Proceso Histologico

Practica 3: Manejo de la lupa y Preparacin de lminas
Laboratorio de Biologa General

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Tema 1. El procesamiento histolgico.
Mtodos de fijacin
Propiedades de los fijadores
Factores implicados en la fijacin
Obtencin de muestras y proceso histolgico
Microtoma
Cortes vibratmicos
Confeccin de cortes con el criostato
Cortes en parafina
Confeccin de cortes semifinos y ultrafinos (ultramicrotoma)
Tipos de tinciones
Interacciones de los colorantes con los tejidos
Mtodos de tincin
Medios de montaje
Seguridad en el laboratorio

Material de estudio complementario
Webs de inters
Artculos

Mtodos de Fijacin
Qu sinifica fijar un tejido u rgano?
La fijacin de los tejidos u rganos para su ulterior procesamiento histolgico y
estudio microscpico se consigue gracias al empleo de sustancias qumicas que
interaccionan con los componentes moleculares de los propios tejidos. Estas
sustancias qumicas reciben el nombre de Fijadores. En ocasiones se emplean
tambin otras tcnicas de fijacin basadas en mtodos fsicos.
Por qu se tienen que fijar los tejidos?
Los objetivos que se pretenden alcanzar realizando una fijacin son los
siguientes:
Preservar el tejido de la putrefaccin, autolisis, etc...
Endurecer el tejido para permitir su manipulacin y evitar alteraciones
morfolgicas y estructurales que pudieran ocasionarse debido al propio
procesamiento histolgico.

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Mantener intacta la citoarquitectura y ultraestructura.
Preservar las caractersticas de las molculas (de particular importancia
para la determinacin histoenzimtica e inmunocitoqumica).
Cuntas clases de fijadores existen?
Existen muchas clases de sustancias fijadoras. Una clasificacin de los
diferentes tipos de fijadores es la propuesta por Backer (1960):
Aldehidos. Son algunos ejemplos: el paraformaldehido, el glutaraldehido,
la acroleina y el glioxilato
Agentes oxidantes. Los ms utilizados: el tetrxido de osmio, el
permanganato potsico y el dicromato potsico.
Agentes desnaturalizantes de proteinas. Algunos ejemplos: el cido
actico, el alcohol metlico y el alcohol etlico
Fijadores que actan por mecanismos poco conocidos. Pertenecen a este
grupo el cido pcrico y el cloruro de mercurio.
Cmo se elige un fijador?
La decisin de emplear un fijador u otro es siempre funcin del tipo de estudio
histolgico que deba realizarse. Existen soluciones fijadoras que son ms
adecuadas que otras para cada tipo de procesamiento y estudio. Distinguimos
entonces:
Fijacin para microscopa ptica
Fijacin para microscopa electrnica
Fijacin para estudios topogrficos o morfolgicos
Fijacin para demostracin de productos especficos
Fijacin para estudios histoqumicos
Fijacin para estudios inmunocitoqumicos
Cules son los mtodos de fijacin ms empleados?
Bsicamente, los mtodos de fijacin pueden clasificarse en mtodos fsicos y
mtodos qumicos.
Los mtodos fsicos de fijacin ms empleados son:
Fijacin por calor
Fijacin por microondas
Los mtodos qumicos de fijacin ms empleados son:
Fijacin por inmersin. Este mtodo consiste en tomar o extraer una
muestra del tejido u rgano que se vaya a procesar y sumergirlo en una
solucin fijadora. Normalmente, se introduce la pieza de tejido en un
frasco que contiene la cantidad adecuada de fijador.

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Fijacin por vapores. Este mtodo consiste en exponer la muestra que
se pretenda fijar a la accin de los vapores del fijador.
Fijacin por perfusin. Este mtodo consiste en realizar una perfusin
de la solucin fijadora utilizando el torrente vascular. Es el mtodo
empleado normalmente con animales de experimentacin en los que se
practica una perfusin cardiaca o artica. Con la utilizacin de este
mtodo se consiguen las mejores fijaciones (y por lo tanto las mejores
observaciones histolgicas) puesto que: Se facilita el proceso de
penetracin del fijador al interior de las muestras. Se evita la
deformacin del tejido durante la manipulacin de extraccin
preservndose mejor la estructura de los tejidos blandos. El proceso de
fijacin comienza inmediatamente y se ha comprobado que de esta
forma el nmero de clulas picnticas que se observa en los tejidos es
menor que utilizando otros mtodos de fijacin. Tambin se ha
observado que el nmero de mitosis observado es mayor que utilizando
otros mtodos. Tras la perfusin, usualmente se completa el proceso de
fijacin disecando las piezas objeto de estudio y fijndolas seguidamente
por inmersin.
En ocasiones, pueden combinarse los mtodos fsicos y los qumicos ya sea
secuencialmente o simultneamente. Por ejemplo se puede fijar con
microondas una pieza sumergida en un fijador qumico.

