Temuco, 4 de Abril del 2014

Universidad de La Frontera
Facultad de Ingeniera, Ciencias y Administracin
Departamento de Ciencias Qumicas y Recursos Naturales



"EXTRACCIN DE ADN GENMICO EN TEJIDO VEGETAL"


NOMBRES: Ricardo Godoy
Sebastin Hernndez
PROFESOR: Dra. Marjorie Reyes
ASIGNATURA: Biologa Molecular






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1.- INTRODUCCIN
1.1 Tejido vegetal
El cido desoxirribonucleico (ADN) vegetal se encuentra rodeado por una serie de
estructuras que lo mantienen protegido. La resistencia del tejido vegetal es proporcionado por la
pared celular.
La pared celular es una especie de exoesqueleto que le da proteccin y sostn mecnico a la
clula vegetal y determina su forma (Robertis et.al, 2012).

1.2 Extraccin de ADN genmico
Los mtodos de aislamiento de cidos nucleicos, sin importar el tipo o procedencia,
siguen siempre cuatro etapas bsicas: 1. Lisis celular, 2.Inhibicin de nucleasas, 3.
Desproteinizacin y 4. Precipitacin de cidos nucleicos (Giraldo et al., 2010).

1.3 Cuantificacin de ADN genmico mediante Espectrofotmetro
La concentracin del ADN se puede estimar utilizando un espectrofotmetro de luz
ultravioleta (UV) a una longitud de onda de 260 nm, debido a que las bases pricas y
pirimidnicas tienen la propiedad de absorber la luz UV a esa longitud de onda (Concepcin J.
et.al,2005).

1.4 Visualizacin de ADN genmico mediante Electroforesis en gel de agarosa al 1%
Es un mtodo bastante utilizado para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN.
La agarosa es un polmero lineal, extrado de algas marinas, en el cual las molculas de ADN
migran en la cmara de electroforesis desde el polo negativo hacia el polo positivo, esto dado a
que el ADN est cargado negativamente gracias a los grupos fosfatos de la molcula (Concepcin
J. et.al,2005).

2.- OBJETIVOS
2.1 Objetivos Generales
Extraer ADN genmico a partir de una muestra vegetal.
Cuantificar la concentracin de ADN genmico.
Visualizar el ADN genmico.


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3.- MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS
3.1 Materiales
Los materiales utilizados para la realizacin del prctico fueron los siguientes:
- Muestra vegetal (ptalos de Viola x wittrockiana). - Centrfuga.
- Solucin de Chomczynski. - Hielo.
- Nitrgeno lquido. - Espectrofotmetro.
- Cloroformo. - Gel de agarosa al 1%.
- Etanol absoluto ( a 20C). - Microondas.
- Etanol al 95% (a 20C). - Matraz.
- Agua destilada estril. - Cmara de electroforesis.
- Tubos Eppendorf de 1,5 ml. - Bromuro de etidio.
- Mortero. - Buffer de carga.
- Guantes. - Fuente de poder.
- Micro pipetas.


3.2 Procedimientos
3.2.1 Extraccin del ADN mediante el mtodo de Chomczynski
1. Se pulveriz el tejido con nitrgeno lquido en un mortero para luego homogenizar con
1,5ml de Chomczynski.
2. El homogenizado se transfiri a un tubo eppendorf y se centrifug a 10000 g
durante 10 minutos y a temperatura ambiente.
3. El sobrenadante se transfiri a un nuevo tubo y se adicionaron 200 l de Cloroformo, se
agit y se centrifug a 10000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
4. Se transfiri el sobrenadante a un nuevo tubo y se agregaron 500 l de EtOH absoluto.
Luego se procedi a mezclar por inversin y se dej reposar por 3 minutos a
temperatura ambiente para luego centrifugar a 4000g durante 2 minutos a temperatura
ambiente.
5. El pellet se lav dos veces en 200 l de etanol al 95% y se dej secar a temperatura
ambiente. En cada lavada se centrifug a 4000 g durante 2 minutos a temperatura
ambiente.
6. Finalmente se sec el pellet y se re suspendi en 500 l de agua destilada estril.

3.2.2 Cuantificacin del ADN en Espectrofotmetro
1. Se utiliz agua como blanco y se midi la muestra a 230, 260 y 280 nm.

3.2.3 Visualizacin del ADN por Electroforesis en gel de agarosa al 1%

1. Se prepar el gel al 1% (1 g en 100ml de agua estril) y se llev a un microondas para
disolver la agarosa. Luego se agreg la solucin de agarosa y bromuro de etidio en el
holder de la cmara de electroforesis y se esper hasta que gelifique.
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4.- RESULTADOS
4.1 Determinacin de la concentracin de ADN genmico extrado de la muestra de Viola x
Wittrockiana
Para calcular la concentracin real de ADN genmico de la muestra se tuvo en cuenta la
dilucin realizada experimentalmente (ver Tabla 1) adems de los valores de absorbancia
obtenidos mediante el espectrofotmetro a 260 nm (ver Tabla 2). El clculo de la concentracin
se efecto utilizando la ecuacin correspondiente (ecuacin 1).
Tabla 1. Dilucin realizada en la muestra y factor de dilucin obtenido.
l muestra l agua destilada
estril
Factor de dilucin
Dilucin realizada 40 120 3

