DEPARTAMENTO ACADMICO DE CIENCIA TECNOLOGIA E INGENIERIA DE ALIMENTOS
PRACTICA N 2: ESTERILIZACION
DOCENTE : Blga. M. Sc. ALCEDO ROMERO, Margarita
CURSO : MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS I
ALUMNOS : COARITE GOMEZ, Juan ENCISO LOPEZ, Deyner
CICLO : 2014 I
TINGO MARA PER
I. INTRODUCCION Esterilizacin es el procedimiento por el cual se destruyen los microorganismos y sus formas resistentes, que se encuentran contaminando las superficies de algn objeto o material de estudio en general. El xito de estudio de un microorganismo al estado de pureza depende de la esterilizacin, ya que el material requerido debe de reunir las condiciones necesarias de asepsia que garanticen la exactitud y validez de un diagnostico o estudio de investigacin en particular. Dado que la esterilidad no puede demostrarse de manera absoluta sin causar la destruccin completa de todas las unidades del lote de producto terminado, se define la esterilidad en trminos probabilsticos, en donde la probabilidad de que una unidad de producto est contaminada es aceptablemente remota. Se considera que un producto crtico es estril cuando la probabilidad de que un microorganismo est presente en forma activa o latente es igual o menor de 1 en 1.000.000 (coeficiente de seguridad de esterilidad 10^-6).
Los agentes que matan microbios son denominados microbiocidas (cida= matar) o ms comnmente denominados germicidas. Si el agente especficamente destruye bacterias, es llamado bacteriocida; si mata hongos es denominado fungicida. Como sea despus de exponer el objeto esterilizado al aire o a sus alrededores, ste otra vez se habr contaminado con microorganismos.
Los mtodos trmicos de esterilizacin son comnmente los ms utilizados para eliminar los microorganismos, incluyendo las formas ms resistentes como lo son las endoesporas. II. OBJETIVOS
Proporcionar al estudiante conocimientos bsicos sobre los principales mtodos empleados en la esterilizacin, tanto para eliminacin o destruccin completa de microorganismos contenidos en objetos, productos, etc. Impartir conocimientos de cmo prevenir el ingreso de los microorganismos en un ambiente determinado estril.
III. REVISION BIBLIOGRAFICA
3.1. AUTOCLAVE Una buena esterilizacin por autoclave depende de la eliminacin de todo el aire de la cmara y la carga, de los materiales que van a esterilizarse deben colocarse sin apretarse. Los artculos limpios pueden ponerse en cestillos de alambre, pero el material contaminado debe estar en un recipiente de fondo solido en una altura no mayor a 8 cm. Deben dejarse grandes espacios de aire alrededor de cada recipiente y ninguno debe estar cerrado. Existen dos tipos de autoclave: El tipo olla a presin. El de desplazamiento por gravedad El tipo olla a presin es el ms comn, es para agua hirviendo a presin. Tiene una cmara vertical de metal provista de una tapa metlica fuerte que se aprieta y cierra hermticamente mediante un aro de goma. Se disponen en la tapa una espita para la salida del aire y del vapor, un indicador de presin y una vlvula de seguridad. El agua del fondo de autoclave se calienta mediante mecheros de gas exterior, un calentador elctrico de inmersin o un serpentn de vapor. a.- instrucciones de funcionamiento. Debe haber agua suficiente dentro de la cmara. Se carga el autoclave y se aprieta la tapa manteniendo la espita de descarga abierta. Se ajusta seguidamente la vlvula de seguridad a la temperatura requerida y se conecta a la fuente de calor. Cuando el agua hierva, fluir el vapor por la espita de descarga, arrastrando con l el aire caliente existente en la cmara. Se dejan que salga libremente el aire y el vapor hasta que se haya eliminado todo el aire. La presin del vapor se eleva en la cmara hasta que la presin deseada, generalmente 1,054 kg/cm2, se alcanza y fluye vapor por la vlvula de seguridad. Cuando la carga ha alcanzado la temperatura requerida se mantiene la presin de 15 a 20 min. Al trmino del periodo de esterilizacin, se apaga el calentador y se deja que el autoclave se enfre se abre la espita de descarga muy lentamente una vez que el indicador ha llegado a cero, se deja que el material se enfre hasta que tenga una temperatura a la cual pueda cogerse con la manos. Nunca se debe dejar enfriar el autoclave por mucho tiempo, si no se abre se forma un vaco, el cual puede romper el material estril. Bennett ha elaborado una cinta indicador, la cual se coloca en los materiales, y segn la tonalidad de dicha cinta, se sabe si fue una buena o mala esterilizacin. Tindalizacin: utilizara un vaporizador de Koch, que es una caja metlica en el fondo de la cual hierve el agua mediante un mechero de gas o un serpentn vapor. Se utiliza este mtodo para esterilizar medios de cultivo que pueden alterarse por exposicin a temperaturas ms elevadas. Estos medios se vaporizan durante 30 45 minutos al da durante tres das consecutivos. La primera vez, se matan las bacterias vegetativas; cualquier espora que sobreviva germinar en el medio nutritivo durante toda la noche, dando lugar a formas vegetativas que sern muertas durante la segunda y tercera vaporizacin. b.