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Manual de Prcticas de Laboratorio


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MANUAL DE PRCTICAS DE
LABORATORIO DE
BACTERIOLOGA Y MICOLOGA
























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CONTENIDO
Pgina

I. INTRODUCCIN 3

II. BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO 4

III. PRCTICAS
1. Procedimientos de rutina para identificar bacterias y hongos 7
2. Mtodos de inoculacin y siembra de bacterias en medios de cultivo 13
3. Toma, conservacin y envi de muestras para anlisis bacteriolgico y micolgico 21
4. Aislamiento e identificacin de enterobacterias 26
5. Aislamiento e identificacin de bacterias no entricas (bacterias que afectan el tracto respiratorio:
Pasteurella, Mannheimia, Bordetella) 30
6. Aislamiento e identificacin de bacterias Gram positivas (cocos pigenos) 33
7. Aislamiento e identificacin de agentes micticos 37
8. Determinacin de la susceptibilidad in vitro a los antimicrobianos 42
9. Procesamiento de muestras enviadas al laboratorio de bacteriologa y micologa 47

IV. BIBLIOGRAFA 51









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I. INTRODUCCIN

La microbiologa tiene numerosas reas o ramas con fundamentos tcnicos comunes, pero cada
rama tiene sus caractersticas particulares, dado que hay diversos tipos de microorganismos
hallados en diferentes hbitats. Una de estas divisiones es la bacteriologa y micologa mdica que
estudia aquellas bacterias, levaduras y hongos que afectan la salud del hombre y de los animales,
especialmente por su capacidad patgena. De tal manera que la bacteriologa y micologa son
ramas de la microbiologa que estudian a las bacterias, levaduras y hongos.

La importancia de los microorganismos en la vida de los humanos y animales, as como la relacin
con el medio ambiente no fue reconoci inmediatamente, pero en 1893 Theobald Smith dijo: En el
estudio de las formas microscpicas conocidas como bacterias, tenemos lo que puede llamarse
justamente el punto focal de varias ramas de la ciencia biolgica. El desarrollo de la bacteriologa
y micologa mdica en los aos subsecuentes ha probado esta veracidad. Lo que ha permitido la
interaccin de las bacterias y hongos en la historia natural de la enfermedad, puesto que el
concepto de enfermedad infecciosa, su prevencin y tratamiento se mantienen actualizados hasta
la fecha.

El desarrollo de la microbiologa se ha debido a la curiosidad cientfica y al inters de
investigadores y cientficos, auxiliados muchas veces por su firmeza en sostener lo que saban que
era cierto, en contra de las refutaciones aparentes y el desdeo de sus compaeros. La historia de
la bacteriologa y micologa mdica, es la evolucin del conocimiento de las causas del proceso
salud-enfermedad.

Este manual de prcticas de bacteriologa y micologa, abarca aquellas especies bacterianas y
micticas de importancia en salud animal, para lo cual se considera sus caractersticas
morfolgicas, fisiolgicas y patognicas. Se realiza una descripcin bsica de los agentes
patgenos que afectan tanto al hombre como a los animales. La ntima relacin existente entre el
hombre y los animales y el consumo de productos de origen animal exigen que toda la gente
involucrada en la microbiologa mdica veterinaria se familiarice con los agentes infecciosos de los
animales si desean comprender las enfermedades que producen.









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II. BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO

La mayora de los accidentes que ocurren en un laboratorio de prcticas, son ocasionados
principalmente por dos razones: la falta de conocimiento acerca de los procedimientos que se
realiza en el laboratorio y la negligencia para seguir las reglas de seguridad. Es transcendental
tener en cuenta que las normas de seguridad, no son la nica base en que los laboratorios
efectan las actividades de docencia, extensin, diagnstico e investigacin, pero es muy
importante que esas medidas sean aplicadas al ingresar al laboratorio de prcticas.

Al realizar cualquier procedimiento en un laboratorio, involucra el exponerse a diferentes agentes
bacterianos o micoticos infecciosos de manera directa al momento de manipular la muestra o
material contaminado, para disminuir este riesgo se debe aplicar la bioseguridad.

La bioseguridad involucra en lograr actitudes y conductas que disminuyan el riesgo del usuario en
el laboratorio, de tal manera que salvaguarde su salud o integridad. El conocimiento previo de
normas y la aplicacin adecuada de buenas prcticas de trabajo en el laboratorio es un deber de
cada discente. Estas normas son la base de un buen control de calidad del trabajo que se est
llevando en la realizacin de cada prctica para cubrir los objetivos planteados.

Recomendaciones generales para aplicar las buenas prcticas en el laboratorio:
1. Ingresar al laboratorio con bata blanca limpia.
2. Antes de realizar cualquier procedimiento retirarse anillos, pulseras, o cualquier otro accesorio
que pueda entrar en contacto con las muestras o medios que se utilizan en el laboratorio;
colocar sus pertenencias en un lugar apropiado retirado del sitio de trabajo.
3. Evitar pipetear con la boca.
4. Manejo de cualquier muestra con equipo de proteccin personal (bata, guantes, mascarilla,
careta facial y goggles).
5. Restringir el uso a alumnos sin previa capacitacin de agujas, jeringas, y otros objetos
punzocortantes a fin de evitar el riesgo de inoculacin.
6. Limpiar y desinfectar con alcohol al 70 % o benzal al 5 % las superficies de trabajo antes, y
despus de realizar cualquier procedimiento. Se sugiere realizar una segunda desinfeccin con
hipoclorito de sodio al 0.5 %
7. Lavado de manos antes y despus de cada sesin de trabajo con jabn y agua, esto incluye
tambin el colocarse los guantes.
8. Manejo, tratamiento y disposicin adecuada de los Residuos Peligrosos Biolgicos Infecciosos
(RPBI), con base a la Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Proteccin
ambiental- Salud ambiental- Residuos Peligrosos Biolgicos Infecciosos- Clasificacin y
especificaciones de manejo.
9. Todos los qumicos debern manejarse con equipo de proteccin y dentro de una campana de
extraccin.
10. En caso de un derrame de muestras biolgicas deber agregarse hipoclorito de sodio al 1.0 %
y dejar actuar por 30 min y posteriormente limpiar.






