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LABORATORIO N NOMBRE
1 Carolina Espinoza E.
Objetivos
General: Cuantificar protenas ocupando tcnicas espectroscpicas como el mtodo de Lowry y el mtodo de Biuret.
Especficos: Obtener la regresin lineal con los datos de la absorvancia y concentracin para luego poder obtener la curva de calibrado y por ende obtendremos tambin el intercepto y la pendiente, para as finalmente obtener la concentracin de la muestra problema
Lograr la reaccin adecuada para as obtener la absorvancia entre los rangos experimentales.
edir la absorvancia y obtener la concentracin de la muestra problema en cada mtodo !Biuret y Lowry"
Cuantificar protenas a travs de las tcnicas de espectrofotometra como el mtodo de Biuret y el mtodo de Lowry
Introduccin
La espectrofotometra es una de las tcnicas experimentales m&s utili%adas para la deteccin especfica de molculas. 'e caracteri%a por su precisin, sensibilidad y su aplicabilidad a molculas de distinta naturale%a y estado de agregacin. Los fundamentos fsico($umicos de la espectrofotometra son relativamente sencillos. Las molculas pueden absorber energa luminosa y almacenarla en forma de energa interna. )sto permite $ue se inicien ciclos vitales de muc*os organismos, entre ellos el de la fotosntesis en plantas. La mec&nica cu&ntica nos dice $ue la lu% est& compuesta de fotones cada uno de los cuales tiene energa. Ley de Lambert + Beer ,elacionan La medida de absorcin )l espesor de la sustancia absorbente La cantidad de sustancia $ue absorbe
etodo de Lowry )s un mtodo colorante de valoracin cuatitativa de las protenas. - la muestra se a.ade un reactivo $ue forma un comple/o coloreado con las protenas siendo la intensidad de color proporcional a la concentracin de protenas, seg0n ley de Lambert( Beer -1 alc
etodo de Biuret )l ,eactivo de Biuret es a$uel $ue detecta la presencia de protenas, pptidos cortos y otros compuestos con dos o m&s enlaces peptdicos en sustancias de composicin desconocida. Bas&ndose en la formacin de un comple/o coloreado )l reactivo, de color a%ul, cambia a violeta en presencia de protenas, y vira a rosa cuando se combina con polipptidos de cadena corta. La intensidad de la coloracin es directamente proporcional a la cantidad de protenas !enlaces peptdicos" y la reaccin es bastante especfica, de manera $ue pocas sustancias interfieren.
Resultados
todo de Biuret Ovoalbmina TUBO () 3 Blanco 6 : 5 9 8 ; 2 4,4 3,4 4,7 4,8 4,5 4,6
,,,
m!"
R% BIURET
&bsorbanci a
'oncentraci n Ovoalbumina
m!" 3,4 4,4 4,6 4,5 4,8 4,7 4,4 5,4 5,4 5,4 5,4 5,4 5,4 5,4
-.+ /0-
!3"4> x 3 mL 1 C6 x 9mL 4> !6"9> x 3mL 1 C6 x 9mL 3> !:"5> x 3mL 1 C6 x 9mL 4,7> !5":> x 3mL 1 C6 x 9mL 4,8> !9"6> x 3mL 1 C6 x 9mL 4,5>
!8" 3> x 3mL 1 C6 x 9mL 4,6> !; 2" 4> x 3mL 1 C6 x 9mL 4>
?ntercepto !a" 1 (4,3:3 2endiente !b" 1 3,34< ,elacin de datos !r" 1 4,<6 )cuacin de la recta y 1 mx @ b m1 3,34< b1 (4,3:3 2or lo tanto la ecuacin $ueda y 1 3,34<x + !(4,3:3"
cx =
A X Ao
