Resumen del artculo: Tumour-fighting virus homes in

(Galanis,E ) 2011


Gentica Molecular 2012-2013| Yasmin Abdelkarim Manso
UNIVERSIDAD
AUTNOMA
DE MADRID
LUCHA CONTRA EL CNCER
MEDIANTE VIRUS

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NDICE

IntroduccinPg 3
Qu son los virus oncolticos y para que se utilizan?.Pg 3
Qu virus se utiliza y porqu?...Pg 3

Mecanismo de accin de JX-594...Pg 4

Va de sealizacin EGFR/RAS...Pg 4

GM-CSF.....Pg 4

Puede JX-594 infectar tumores metastsicos mediante infusin intravenosa?......Pg 5

Infeccin ex vivo....Pg 5

Fase 1: Dosis escalonada de JX-594 mediante infusin intravenosa.Pg 5

Conclusiones.....Pg 8

Bibliografa.Pg 9


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INTRODUCCIN:
Qu son los virus oncoltcos y para se utilizan?
Desde su descubrimiento, los virus han despertado el inters de los cientficos, ya sea por sus
exclusivas caractersticas y por sus efectos. En los ltimos aos, en el campo de la oncologa se
ha investigado la viroterapia, basada en los virus oncoltcos. Estos virus atacan especficamente
a las clulas cancerosas por receptores que sobreexpresan dichas clulas y/o mediante la
explotacin de vas moleculares de sealizacin, asociadas con la transformacin maligna para
su replicacin. A medida que el virus comienza a replicarse dentro del tumor genera un efecto
citotxico y su efecto destructivo aumenta. Este proceso es ms eficiente mediante la
incorporacin de transgenes teraputicos o inmunomoduladores en los virus.
La infeccin de los tumores con virus oncolticos ha sido explorada como un nuevo tipo de
tratamiento que no ofrece resistencia contra las terapias aprobadas contra el cncer teniendo
adems menos efectos secundarios txicos.
La administracin intravenosa de estos virus es crucial para los tratamientos contra el cncer
porque nos permite atacar los tumores en todo el cuerpo en vez de hacerlo directamente de
uno en un uno.
Qu virus se utiliza y por qu?
La capacidad de los poxvirus para la propagacin sangunea en mamferos hizo pensar que
podra ser diseado para replicarse en unas clulas determinadas: clulas tumorales. Adems,
podra ser usado como vehculo para la expresin de transgenes seleccionados a travs de la
administracin intravenosa.
Vaccinia y otros poxvirus tienen varias propiedades biolgicas que los hacen ideales para la
administracin intravenosa y la posterior amplificacin de los transgenes dentro de los
tumores. En primer lugar, vaccinia ha desarrollado mecanismos para la estabilidad intravenosa
y propagacin a tejidos distantes, incluyendo resistencia a anticuerpos. En segundo lugar,
vaccinia tambin ha desarrollado mecanismos para moverse rpidamente dentro de los
tejidos. Y por ltimo, debido a su tamao relativamente grande, los viriones de vaccinia
pueden llegar a los tumores dnde la vasculatura ha incrementado su permeabilidad. Cabe
destacar que la replicacin del virus de vaccinia es dependiente de la va de sealizacin
EGFR/Ras que comnmente se sobreexpresa en cnceres epiteliales as como en cnceres de
mama, ovario y colorrectal.
JX-594 (cepa Wyeth) es un virus oncoltico modificado mediante ingeniera gentica a partir de
vaccinia virus para atacar selectivamente y destruir las clulas tumorales. Posee una
interrupcin del gen que codifica para la timidina quinasa viral (TK) y expresa dos transgenes:
GM-CSF (Factor estimulante de colonias de granulocitos y macrfagos codificado por CSF2)
para estimular la inmunidad antitumoral y la -galactosidasa (codificada por lac Z), marcador
para la expresin gnica viral.

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MECANISMO DE ACCIN DE JX-594
Tiene tres mecanismos de accin especficos:
1. Lisis de las clulas tumorales a travs de la replicacin viral.
2. Reduccin del suministro de sangre a los tumores a travs de la orientacin vascular y
su destruccin.
3. La estimulacin de la respuesta inmune del individuo contra las clulas del cncer.

Va de sealizacin implicada: EGFR/RAS
En los tumores se observan frecuentemente receptores de quinasas mutados o
sobreexpresados. Por ejemplo, el receptor del factor de crecimiento epidrmico (EGFR) se
sobreexpresa en algunos cnceres. Dado que pequeas cantidades del receptor EGFR pueden
dimerizar y activar vas de sealizacin, la sobreexpresin del receptor aumenta la posibilidad
de que una seal de crecimiento y divisin se enve inadecuadamente a la clula. El receptor
EGFR transmite las seales a travs de un receptor con actividad tirosina quinasa. La unin del
ligando EGF induce un cambio conformacional que permite la dimerizacin del receptor y la
fosforilacin cruzada. El receptor fosforilado se une a protenas adaptadoras que median la
activacin de Ras, una GTPasa. La activacin de Ras inicia una cascada de protein-quinasas (TK)
que produce la fosforilacin de factores de transcripcin y cambios en la transcripcin de
genes. La finalizacin de la sealizacin por EGF necesita de fosfatasas y de la hidrlisis por
Ras. Por lo tanto, el virus utiliza la cascada de TK para su propia replicacin viral, dado que
como se ha mencionado antes posee una interrupcin en el gen que codifica para timidina
quinasa.
En las clulas normales, sin embargo, la replicacin viral se bloquea porque este virus no
puede explotar de forma eficiente la maquinaria celular de replicacin.
GM-CSF
Los factores estimulantes de colonias forman parte de la familia de las citoquinas. Estn
involucrados en la estimulacin funcional de granulocitos y fagocitos mononucleares maduros,
y en la proliferacin y diferenciacin de las clulas progenitoras hematopoyticas. Por lo tanto,
estos factores modulan la hematopoyesis, la homeostasis tisular y son un importante
regulador de la respuesta inmune.






Figura 1. Mutaciones oncognicas
comunes en las clulas tumorales que
estimulan la replicacin del virus JX-594.
El virus utiliza la va de sealizacin
EGFR/RAS de una clula tumoral con
sobreexpresin de EGFR. Para
replicarse, el virus deficiente en
timidina quinasa (TK) utiliza la expresin
de las TK de las clulas tumorales. Estos
virus tambin secretan GM-CSF, factor
que estimula la inmunidad antitumoral.
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PUEDE JX-594 INFECTAR TUMORES METASTSICOS MEDIANTE INFUSIN
INTRAVENOSA?
- Infeccin ex vivo
Se evalu la selectividad de JX-584 en el tejido tumoral despus de una infeccin ex vivo de
explantes de tumores y tejidos adyacentes normales obtenidos de pacientes que se han
sometido a ciruga.
Fueron infectados los tejidos tumorales durante la noche para evaluar la selectividad de
replicacin y expresin de los transgenes. El tejido normal se trat con PBS como control
negativo (Figura 2). Despus de 24 horas de exposicin, JX-594 fue capaz de infectar
selectivamente el tejido tumoral en siete de diez muestras: la mayora de los tumores
presentaban una notable intensidad de tincin, mientras que en los tejidos normales eran
resistentes a dicha infeccin. Cabe destacar que las clulas de la sangre tambin eran
resistentes.


- Fase 1: Dosis escalonada de JX-594 mediante infusin intravenosa
Breitbach et al. realizaron una dosis escalonada mediante inyeccin por va intravenosa del
virus JX-594 en 23 pacientes con un estado avanzado de cncer, considerando distintos tipos
de cncer: pulmn, piel, colorectal, tiroides, ovario y pncreas. Cada paciente fue tratado en
uno de los seis grupos de dosis desde 1x10
5
a 13x10
7
(p.f.u.)Kg
-1
. Con esta prueba se pretende
evaluar la expresin gnica y la replicacin del virus en los tumores.

Figura 2. Infeccin ex vivo de los explantes de
tumor y el tejido normal de los pacientes
dnde se revela la selectividad de JX-594 por
el tumor.
JX-594 expresa una protena verde
fluorescente (GFP) que se utilizo para infectar
el tejido vivo de los pacientes con cncer
sometidos a una operacin quirrgica.
Mientras que las muestras de tejido normal
estn tratadas con PBS como control
negativo.
N= tejido control C: tejido tumoral
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Farmacocintica: Se utiliza la PCR cuantitativa para cuantificar la expresin gnica en la
sangre tras la inyeccin intravenosa en la primera hora y despus de 4 horas. Se demostr que
la expresin gnica an era detectable a las 4 horas (Figura 2a). El virus JX-594 fue
generalmente bien tolerado salvo algunos efectos secundarios tras 24 h desde la inyeccin
pero fueron rpidamente solventados.
Tambin se comprob que haba cierta selectividad respecto a los tejidos tumorales por parte
del virus que dependa de la dosis inyectada. Para aquellos pacientes en los que la dosis era
superior a 1.5x10
7
p.f.u. kg
-1
la PCRq indicaba la presencia del virus en los tumores. Sin
embargo, para dosis menores se realizaron biopsias a los 8-10 das de empezar el tratamiento
dnde se demostr tambin la actividad vrica en dichos tumores (Figura 2b).

Tras la tincin citoplasmtica granular mediante la tcnica de inmunohistoqumica de las
biopsias dio positivo a la evidencia de replicacin del virus en los tumores seleccionados
(Figura 3a,d). Adems se hicieron evidentes infeccines y necrosis difusas intercaladas en las
estructuras glandulares del tumor. Los tejidos normales y adyacentes dieron negativo para la
replicacin mediante la inmunohistoqumica (Figura 3i). No se tieron las muestras de control
negativo de las biopsias de los tumores (Figura 3c, f). La visualizacin tridimensional de la
infeccin por JX-594 en una glndula del tumor revel una infeccin y propagacin difusa
(Figura 3g, h).
Figura 2. JX-594 se libera selectivamente
y se amplifica en dentro de los tumores
despus de la infusin intravenosa.
a. Resultados de los estudios
farmacocinticos de la expresin gnica
de JX-594 despus de una infusin
intravenosa nica, teniendo en cuenta los
grupos realizados para las dosis.
b. Dependiendo de la dosis implantada se
demostr la actividad de JX-594 mediante
PCR y/o anlisis inmunohistoqumicos
(IHC) analizando biopsias de tumores
recogidos 8-10 das despus del
tratamiento.
c. Dependiendo de la dosis implantada en
los pacientes se indujo ms o menos al
aumento de anticuerpos para -
galactosidasa. = coeficiente de
correlacin de Spearman. El nmero de
pacientes evaluable para cada grupo (n)
se indica en el grfico.
7

