D-alanina. O fentipo VISA est relacionado com o espessamento da parede bacteriana, impossibilitando a ao do glicopeptdeo devido captura de suas molculas que ficam retidas na parede bacteriana e comprometem a eficcia teraputica deste agente. Semelhante oxacilina, apresenta estgio inicial de resistncia, denominado heterorresistncia, com presena de sub-populaes resistentes para este antimicrobiano. O significado clnico dos isolados com heterorresistncia ainda no est comprovado. Os isolados so considerados sensveis, intermedirios ou resistentes aos glicopeptdeos conforme os pontos de corte estabelecidos pelo Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI), que a referncia adotada no Brasil, sendo divulgada e disponibilizada pela ANVISA a partir de 2005. O mecanismo de resistncia est relacionado as caractersticas especficas de crescimento e multiplicao bacteriana. Dentre estas caractersticas, temos:

Aumento da produo de monmeros de murena (precursores do peptideoglicano); Maior quantidade de resduos livres de D-alanil-D-alanina ou debris da parede bacteriana liberados para o meio extra-celular; Elevada atividade autoltica; Aumento da produo e expresso da PBP2a.

A maioria dos isolados VISA descritos no mundo possui alteraes na estrutura da parede celular, que apresenta-se espessa e irregular quando analisada pela microscopia eletrnica. VRSA ou GRSA (Glycopeptide resistant S. aureus): Estes isolados apresentam resistncia completa aos glicopeptdeos. O mecanismo deste fentipo de resistncia est relacionado aquisio por conjugao, pelo S. aureus, de um plasmdeo ou transposon carreador do gene vanA proveniente do Enterococcus faecalis, resistente aos glicopeptdeos. Felizmente este evento raro, porm medidas para deteco desta resistncia devem ser implantadas pelos laboratrios de microbiologia.

Resistncia Resistncia aos macroldeos, lincosaminas e estreptogramina B (MLS B) Estas classes de antimicrobianos, apesar de diferentes, apresentam mecanismo de ao similar, atuando na ligao do ribossomo e inibio da

sntese protica. A resistncia do S. aureus a estes agentes est relacionada a trs mecanismos:

Modificaes no alvo de ligao no ribossomo codificado pelo gene ermA ou ermC conferindo resistncia cruzada aos macroldeos, lincosamidas e estreptogramina B (fentipo MLSB); Efluxo ativo codificado pelo gene mrsA que confere resistncia aos macroldeos e estreptogramina B; Inativao da droga.

A resistncia MLSB pode ser constitutiva ou induzvel, dependendo da exposio aos macroldeos. Na expresso constitutiva, a resistncia eritromicina e clindamicina detectada no antibiograma. Na forma induzvel, pode apresentar resistncia eritromicina e falsa sensibilidade clindamicina. A deteco da resistncia induzvel pode se feita pelo chamado D-teste, pelo mtodo de disco aproximao. Descrio dos fentipos de resistncia e resultados do D-teste est apresentada no Quadro 5.

Fluxograma de Identificao de Staphylococcus