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Normas disciplinarias:
1. Leer el reglamento interno del laboratorio de prcticas
2. No se permitir el ingreso al laboratorio, despus de 15 minutos del horario estipulado de
inicio de la prctica.
3. El acceso al laboratorio es exclusivamente con bata blanca y limpia, por lo que no se permitir
la permanencia en la sesin prctica de los discentes que no porten su bata.
4. Se prohbe fumar, comer, beber o realizar cualquier otra actividad que no est relacionada con
la prctica correspondiente.
5. Se prohbe el uso de celulares y otros medios electrnicos de comunicacin durante la
realizacin de las prcticas y uso de los laboratorios.
6. Ningn discente podr salir o entrar sin previa autorizacin del docente.
7. Las comunicaciones verbales sern de manera ordenada, en voz baja y solo con la mesa que
integra el equipo.
8. Evitar lo ms posible el estar circulando entre mesas del laboratorio durante la sesin prctica
9. En caso de accidentes (quemadura, salpicadura y heridas) avisar inmediatamente al docente
encargado de la prctica.
10. Colocar los desechos en el contenedor correspondiente.
11. No verter sustancias en la superficie de la mesa, suelo o tarjas.

Manejo adecuado de residuos peligrosos biolgico infecciosos:
Sangre y material orgnico: Cogulos, aplicadores de madera e hisopos, se sumergirn en una
solucin de hipoclorito de sodio al 1.0%, posteriormente sern colocados en bolsas de plstico
rojas (sangre) y amarillas (desechos patolgicos) para su eliminacin e incineracin.

Materia fecal: Al trmino de la prctica se colocar en una solucin de hipoclorito de sodio al
1.0%, posteriormente sern colocados en bolsas de plstico amarillas (desechos patolgicos) para
su eliminacin e incineracin.

Material de vidrio: tubos, portaobjetos, cubreobjetos, varillas de vidrio, cajas de Petri, matraces y
frascos de diferentes capacidades, sern depositados en contenedores con agua jabonosa
adicionada con hipoclorito al 1.0%, en esta solucin permanecern por tres horas antes de su
lavado y secado.

Nota: Material como papel, aplicadores de madera, algodn y similares que hayan estado en
contacto con material infeccioso, debern ser rociados con hipoclorito al 1.0 %, y posteriormente
colocarlos en bolsas de plstico amarillas (desechos patolgicos) para ser incinerados.

Desinfectantes
Es importante conocer las diferentes soluciones desinfectantes, como el cloro, que se utiliza para
mantener limpio y desinfectado el laboratorio, materiales, equipos, as como su preparacin en las
concentraciones que se necesiten.

Al inicio y al final de cada prctica el discente debe lavarse las manos y colocarse alcohol al 70 %
o benzal al 5 %.





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Las superficies de trabajo deben ser limpiadas y suministrar con un pao una solucin de
hipoclorito de sodio al 0.5 % esperar 3 minutos e iniciar a trabajar.

ADVERTENCIA: No usar fenol, debido a que es una solucin custica, no se recomienda su
empleo sobre la piel, por su efecto irritativo y acumulativo en la piel.

Preparacin de soluciones:
Solucin de alcohol al 70 %
Alcohol al 96.. 73 mL
Agua bidestilada o desionizada 27 mL

Hipoclorito de sodio al 0.5 % (reas sin presencia de material orgnico)
Hipoclorito de sodio (5.0 % presentacin comercial)... 100 mL
Agua bidestilada o desionizada.... 900 mL

Hipoclorito de sodio al 1.0 % (reas con presencia de material orgnico)
Hipoclorito de sodio (5.0 % presentacin comercial)... 200 mL
Agua bidestilada o desionizada.... 800 mL

Cuestionario.
1. Qu es la bioseguridad?
2. Cul es el objetivo de la bioseguridad?
3. Cules son los tipos de riesgos que existen en un laboratorio?
4. En que se basa la clasificacin de los agentes biolgicos?
5. Menciona cuales son las vas de entrada de los agentes biolgicos al cuerpo?
6. Mtodos para disminuir los riesgos biolgicos?
7. Menciona 5 recomendaciones para buenas prcticas de trabajo?
8. Menciona 5 normas disciplinarias de un laboratorio?
9. Qu desinfectantes se pueden usar en la piel?
10. Qu causa el fenol en el organismo?

Glosario de trminos:
Accidente: suceso eventual o accin de que involuntariamente resulta dao para las personas o
las cosas.
Desinfectante: sustancia que destruye los microorganismos presentes, a excepcin de las
esporas bacterianas
Precaucin: accin para evitar o prevenir los inconvenientes, dificultades o daos que pueden
temerse durante el procedimiento.
Investigacin: actividad que tiene por fin ampliar el conocimiento, sin perseguir, en principio,
ninguna aplicacin prctica.






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III. PRCTICAS
1. Procedimientos de rutina para identificar bacterias y hongos

Unidad de Competencia 1: Conocer e identificar la morfologa bacteriana y fungal, as como sus
principios metablicos, genticos y taxonmicos.

Introduccin:
En el diagnstico microbiolgico, la visualizacin del agente patgeno o su efecto en el material
biolgico remitido al laboratorio de diagnstico constituye el primer paso hacia su identificacin.
Esto puede realizarse mediante el examen directo de una preparacin hmeda o bien de un frotis
fijo teido con colorantes especficos.

La observacin de microorganismos vivos con o sin motilidad utilizando preparaciones hmedas es
fcil de realizar y requieren de un mnimo de material.
En una preparacin hmeda se pueden observar diferentes tipos de movimiento, como son:
El movimiento browiniano de partculas pequeas debido al bombardeo por molculas del
medio lquido.

El movimiento de microcorrientes debido frecuentemente al calor generado por el foco
microscpico.

Movimiento flagelar o real de las bacterias cuyas caractersticas pueden variar en los diversos
microorganismos.

Para los estudios bacteriolgicos y micolgicos adems se han ensayado y propuesto gran
variedad de mtodos de tincin, los que apoyan en proporcionar contraste entre el microorganismo
y el medio que la rodea, permitiendo llevar a cabo la diferenciacin entre los distintos tipos
morfolgicos; adems permite el estudio de estructuras u organelos propios de la clula bacteriana
y mictica. Dentro de las tinciones importantes para bacterias y hongos son las siguientes:

Tincin de Gram:

En 1884 un mdico Dans, Christian Gram, desarroll un mtodo de tincin de gran utilidad en el
laboratorio de bacteriologa. Est tincin revela detalles referentes a la forma y agrupacin
bacteriana y permite clasificar a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram
negativas.

Durante el proceso de tincin, tanto las bacterias Gram positivas como las Gram negativas
retienen el colorante primario. Sin embargo al aplicar el agente decolorante, la pared de las
bacterias Gram positivas sufre una deshidratacin que impide la salida de colorante. En el caso de
las bacterias Gram negativas, el agente decolorante destruye la integridad de la membrana
externa, incrementando as su permeabilidad, lo cual permite la salida del colorante primario.