Propiedades de los fijadores
Mecanismos de Fijacin
Los mecanismos de accin de ciertos fijadores son poco conocidos. Es el
caso de los fijadores basados en el uso de sales de mercurio.
La mayor parte de los fijadores establecen entrecruzamientos con
protenas solubles y estructurales formndose, como consecuencia, un
gel que mantiene una estructuracin muy parecida a la observada in vivo
Algunos fijadores interaccionan con los cidos nucleicos.
Fijacin de las protenas
Formaldehido: entrecruzamiento con aminocidos externos
(especialmente con la lisina). Reacciones reversibles durante las
primeras 24 horas. Preserva bastante tantol la capacidad antignica
como la actividad enzimtica. La morfologa suele ser ptima pero la
ultraestructura puede ser deficiente.
Glutaraldehido: formacin de polmeros que establecen
entrecruzamientos con las protenas. Con el paso del tiempo los

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polmeros se van uniendo entre s. Reacciones rpidas e irreversibles.
Puede inhibir tanto la actividad enzimtica como la capacidad antignica.
Se obtiene una muy buena preservacin ultraestructural.

Factores implicados en la fijacin

1. Concentracin del fijador
La capacidad de fijacin de la solucin fijadora que empleemos vendr
determinada por la concentracin del fijador utilizado. A mayor concentracin
mayor fijacin. Sin embargo conviene elegir la concentracin adecuada para
impedir que la interaccin del fijador con el tejido (efecto barrera) sea un
impedimento para la entrada del fijador hacia la parte central de la muestra.
Concentraciones muy elevadas del fijador pueden provocar malas fijaciones
El formol comercial (35%) se utiliza normalmente diluyndolo 10 veces para
preparar la formalina.
El paraformaldehido suele utilizarse en concentraciones del 2 al 4%
El glutaraldehido (que se comercializa al 25%) puede utilizarse a concentracin
entre el 0,1 y 2,5 %
2. Tampn y pH
Pueden utilizarse los fijadores en soluciones acuosas, pero para trabajos ms
finos es necesario que el vehculo est tamponado a un pH determinado (en
funcin del tipo de tejido o de la actividad enzimtica que se desea
determinar).
La morfologa y ultraestructura se mantienen aceptables dentro de un margen
de pH de 6 a 8. Para tejido nervioso se recomienda generalmente un pH de 7.4
Cuales son los tampones ms utilizados?
El tampn fosfato, el tampn cacodilato, o el tampn veronal
Es indiferente elegir un tampn u otro?
No. Hay ciertas precauciones que hay que tener en cuenta:

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o Evitar interacciones entre el fijador y el tampn (Por ejemplo: el
tampn tris y los barbituratos reaccionan con los aldehidos)
o Algunos tampones inhiben ciertas actividades enzimticas mientras
que otros las favorecen (Por ejemplo: el tampn fosfato inhibe la
glucosa 6'-fosfato deshidrogenasa; el tampn trizma-maleato
favorece la determinacin enzimtica de las fosfatasas)
3. Temperatura
Para muchos de los estudios que se realizan en Microscopa ptica las
fijaciones suelen realizarse a temperatura ambiente.
Sin embargo, para estudios Histoqumicos o Inmunocitoqumicos o cuando el
objetivo es realizar un estudio en Microscopa electrnica, las fijaciones
conviene realizarlas en nevera a temperatura de 0-4 grados C.
En general, incrementando la temperatura, se acelera el proceso de fijacin.
Cuando se utilizan bajas temperaturas, hay que aumentar los tiempos de
fijacin.
4. Penetracin de los Fijadores
Cada fijador tiene un coeficiente de difusin intrnseco que indica el grado de
penetracin que posee, expresado en milmetros por hora.
Para facilitar la penetracin de los fijadores, se han de retirar todos los
obstculos que impidan su penetracin (Por ejemplo, para fijar el cerebro hay
que retirar las meninges).
Para facilitar la fijacin, las muestras se han de trocear en rebanadas lo ms
delgadas posibles: Para microscopa ptica, son suficientes rebanadas de 5
mm. de grosor. Para microscopa electrnica se recomienda que estas
rebanadas tengan un grosor menor a 1 mm.
5. Volumen
Que volumen de fijador debemos usar?
Para asegurarnos buenas fijaciones por inmersin es necesario que el volumen
del fijador exceda en una proporcin de 10:1 el volumen de las muestras.
Es conveniente cambiar el fijador una o varias veces a lo largo de la fijacin.
6. Osmolaridad
Es importante ajustar la presin osmtica de la solucin fijadora. Si la solucin
fijadora es isotnica (340 mOsm) o hipotnica, se produce vacuolizacin

