UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI

ESCOLA DE FARMCIA
CONTROLE BIOLGICO DE QUALIDADE
ROTEIRO DE AULA PRTICA

3 AULA PRTICA- CONTAGEM DO NMERO DE MICRORGANISMOS MESFILOS E VALIDAO


Mtodo de Contagem em placa

Avalia o nmero de microrganismos mesfilos no produto aps neutralizao da propriedade
antimicrobiana presente no produto.
Controles realizados: Controle negativo
Validaes do teste: Teste de Capacidade nutritiva dos meios de cultura (Teste de Promoo
do crescimento); Teste de eliminao/neutralizao da propriedade antimicrobiana

Medicamento/cosmtico:
Fabricante:
Nmero do Lote:
Data de validade:
Data da Fabricao:
Condies da amostra:






A. Neutralizao: para que o aspecto quantitativo (contagem) seja observado, torna-se
necessria a neutralizao da atividade antimicrobiana do conservante presente no produto.

Tabela 1- Neutralizante Polivalente
Lecitina 3 g ( quaternrio de amnio)
Tween 80 30 mL (fenlicos)
Tiossulfato de sdio 5 g ( cloro)
L-histidina 1 g ( formaldedo)
Peptona pancretica 1 g
Cloreto de sdio 8,5 g
Tampo fosfato 10 mL
gua destilada 1000 mL


Usa-se para cada caso o(s) neutralizante(s)/mtodo de neutralizao descrito(s) na Tabela 2.









Tabela 2- Agentes conservantes e neutralizantes


PREPARO DA SOLUO SALINA PEPTONADA E TAMPONADA

Fosfato monopotssico--------------------- 3,56 g
Fosfato dissdico------------------------------7,32 g
Cloreto de sdio-------------------------------4,00 g
Peptona ( de carne ou de casena)--------1,00 g
H
2
O destilada--------------------------------1000 mL

PREPARO DA SOLUO SALINA + NEUTRALIZANTE

Acrescentar Tween 80 a 3% e lecitina a 0,3% diluio 10
-1
. Para 20 mL de salina:

Tween 80------------6 g
Lecitina--------------0,6 g
Sol. Salina q.s.p----200 mL

B. Teste de Contagem do nmero de microrganismos mesfilos (mtodo de Contagem em
placa) - Mtodo de profundidade

Homogeneizar 10 g ou 10 mL do produto em 90 mL de SSPT adicionados do neutralizante
adequado (diluio 1:10);
Corrigir o pH, utilizando papel indicador;
Preparar diluies decimais do produto (1:100; 1:1000; 1:10.000) em SSPT;
Adicionar 1,0 mL de cada diluio s placas de Petri previamente esterilizadas (em
quadruplicata);
Para duas placas de cada diluio preparada anteriormente adicionar 20 mL de gar Casena-
soja e para as outras duas placas adicionar 20 mL de gar Sabouraud-dextrose (os meios
devem ser fundidos e resfriados a 45 C). Misturar cuidadosamente, deixar solidificar e incubar
as placas invertidas de acordo com as especificaes de cada meio (30 a 35 C por 3 dias
gar Casena-soja; 20 a 25 C por 5 dias - gar Sabouraud-dextrose).
Tomar a mdia aritmtica das placas de cada meio de cultura e calcular o nmero de UFC
por grama ou mL do produto.
- Controle negativo: Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, coloc-los em incubao
por, no mnimo, 72 horas, na temperatura adequada. No deve haver crescimento de micro-
organismos.

C. Validao: Deve ser realizada antes do Teste de Contagem do nmero de
microrganismos mesfilos

Microrganismos utilizados nos testes de validao (segundo F. Brasileira V):
a- Staphylococcus aureus ATCC 6538
b- Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
c- Bacillus subtilis ATCC 6633
d- Candida albicans ATCC 10231
e- Aspergillus brasiliensis ATCC 16404

Observaes:
- Repiques de a, b e c: 24 horas antes do ensaio em meio inclinado (gar Casena-soja).
Incubao a 30 35 C
- Repiques de d e e: em gar Sabouraud Dextrose inclinado. Incubao a 30 35 C por 3 dias
para d e 20 25 C por 5 dias para e.