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Al aplicar el colorante de contraste, este no puede penetrar fcilmente en las bacterias Gram
positivas debido a la deshidratacin de su pared; adems de que estas bacterias quedaron
previamente teidas con el colorante primario. Por el contrario, las bacterias Gram negativas se
tien fcilmente con el colorante de contraste. El resultado final es que las bacterias Gram
positivas se tien de violeta o azul y las Gram negativas de rojo.

La tincin de Gram es aplicada en forma universal como primer paso en la identificacin de las
bacterias. Desafortunadamente existen algunos grupos bacterianos en los cuales la tincin de
Gram no es de utilidad taxonmica; como son: espiroquetas, micoplasmas, micobacterias,
clamidias y rickettsias.

Tincin para Bacterias Acido-Alcohol Resistentes:

Este mtodo de tincin la penetracin del colorante primario se facilita debido a que ste se
encuentra disuelto en fenol y a que es aplicado en presencia de calor. El mtodo para demostrar la
cido-alcohol resistencia es la tincin de Ziehl-Neelsen.

Una vez que el colorante penetra a la clula bacteriana, este se combina con las mismas
estructuras con las que se combina en cualquier otra bacteria y adems reacciona con cidos
miclicos libres, lo cual hace que la pared celular se vuelva an ms hidrofbica.

Con la tincin de Ziehl-Neelsen tanto las bacterias cido-alcohol resistentes, como las bacterias no
cido-alcohol resistente se tien con el colorante primario. Sin embargo, al aplicar el agente
decolorante, compuesto por una mezcla de alcohol-cido, este no solubiliza los lpidos de la pared
de las bacterias cido-alcohol resistentes, y por lo tanto no se decoloran. Las bacterias no cido-
alcohol resistentes se decoloran fcilmente, por lo que se vuelve a teir al aplicar el colorante de
contraste.

El grupo de bacterias cido-alcohol resistentes, est representado principalmente por el gnero
Mycobacterium.

Tincin para Endoesporas:

La endoespora bacteriana es una estructura altamente deshidratada y rgida, que es formada por
algunos bacilos Gram positivos. Los gneros bacterianos de inters en medicina veterinaria que
son capaces de formar endoesporas son Bacillus y Clostridium. Estos responden de manera
diferente a las condiciones ambientales que inducen la formacin de la espora.

Las endoesporas son estructuras ovales o esfricas que pueden encontrarse tanto
intracelularmente, como fuera de la bacteria (clula vegetativa). Por su localizacin dentro de la
clula pueden ser centrales, subterminales o terminales, y presentan adems variacin en su





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tamao. Estas caractersticas son de utilidad taxonmica para la identificacin de algunas especies
de los gneros capaces de esporular.

Se preparan 2 frotis fijos a partir del cultivo, uno de los frotis ser teido con la tincin de Gram y el
otro con la tincin de Schaeffer y Fulton.
En la tincin de Gram las esporas se observan como cuerpos refringentes sin teir, mientras que
con la tincin de Schaeffer y Fulton las esporas se observan de color verde y las formas
vegetativas rojas.

Tincin Lactofenol Azul de Algodn:

Este es un mtodo utilizado rutinariamente para la realizacin de preparaciones microscpicas de
hongos filamentosos con el fin de determinar sus estructuras morfolgicas y por lo consiguiente su
identificacin. Cada uno de los constituyentes del colorante lactofenol azul de algodn cumple una
funcin determinada.
El fenol sirve como fungicida, la glicerina permite tener una preparacin semipermanente, el azul
de algodn tie el exterior de la pared de los hongos y el cido-alcohol lctico acta como agente
aclarante.

Objetivo: El discente realizar las tinciones de rutina en el laboratorio de Bacteriologa y Micologa
para la identificacin de estructuras bacterianas y micticas, y comprender su utilidad.

Competencias:
1. Describir la diferencia entre una preparacin hmeda y un frotis fijo, as como su utilidad
diagnstica.
2. Aplicar los principios y procedimientos de las tinciones para la observacin de bacterias y
hongos.
3. Emplear la tincin de Gram y lactofenol azul de algodn, para observar la morfologa, tamao,
agrupacin y afinidad tintorial de bacterias y hongos.

Lugar de Realizacin:
Laboratorio de prcticas de la FMVZ-UAEM.

Tiempo Destinado a la Prctica:
2 Horas

Material de laboratorio:
Portaobjetos, cubreobjetos, lpiz graso, asas bacteriolgicas graduadas, papel secante, aceite de
inmersin, mechero, tren de tincin de Gram, tincin de lactofenol azul de algodn, solucin
desinfectante, KOH al 3%, Microscopio ptico binocular de campo claro (con objetivos de 4X, 10X,
40X, 100X), vaselina o plastilina






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Material biolgico:
Cultivo en agar de Escherichia coli
Cultivo en agar de Staphylococcus spp.
Cultivo en agar de una levadura
Cultivo en agar de Aspergillus spp.

Metodologa:

Preparaciones Hmedas:
1. Depositar una capa delgada de vaselina alrededor del borde del cubreobjetos o un pedazo
pequeo de plastilina en las 4 esquinas del cubreobjetos, SIN TOCAR las caras del cubreobjetos
con los dedos.
2. En el centro del cubreobjetos preparado con vaselina plastilina, coloque con el asa
microbiolgica varias gotas del cultivo bacteriano (un cubreobjetos por muestra)
3. Tome una laminilla y colquela sobre el cubreobjetos, presionando suavemente.
4. Invierta la preparacin y obsrvala al microscopio con los objetivos de 40X y 100X si se utiliz
vaselina, o con el de 10X en el caso de haberse utilizado plastilina.

Preparacin de Frotis Fijos para Tinciones:
a) Realizar un frotis fijo de cada uno de los cultivos proporcionados.
b) Utilizar laminillas limpias y marcadas para su identificacin, con el lpiz graso marcar el rea
donde se va a colocar la muestra.
c) La metodologa para realizar el frotis bacteriano depender si el cultivo se encuentra en medio
slido o lquido.
a) Cultivo en lquido: con un asa bacteriolgica previamente flameada y fra, se introduce
en el cultivo bacteriano se coloca en el portaobjetos y se difunde en el rea marcada y se
fija al calor.
b) Cultivo en medio slido: se coloca una gota de agua destilada estril en el
portaobjetos, se recolecta una colonia de medio solido y se mezcla, realizando un
extendido uniforme.
d) Se debe extender la gota sobre el portaobjetos de forma que el resultado sea una capa fina.
Debe evitarse preparar un frotis demasiado grueso.
e) Dejar secar las preparaciones (frotis) a temperatura ambiente.
f) Cuando se haya secado el frotis pasar el portaobjetos por la llama del mechero con la capa del
frotis hacia arriba, no aplicar calor en forma excesiva ya que estropeara la morfologa normal y
la estructura de los microorganismos que se van a teir.