- desinfeccin Para esto pueden usarse una gran variedad de sustancias qumicas y todas ellas reciben el nombre comn de biosidas. Los efectos del tiempo, temperatura, pH y la naturaleza fsica y qumica del artculo que se va a desinfectar y la materia orgnica presentes, no son a menudo totalmente considerados. Los tipos de desinfectantes son muchos, y su efectividad depende de la sensibilidad de los microorganismos, los ms sensibles son las bacterias vegetativas, los hongos y los virus que contienen lpidos. Las mico bacterias y los virus que no contienen lpidos son menos sensibles y las esporas son por lo general resistentes. En la eleccin de los desinfectantes deben tomarse en cuenta algunas consideraciones acerca de su toxicidad y de los efectos perjudiciales que pueden tener sobre la piel, ojos y vas respiratorias. Los desinfectantes ms utilizados corrientemente en los trabajos de laboratorio son los fenoles y los hipocloritos. Los aldehdos tienen una aplicacin limitada y el alcohol y las mezclas de alcoholes son menos populares, aunque merecen mayor atencin. 3.2. ESTERILAZION Existen dos mtodos esterilizacin en general: A) Por agentes fsicos:
1. El calor
a) Accin directa: flameado es el quemado directo. b) Calor seco: aire caliente es el horno. c) Calor hmedo ebullicin, vapor fluente, vapor discontinuo o tindalizacin y vapor saturado a presin. 2. Filtracin: esto se da mediante bujas filtrantes. 3. Centrifugacin 4. Radiacin
B). por agentes qumicos: utilizando sustancias antispticas que varan en forma y concentracin, segn su accin bactericida. Los antibiticos y quimioterapicos no cumplen siempre con un rol de completa esterilizacin, porque frenan o atenan el desarrollo microbiano.
POR AGENTES FISICOS 1. EL CALOR Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la accin del calor. El calor provoca desnaturalizacin de protenas, fusin y desorganizacin de las membranas y/o procesos oxidativos irreversibles en los microorganismos. La efectividad del calor como mtodo de esterilizacin depende de: Temperatura Tiempo de exposicin
EL CALOR SE PROPAGA POR TRES METODOS Por conduccin, cuando se transmite a travs de la materia sin movimiento aparente de la misma, estando en contacto el cuerpo ms caliente con el ms frio (el calor se propaga de molcula a molcula). Por conveccin, cuando el calor se propaga a travs de la materia, con movimiento apreciable de la misma como sucede en masas liquidas o corrientes areas al ser sometidos a calentamiento (ejemplo: gases propagan el calor por este fenmeno). Por radiacin, cuando el calor se transmite sin necesidad de material intermedio y en forma de ondas. Ejemplo; foco de la luz, que al estar al vaco permite el paso dea radiaciones va siempre en lnea recta, a la misma velocidad de la luz. a) Esterilizacin por flameado, es cuando el material se somete a a accin directa de la llama de un mechero, sin que se altere o sufra deterioro, se esterilizan mediante este mtodo: las asa de siembra, material de diseccin (previo a un bao de alcohol), las bocas delos tubos, matraces, frasco, etc. El calor por este mtodos e transmite por conduccin. Las asas o agujas deben ser esterilizadas antes o despus de su uso para ello se ponen en la flama de un mechero bunsen hasta que se tome rojo y luego se deja enfriar 10 a 15 segundos. b) Esterilizacin por Calor Seco, el calor seco produce desecacin de la clula, efectos txicos por niveles elevados de electrolitos, procesos oxidativos y fusin de membranas. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que estn en contacto con stos. El aire es mal conductor del calor, y el aire caliente penetra ms lentamente que el vapor de agua en materiales porosos. La accin destructiva del calor sobre protenas y lpidos requiere mayor temperatura cuando el material est seco o la actividad de agua del medio es baja. Esto se debe a que las protenas se estabilizan mediante uniones puente de hidrgeno intermoleculares que son ms difciles de romper por el calor seco. La estufa de esterilizacin es el artefacto utilizado en los laboratorios para esterilizar por calor seco. Se requiere mayor temperatura y tiempo de exposicin que el autoclave. La temperatura vara entre 120 y 180C, requirindose distintos tiempos de exposicin. A 140C se necesitan por lo menos 5 horas de exposicin, mientras que a 160C se requieren al menos 2 horas de exposicin. Sirve para esterilizar material de vidrio. El papel y el algodn no pueden ser esterilizados a ms de 160C. Ventajas No es corrosivo para metales e instrumentos. Permite la esterilizacin de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias viscosas no voltiles. Desventajas Requiere mayor tiempo de esterilizacin, respecto al calor hmedo, debido a la baja penetracin del calor. Existen otras formas de eliminar microorganismos por calor seco. La incineracin se utiliza para destruir material descartable contaminado. La accin directa de la llama elimina a los microorganismos cuando se lleva al rojo el material de metal como ansas, lancetas, agujas de diseccin.
c) Esterilizacin por Calor Hmedo, el calor hmedo produce desnaturalizacin y coagulacin de protenas. Estos efectos se deben principalmente a dos razones: El agua es una especie qumica muy reactiva y muchas estructuras biolgicas (DNA, RNA, protenas, etc.) son producidas por reacciones que eliminan agua. Por lo tanto, reacciones inversas podran daar a la clula a causa de la produccin de productos txicos. Adems, las estructuras secundarias y terciarias de las protenas se estabilizan mediante uniones puente de hidrgeno intermolecular que pueden ser reemplazadas y roto por el agua a altas temperaturas. El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho ms elevado que el aire. Por lo que, los materiales hmedos conducen el calor mucho ms rpidamente que los materiales secos debido a la energa liberada durante la condensacin. El calor se propaga por conveccin puede ser: a. Ebullicin, Cuando el material es sometido a la accin directa del agua hirviendo a 100C de temperatura, esta puede elevarse por adiccin de ciertas sustancias qumicas. Por este mtodo se puede esterilizar: jeringas, guantes de jebe, sondas, ropa, etc. Por 40 a 60 minutos. b. Vapor fluente, es cuando se hace actuar sobre el material a esterilizar un chorro continuo de vapor de agua po30 minutos a 1 hora. El vapor debe calentar a 100C los objetos (es la temperatura que se consigue cuando el vapor no contiene aire y es correcta la circulacin de vapor. Se esterilizan por este mtodo, sustancias que s e desnaturalizan a mayor temperatura, ejemplo: gelatina, bilis, leche. El aparato que se usa es el aparato de Arnold. c. Vapor discontinuo o tindalizacin, es cuando acta el calor en forma fraccionada por tres das sucesivo a 100C durante 30 a 40 minutos. En el primer da se destruirn las formas vegetativas, en el segundo da las formas ms activas germinadas de esporas y en el tercer da las formas esporuladas. Mediante este mtodo se esterilizan: sustancias orgnicas que sufren descomposicin a altas temperaturas. Los aparatos de Arnold y de Coch, son muy recomendados. d. Vapor de agua saturada a presin, es uno de los mtodos ms seguros y efectivos. Permite una esterilizacin completa de la mayora de los medios de cultivo, y soluciones que no contienen sustancias de fcil desnaturalizacin. Se emplea en este mtodo las autoclaves, las comunes son: modelo de chamberland, las actuales son elctricas, y el funcionamiento es automtico. El autoclave se logran temperaturas superiores a la temperatura de ebullicin del agua mediante un aumento de presin. El autoclave funcin a 10-145 libras de presin, por encima de la presin atmosfrica normal, a esta presin el agua hierve a 121C en lugar de 100C (a la presin atmosfrica normal). Manteniendo la temperatura de 121C a una presin de 15libras de presin durante 15 minutos, posible la destruccin de toda forma viva en el material a esterilizar Autoclave: Es el aparato ms comnmente utilizado en los laboratorios para esterilizar cultivos y soluciones que no formen emulsiones con el agua y que no se desnaturalicen a temperaturas mayores a 100 C. Una temperatura de 121 C (una atmsfera de sobrepresin) con un tiempo de exposicin mayor a 15 minutos sirve para destruir organismos formadores de esporas. . Ventajas Rpido calentamiento y penetracin Destruccin de bacterias y esporas en corto tiempo No deja residuos txicos Hay un bajo deterioro del material expuesto Econmico Desventajas No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metlicos.
