UNIVERSIDAD LA SALLE

FACULTAD DE CIENCIAS
QUMICAS
Laboratorio De Bioqumica Molecular
Prctica No. 9
Determinacin cuantitativa de protenas Mtodo
de Biuret
Equipo 2
!arca "alde# Berenice
!ar#a $ollano Mara %ernanda
Pre# Lpe# Mare& 'raceli
(e&es (o)as "ernica Li#bet*
+ali,icacin --------
Dr. .os D. Mnde#
Objetivos:
Aplicar el mtodo colorimtrico para la determinacin de protenas en
fluidos biolgicos que permite detectar concentraciones del orden de mg.
It!o"u##i$:
El amoniaco y sus derivados, incluyendo los aminocidos forman complejos con
Cu
!
y otros iones metlicos. El in de cobre y amonio, Cu"#$%&'
!
, es el ejemplo
ms elemental de complejos de este tipo. (os aminocidos simples como la glicina
forman complejos de estructura semejante.
Adems de estos complejos simples de cobre con aminocidos, se pueden formar
otros productos ms complejos a base de Cu
!
y pptidos o protenas. Estos
compuestos aparecen de manera especial en soluciones alcalinas, y muestran un
color rosa o violeta muy distinto de los complejos simples de amonio y cobre. (as
sustancias que poseen dos enlaces peptdicos o ms, como por ejemplo los
pptidos y las protenas, se pueden identificar alcanili)ando una solucin de la
sustancia y a*adiendo peque*as cantidades de Cu
!
. (a aparicin de un color rosa
o violeta se considera un resultado positivo, un color a)ul, como el que podra dar
un aminocido simple, no debe confundirse con una prueba de +iuret positiva.
El nombre de esta prueba se debe a que la sustancia conocida como +iuret
produce un color rosado en las mismas circunstancias. (a estructura del +iuret es
#$!,C-,#$,C-,#$!. #o e.iste +iuret como tal en los tejidos, lquidos corporales
o protenas, sino que solamente da un color semejante al que producen los
pptidos, porque contiene lo que se puede considerar como enlaces peptdicos.
(a reaccin de +iuret la dan los pptidos y protenas pero no los aminocidos
libres.
(a formacin del color p/rpura es debida a un complejo de coordinacin del catin
cobre. 0arece ser una propiedad de los compuestos que poseen muc1os grupos
amida pr.imos,
2ones de cobre y polipctidos reaccionan en alclisis fuertes con formacin de un
color violeta que debende ms del n/mero de pptidos presentes que de la
naturale)a de las cadenas laterales.
Ate#e"etes:
3eterminar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es una tcnica
de rutina bsica cuando se aborda un esquema de purificacin de una protena
concreta, cuando se quiere conocer la actividad especfica de una preparacin
en)imtica, para el diagnstico de enfermedades, as como para otros muc1os
propsitos.
E.isten diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. 4uc1os de estos mtodos
se basan en5
a) (a propiedad intrnseca de las protenas para absorber lu) en el 67.
b) (a capacidad de formacin de derivados qumicos.
c) (a capacidad que tienen las protenas de unir ciertos colorantes.
8i una solucin fuertemente alcalina de sulfato c/prico "Cu8-'& se a*ade a una solucin
de protena se forma una complejo entre el ion c/prico y los enlaces peptdicos, con
aparicin de una coloracin violeta,p/rpura, que presenta un m.imo de absorcin a 9':
nm.
(as caractersticas ms importantes de la reaccin son5
(a reaccin del +iuret se aplica, a partir de los tetrapptidos, a todos los pptidos y
protenas.
8u rango de determinacin es de ; a < mg=m(.
#o depende de la composicin de aminocidos.
Algunos compuestos "#$', >ris, etc.& dan la reaccin.
Este mtodo se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu! y
los grupos #$ de los enlaces peptdicos en medio bsico. 6na molcula de Cu
!
se acompleja con ' #$.
(a intensidad de coloracin es directamente proporcional a la cantidad de
protenas "enlaces peptdicos& y la reaccin es bastante especfica, de manera que
pocas sustancias interfieren. (a sensibilidad del mtodo es muy baja y slo se
recomienda para la cuantificacin de protenas en preparados muy concentrados
"por ejemplo en suero&.
M%te!i%&es ' M(to"o:
Material:
Matraz Aforado
Vasos de precipitados
Pipetas
Tubos de ensaye
Reactivos:
NaOH
Sulfato de Cobre Pentaidratado
Tartrato doble de Na y !
"#uipo
"spectrofot$%etro
Celda
Material &iol$'ico
Huevo
Alb(%ina &ovina
)!o#e"i*ieto o Des%!!o&&o E+pe!i*et%&:
Preparacin de soluciones:
)* 8olucin #a-$ ;#
+* ?eactivo de +iuret5 para preparar este reactivo se requieren sulfato de
cobre penta1idratado ":.%@9 g&, tartrato doble de #a y A ";.9 g&, ambos
reactivos se disuelven en ;!9 m(. A esta solucin se le agrega @9 m( de
#a-$ ;:B y se diluye a !9: m(.