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celular. Si la solucin fijadora es muy hipertnica se produce una contraccin
del tejido con retraccin celular.
Cual es la osmolaridad adecuada?
Los mejores resultados se consiguen con una solucin ligeramente hipertnica
de 400 - 450 mOsm.
Cmo se ajusta la osmolaridad?
Para ajustar la la osmolaridad de las soluciones fijadoras se recurre a la adicin
de determinadas sustancias como: dextranos, polivinilpirrolidona, sucrosa
(>5%) o Cloruro sdico (0,9%)
7. Tiempo de Fijacin
Hay que ajustar cuidadosamente el tiempo de fijacin en funcin del fijador
utilizado, de su concentracin, de la temperatura y del objetivo del estudio.
Es conveniente prolongar el tiempo de fijacin?
No, ya que una fijacin excesiva produce efectos adversos como: Retraccin
del tejido; endurecimiento excesivo que dificulta la ulterior obtencin de
cortes; extraccin de algunas molculas; inhibicin de actividades enzimticas;
prdida de caractersticas antignicas; y degradacin general del tejido por
oxidacin de las protenas.

Obtencin de muestras y proceso histolgico

Toda muestra, ya sea procedente de una biopsia, una autopsia, o de un
trabajo experimental (utilizando animales de experimentacin) que deba
estudiarse en el laboratorio de Histologa debe estar bien identificada desde el
principio. Todos los recipientes que la contengan deben estar
convenientemente etiquetados con una referencia adecuada.
Una vez las muestras han sido convenientemente fijadas se ha de proceder
con el desarrollo del proceso histolgico adecuado que permitir la obtencin
de cortes. En funcin de las tcnicas de tincin que se pretendan emplear y del
tipo de estudio que se quiera realizar, las muestras se procesarn de una
forma u otra.

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En ocasiones (cuando se ha de realizar un diagnstico rpido de una biopsia, o
cuando la tcnica lo requiere) puede ser necesario o conveniente obtener
secciones histolgicas sin realizar una fijacin previa. En estos casos las
muestras se congelan rpidamente y se cortan con un microtomo de
congelacin
En trminos generales puede decirse que el proceso histolgico pretende dar
soporte o endurecer lo suficientemente las muestras para permitir la obtencin
de cortes delgados. Para ello puede recurrirse a la utilizacin de medios de
encastracin o medios de inclusin. Cuanto ms se endurezca la pieza y el
medio de soporte, ms delgados podrn realizarse los cortes. En funcin del
tipo de corte que necesitemos utilizaremos un tipo de microtomo.
Consideraremos cuatro procesos histolgicos bsicos:
Proceso histolgico para obtencin de cortes vibratmicos.
Tras la fijacin, las muestras se lavan en tampn de lavado y seguidamente
pueden ser llevadas directamente al vibratomo para ser cortadas. Es un
proceso rpido y sencillo.
Proceso histolgico para congelacin.
Si las muestras no han sido fijadas previamente, se procede a una congelacin
rpida. El agua contenida en el tejido se congela y el propio hielo sirve de
sostn al tejido permitiendo que sea cortado en secciones delgadas. Para
realizar la congelacin pueden utilizarse aerosoles en spray (-50 C) o bien se
procede a sumergir la muestra en nitrgeno lquido (-190 C), o en isopentano
enfriado con nitrgeno (-150 C), o bien en dixido de carbono (-70 C). Una vez
congeladas, las muestras se pueden cortar inmediatamente en un criostato o
bien pueden almacenarse en un congelador (-80 C).
Si las muestras estn convenientemente fijadas, tras lavar el fijador, se
sumergen a temperatura de 4 C en un medio crioprotector (sucrosa al 30%)
que evitar la formacin de grandes cristales de hielo que pueden producir
alteraciones morfolgicas. Una vez ha penetrado el medio crioprotector en la
muestra, la congelacin puede realizarse con dixido de carbono. Con una
congelacin relativamente lenta se obtienen buenos resultados. Una vez
congeladas las muestras pueden cortarse con un criostato o con un microtomo
de congelacin, o bien pueden almacenarse en congelador (-80 C) hasta su
utilizacin. Como precaucin hay que evitar congelar muestras que han sido
fijadas utilizando alcohol, cloruro de mercurio, o dicromato porque endurecen
excesivamente el tejido y lo hacen quebradizo.
Proceso histolgico de inclusin en parafina
Tras la fijacin, las muestras se lavan convenientemente para retirar cualquier
resto de fijador, y seguidamente se deshidratan, se aclaran y se infiltran en