2. FILTRACIN Se usan membranas filtrantes con poros de un tamao determinado. El tamao del poro depender del uso al que se va a someter la muestra. Hay que tener en cuenta que los filtros que se utilizan generalmente en los laboratorios no retienen virus ni micoplasmas, estos ltimos estn en el lmite de separacin segn el dimetro de poro que se utilice. Existen tres tipos bsicos de filtros: Filtros profundos o Filtros de profundidad: consisten de un material fibroso o granular prensado, plegado, activado, o pegado dentro de los canales de flujo. En este tipo de filtros la retencin de las partculas se produce por una combinacin de absorcin y de retencin mecnica en la matriz. Membranas filtrantes: tienen una estructura continua, y la retencin se debe principalmente al tamao de la partcula. Partculas ms pequeas al tamao del poro quedan retenidas en la matriz del filtro debido a efectos electrostticos. Filtros de huella de nucleacin (Nucleoporo): son pelculas muy delgadas de policarbonato que son perforadas por un tratamiento conjunto con radiacin y sustancias qumicas. Son filtros con orificios muy regulares que atraviesan la membrana verticalmente. Funcionan como tamices, evitando el paso de toda partcula con un tamao mayor al del poro
3. CENTRIFUGACIN
4. RADIACIONES La accin de las radiaciones del tipo de radiacin y el tiempo de exposicin. a). Radiaciones ionizantes: Producen iones y radicales libres que alteran las bases de los cidos nucleicos, estructuras proteicas y lipdicas, y componentes esenciales para la viabilidad de los microorganismos, dando lugar a mutaciones en los microorganismos que los incapacitan metablicamente para producir una enzima esencial y sobreviniendo la muerte bacteriana. Las radiaciones tienen gran penetrabilidad y se las utiliza para esterilizar materiales termolbiles (termosensibles) como jeringas descartables, sondas, etc. Se utilizan a escala industrial por sus costos. b). Rayos Gamma: Su empleo esta basado en los conocimientos sobre la energa atmica. Este tipo de esterilizacin se aplica a productos o materiales termolbiles y de gran importancia en el campo industrial. Puede esterilizar antibiticos, vacunas, alimentos, etc. c). Rayos X: Penetran bien, pero requieren mucha energa, son pocos operativos para su empleo masivo, su uso es muy costoso, por lo tanto son muy poco usados con fines de esterilizacin d). Rayos Ultravioletas: Afectan a las molculas de DNA de los microorganismos. El ADN absorbe una longitud de onda de 2600 y libera energa ocasionado rearreglo de enlaces qumicos son escasamente penetrantes y se utilizan para superficies, se utilizan para la esterilizacin en quirfanos. Esterilizacin Esterilizacin: eliminacin o muerte de todos los microorganismos que contiene un objeto o sustancia, y que se encuentran acondicionados de tal forma que no pueden contaminarse nuevamente. Satirizante: agente que disminuye la carga microbiana total a un nivel el cual es seguro para la salud de la poblacin. Slo es aplicable sobre objetos inanimados. Desinfectante: agente que elimina la carga microbiana total en superficies inanimadas tales como habitaciones. Antisptico: agente que controla y reduce la presencia de microorganismos potencialmente patgenos sobre piel y/o mucosas (slo pueden aplicarse externamente sobre seres vivos).