El el 87% de los pacientes tratados con dosis mayores o iguales a 1.5x10
7
p.f.u. kg
-1
y evaluados
por biopsias, dieron positivo para JX-594 por PCRq o por la prueba inmunohistoqumica,
mientras que JX-594 no fue detectado en las biopsias recogidas en los pacientes tratados con
dosis ms bajas.










La tincin inmunohistoqumica para la protena -galactosidasa confirm la expresin de JX-
594 en las clulas tumorales infectadas (Figura 3j-l). Adems la induccin de anticuerpos para
Figura 3. La tincin inmunohistoqumica revela la infeccin de JX-594 y la expresin de -
galactosidasa en los tumores.
a. Inmunohistoqumica de vaccinia (paciente 20, 10 das despus del tratamiento). Escala: 200
mm.
b. Inmunohistoqumica sin anticuerpo primario. Escala: 200mm.
c. Inmunohistoqumica de vaccinia en la biopsia. Escala: 50 mm.
d,f. Inmunohistoqumica de vaccinia (paciente 18, biopsia 8 das despus del tratamiento)
Escala:50mm.
g,h. Reconstruccin tridimensin de vaccinia (verde) a lo largo del tumor en el paciente 20. Escala:
200 mm.
i. Inmunohistoqumica para la vacuna a bajo aumento (paciente 20). Escala: 500 mm. Las flechas
negras indican tumor mientras que las rojas indican tejido normal.
j. Inmunohistoqumica para -galactosidasa (paciente 20). Escala: 50 mm.
k. Inmunohistoqumica para vaccinia. Escala: 50 mm.
8

dicha protena era un marcador sustituto para identificar la replicacin de JX-594 y la expresin
del transgen (altos niveles de expresin requieren que haya replicacin). La induccin de
anticuerpos anti--galactosidasa estaba altamente relacionada con la dosis, dado que se
produce en los pacientes con altas dosis (Figura 2c).
Por ltimo, se evalu la expresin del segundo transgen: GM-CSF. Tres de los pacientes
mostraron altos niveles de dicha protena alcanzando su punto mximo entre los das 4 y 15.
Era difcil detectar dicho factor dado que tiene una vida media corta (<2h)
15
o por la aparicin
de otras citoquininas en sangre. Por lo tanto, la deteccin de GM-CSF en sangre es un
indicativo de un alto nivel de expresin de GM-CSF y puede ser un marcador especfico pero
insensible a la expresin del transgen.




CONCLUSIONES
El cncer es una enfermedad que afecta hoy en da a millones de personas en todo el mundo y
al ser una enfermedad tan difcil de abordar y existir diversas terapias contra ella que pueden
curar o no la enfermedad dependiendo del diagnstico y las caractersticas del cncer,
Breitbach et al. han centrado sus investigaciones en encontrar una alternativa a estas terapias,
utilizando virus oncolticos (JX-594) mediante inyecciones intravenosas para la destruccin de
las clulas cancerosas desde dentro del organismo. Para ello interrumpieron en dicho virus el
gen que codifica para la timidina quinasa y le incorporaron dos transegenes: GM-CSF para
estimular la inmunidad antitumoral y la -galactosidasa como marcador para la expresin
gnica viral.
El enfoque de inyectar en los pacientes por va intravenosa dicho virus es una estrategia que
ha demostrado que el virus JX-594 posee selectividad para atacar y destruir las clulas
cancerosas y es bien tolerado en los pacientes. Mltiples pacientes tratados con JX-594 en
ensayos clnicos han sobrevivido durante ms de un ao y hasta los 4 aos.
En rasgos generales, lo importante de estos resultados es que la introduccin de JX-594 por va
intravenosa ha demostrado una notable eficacia como terapia alternativa a la cura del cncer.
Aunque es cierto que la cura total de determinados cnceres en sus fases ms avanzadas est
an por llegar, los avances y la combinacin de diferentes tcnicas destacando la utilizacin de
la viroterapia, nos acercan cada vez ms a una esperanzadora solucin contra el cncer.




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BIBLIOGRAFA

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Breitcbach et al. (2011) Intravenous delivery of multi-mechanistic cancer-targeted
oncolytic poxvirus in humans. Nature 477: 99-102.

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Jeremy Mark Berg,Lubert Stryter,Jhon L. Tymoczko (2008) Bioqumica (6 Ed). Editorial
Reverte.