Procedimiento para la tincin de Gram:
1. Preparar frotis fijos a partir de cada uno de los cultivos bacterianos
2. Agregar sobre la preparacin cristal violeta durante 30 segundos.
3. Lavar con agua destilada
4. Aadir lugol durante 30 segundos.
5. Lavar con agua destilada





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6. Decolorar con alcohol-cetona por 5 a 10 segundos.
7. Lavar con agua destilada
8. Agregar safranina durante 30 segundos.
9. Lavar, secar y observar al microscopio con aceite de inmersin y con el objetivo de 100X

Procedimiento para la prueba de KOH al 3 %:
El objetivo de realizar la prueba de KOH al 3% es para ratificar los resultados de la tincin de
Gram. Esta prueba consiste en colocar sobre una laminilla una gota de KOH al 3 %, despus con
el asa calibrada se recolecta muestra de las colonias bacterianas en estudio, se mezcla con la gota
de KOH, con movimientos giratorios durante 1 a 3 minutos.

Interpretacin: Si al separar el asa de la mezcla se forma una hebra viscosa, la prueba es positiva
e indica que se trata de bacterias Gram negativas. Si al separar el asa no se forma hebra, la
prueba es negativa, e indica que las bacterias son Gram positivas

Procedimiento de Tincin de Lactofenol Azul de Algodn:
Este procedimiento se usa para identificar las formas fungales
1. Sobre un portaobjetos limpio se coloca una gota de lactofenol azul de algodn.
2. Con el asa en forma de L recolectar una pequea cantidad de la colonia y se deposita sobre
la gota del colorante.
3. Se coloca un cubreobjetos sobre la preparacin, la cual puede ser ligeramente calentada (esto
ayuda a extender el hongo en toda la preparacin y a remover las burbujas)
4. La preparacin se observa al microscopio con los objetivos 5X, 10X y 40 X.

Resultados:
El discente realizara dibujos o fotografas de las formas bacterianas y fngicas, as como una
investigacin bibliogrfica para conocer de acuerdo a la morfologa colonial macroscpica y
microscpica de las bacterias, as como las estructuras celulares de los hongos para identificarlos,
y realizar un reporte escrito de la prctica.

Evaluacin:
El docente establecer los criterios de evaluacin para otorgar una calificacin durante la prctica
y del reporte de prcticas, con la finalidad de medir el grado de adquisicin de conocimientos,
habilidades, aptitudes/valores de las unidades de competencia que se relacionen con la prctica.

Cuestionario:
1. De qu color se tien las bacterias Gram positivas y por qu?
2. De qu color se tien las bacterias Gram negativas y por qu?
3. Qu es un frotis?
4. Con que finalidad se fija la muestra de microorganismos en el porta objetos?
5. Cul es la razn de teir las muestras bacterianas?
6. Por qu es necesario emplear aceite de inmersin para la observacin de los
microorganismos?





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7. Qu funcin tiene el yodo en la tincin de Gram?
8. Menciona tres bacterias que tien Gram positivas y escribe la enfermedad que causa cada una
de ellas
9. Menciona tres bacterias que tien Gram negativas y escribe la enfermedad que causa cada
una de ellas.
10. Para qu sirve la tincin de Ziehl-Neelsen?








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2. Mtodos de inoculacin y siembra de bacterias en medios de cultivo

UNIDAD DE COMPETENCIA 1: Conocer e identificar la morfologa bacteriana y fungal, as como
sus principios metablicos, genticos y taxonmicos.

Introduccin:

Para realizar el estudio de las bacterias es necesario recuperarlas del hbitat natural donde se
encuentran y hacer que proliferen en medios artificiales, que les proporcionen sus requerimientos
nutricionales. Este procedimiento se le conoce como cultivo bacteriano in vitro.

Las bacterias para su metabolismo necesitan donadores y aceptores de hidrgeno, fuentes de
carbono, fuentes de nitrgeno y minerales. Adems del uso de un medio nutritivo adecuado para el
cultivo bacteriano, es necesario considerar factores ambientales tales como la temperatura, pH,
humedad relativa y atmsfera de incubacin.

Los mtodos de siembra de bacterias en medios de cultivo estn directamente relacionados con la
consistencia de los mismos. Estos pueden ser lquidos (pruebas bioqumicas y medios de
enriquecimiento), semislidos (pruebas de motilidad de cepas), slidos (pruebas bioqumicas,
conservacin de cepas, pruebas de susceptibilidad a quimio-teraputicos o realizar aislamientos
en cultivo puro).

Medios Slidos para Conservacin de Cepas: el medio es envasado en tubos y se permite su
solidificacin de manera inclinada de tal manera que se logre una superficie (Fig. 1). El uso de
tubos con tapn de baquelita disminuye la deshidratacin del medio.
















Fig. 1. Medio de cultivo envasado
en tubo y salificado de manera
inclinada para realizar la siembra
del cultivo bacteriano a conservar.





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Medios Slidos para Pruebas de Susceptibilidad a Quimioteraputicos: el medio es envasado
en cajas de Petr y la inoculacin se hace por medio de estras continuas en toda la superficie por
medio del asa o por medio de un hisopo (Fig. 2).

















Medios Slidos para el Aislamiento en Cultivo Puro: el medio para cultivo bacteriano se envasa
en cajas de Petr, con el objetivo es obtener un crecimiento uniforme de colonias bacterianas, es
decir, colonias puras, libres de otros grmenes contaminantes, con el fin de estudiar e identificar
la especie bacteriana. La inoculacin se realiza con el asa graduada (Fig. 3).

















Fig. 2. (a). Medio de cultivo solido en caja Petr, la superficie debe ser lisa y el nivel de llenado
debe estar parejo, (b). Inoculacin de la cepa bacteriana para realizar la prueba de
sensibilidad.

a

b
Fig. 3. (a) Distribucin del medio de cultivo en cuadrantes envasado en caja Petr para el
aislamiento bacteriolgico (b) modo de sembrado con el asa bacteriolgica y el sentido de la
dilucin.

a

b





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El estudio de la morfologa de las colonias es de gran importancia debido a que gracias a sta
puede iniciarse una identificacin preliminar de los microorganismos aislados. Las colonias
bacterianas presentan caractersticas morfolgicas muy variadas, mismas que son constantes para
cada especie de bacterias en idnticas condiciones de cultivo. Estas caractersticas pueden
modificarse cuando factores tales como la humedad relativa, medio de cultivo, temperatura,
atmsfera de incubacin varan.