Ecuacin 1. Frmula para determinar la concentracin de ADN.
ADN (g/l) = absorbancia a 260 nm x factor de dilucin x 50 (g/l)

Tabla 2. Determinacin de la concentracin real de ADN genmico existente en la muestra de
Viola x Wittrockiana.
Absorbancia a 260
nm
Factor (g/l) Factor de dilucin Concentracin
existente (g/l)
1,94 50 3 291

4.2 Determinacin de la pureza del ADN genmico extrado
Para poder hacer una estimacin de la pureza de la muestra de ADN, se tuvo en
consideracin las absorbancias a 230 nm utilizada para azcares, 260 nm para cidos nucleicos y
280 nm para protenas (ver Tabla 3). Las relaciones de estas absorbancias son el parmetro
establecido para determinar la pureza de ADN en la muestra de Viola x Wittrockiana (ver Tabla
4).
Tabla 3. Valores de absorbancia para cada longitud de onda.
Longitud de onda Absorbancia
230 nm 1.81
260 nm 1.94
280 nm 1.18



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Tabla 4. Relaciones de absorbancia para determinar la pureza en la muestra de ADN genmico.
Relacin Pureza
A260/230 nm 1.07
A260/280 nm 1.65

4.3 Visualizacin de ADN genmico de Viola x Wittrockiana
La electroforesis en gel de agarosa realizada en el laboratorio, con el fin de visualizar el
corrimiento de los cidos nucleicos hacia el nodo del instrumento, puede verse a continuacin
(ver Figura 1).


Figura 1. Fotografa correspondiente a varias muestras de ADN que migraron en un gel de
electroforesis. El pocillo marcado en el cuadro rojo posee la muestra de Viola x Wittrockiana.










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5.- DISCUCIN
En el procedimiento espectrofotomtrico se determina la absorbancia del extracto de
ADN a diversas longitudes de onda para determinar su concentracin y su pureza con respecto a
otras sustancias que podran estar incluidas en el extracto (polisacridos, protenas, ARN, etc). La
medida de la absorbancia a 260 nm permite cuantificar la concentracin de cidos nucleicos,
mientras que la relacin entre esta absorbancia y la determinada a otras longitudes de onda (por
ejemplo, 230 nm para fenol y polisacridos, 280 nm para protenas) permite determinar la pureza
relativa del extracto. (Elosegi, Sabater. 2009).
Dado que las protenas absorben a 280 nm, se emplea el cociente A260/A280 para calcular la
pureza de los cidos nucleicos. Los cocientes respectivos del ADN y ARN puros son
aproximadamente de 1,8 y 2,0. Una absorcin a 230 nm significa que la muestra est
contaminada con hidratos de carbono, pptidos, fenoles, compuestos aromticos u otras
sustancias. El cociente A260/A230 de las muestras puras es de 2,2 aproximadamente. (Somma.
2012).
En base a lo citado anteriormente la extraccin de ADN realizada obtuvo un grado de pureza
deficiente, existiendo alta cantidad de contaminacin tanto de azcares como de protenas. Las
causas de este resultado pueden ser que el protocolo de extraccin no era el adecuado para una
especie como la Viola x Wittrockina, la cual puede contener una alta cantidad de compuestos
fenlicos y azcares causantes de la contaminacin. Otra causa puede ser debida a un error
personal al momento de realizar la extraccin, aunque el ADN fue lavado varias veces en etanol.
La fotografa tomada al gel de agarosa de la electroforesis (ver Figura 1) muestra la baja cantidad
de ADN genmico extrado, donde esto puede ser debido a las hiptesis antes ya propuestas.

6.- CONCLUSIN
En este prctico se cumpli el objetivo de extraer ADN genmico de una muestra vegetal,
en este caso de Viola x Wittrockiana aunque no con el grado de pureza esperado. Se sigui un
protocolo el cual contena los reactivos y procedimientos necesarios para influir sobre las
biomolculas y estructuras celulares con el fin de obtener una extraccin de ADN segura. La
utilizacin del espectrofotmetro permiti la cuantificacin del ADN de la muestra,
proporcionando informacin til sobre el grado de pureza obtenido en la extraccin. Por ltimo,
con la electroforesis en gel de agarosa se logr visualizar el ADN de la muestra y sacar las
deducciones debidas con respecto al trabajo realizado.










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7.- BIBLIOGRAFA

Concepcin J. Puerta B. y Claudia P. Urea P. (2005). Prcticas de biologa molecular
Pontificia Universidad Javeriana.

Documento de la Europian Comission. Recuperado el 2 de Abril de 2014 de http://gmo-
crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi%C3%B3n4.pdf

Elosegi A. & Sabater S. (2009). Conceptos y tcnicas en ecologa fluvial. Bilbao:
Fundacin BBVA. p. 190.
Giraldo G, Chamorro N, Meja C. 2010. Laboratorio de Bioqumica: Una visin prctica
(1ra edicin). Edit. ELIZCOM S.A.S. Universidad del Quindo, p.151.

Robertis, E., Hib, J. & Ponzio, R. (2012). Biologa celular y molecular de De Robertis
(15 Ed.).Buenos Aires: El Ateneo.