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MATERIAL
Placa fina (Ac. de celulosa)
Micropipetas y cnulas
Estufa a 105C
Cubeta de cromatografa
Lapiz y regla
Secador
REACTIVOS
*Fase mvil (n-butanol/acetona/actico/agua, 35/35/20/10 en volumen).
*Ninhidrina 1 mg/ml en acetona.
*Asp 0.5%
*Leu 0.5%
*Lis 0.5%
*Ala 0.5%
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
IMPORTANTE: Tomar la placa solamente por los bordes, y no poner los
dedos sobre su superficie, para evitar manchas debido a los aminocidos
y/o protenas presentes en la piel.
1. Colocar aprox. 25 ml de la fase mvil en la cubeta, que debe
permanecer cerrada para saturar su atmsfera en esos disolventes.
2. Utilizando el lpiz, sin presionar para no rascar el acetato de celulosa,
trazar dbilmente una lnea a 1 cm del extremo inferior de la placa, tal
como indica la figura. Marcar en esta lnea 5 puntos equidistantes y
aplicar en cada uno de ellos 5 l gota de cada aminocido, teniendo
cuidado de que la gota se extienda lo menos posible, con la ayuda del
secador.
3. Colocar la placa en la cubeta, con los puntos de aplicacin en el borde
superior y en contacto con la fase mvil. El nivel no debe cubrir la lnea
trazada. Cerrar y esperar una aproximadamente una hora, vigilando que el
frente de la fase mvil no llegue al extremo superior de la placa. Realizar
en ese tiempo el otro apartado de la prctica.
4. Sacar la placa y cerrar la cubeta. Marcar rascando un borde el extremo
superior donde lleg la fase mvil. Secar la placa 1 minuto en la estufa e
introducirla en la cubeta de revelado con ninhidrina hasta que se
impregne. Sacarla y meter en la estufa durante 3-5 min a 105C.
5. Observar las manchas aparecidas, su forma, intensidad y color.
CUESTIONES
1. Calcular el Rf de cada aminocido patrn y del problema.
2. Identificar el aminocido(s) problema(s)
3. Que entiende por cromatografa en placa fina bidimensional?
4. Como afectara al Rf de los aminocidos la sustitucin de n-butanol por
etanol en la fase mvil?
MATERIAL Y REACTIVOS
1 Columna de cromatografa BioRad de 1 cm de dimetro y 20 cm de largo
4 probetas de 10 ml
2 pipetas de 1 y 5 ml
2 pipetas Pasteur
NaCl al 0.9% con azida sdica al 0.02% (TOXICO, NO PIPETEAR CON LA
BOCA).
Mezcla de azul dextrano y vitamina B12 para separar.
Micropipeta P200 para aplicacin de muestra (entre 100 y 200 l).
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Colocacin de la muestra y recogida de muestras:
1. Desconectar el tubo capilar que une el eluyente con la columna,
destapando sta.
2. Quitar el tapn inferior de la columna hasta que eluya todo el volumen
encima del lecho. Volver a tapar.
3. Pipetear 0.1 ml de mezcla colocndola suavemente encima del lecho de
gel.
4. Destapar de nuevo la parte inferior de la columna, con una probeta (A)
situada debajo para empezar a medir volmenes. Tapar cuando la muestra
se introduzca en la columna.
5. Llenar de eluyente la parte superior de la columna, suavemente con la
ayuda de una pipeta Pasteur.
6. Conectar el capilar desde el reservorio de eluyente a la columna y
quitar el tapn inferior, siguiendo la recogida en la probeta A hasta que
llegue la primera gota azul.
7. Cambiar a la probeta B, recogiendo todo el eludo azul.
8. Cambiar a la probeta C, recogiendo todo el eludo incoloro hasta la
aparicin de la primera gota rosa.
9. Cambiar a la probeta D, recogiendo todo el eludo de vitamina B12,
hasta nueva aparicin de eluyente incoloro.
10. Tapar la columna en su parte inferior y dejar lista para la cromatografa
siguiente.
Suponiendo que el proceso de elucin da lugar a picos simtricos, el
mximo de concentracin de cada sustancia coloreada se encontrar en
el centro de los volmenes medidos, por lo que los volmenes de elucin
sern:
Ve (Azul Dextrano) = A + B/2
Ve (Vitamina B12) = A + B + C + D/2