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parafina. El objeto de este proceso es embeber las muestras en una sustancia
como la parafina que tiene una densidad parecida a la de los tejidos y a
temperatura ambiente es solida y lo suficientemente consistente para
confeccionar bloques que pueden ser cortados con un microtomo.
La deshidratacin se suele realizar con concentraciones crecientes de alcohol, o
acetona o bien dioxano: Baos sucesivos de gradacin de 70%, 90% y 100%
(de este ltimo varios cambios)
El aclarado se realiza usualmente con tolueno, xileno o benceno. Estas
sustancias tienen la particularidad de ser miscibles tanto con el agente
deshidratante como con la parafina. Al ser expuestas al agente aclarante, las
muestras suelen transparentarse.
La imbibicin en parafina se realiza calentando sta por encima de su punto de
fusin para que est en estado lquido y pueda infiltrarse en el interior de la
muestra. Existen parafinas con diferente punto de fusin y dureza. Su eleccin
depende de la consistencia del tejido y de la temperatura ambiente del
laboratorio. Una vez infiltradas las muestras con parafina, se confeccionan
bloques con moldes adecuados. Al enfriarse, la parafina se solidifica y el bloque
adquiere una dureza adecuada para ser cortado con el microtomo de parafina
(de deslizamiento o de rotacin). Alternativamente a la parafina pueden
utilizarse otros medios de imbibicin como el paraplast (parafina +
plastificantes).
Dado que todo este proceso es largo, cuando se tienen que procesar
numerosas muestras, se recurre a aparatos automticos denominados
"Autotecnicones" que pueden programarse para que realicen los diferentes
baos de forma automtica. Las muestras siguen todo el proceso en el interior
de unas cpsulas o casettes convenientemente agujereados que permiten el
intercambio de lquidos.
Los bloques de parafina pueden almacenarse indefinidamente hasta que son
cortados.
Proceso histolgico de inclusin en resinas plsticas.
Tras la fijacin adecuada, se sigue un proceso muy similar al descrito para la
inclusin en parafina, pero con ms pasos intermedios. El objeto final el
embeber las muestras en un producto plstico, generalmente una resina, como
la Araldita o el Epon que una vez han polimerizado forman una estructura dura
que permite la obtencin de cortes muy delgados (semifinos y ultrafinos)
utilizando un microtomo especial denominado ultramicrotomo.
Los bloques de resina pueden almacenarse durante aos hasta su utilizacin

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Microtoma

Qu es un microtomo?
Un microtomo es un aparato mecnico de precisin que consta usualmente de
un soporte para colocar la muestra que hay que cortar y una cuchilla de acero
o vidrio que permite realizar los cortes.
Cuantos tipos de microtomos existen?
Existen diversos tipos y modelos de microtomos que permiten la obtencin de
cortes de diferentes grosores en funcin de las tcnicas histolgicas que se
tengan que realizar. Una clasificacin es la siguiente:
Vibratomos: Cortes gruesos (30- 100 m). Los vibratomos disponen de
una cubeta donde la muestra permanece sumergida constantemente en
una solucin (usualmente un tampn de lavado). Una cuchilla vibrante
realiza las secciones que permanecen en el interior de la cubeta.
Microtomos de congelacin y criostatos: Cortes delgados (8-30 m).
Los microtomos de congelacin son aparatos relativamente sencillos que
estn conectados a una bombona de dixido de carbono. Una cuchilla de
acero deslizante permite la obtencin de cortes delgados que se manejan
con un pincel o aguja enmangada. Los criostatos constan de una cmara
refrigerada en cuyo interior queda alojado un microtomo de rotacin.
Mediante una manivela o un mecanismo automatizado se controla el
movimiento y avance de la muestra. Los cortes quedan sobre una
cuchilla metlica y se manipulan con pincel o aguja.
Microtomos de parafina (de rotacin y de deslizamiento): Cortes muy
delgados (5 - 10 m). En los microtomos de rotacin, la muestra sujeta
a un brazo movil se va cortando con ayuda de una manivela rotatoria.
Los cortes se obtienen en tiras que pueden manipularse con pincel o
aguja. En los microtomos de deslizamiento, la muestra permanece fija y
es la cuchilla la que se desliza hasta alcanzar la muestra. El microtomo
de deslizamiento se utiliza generalmente para obtener secciones
histolgicas de gran superficie.
Ultramicrotomos: Cortes semifinos (1-3 m) y ultrafinos (50-100 nm).
Son aparatos muy precisos totalmente automtizados en los que el
avance de la muestra es muy preciso y suele estar controlado
trmicamente. Las cuchillas son de vidrio o de diamante. Los cortes que
se obtienen quedan flotando en la superficie del agua que hay en un
receptculo acoplado a la cuchilla. La manipulacin de los cortes es
crtica y se realiza con un pelo delgado o con una barilla de vidrio.