Esterilizacin Agentes qumicos Dentro de los compuestos qumicos podemos encontrar agentes esterilizantes, desinfectantes y antispticos. La efectividad de estos agentes depende de las condiciones bajo las que actan. Concentracin: vara con el tipo de agente y de microorganismo, pues una misma concentracin del agente puede producir un efecto diferente en distintos microorganismos. Tiempo: los microorganismos no son susceptibles a un agente en la misma forma, por lo que no todos los microorganismos mueren al mismo tiempo. pH: afecta tanto a los microorganismos como a los agentes qumicos. El aumento de pH por encima de 7 incrementa la carga negativa de los microorganismos afectando la concentracin del agente sobre la clula. El pH determina el grado de disociacin y la efectividad del agente qumico, pues a menor disociacin mayor permeabilidad y mayor efectividad. 2
Antispticos Alcoholes Lesionan la membrana celular de los microorganismos y desnaturalizan protenas celulares. Desorganizan la estructura fosfolipdica. No destruyen esporas y tienen una accin germicida lenta. Los alcoholes de cadena corta tienen un efecto nocivo mayor que los de cadena larga. Se utilizan en concentraciones del 50 al 70%. Los ms utilizados son el etanol e isoproplico. Iodo Es un agente oxidante que modifica grupos funcionales de protenas y cidos nucleicos. Inactiva protenas y enzimas por oxidacin de los grupos -SH a S-S, pudiendo atacar tambin grupos amino, ndoles, etc. Se utiliza como desinfectante de la piel (tintura de iodo: yodo molecular 2% y yoduro de sodio 2% en alcohol), aunque es irritante. Es efectivo contra esporas en una concentracin de 1600 ppm de iodo libre.
Agentes inicos y anfteros Son sustancias que lesionan la membrana celular debido a que desordenan la disposicin de las protenas y de los fosfolpidos, por lo que se liberan metabolitos desde la clula, se interfiere con el metabolismo energtico y el transporte activo. No son esporicidas ni tubercolicidas an en altas concentraciones. Sus principales ventajas se hallan en que son inodoros, no tien, no son corrosivos de metales, estables, no txicos y baratos. Catinicos: Sales de amonio cuaternarias. Tienen mayor actividad a pH alcalino y los Gram + son ms susceptibles. Aninicos: Jabones y cidos grasos. Tienen mayor actividad a pH cido y son eficaces contra Gram +. Anfteros: Actan como catinicos o aninicos segn el pH. 3
PREPARACION PARA LA LIMPIEZA Y ESTERILIZACION
El material de vidrio se caracteriza por su gran resistencia a cidos y bases, destacando el vidrio Pirex o borosilicatado que ofrece gran resistencia trmica. La nica precaucin a tener en cuenta es que no se debe utilizar para conservar disoluciones concentradas de bases. El material de plstico puede ser de diferentes tipos de polmeros, aunque el ms frecuente es el polipropileno. Cuando se emplea material de plstico hay que tener en cuenta las disoluciones que va a contener ya que algunos plsticos pueden ser atacados. El material metlico puede ser de distintos metales dependiendo de su funcin. Para estar en contacto con los compuestos se utiliza aceros especiales que no sean atacados. LIMPIEZA DE MATERIAL: Lavado, enjuagues y secado
Para que los resultados obtenidos en el laboratorio sean fiables se ha de mantener la mesa de trabajo limpia y se debe limpiar el material de laboratorio de forma adecuada lo antes posible. En general, el material de vidrio se suele lavar en primer lugar con agua y jabn y se enjuaga con agua del grifo. Sin embargo hay que tener en cuenta que:
hacer la limpieza tan pronto como sea posible, recipientes con cultivo o materiales contaminados, esterilizar en autoclave antes de lavar, para ello quitarle los tapones, para pipetas colocar en una solucin bactericida, por 24 horas.
Si se ha usado para disolventes orgnicos puros no solubles/miscibles con agua de p.eb. < 100C basta dejar evaporar los restos de disolvente.
Si se ha usado para disolventes orgnicos de p.eb > 100 C o disoluciones de compuestos orgnicos no solubles en agua, eliminar primero el material insoluble con una pequea cantidad de acetona. Posteriormente se puede lavar con agua y jabn.