La descripcin de las colonias bacterianas debe realizarse cuando stas se encuentran separadas
unas de otras en el medio de cultivo, tomando en cuenta las siguientes caractersticas: tamao,
color, superficie, borde, opacidad, elevacin, estructura interna.

Las caractersticas de la superficie, borde, opacidad, elevacin y estructura interna, estn sujetas a
la interpretacin del observador. Para describirlas es necesario el uso de un microscopio
estereoscpico, por lo que su valor descriptivo es menos relevante (ver Anexo 3). De acuerdo a
estos criterios, las colonias pueden clasificarse de la siguiente forma:
Superficie: lisas, rugosas.
Estructura interna: mucoide, granular, filamentosa.
Opacidad: translcidas, opacas, brillantes.
Borde: enteras, onduladas, lobuladas, erizadas, filamentosas.
Elevacin: umbilicales, difusas, planas, convexas.

Otro dato til en la identificacin preliminar de colonias bacterianas es la produccin de
hemolisinas. Estas se ponen de manifiesto en medios de cultivo adicionados con sangre, tales
como el agar sangre y el caldo sangre. En el agar sangre la produccin de hemolisinas conduce a
la formacin de un halo de lisis de eritrocitos alrededor de las colonias. Si dicho halo es
transparente se interpreta como hemlisis completa (hemolisis ) mientras que si el halo es de
color gris verdoso se trata entonces de hemlisis incompleta (hemolisis ).

Al hacer la identificacin de las colonias bacterianas aisladas no siempre ser necesario detallar
todas las caractersticas morfolgicas mencionadas; generalmente se toman en cuenta aquellas
que son relevantes.

Objetivo: El alumno analizar las diferentes tcnicas de siembra para el cultivo de bacterias y
hongos in vitro, utilizando medio de cultivo segn su utilidad y describir la morfologa colonial.

Competencias:
1. Describir la importancia del cultivo de bacterias y hongos in vitro.
2. Identificar las condiciones necesarias para el cultivo in vitro de las bacterias y hongos.
3. Clasificar los medios de cultivo bsico, de enriquecimiento, diferenciales, selectivos y de
transporte.
4. Realizar las tcnicas de siembra en medios de cultivo lquidos semislidos y slidos.
5. Explicar las reacciones metablicas de bacterias y hongos en algunos medios diferenciales.





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6. Analizar la utilidad diagnstica de la morfologa colonial bacteriana y fungal, y categorizar con
base en las siguientes caractersticas: tamao, color de la colonia, pigmentacin de medio,
estructura interna, borde y hemlisis.

Lugar de Realizacin:
Laboratorio de prcticas de la FMVZ-UAEM, bajo el apoyo del Departamento de Prcticas de la
Facultad

Tiempo Destinado a la Prctica:
4 Horas (dos sesiones)

Material:

General: Asas bacteriolgicas graduadas, asas bacteriolgicas rectas, papel secante, solucin
desinfectante, marcador permanente, mechero, estufa bacteriolgica a 37 C (temperatura
constante).

Seccin:
1 cultivo en agar de Escherichia coli
1 cultivo en agar de Staphylococcus spp.
1 cultivo en agar de una levadura
1 cultivo en agar de Aspergillus spp.
Medio Agar sangre
Medio MacConkey
Medio Verde Brillante
Medio Agar Sal y manitol
Medio Agar Sabouraud
Medio TSI
Medio SIM
Caldo Rojo de Fenol
Caldo nutritivo

Metodologa:

Proceso de Inoculacin y Siembra en Placa:
Primer Da (Sesin Uno)
1. Desinfectar la mesa de trabajo.
2. Seleccionar una colonia del medio que contiene un cultivo puro, sosteniendo la placa a una
distancia no mayor de 20 cm. del mechero.
3. Esterilizar el asa y dejarla enfriar en el agar.
4. Tomar nicamente la colonia seleccionada
5. Descargar el asa en uno de los extremos de la placa (ver Anexo 1).
6. Realizar la siembra con la misma asa.
7. Esterilizar el asa y dejarla enfriar,





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8. Cerrar la caja y rotularla con el nmero o nombre de muestra, nmero de equipo y fecha.
9. Incubar placas a 37 C por 24 horas.

Segundo Da (Sesin Dos)
1. Desinfectar la mesa de trabajo y encender el mechero.
2. Analizar cuidadosamente el crecimiento en las cajas de Petr, sin abrirlas.
3. Observar las colonias obtenidas y describirlas teniendo en cuenta las siguientes
caractersticas: tamao, color de la colonia, pigmentacin de medio, estructura interna, borde y
hemlisis.
4. Interpretar las formas y caractersticas de las colonias (ver Anexo 3).
5. Guarda las cajas en el refrigerador, hasta la prxima clase (OPCIONAL).

Proceso de Inoculacin y Siembra en Tubo (Medio Slido):

Primer Da (Sesin Uno)
1. Destapar el tubo y flamear la parte superior.
2. Esterilizar el asa recta y enfriarla.
3. Tomar una colonia del medio que contiene el cultivo puro con el asa recta estril.
4. Siembre en los tubos con agar inclinado de acuerdo al mtodo que se utilice de siembra, a una
distancia aproximada de 20 cm. del mechero (ver Fig. 1).
5. Rotular los tubos de la misma manera que las placas.
6. Incubar placas a 37 C por 24 horas.

Segundo Da (Sesin Dos)
1. Analizar y observar cuidadosamente el crecimiento en los tubos, sin abrirlos, y anotar lo
interpretado.
2. Guarda las cajas en el refrigerador, hasta la prxima clase.

Proceso de Inoculacin en Tubo (Medio Lquido):

Primer Da (Sesin Uno)
1. Seleccionar una colonia del medio a una distancia aproximada de 20 cm. del mechero
2. Esterilizar el asa recta y enfriarla
3. Destapar el tubo y flamear la parte superior.
4. Introducir el asa con el inocul a sembrar, agitar el asa hasta que la muestra sea homognea
(ver Anexo 2).
5. Esterilizar el asa y dejarla enfriar
6. Flamear el tubo y taparlo.
7. Rotular los tubos de la misma manera que las placas.
8. Desinfectar la mesa de trabajo
9. Incubar tubos a 37 C por 24 horas.

Segundo Da (Sesin Dos)
1. Analizar y observar cuidadosamente el crecimiento en los tubos, sin abrirlos, y anota lo
observado.
2. Guarda los tubos en el refrigerador, hasta la prxima clase (OPCIONAL).