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Cortes vibratmicos
La ventaja de obtener cortes vibratmicos es que el tejido permanece durante
todo el proceso en un medio acuoso, sin sufrir deshidratacin alguna lo cual
preserva de forma ptima las actividades enzimticas y las caractersticas
antignicas.
Los cortes se toman de la cubeta del vibratomo con un pincel y se van
guardando en botes que contienen tampn de lavado. Pueden obtenerse cortes
seriados relativamente gruesos que pueden procesarse para tcnicas
histoqumicas e inmunocitoqumicas "en flotacin".
Los cortes vibratmicos una vez procesados histoqumica o
inmunocitoqumicamente, pueden incluirse a continuacin en resina o plstico
y ser procesados para Microscopa electrnica.
La obtencin de cortes vibratmicos es relativamente sencilla, pero es un
proceso lento.

Confeccin de cortes con el criostato
Para obtener buenos cortes con un criostato a partir de tejidos sin fijar se
precisan temperaturas de trabajo bastante bajas (alrededor de -25 C). Los
tejidos fijados se cortan a temperaturas superiores (alrededor de -10 C). En
cualquier caso debe ajustarse la temperatura ptima en funcin de las
caractersticas de cada tejido.
Los cortes de criostato se recogen directamente sobre portaobjetos que
pueden procesarse directamente o guardarse en el congelador a -80 C.
Tambin pueden recogerse en botes con tampn de lavado donde permanecen
hasta su utilizacin, pero si se tienen que almacenar durante mucho tiempo es
recomendable mantenerlos a -20 C y utilizar un medio que contenga un agente
crioprotector (solucin de Olmos).
Los cortes de criostato pueden utilizarse para la mayor parte de tcnicas de
tincin rutinarias y son especialmente tiles para desarrollar tcnicas
histoqumicas e inmunocitoqumicas. Son tiles tambin para la demostracin
de sustancias solubles que no resisten el proceso de deshidratacin como son
los lpidos. Sin embargo no pueden emplearse estos cortes para ser

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procesados ulteriormente para microscopa electrnica ya que la
ultraestructura resulta daada por el propio proceso de congelacin y corte.
La obtencin de cortes con el criostato es una tcnica rpida en comparacin
con la de obtencin de cortes en parafina. Es ampliamente utilizada cuando se
precisa estudiar una biopsia y dar un diagnstico rpido.

Cortes en parafina.
Los cortes de parafina constituyen la forma usual de trabajo en un laboratorio
de histologa. Los cortes, relativamente delgados, pueden recogerse fcilmente
de forma seriada. Los cortes, que se manejan con ayuda de un pincel o aguja
enmangada, se depositan sobre la superficie de un bao de agua caliente (38
C) donde con el calor se estiran convenientemente. Seguidamente se recogen
sobre portaobjetos tratados con gelatina, albmina o poli L- lisina y se dejan
secar en una estufa para que se adhiran al vidrio.
La realizacin de cortes de parafina exige experiencia y paciencia.
Para poder teir los cortes de parafina es necesario proceder a retirar
previamente la parafina, lo cual se consigue baando los portaobjetos con los
cortes en un disolovente de la parafina, usualmente xilol.
Los cortes de parafina se emplean para una gran cantidad de tcnicas de
tincin, ya sea topogrficas o especficas. Tambin pueden realizarse algunas
tcnicas histoqumicas e inmunocitoqumicas.

Confeccin de cortes semifinos y ultrafinos
(ultramicrotoma)
Los cortes semifinos obtenidos con un ultramicrotomo se "pescan" de la
superficie del agua de la balsa de la cuchilla de vidrio con una barilla. El
portaobjetos se coloca en una placa caliente y los cortes quedan adheridos al
vidrio. Los cortes semifinos se pueden teir directamente con soluciones
colorantes adecuadas o bien ha de procederse a retirar previamente la resina
plstica mediante la exposicin a un disolvente adecuado. Tras su tincin los
cortese semifinos constituyen un excelente material de estudio en microscopa
ptica.

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Los cortes ultrafinos se recogen sobre rejillas de cobre con ayuda de un pelo
delgado. Las rejillas se guardan en un portarejillas. Tras su contraste, los
cortes ultrafinos se observan con un microsocopio electrnico de transmisin.
La confeccin de cortes semifinos, y sobre todo de cortes ultrafinos, requiere
una gran preparacin tcnica, experiencia y habilidad.