Si se va a utilizar en experimentos en los que interfieren las sales que acompaan al agua del grifo: se lava el material (por arrastre) con agua destilada/des ionizada tantas veces como sea necesario. Una vez lavado si se va a necesitar el material seco: 1. Eliminar el exceso de agua del lavado sacudiendo ligeramente el material o dejando escurrir. 2. Enjuagar con una pequea cantidad de acetona deslizndola por toda la superficie a secar. 3. Desechar la acetona al frasco de residuos. 4. Dejar secar el material a l aire o secarlo con el secador de mano o en la estufa teniendo en cuenta que nunca se debe de poner en la estufa el material volumtrico (pipetas, buretas, matraces aforados, etc.)
PREPARACION DEL MATERIAL DESPUES DE LA LIMPIEZA PARA SU ESTERILIZACION 1. confeccionar tapones de algodn para tubos y matraces, colocarlos cuando se va a esterilizar. 2. proteger el material de vidrio con papel o con recipientes de metal como en el caso para pipetas y placas Petri.
IV. MATERIALES Y METODOS
1.- PREPARACION PREVIA DEL MATERIAL DE VIDRIO PARA SU ESTERILIZACION.
MATERIALES: Materiales de vidrio como: pipetas, palcas de Petri, tubos de prueba jeringas descartables, balones matraces, Erlenmeyer, kitasato, etc. Papel kraff, en lneas y tiras, en trozos rectangulares y cuadrados. Algodn. Pedazo de papel engomado/pabilo.
PROCIDIMIENTO 1.- LIMPIEZA: El material de vidrio se debe lavar con un detergente adecuado, ayudndose de escobillas o esponjas frotando bien las superficies internas de los frascos y tubos. Usar abundante agua hasta eliminar completamente el detergente. Enjuagar nuevamente esta vez con agua destilada y dejar escurrir el soporte especial. Nota: si es necesario hacer secar en horno para luego ser esterilizados.
2. PREPARACION DE MATERIAL PARA SU ESTERILIZACION
a).- PREPARACION DE TUBOS EN PRUEBA: Preparar tapones de algodn y colocarlos en los tubos de prueba a esterilizar. Hacer manojos de tubos taponados PROCIDIMIENTO DE ESTERILIZACION DE LA PRCTICA El tcnico de laboratorio preparo dos muestras de caldo nutritivo para su esterilizacin previamente se calibro la autoclave a una temperatura de 100 C ; seguidamente se coloc uno de los matraces que contena la muestra ( caldo ) en la autoclave. Pasado unos minutos la temperatura llego a 121 C/ 15 min. Debido a que la presin en la autoclave era de 15 lb. o 1.5 atm.
El color permanece igual (amarillo translucido), no se ve presencia de M.O, a simple vista; en el fondo se ven pequeos residuos de color blanco.
B ( sin auto clavar)
Se observa un cambio de color (color amarillo opaco). Presencia de precipitado blanquecino en la parte inferior del matraz con olor ftido, boca sucia y maloliente.
VI. DISCUSION
Despus de una investigacin terica para la realizacin de esta prctica, estudiamos conceptos bsicos para la preparacin de medios de cultivo; as como los tipos de esterilizacin. En esta prctica se utiliz un mtodo fsico: presin a vapor, es decir autoclave que posee los requisitos indispensables (temperatura y tiempo de exposicin) y es lo ms recomendable para eliminar los microorganismos que pudieran haber quedado en el medio.
VII. CONCLUSION
En conclusin, se puede afirmar lo que dice la investigacin terica, acerca de realizar una buena esterilizacin por el mtodo del auto clavado. Nuestros resultados no fueron tan favorables como se mostraba en la prctica por la baja resolucin del microscopio. Se lleg a conocer de cmo prevenir el ingreso de los microorganismos en un ambiente determinado estril por medio de la teora y explicacin de la profesora del curso.
VIII. BIBLIOGRAFIA
1.- Arevalo, J.; Abecia, L.: Jornadas Internacionales de Actualizacin en Esterilizacin y Procedimientos de Limpieza en Cirugia. 1991.
2.- Block, S.: Disinfection, sterilization and preservation. Lea and Febiger. Filadelfia. 1991. 3.- Loscos, P.: Planificacin y organizacin de un servicio de esterilizacin hospitalaria: Libro de ponencias de las Primeras Jornadas sobre esterilizacin de la Comunidad Valenciana. Generalitad Valenciana. 4.- http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/ metodos de esteri l zacion.pdf: Mtodo estril y Medios de cultivo por la Prof. Sofa Gutirrez de Gamboa (Octubre 2001).