Observando $ueA Cx 1 concentracin final muestra problema -x 1 -bsorvancia -4 1 ?ntercepto B x l 1 2endiente ,eempla%ando obtenemos uestra 2roblema
/4todo de !o5r6 B7& TUBO 3B 6' :' 5' 9' 8' ; 2 m!" +.* m9:m! (((( 4,3 4.6 4,: 4,5 4,9 ((( /0 ((( ((( ((( ((( ((( ((( +.( /0#$O m!" 3,4 4,< 4,7 4,; 4,8 4,9 4,9 R%'%&% m!" 3,4 3,4 3,4 3,4 3,4 3,4 3,4 R%8% m!" 5,4 5,4 5,4 5,4 5,4 5,4 5,4 & ;(+ nm 4 4,4:8 4,49; 4,4;3 4,474 4,4<5 4,: 'onc% ) 4> 4,888> 3,::> 6> 6,88> :,::> 4>
C&lculos de concentracin !Ci x =i 1 Cf x =f por 344" !6'"4,5mg x 4,3ml 1 8ml x C6 8,88x34(: x 344 1 4,888> !:'" 4,5 mg x 4,6ml 1 8ml x C6 4,43: x 344 1 3,::> !5'" 4,5 mg x 4,:ml 1 8ml x C6 4,46 x 344 1 6> !9'" 4,5 mg x 4,5ml 1 8ml x C6 4,468 x 344 1 6,88> !8'" 4,5 mg x 4,9 ml 1 8ml x C6 4,4:: x 344 1 :,:: >
?ntercepto !a" 1 (4,::5 2endiente !b" 1 :9,5; ,elacin de datos !r" 1 4,<87 )cuacin de la recta y 1 mx @ b m1 :9,5; b1 (4,::5 2or lo tanto la ecuacin $ueda y 1 :9,5;x + !(4,::5"
cx =
A X Ao
Observando $ueA Cx 1 concentracin final muestra problema -x 1 -bsorvancia -4 1 ?ntercepto B x l 1 2endiente ,eempla%ando obtenemos uestra 2roblema
>iscusiones
Biuret 2odemos observar $ue las absorvancias van aumentando entre los tubos 6 y 8, esto lo podemos atribuir a $ue las concentraciones de ovoalb0mina van disminuyendo y por otro lado las concentraciones de agua van aumentado en cada tubo respectivamente. Los resultados de absorcin #ieron en los rangos estimados !4,9 y 3,9" esto se debe a la correcta preparacin de las disoluciones Las absorvancias no dieron exactas ya $ue al comen%ar su medicin en el espectrofotmetro este comen%aba a aumentar, esto se debe a $ue no se espero el tiempo necesario para $ue la reaccin ocurriera por completo, por consiguiente esto te lleva a un cierto > de error
!o5r6
Co *ubo suficiente agua ni estuvo a la temperatura re$uerida para $ue las muestras se calentaran, de esta manera la reaccin no fue completada por falta de calor en la reaccin.
Como los rangos de absorvancia dieron menor a los rangos experimentales, deberamos *aber procedido a a.adir m&s concentracin de la solucin a la muestra esto no se pudo llevar a cabo por el tiempo y la poca solucin disponible.
2uede *aber ocurrido $ue no se espero el tiempo necesario entre $ue se verta el reactivo alcalino !,C-" y luego el reactivo Dolin ya $ue deba transcurrir 34 min.
'onclusin
2odemos concluir $ue no existe un mtodo completamente efectivo para medir la cuantificacin de protenas en una muestra determinada. Lo $ue si podemos *acer es elegir el mtodo seg0n la naturale%a de la protena la cual deseo anali%ar Luego de aplicar ambos mtodos, el de lowry y el de biuret, para la cuantificacin de protenas podemos decir $ue es muc*o m&s efica%, certero y preciso el de Llowry ya $ue tiene una gran venta/a de ser extremadamente sensible, capa% de detectar cantidades del orden de 34 microgramos de protena
Biblio9rafa
*ttpAEEocw.uv.esEocw(formacio(permanentE6.2racticaespectrofotometria.pdf *ttpAEEacasti.webs.ull.esEdocenciaEpracticasE5.pdf