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Resultados:
Con la informacin obtenida durante la prctica y la posterior investigacin que tendr que realizar
el alumno, entregar un reporte de prctica tal como lo solicite el docente.

Evaluacin (Criterios):
Cada docente establecer los criterios de evaluacin para otorgar una calificacin durante la
prctica y del reporte de prcticas, con la finalidad de medir el grado de adquisicin de
conocimientos, habilidades, aptitudes/valores de las unidades de competencia que se relacionen
con la prctica.

CUESTIONARIO:
1. Por qu se debe trabajar cerca del mechero?
2. Qu es un cultivo puro?
3. Qu estudios se realizan aislando un microorganismo?
4. Qu sucede si se recolecta una colonia bacteriana con el asa caliente?






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Anexos:
Anexo 1. Tcnicas de Siembra en Placa y Tubo



















Anexo 2. Tcnica de sembrado en tubo



















Anexo 1. (a) Inicio de la inoculacin y distribucin de la muestra con asa bacteriolgica, (b) y (c)
distribucin de los cuadrantes 2 y 3 se toca una o dos estras del cuadrante anterior (d) el cuarto
cuadrante se toca una o dos estras del tercer cuadrante y se hace la distribucin con estras
separadas con la finalidad de obtener colonias aisladas. Terminada la distribucin en cada cuadrante
se flamea el asa. Ntese que el procedimiento es en sentido a las manecillas del reloj.
Anexo 2. (a) Se flamea el asa bacteriolgica. (b) Se enfra y se recolecta la muestra. (c) Se introduce
en el tubo con medio lquido y se gira el asa para que se desprenda la muestra. (d) Se cierra el tubo y
se flamea el asa. El proceso se realiza cerca de la flama del mechero.
(a)
(b)
(c) (d)

(a)
(b)
(c)
(d)





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Anexo 3. Morfologa de las colonias bacterianas



























Anexo 3. Caractersticas morfologa de las colonias bacterianas en cultivos primarios (Stanchi N. O., et
al 2007)





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3. Toma, conservacin y envi de muestras para anlisis bacteriolgico y miclogico

UNIDAD DE COMPETENCIA III: Explicar la importancia del control de las bacterias y hongos en
las diversas reas de la medicina veterinaria en las que se ven relacionados, as como la
coleccin, envo y procesamiento de muestras para diagnstico

Introduccin:
La bacteriologa y micologa diagnstica es el estudio de las muestras tomadas a partir de
pacientes de los cuales se sospecha de una infeccin que involucre a estos agentes. El laboratorio
puede apoyar al clnico de la siguiente manera:
Confirmando el diagnstico presuntivo.
Sugiriendo la quimioterapia de la enfermedad.
Colaborando en el conocimiento epidemiolgico de las enfermedades.
Permitiendo la elaboracin de autobacterinas.

Los resultados del examen bacteriolgico y micolgico, as con la rapidez con que stos sean
obtenidos, no dependen slo de los mtodos de laboratorio empleados, sino tambin de la forma
en que sean colectadas y enviadas las muestras clnicas. Dichos resultados pueden verse
influenciados por la presencia de microorganismos que son parte de la microflora normal, por la
migracin bacteriana pos-mortem o por la aplicacin de antimicrobianos antes del envo de la
muestra. El clnico debe tener en mente estos factores para realizar la interpretacin de los
resultados emitidos por el laboratorio.

1. Coleccin y Envi de Muestras:
A continuacin se mencionan algunas normas generales:
Tomar la muestra del sitio ms representativo del problema, de preferencia en la etapa aguda
de la enfermedad.
Las muestras obtenidas a partir de animales muertos debern tomarse dentro de las primeras
3 horas de ocurrida la muerte o el sacrificio.
Las muestras deben colectarse bajo estrictas condiciones de antisepsia. Tanto el material de
coleccin como el recipiente en el que la muestra sea transportada debern ser estriles. Este
ltimo preferentemente debe tener un tapn de rosca.
Las muestras colectadas no deben entrar en contacto con desinfectantes.
Las muestras deben identificarse con los siguientes datos: especie, raza, edad, sexo, arete o
nombre del animal, as como direccin telfono y nombre del propietario del animal (etiqueta
de identificacin).
Una vez colectadas las muestras deben enviarse dentro de las siguientes 24 horas al
laboratorio en condiciones de refrigeracin.
Cuando sea necesario el uso de hisopos para la coleccin de las muestras hay peligro de
desecacin, por ello deben enviarse en medios de transporte (Stuart, Carry-Blair, etc.) que
ayudan a la preservacin de la bacteria pero no a la multiplicacin.
Debe anexarse una historia clnica pertinente que incluya la hora de la muerte del animal,
nmero de animales afectados, si el animal del que proviene la muestra fue tratado con





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antimicrobianos, cules y durante cunto tiempo; as como un diagnstico presuntivo con base
en signos clnicos y epidemiolgicos.
Es importante hacer notar que el manejo de las muestras clnicas deben realizarse con
precaucin debido a que algunos agentes involucrados en las enfermedades infecciosas de
animales constituyen un riesgo de zoonosis para la salud del clnico y del bacterilogo.

Los problemas ms frecuentes para la identificacin bacteriana y micolgica en el laboratorio son:
Envi de muestras no representativas de la lesin en cuestin.
Toma de muestras sin antisepsia.
Envi de muestras en condiciones inadecuadas.
Falta de historia clnica completa y de un diagnstico presuntivo.

Por lo anterior, es indispensable que el clnico tenga un conocimiento sobre la correcta obtencin y
envo de muestras al laboratorio (ver Anexo 4).

Objetivo: El alumno utilizar los procedimientos generales para la coleccin, conservacin y envo
de muestras clnicas al laboratorio para el diagnstico bacteriolgico y micolgico.

Competencias:
Describir el material necesario para colectar muestras o especmenes sospechosos de
microorganismos aerobios y anaerobios
Identificar las condiciones ambientales adecuadas para tomar una muestra representativa de
un proceso infeccioso, as como de agua y alimento
Describir como se conservan y se envan las muestras al laboratorio
Indicar los datos importantes para realizar una historia clnica pertinente, orientada al
diagnstico bacteriolgico y micolgico
Demostrar a partir de una muestra clnica, los conocimientos de coleccin y envi de muestras
para laboratorio

Lugar de Realizacin:
Laboratorio de prcticas de la FMVZ-UAEM, bajo el apoyo del Departamento de Prcticas de la
Facultad, siempre y cuando se decida trabajar con animales de laboratorio.
OPCIONAL: Se puede optar por ir a una explotacin animal y a nivel de campo realizar el ejercicio
de toma y envi de muestras

Tiempo Destinado a la Prctica:
2 Horas (una sesin)

Material:
Grupo:
Una nevera con refrigerantes
Torundas con alcohol al 70 %
Torundas con yodo al 2 %






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Por Equipo:
Material para sujecin del animal
Medio de transporte Stuart
Hisopos estriles
Frascos tipo Gerber estriles
Bolsa de plstico nuevas
Estuche de disecciones

Por Discente:
Equipo de proteccin personal (dependiendo si se decide realizar en laboratorio o explotacin
pecuaria)

Metodologa:
Obtener muestras de exudado, leche, sangre, heces, orina, rgano y pelos de animales que
presenten problemas clnicos, as como de agua y alimento si amerita.
Recopilar los datos ms importantes para realizar la historia clnica
Conservar y enviar las muestras al laboratorio de diagnstico para su anlisis bacteriolgico o
micolgico.