Preparao do inculo: Suspender cada tipo de mo (a, b, c, d, e ) em soluo salina estril
peptonada (SSPT) at atingir 30% de transmitncia a 580 nm ou turvao comparada a do tubo
n 3 de Mc Farland.

C.1- Teste de Capacidade nutritiva dos meios de cultura (Teste de Promoo do crescimento)
Quando deve ser realizado?
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
Princpio: inocular cada placa contendo o meio de cultura indicado com menos que 100 UFC
do micro-organismo teste. Incubar temperatura adequada e comparar o crescimento obtido
que no deve ser inferior a 50% em relao ao inculo padronizado.
Adicionar 0,1 mL da suspenso de cada mo s placas de Petri previamente esterilizadas (em
duplicata);
Adicionar s mesmas 20 mL de gar fundido e resfriado a 45 C (mos a, b e c gar Casena-
soja; mos d e e- gar Sabouraud-dextrose);
Misturar cuidadosamente, deixar solidificar e incubar as placas invertidas de acordo com as
especificaes de cada mo ( a, b e c 30 a 35 C por 3 dias; d e e -20 a 25 C por por 5 dias).
Tomar a mdia aritmtica das placas de cada mo e calcular o nmero de UFC de cada mo no
seu respectivo meio de cultura.
O crescimento obtido que no deve ser inferior a 50% em relao ao inculo padronizado.
- Controle negativo: Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, coloc-los em incubao
por, no mnimo, 72 horas, na temperatura adequada. No deve haver crescimento de micro-
organismos.

C.2- Teste de eficcia da neutralizao/remoo da propriedade antimicrobiana
Princpio: Neutraliza-se inicialmente o conservante presente no produto e avalia-se a remoo
da propriedade antimicrobiana contaminando-o com linhagens padro de micro-organismos.
Adicionar 0,1 mL da suspenso de cada mo s placas de Petri previamente esterilizadas (em
duplicata);
Adicionar 1,0 mL de cada diluio do produto preparada anteriormente s placas de Petri
previamente esterilizadas.
Adicionar s mesmas 20 mL de gar fundido e resfriado a 45 C (mos a, b e c gar Casena-
soja; mos d e e- gar Sabouraud-dextrose);
Misturar cuidadosamente, deixar solidificar e incubar as placas invertidas de acordo com as
especificaes de cada mo ( a, b e c 30 a 35 C por 3 dias; d e e -20 a 25 C por por 5 dias).
Tomar a mdia aritmtica das placas de cada mo e calcular o nmero de UFC de cada mo no
seu respectivo meio de cultura.
Controle positivo: adicionar 0,1 mL da suspenso de cada mo s placas de Petri previamente
esterilizadas (em duplicata) e acrescentar o meio de cultura de acordo com as especificaes
de cada micro-organismo.

Para que o conservante no esteja atuando ou tenha seu efeito antimicrobiano inibido pela
ao do neutralizante, o nmero de micro-organismo encontrado no teste com a amostra
deve ser 50% do nmero encontrado no controle positivo.

D. Esquema do teste:





































E. Resultados:

E.1- Teste de Contagem do nmero de microrganismos mesfilos

Tabela 3- Nmero de UFC encontrado em cada diluio do produto
DILUIES Controle
negativo
10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
ACS AS
ACS AS ACS AS ACS AS ACS AS



Clculo do nmero de UFC/mL ou UFC/g no produto:
Nmero de bactrias:



Nmero de leveduras e fungos:




Especificao:



Validaes
E.2- Teste de Capacidade nutritiva dos meios de cultura (Teste de Promoo do crescimento)





E.3- Teste de eficcia da neutralizao/remoo da propriedade antimicrobiana








Resultado do teste: