Universidad de Caldas

INVESTIGACIN Y RECUENTO DE CLOSTRIDIUM SULFITO REDUCTORES

Lorena R. Portilla, Diana Carolina L. Crdenas, Leonardo O. Alvarn
1

Microbiologa De Alimentos.
23/ 05/ 2012


RESUMEN: El objetivo del presente trabajo ha sido la identificacin y recuento de
esporas de Clostridium sulfito reductores mediante siembra en tubo de agar SPS,
en a partir de una muestra de leche en polvo. Despus de escoger el alimento se
licua y se agita fuertemente la muestra para homogeneizarla, se realizaron las
diluciones correspondientes, una vez preparadas las diluciones, los tubos de
ensayo con su respectivo contenido se mantuvieron en un bao Maria a 80C
durante 510 minutos y se sometieron a un choque trmico introducindolos
despus en agua con hielo, a efecto de que se destruyan las formas vegetativas y
permanezcan solamente las formas esporuladas. Luego se tomaron los tubos con
agar SPS a 50C y se procedi a su inoculacin profunda, de la siguiente manera:
1) Con una pipeta estril se tomaron 5 mL de dicha agua e introducirla hasta el
fondo del tubo que contiene el agar. 2)Con mucho cuidado se fue depositando el
agua a lo largo de todo el tubo desplazando la pipeta al exterior procurando que el
total de la muestra quede en el agar y no se airee. 3) Rpidamente se pas el tubo
a la llave del agua para enfriarlo.4) Despus se aadi una capa de agar agar
estril de unos 3 mm de espesor para conseguir condiciones de anaerobiosis y
luego se repiti este procedimiento con los tubos restantes. Una vez inoculados
todos los tubos, se incubaron a 37C (1C) durante 24 h (2 h) y al haber pasado
el perodo de incubacin, se contaron las colonias de color negro que aparecieron
en la totalidad de los cuatro tubos inoculados.
La muestra de leche en polvo analizada en el laboratorio incumple con los
requisitos declarados por el DEC. 2437/83 ya que se obtuvo un recuento de 3000
UFC /g. hacindola no apta para el consumo humano.
Palabras claves: clostridium sulfito reductores, agar SPS, anaerobiosis..



INTRODUCCIN


1
Correos: dianacarol2404@hotmail.com, lorenaruanoportilla@hotmail.com, leo-oan@hotmail.com
Comment [U1]: ok
Comment [U2]: No se debe entrar en tanto
detalle de la metodologa en el resumen
Comment [U3]: ok
La contaminacin microbiana de alimentos es un problema serio para la industria
alimentaria por las grandes prdidas econmicas que trae consigo. Este fenmeno
es mixto por la participacin de bacterias, hongos filamentosos y levaduras, pero
ha sido estudiado mayormente en bacterias y hongos filamentosos por su
protagonismo en el dao.
Clostridium sulfito reductores son bacterias Gram positivas, esporuladas,
anaerobias, que tienen la capacidad de reducir sulfito a sulfuro y de producir
esporas, esto le confiere una gran resistencia. Se utilizan como indicadores de
contaminacin fecal antigua.
Entre las bacterias productoras de ETAs encontramos el Clostridium entre las
especies que ms se destacan en alimentos son: C. botulinum es el nombre de la
bacteria que produce la enfermedad del botulismo. Es formador de esporas y un
potente productor de neurotoxina, aunque la incidencia de la enfermedad es baja
es considerada de inters debido a la elevada tasa de mortalidad si no se
diagnostica y trata apropiadamente. Y C. perfringens est ampliamente distribuido
en la atmsfera y se halla frecuentemente en el intestino humano y de muchos
animales domsticos y salvajes. Las esporas del microorganismo estn presentes
en el suelo, sedimentos y reas sujetas a la polucin fecal por humanos y
animales.
El objetivo principal de esta prctica es aprender a usar las herramientas
disponibles en el laboratorio para determinar la presencia de esporas de clostridios
sulfito-reductores a partir productos alimenticios de origen animal por el mtodo de
recuento en tubo, basndose en el recuento del nmero de colonias de clulas
vegetativas o sus esporas con capacidad sulfito-reductora, desarrolladas en un
medio de cultivo especfico, incubadas en condiciones anaerbicas durante un
tiempo y temperatura determinadas.


MATERIALES Y MTODOS

Se realiza la preparacin de la muestra, en este caso una muestra de leche en
polvo, de la cual se pesan 10g en la balanza analtica y se diluyen en 90 ml de
agua peptonada, realizando asi la dilucin 10
-1
, tomando con una pipeta 1ml de la
dilucin inicial y transfiriendo a 9ml de agua peptonada se realizan diluciones
logartmicas hasta 10
-3
.
Despus de tener las diluciones 10
-2
y 10
-3
se procede a transferirlas a un bao
serolgico por 10 minutos, al retirarlas del bao se enfran rpidamente en un
beaker con agua y hielo, posteriormente al disminuir su temperatura, se procede a
transferir 1ml de cada dilucin a un tubo con agar SPS fundido (realizar por
duplicado), dejar solidificar.
Para crear un ambiente de anaerobiosis, a los tubos con el agar y la muestra ya
solidificados se le adiciona un tapon de agar-agar fundido, se deja solidificar este y
se incuba por 37C durante 72 horas.
Para realizar el conteo de las colonias, se cuentan las colonias negras ya que el
medio de cultivo utilizado contiene sulfito de sodio y las bacterias Clostridium
sulfito reductores ejercen una accin sulfito-reductora sobre el sulfito de sodio
Comment [U4]: Redactar en tiempo pasado.
Comment [U5]: A qu temperatura?
reducindolo a sulfuro, el sulfuro reacciona con el citrato ferrico formando un
precipitado de sulfuro de hierro alrededor de las colonias, lo que permite contarlas.

Muestra: leche en polvo







Pesar 10g de la muestra










Preparacin diluciones:
10
-1
: 10g muestra + agua peptonada
10
-2
y 10
-3
: 1ml + 9ml agua peptonada














Someter las diluciones a bao
serolgico por 10 min














Por duplicado transferir 1ml de cada
dilucin a agar SPS fundido















Dejar solidificar
















Agregar agar-agar fundido para crear
un tapn de anaerobiosis.









Dejar solidificar e incubar a 37C por
72 horas.















Resultados:
(Contar colonias negras)



RESULTADOS

VOLUMEN DE LA MUESTRA
INOCULADA (ml)
TUBO NMERO DE COLONIAS
0.01 DILUCIN 10
-2
INCONTABLE
0.01 DILUCIN 10
-2
INCONTABLE
0.001 DILUCIN 10
-3
3
0.001 DILUCIN 10
-3
AUSENCIA




Ilustracin 1 ECSR antes de la incubacin Ilustracin 2 ECSR despus de la incubacin


Ilustracin 3 10
-3
recuento de ECSR

NMERO TOTAL DE COLONIAS: 3
VOLMEN DE MUESTRA INOCULADA: 0.001
FORMULA GENERAL:
(3 colonias / 0.001 ml) * 10 = 30000
Nmero de esporas de clostridios sulfito-reductores: 30000/ 10 g


ANALISIS

Se seleccionaron las cajas con menos de 150 colonias y se contaron todas las
colonias negras, presuntivas de ser esporas de Clostridium sulfito reductor, de las
cuales solo un tubo con dilucin de 10
-3
se obtuvo recuento contable.
Segn el DEC. 2437/83 Por el cual se reglamenta parcialmente el Ttulo V de la
Ley 9a de 1979, en cuanto a Produccin, Procesamiento, Transporte y
Comercializacin de la leche, nos dice que el recuento de esporas para clostridium
sulfito reductor, debe hacerse con 3 muestras, donde el rango tiene que estar
entre 100 y 1000 UFC/g y donde solo se permite que una de las muestras
analizadas tenga un resultado entre m y M los lmites permitidos. La muestra de
leche en polvo analizada en el laboratorio incumple con estos requisitos ya que se
obtuvo un recuento de 3000 UFC /g. hacindola no apta para el consumo humano.
Comment [U6]: Ojo, para hacer el calculo de los
resultados no se toma solo un tubo de los 4.

Este reporte no es correcto
Comment [U7]: Ok, asumiendo que el reporte
haya sido correcto.
Este resultado en la leche en polvo se puede justificar ya que el Clostridum
Perfringens es muy resistente a las elevadas temperaturas y a la desecacin.
Adems la muestra analizada posee un pH muy cercano al ptimo de este
microorganismo que es 6.8 facilitando as su presencia.
En el recuento obtenido se puede decir que se present una deficiencia en alguna
de las etapas involucradas a lo largo de todo el proceso, o un mal manejo del
producto en la disposicin para la venta, de manera que la condicin de
almacenamiento hubiese permitido el crecimiento, lo cual lleva a que este alimento
que no sea inocuo.

C. perfringens Est ampliamente distribuido en la atmsfera y se halla
frecuentemente en el intestino humano y de muchos animales domsticos y
salvajes. Las esporas del microorganismo estn presentes en el suelo, sedimentos
y reas sujetas a la polucin fecal por humanos y animales. Y es uno de los
microorganismos productores de ETAs.

Es un indicador apropiado de contaminacin fecal antigua, intermitente, adems
de que es de gran utilidad cuando los coliformes estn ausentes pues indica de
igual forma contaminacin fecal antigua y por lo tanto una mala manipulacin.


CONCLUSIONES

Los anaerobios sulfito-reductores se han propuesto como indicadores de
contaminacin de alto riesgo del agua y en nuestro caso de alimentos, ya
que poseen ventajas tan importantes como esporas y como
microorganismo viable, pueden sobrevivir en el agua mucho ms tiempo
que los organismos del grupo coliformes y son resistentes a la desinfeccin.
La evaluacin de los resultados nos permite concluir que el alimento no es
apto para el consumo pues la presencia de este microorganismo es alta y
segn la legislacin no est permitida la presencia de estos
microorganismos.
Pudimos observar que los dos tubos con dilucin de 10-2 estaban
altamente contaminadas lo que nos permite concluir que el alimento estaba
altamente contaminado.
Aunque elevamos la temperatura y sometimos las diluciones a un choque
trmico, las colonias de clostridium aun as crecieron en los medios de
cultivo lo que nos permite identificar claramente la capacidad de dicho
microorganismo para producir esporas.


BIBLIOGRAFIA

COLOMBIA. MINISTERIO DE SALUD. Decreto 2437 (30 de agosto de
1983). Por el cual se reglamenta parcialmente el Ttulo V de la Ley 9a de
Comment [U8]: ok
Comment [U9]: Esto es teora
Comment [U10]: ok
Comment [U11]: ok
Comment [U12]: ok
1979, en cuanto a Produccin, Procesamiento, Transporte y
Comercializacin de la leche.
Martnez. M, 2011. Guas de Laboratorio. Microbiologa de Alimentos.