Resultados:
Con la informacin obtenida durante la prctica y la posterior investigacin que tendr que realizar
el alumno, entregara un reporte de prctica tal como lo solicite el docente.

Evaluacin (Criterios):
Cada docente establecer los criterios de evaluacin para otorgar una calificacin durante la
prctica y del reporte de prcticas, con la finalidad de medir el grado de adquisicin de
conocimientos, habilidades, aptitudes/valores de las unidades de competencia que se relacionen
con la prctica.





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Anexos:
Anexo 4. Recomendaciones para la Toma y Envi de Muestras de Acuerdo a Condiciones
Patolgicas Especficas.

Condicin
Patolgica
Tipo de Muestra y Cantidad
Recomendada
Forma de
Coleccin y
Envo
Observaciones
Abortos Feto Completo o Contenido
Abomasal (1 mL)
Pulmn, Bazo, Hgado, Rin
Fetal (6 cm por lado)
Placenta y Placentomas.
Secrecin Vaginal (1 mL)
Leche (15 mL)
Alimento (100 g.)
Frascos,
Bolsas de
Plstico,
Hisopos,
Jeringas.
El feto y los rganos
pueden enviarse en
congelacin, cuando se
sospecha de candidiasis
enviar hgado en medio de
transporte especial.
Alimento en caso de
aflatoxicosis.
Abscesos,
Granuloms y
Exudados
Exudado Purulento (1 mL)
Absceso Completo
Biopsia
Jeringa,
Hisopo,
Frasco, Bolsa
de Plstico.
En caso de granulomas
sospechosos de
tuberculosis deben
extremarse precauciones.
Artritis Lquido Sinovial (1 mL)
Articulacin Completa
Jeringa,
Hisopo, Bolsa
de Plstico.
Desinfectarse piel antes de
la artrocentesis.
Clostridiasis
Invasivas (Miositis
Necrticas,
Hepatitis
Necrtica)
Msculo Necrtico (6 cm. por
lado)
Tejido Subcutneo Edematoso (6
cm. por lado)
Hgado (6 cm. por lado)
Frasco, Bolsa
de Plstico
Enviar rpidamente al
laboratorio en atmsfera
anaerobia, en este caso no
es recomendable
refrigeracin.
Enterotoxemia Intestino y rganos Afectados Segmento
Ligado de
Intestino en
Frasco.
Enviar en refrigeracin.
Dermatomicosis Pelos y Escamas Frascos,
Sobres de
Papel Nuevos,
Portaobjetos
No es necesario que los
recipientes estn estriles.
Las muestras deben
tomarse de la periferia de la
lesin.
Diarreas Intestino
Heces (1 g.)
Nodulos Linfaticos Mesentericos,
Vescula Biliar.
Alimento (100 g.)
Agua (100 mL)
Segmento
Ligado del
Intestino en
Frasco.
Guantes de
Palpacin.
Frascos,
Bolsas,
En grandes especies tomar
las heces directamente del
recto y en pequeas
especies con hisopos. En
caso sospechoso de
paratuberculosis enviar
raspado y mucosa
intestinal.





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Hisopos.
Infecciones
Genitales
Exudados (1 mL)
Lavados Prepuciales o Vaginales
(10 mL)
rganos: Testculos, Epididimo,
tero. (Completos o 6 cm. por
lado)
Hisopos,
Jeringas,
Frascos o
Bolsas de
Plstico.
Si se sospecha de
Campylobacter, Leptospira
o mycoplasma, las
muestras deben enviarse
dentro de las siguientes 3
horas de su coleccin en
refrigeracin.
Infecciones
Urinarias
Orina (6 mL)
Rin (6 cm. por lado)
Cateter,
Jeringa,
Frasco, Bolsa
de Plstico.
Las muestras deben
enviarse dentro de las
siguientes 2 horas de su
coleccin.
Mastitis Leche (15 mL)
Glndula Mamaria (6 cm. por
lado)
Frascos,
Bolsas de
Plstico
Lavar y desinfectar el
pezn previo a la obtencin
de la muestra, cuidar de no
tocar la piel con el frasco,
slo el chorro de leche
tendr contacto con el
frasco.
Neumonas Lavado Traqueobronquial (5 mL)
Pulmn (6 cm. por lado)
Ndulos Linfaticos Mediastinicos
Jeringas,
Frascos,
Bolsas de
Plstico
Si se sospeche de
micoplasmosis o
clamidiasis, las muestras
deben enviarse dentro de
las siguientes 4 horas a su
coleccin.
Otitis Media Aguda
o Crnica
Exudado (1 mL) Hisopos,
Jeringas
Limpiar el canal externo
con un antisptico y tomar
la muestra en el odo
medio.
Problemas
Nerviosos
Encfalo (Completo o 6 cm. por
lado)
Exudados (1 mL)
Lquidos Cefalorraquideo (2 mL)
Bolsas de
Plstico,
Frascos,
Jeringa,
Hisopos.
El liquido cefalorraqudeo
debe ser procesado de
inmediatos
Septicemias Sangre (10 mL)
Bazo, Hgado, Pulmn, Nodulos
Linfaticos
Riones, Cerebro (6 cm. por lado)
Mdula sea (Una Costilla)
Jeringas,
Frascos,
Bolsas de
Plstico
Si el animal tiene ms de 3
horas de muerto debe
enviarse mdula sea.









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4. Aislamiento e identificacin de enterobacterias

UNIDAD DE COMPETENCIA IV: Identificar los principales agentes bacterianos Gram negativos de
importancia veterinaria.

Introduccin:
Dentro de la familia Enterobacteriaceae, muchos gneros de este grupo son habitantes naturales
del tracto gastrointestinal. Antes del advenimiento de los antibiticos, quimioteraputicos e
inmunodepresores, estos gneros bacterianos estaban limitados a causar enfermedades del tracto
gastrointestinal y urinario. Hoy las enterobacterias (como lo es la E. coli) se pueden aislar en
infecciones septicmicas y en otros rganos diferentes al sistema digestivo y urinario.