Tipos de tinciones
Existen mltiples mtodos de tincin histolgica, unos generales y otros
especficos, que permiten poner de manifiesto tanto la topografa tisular, como
tipos celulares concretos, determinados orgnulos o estructuras intracelulares.
Las tinciones histolgicas propiamente dichas utilizan colorantes, la mayor
parte de ellos derivados de la industria textil, que se eligen en funcin de su
capacidad de interaccionar con los diferentes constituyentes de los tejidos.
Tcnicas de tincin ms complejas como las histoenzimticas o
inmunocitoqumicas se basan en el empleo de sustratos, lectinas, anticuerpos,
etc.
Que es un colorante?
Un colorante es una molcula que tiene la capacidad de absorber radiaciones
electromagnticas dentro de la regin del espectro visible es decier entre 400 y
650 nm. Los colorantes que absorben todas las radiaciones entre estos
mrgenes, no transmiten ningn tipo de luz y se ven por lo tanto de color
negro. Aquellos colorantes que absorben una franja ms estrecha, transmiten
un color determinado. Por ejemplo el cido pcrico absorbe predominantemente
la luz azul-violeta del final del espectro visible, dando como resultado una luz
transmitida de color amarillo.
Cundo se habla de un buen mtodo de tincin?
Un buen mtodo de tincin es aquel que cuando se reproduce da un alto
porcentaje de xito con resultados equiparables. Todos lo mtodos de tincin
requieren siempre una adapatacin o modificacin para ser utilizados
correctamente. Para reproducir un mtodo de tincin hay que utilizar siempre
reactivos, colorantes y agua destilada de calidad y preparar las soluciones
colorantes en material de vidrio extremadamente limpio. Conviene tener
presente que la tcnica de tincin en s misma no es una tcnica aislada sino
que forma parte integral de todo el proceso histolgico.

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Los protocolos de tincin deben escribirse de forma concisa, anotando de
forma muy precisa indicando claramente todos los pasos necesarios para
preparar todas las soluciones empleadas, tiempos de actuacin, temperatura,
condiciones, etc...
Puede la fijacin interaccionar con la tcnica de tincin?
Los diferentes fijadores interactan de forma diferente sobre las molculas que
componen los tejidos produciendo modificaciones. En un mismo tejido, los
colorantes se comportan de forma diferente en funcin del grado de fijacin y
de la naturaleza del fijador utilizado. Por ejemplo, se conoce que tanto la
formalina como el tetrxido de smio inducen basofilia en los tejidos,
mientras que las soluciones colorantes a base de dicromato inducen acidofilia.
En comparacin con la formalina, el fijador de Carnoy incrementa la avidez del
tejido por los colorantes, mientras que el fijador de Zenker disminuye el grado
de coloracin.
Que es una tincin progresiva y una tincin regresiva?
Una tincin progresiva es aquella en las que los cortes histolgicos se
sumergen en la solucin colorante durante el tiempo necesario hasta que
adquieren el grado de tincin deseada. Cuanto ms tiempo estn los cortes en
la solucin colorante, ms fuerte es la tincin. Una tincin regresiva es aquella
en la que los cortes se "sobretien" dejndolos en la solucin colorante durante
un tiempo excesivo y posteriormente se procede a retirar el exceso de
colorante (proceso que se llama "diferenciacin") mediante tratamiento con
una solucin cida o alcohlica. En este caso se ajusta el tiempo de
diferenciacin.
Qu diferencia hay entre una tincin fsica y una tincin qumica?
En una tincin fsica, el colorante se disuelve en el sustrato. Por ejemplo el
Sudn III se disuelve en las grasas, y es empleado para demostrar gotas
lipdicas. En una tincin qumica, el colorante interacciona qumicamente con el
sustrato a travs de fuerzas de van der Waals, puentes de hidrgeno, enlaces
covalentes o enlaces electrostticos.
Qu es una tincin directa y una indirecta?
En una tincin directa el colorante interacciona directamente con el sustrato.
En una tincin indirecta se hace interaccionar en primer lugar a una sustancia
qumica denominada "mordiente" con el sustrato la cual permite la posterior
interaccin del colorante. Usualmente los mordientes son sales, hidrxidos o
alumbres de metales bivalentes o trivalentes.
Qu es una tincin tricrmica?