,* 8olucin estndar de alb/mina5 !: mg=m( #a-$ ; #
Procedimiento:
8e preparan los tubos como se india en la siguiente tabla y se le agregan los
reactivos necesarios.
>ubo #o.
Alb/mina !:
mg=ml
$!-
destilada
?eactivo de
+iuret
+lanco , ;.: ml % ml
; ! mg= :.; ml :.C ml % ml
! ' mg= :.! ml :.D ml % ml
% < mg= :.% ml :.@ ml % ml
' D mg= :.' ml )*- ml % ml
9
;: mg= :.9
ml
)*. ml % ml
1. 4uestra problema, $uevo5 :.; ml de clara de 1uevo, :.C ml de agua
destilada y % ml de reactivo de +iuret
2. 3espus de agregar el reactivo de +iuret se me)cla y se deja reposar
durante %: minutos.
3. 8e le la absorbancia a 9': nm.
C,&#u&os
Soluci$n NaOH /*)N
Resu&t%"os
8e enumeraron del ; al @ los tubos
de ensaye y a cada uno se le
agreg alb/mina, agua destilada y
reactivo de +iuret como se indic
en la tabla anterior. As mismo se
midi la cantidad total de clara de
1uevo, siendo esta de %% mlE se
agergo solucin #aCl 1asta
obtener un volumen de ;::ml
8e tomaron :.; m( de la muestra
anterior y se agregaron :.C m( de
agua destilada ms % m( del
reactivo de +iuret. 8e observ un
cambi la coloracin del reactivo
de +iuret de a)ul a morado
En los tubos que contenan la
muestra estndar, se observ que
la coloracin se va intensificando
conforme a la concentracin de
alb/mina
.
8e reali) una curva estndar en el espectrofotmetro, obteniendo la siguiente
grfica5
8e obtuvo una lnea recta, sin embargo, no todos los puntos caen dentro de la
recta, esto se debe a errores al pipetear.
0a concentraci$n de prote1nas va au%entando*
Anali)ando la muestra problema, que es la clara de 1uevo, se obtuvo el siguiente
resultado5
Dis#usi$ "e !esu&t%"os:
3urante la prueba de +iuret se forma un complejo que se puede identificar con la
coloracin en los tubos de ensaye. (a cantidad de protena es proporcional a la
concentracin de color en las muestras.
+asndonos en la curva estndar se obtuvo que la muestra problema contiene
una concentracin de protena de ;.!<! mg=m(. +ibliogrficamente se investig
que un 1uevo grande pesa apro.imadamente 9D g de los cuales el 9DB "%%.<' g&
corresponden a la clara, el %;B ";@.CD g& y el ;;B "<.%D g& al cascarn
)
.
) ttp:22avalon*cuautitlan+*una%*%32pollos2%+45*pdf
Comparado con el dato terico que nos dice que la protena presente en la clara
de 1uevo va del 99,<9B del peso de la clara
+
, se
reali)aron los siguientes clculos5
/00 11.23 g r
B protena F
20 40.53 g r
40.536r 11ml
x0./mLde muestra problema(clara)
x=.021/ gr =21./mg '
(a albumina es una sustancia orgnica
nitrogenada, viscosa, soluble en agua, coagulable
+ ttp:22ali%entosproteinas*co%2uevo
por el calor, contenida en la clara de 1uevo. (a clara o tambin conocida como
albumen, tiene un DD por ciento de agua y el resto est constituido bsicamente
por protenas de la clara siendo la principal la ovoalb/mina, que representa el 9'
por ciento del total proteico.
,
(a albumina es una protena que la utili)an principalmente los fisicoculturistas para
el desarrollo de masa muscular, es ingerida en su estado normal "cruda& o
cocinada, que al desnaturali)arse "mediante calor& se torna de color blanco.
6
Co#&usioes:
Cuestio%!io:
)* &uscar la estructura del co%ple7o for%ado entre la prote1na y el i$n cobre*
+* 8nvesti'ar sobre las venta7as y desventa7as del %9todo de &iuret con respecto al
%9todo de 0o:ry
A!t-#u&o
.ib&io/!%0-%
, An$ni%o* +//-* ;<ue es la albu%ina de uevo=* "n l1nea* >eca de consulta: /)2/62))* ?isponible en:
ttp:22:::*#ui%inet*co%*%32art2ar4@+.&.o@+.CA@+.B5@+.A/@+.?/@+.B/&*pp
6 Silvia* +/)/* Todo lo #ue ay #ue saber del uevo* "n l1nea* >eca de consulta: /)2/62))* ?isponible en:
ttp:22:::*entrepuceros*co%2todoCloC#ueCayC#ueCsaberCdelCuevo2