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Las tinciones pueden ser simples cuando se utiliza un solo colorante, o
mltiples cuando se usan dos o ms colorantes. En una tincin tricrmica se
emplean tres colorantes, cada uno de ellos con unas particularidades, de tal
manera que se consigue teir con colores diferentes, estructuras diferentes,
permitiendo as su rpida identificacin en el microscopio.
Qu es una tincin supravital?
Es aquella que se realiza sobre clulas frescas, recin obtenidas, con objeto de
realizar una observacin de las estructuras teidas con las clulas vivas. Por
ejemplo, se puede teir las mitocondrias de clulas vivas con el colorante
Verde Jano y observarlas con el microscopio mientras las clulas permanecen
vivas.
Qu es una tincin vital?
Es aquel procedimiento por el cual un colorante no-txico, como el Carmn de
litio o el Azul Tripn, se inyecta en un organismo vivo para estudiar procesos
vitales de clulas capaces de acumularlo por pinocitosis o fagocitosis.
En qu consiste una tincin negativa?
Esta forma de tincin se basa en que el colorante no-tie la estructura que se
desea estudiar, de tal forma que la morfologa externa o los contornos de esa
estructura quedan delimitados por el propio colorante que se encuentra a su
alrededor.
Qu es una tincin de cortes "en flotacin"?
Usualmente los cortes histolgicos se montan sobre portaobjetos antes de ser
teidos lo cual facilita su manipulacin. Sin embargo en ocasiones, sobre todo
cuando se utilizan cortes gruesos de 30-50 micras, obtenidos con un criostato
o con un vibratomo, conviene realizar determinado tipo de tinciones "en
flotacin". Para ello los cortes de tejido se mantienen sumergidos (en flotacin)
en el interior de la solucin colorante lo cual permite la accesibilidad del
colorante por ambas superficies. Este tipo de tcnica es poco comn cuando se
utilizan colorantes pero es habitual cuando se realizan tcnicas de tincin
histoenzimticas o inmunocitoqumicas.
Qu es una tincin en placa?
Es aquella que se realiza utilizando placas de cultivo celulares. Es decir, la
tincin se realiza sobre clulas que se han mantenido vivas en condiciones in
vitro.
En qu consiste una tincin "en bloque"?

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En ocasiones, en algunos tipos de impregnaciones metlicas, tcnicas de Golgi,
etc... conviene realizar la tincin no sobre cortes histolgicos sino sobre la
pieza o bloque de tejido. Para ello el bloque de tejido se sumerge en la
solucin colorante durante un tiempo determinado. Los resultados finales no se
pueden valorar, sin embargo, hasta que no se han confeccionado los cortes y
se realiza la observacin microscpica.
Qu es una tincin para microscopa electrnica?
Para la observacin de los cortes ultrafinos con el microscopio electrnico de
transmisin, es preciso "contrastar" los cortes con objeto de incrementar las
diferencias de densidad electrnica de las diferentes partes de la muestra. Para
ello se recurre al emleo de sales de metales pesados como uranio, wolframio o
plomo.
Qu es una tincin histoenzimtica?
El objetivo de una tincin histoenzimtica es detectar la presencia de un
enzima. Para ello se recurre a una serie de reacciones qumicas que
demuestran la presencia del producto de la actividade enzimtica.
Qu es una tincin inmunocitoqumica?
Las tinciones inmunocitoqumicas o inmunohistoqumica pretenden detectar la
presencia de una molcula con caractersticas antignicas. Para ello se recurre
al empleo de anticuerpos que interaccionan directamente con los antgenos.
Estos anticuerpos pueden estar marcados con una sustancia fluorescente y en
este caso se trata de una tincin de inmunofluorescencia.

Interacciones de los colorantes con los tejidos
Los colorantes interaccionan con las molculas componentes de las estructuras
celulares y tisulares a travs de alguno o varios de los siguientes tipo de
interacciones:
Fuerzas de van der Waals. Son fuerzas de atraccin de corto alcance y
de gran importancia en la interaccin de los sustratos hidrofbicos con
las estructuras aromticas de los colorantes. Es importante por ejemplo
en la tincin de las fibras elsticas (compuesta por la proteina elastina
que es hidrofbica) por colorantes como la orcena cuyo componente
activo presenta anillos aromticos.
Puentes de Hidrgeno. Tienen gran importancia cuando el solvente del
colorante es no-acuoso. Un ejemplo es la interaccin que se produce

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entre el colorante carmn de Best y el glucgeno, tincin que se lleva a
cabo utilizando metanol como solvente.
Enlaces covalentes. Se producen por ejemplo en los sistemas de
tincin que emplean iones metlicos como mordiente entre el colorante y
el tejido.
Uniones electrostticas (de Coulomb). Son las ms frecuentes y se
producen entre las estructuras tisulares cargadas positiva o
negativamente con los aniones o cationes respectivamente de los
colorantes inicos.
Clasificacin de los colorantes
Los colorantes pueden clasificarse en inicos y no-inicos (o hidrofbicos). A su
vez, los colorantes inicos se clasifican en cidos, bsicos y neutros.
Qu es un colorante inico cido?
Es aquel que cuyo principio colorante es aninico (carga negativa) y tiene por
lo tanto afinidad por las estructuras tisulares cargadas positivamente. Estas
estructuras tisulares se dice que son acidfilas.
Qu es un colorante inico bsico?
Es aquel que cuyo principio colorante es catinico (carga positiva) y tiene por
lo tanto afinidad por las estructuras tisulares cargadas negativamente. Estas
estructuras tisulares se dice que son basfilas.
Que es un colorante inico neutro?
Es aquel que tiene un principio colorante aninico (carga negativa) y otro
principio colorante catinico (carga positiva)
Que significa metacromasia?
Un colorante presenta metacromasia cuando tie ciertas estructuras de un
color diferente al suyo propio. Por ejemplo, el azul de toluidina que tie las
estructuras normalmente de color azul (tincin ortocromtica) presenta
metacromasia cuando tie los grnulos de los mastocitos, de color rojo. Esta
propiedad de algunos colorantes se debe a que en algunas circunstancias los
monmeros forman dmeros que presentan un color diferente.

Mtodos de tincin
Metodologa general de tincin de cortes en parafina

17
Para teir cortes en parafina, debe procederse en primer lugar a eliminar la
parafina puesto que no existe ningn colorante que pueda teir a travs de
sta. Para ello se recurre al proceso inverso al utilizado durante la elaboracin
de los bloques de parafina. Es decir, en primer lugar se procede a una
desparafinacin mediante el empleo de un disolvente de la parafina como
pueda ser el xilol. A continuacin se procede a una hidratacin mediante baos
sucesivos de alcohol en gradacin decreciente. Una vez en medio acuoso, se
pueden emplear colorantes hidrosolubles.
Metodologa general de tincin de cortes en congelacin y
vibratmicos.
Los cortes en congelacin y vibratmicos, puesto que ya estn hidratados,
pueden teirse directamente con colorantes hidrosolubles.

Medios de montaje
Para observar adecuadamente los cortes teidos con el microscopio ptico, se
ha de proceder a cubrir las preparaciones mediante un cubreobjetos. Para ello
se requiere la utilizacin de una sustancia cementante o medio de montaje. Si
se quiere asegurar la estabilidad de la tincin histolgica, se utiliza unl medio
de montaje permanente que se ha de elegir en funcin del tipo de tcnica de
tincin empleada.
Si durante la tcnica de tincin se han empleado colorantes hidrosolubles,
deben utilizarse medios de montaje no-acuosos, es decir hidrofbicos.
Consecuentemente, los cortes han de volverse a deshidratar y tratarse con un
disolvente del medio de montaje antes de aplicar ste.
Si por el contrario, los colorantes utilizados son no-inicos, es preceptivo
utilizar un medio de montaje hidrosoluble. Antes de su aplicacin, los cortes
deben hidratarse convenientemente.

Seguridad en el laboratorio
(Preparado por Isabel Venteo Valverde (alumna del curso 98-99)
Todo accidente en el laboratorio ser descrito e investigado con
informes. Los procedimientos de seguridad en caso de incendio estarn
expuestos a la vista.
El equipo de seguridad (extintores, mantas y alarmas) tendr fcil
acceso. Tambin estarn disponibles duchas y lavadores de ojos.

18
El laboratorio estar bien ventilado, controlando los niveles de formol e
hidrocarbonos (xileno y tolueno).
Todo instrumento deber tener instrucciones sobre funcionamiento y
seguridad durante su utilizacin.
Habr archivos de todos los compuestos qumicos usados, indicndose la
naturaleza, toxicidad y precauciones de uso.
El laboratorio dispondr de medios para depositar los restos peligrosos:
los tejidos debern ser almacenados en formol y nos desharemos de
ellos incinerndolos o tirndolos a una trituradora de tejidos conectada a
un amplio alcantarillado para depositar basuras. A menudo se contratan
compaas que se encargan de estos residuos.
Los materiales inflamables estarn en vitrinas especialmente diseadas y
almacenados en habitaciones autorizadas.
Determinados riesgos que se deben conocer:
o El cido pcrico de la solucin de Bouin es explosivo en
forma no hidratada. Cuando las soluciones que
contengan acida sdica sean eliminadas por el
desguace lavaremos ste dejando correr mucha agua
para evitar que esta reaccione con el metal de las ca
eras y lo haga explosivo.
o Los compuestos con bencidina, benceno, antraceno y
naftol son cancergenos. Evitar su uso.
o Las soluciones de mercurio tienen su propio
contenedor. Si se tiran por el desage se forman
resistentes amalgamas con el metal de las caeras.

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Practica 3: Manejo de la lupa y Preparacin de lminas

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