Las enterobacterias tienen como va de salida las heces y contaminan el medio ambiente, donde
pueden permanecer viables por mucho tiempo en condiciones favorables, por lo cual estos
agentes bacterianos son indicadores del grado de contaminacin fecal de los alimentos y agua.
Algunos microorganismos intestinales como E. coli son parte de la flora normal, producen
enfermedades de manera accidental; en tanto otros gneros como Salmonella cuentan con
serovares que son patgenos para el hombre (tiphymurium) y en los animales domsticos
(chorelaisuis, dublin, entre otros).

Todas las enterobacterias son bacilos Gram negativos, sin agrupacin definida. Ninguna
enterobacteria forma esporas. Son aerobias o anaerobias facultativas. Este grupo es amplio y
frecuentemente de publican cambios en su clasificacin taxonmica.

E. coli causa diarrea y enteritis en distintas especies animales, adems puede actuar como un
patgeno oportunista de procesos miscelneos como mastitis, onfalitis, infecciones de vas
urinarias y respiratorias. Adems existen serotipos enteropatgenos que se asocian a la
produccin de diarreas en cerdos, bovinos, caprinos y equinos; y serotipos asociados a septicemia
en bovinos y aves.

Citrobacter freundii es un patgeno oportunista que se asocia a infecciones miscelneas como las
descritas para E. coli. Se puede aislar de mamferos, aves, reptiles y anfibios.

Salmonella enteritidis causa diarreas, septicemia y aborto en distintas especies animales.
Salmonella cholerasuis causa septicemia y neumona en cerdos. Salmonella gallinarum causa la
tifoidea aviar.

Proteus mirabilis y Proteus vulgaris son patgenos oportunistas ampliamente distribuidos en la
naturaleza.






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Enterobacter aerogenes se asocia a mastitis bovina, se comporta como patgenos oportunista.
Serratia marcescens causa mastitis en bovinos. Klebsiella pneumoniae acta como oportunista en
vas respiratorias y en tracto genital principalmente; es causa comn de mastitis aguda en bovinos
y metritis, cervicitis y abortos en yeguas.

Objetivo:
El alumno describir las caractersticas de cultivo, morfolgicas y bioqumicas ms relevantes de
las enterobacterias de mayor importancia en Medicina Veterinaria.

Competencias:
1. Realizar la tincin de Gram en las diferentes cepas de trabajo para conocer su morfologa
microscpica, afinidad tintorial y agrupacin.
2. Utilizar los medios de cultivo in vitro para el aislamiento de enterobacterias, as como sus
requerimientos atmosfricos.
3. Identificar las principales especies de cada gnero bacteriano perteneciente a las
enterobacterias.
4. Realizar las pruebas bioqumicas mnimas necesarias para la identificacin de las
enterobacterias.
5. Utilizar las tablas de identificacin para confirmar el gnero y la especie de cada
microorganismo.
6. Describir los principales procesos patolgicos en los que se presentan las enterobacterias.

Lugar de Realizacin:
Laboratorio de prcticas de la FMVZ-UAEM, bajo el apoyo del Departamento de Prcticas de la
Facultad

Tiempo Destinado a la Prctica:
4 Horas (dos sesiones)

Material:

GENERAL: Asas bacteriolgicas graduadas, asas bacteriolgicas rectas, portaobjetos, papel
secante, solucin desinfectante, marcador permanente, Mechero, Estufa Bacteriolgica a 37 C
(temperatura constante). Microscopio ptico binocular de campo claro (con objetivos de 4X, 10X,
40X, 100X), tiras de papel filtro.

Seccin:
1 cultivo en agar de Escherichia coli
1 cultivo en agar de Salmonella tiphymurium
1 cultivo en agar de Enterobacter cloacae
1 cultivo en agar de Citrobacter freundii
1 cultivo en agar de Proteus vulgaris o Proteus mirabilis
1 cultivo en agar de Pseudomona aeroginosa





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Por Equipo:
Agar Sangre
Agares selectivos diferenciales: MacConkey, Verde Brillante, XLD, Salmonella-Shigella,
Bismuto sulfito.
Agar de Triple Hierro y Azcar (TSI)
Medio SIM
Citrato de Simmons
Urea
Lisina Descarboxilasa
Agar de Fenilalanina
Base de rojo de Fenol con Lactosa, glucosa, manitol y maltosa.
Medio MIO.
Reactivo de Cloruro ferrico al 10 %.
Reactivo de Oxidasa
Reactivo de Indol
Tren de tincin de Gram
Reactivo de KOH al 3 %

Metodologa:

Primer Da (Sesin Uno)
1. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
2. Inocule y siembre en cada medio de cultivo asignado, la cepa bacteriana establecida a cada
equipo.
3. Realice la tincin de Gram y compruebe con la prueba de KOH al 3 %
4. Realice la prueba de Oxidasa, utilizando el papel filtro
5. Siembre las pruebas bioqumicas con la cepa bacteriana establecida a cada equipo
6. Incube los medios de cultivo y las pruebas bioqumicas a 37 C por 24 horas
7. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
8. Anote las observaciones obtenidos de las pruebas realizadas.

Segundo Da (Sesin Dos)
1. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
2. Realice la tincin de Gram, prueba de KOH al 3% y prueba de Oxidasa.
3. Realice la interpretacin de las pruebas bioqumicas.
4. Observe la morfologa colonial y las reacciones que se observan en cada medio de cultivo.
5. Concluya la identificacin del microorganismo con base a los resultados de las pruebas
bioqumicas.
6. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.

Resultados:
Con la informacin obtenida durante la prctica y la posterior investigacin que tendr que realizar
el alumno, entregara un reporte de prctica tal como lo solicite el docente.






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Evaluacin (Criterios):
Cada docente establecer los criterios de evaluacin para otorgar una calificacin durante la
prctica y del reporte de prcticas, con la finalidad de medir el grado de adquisicin de
conocimientos, habilidades, aptitudes/valores de las unidades de competencia que se relacionen
con la prctica.

CUESTIONARIO:
1. Menciona las principales enterobacterias de importancia en Medicina Veterinaria?
2. Cules son las enfermedades que producen y que especies afectan las enterobacterias que
mencionaste anteriormente?
3. Qu medios de cultivo y pruebas complementarias necesitaras para confirmar el gnero y
especie de las enterobacterias antes mencionadas?









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5. Aislamiento e identificacin de bacterias no entricas
(Bacterias que afectan el tracto respiratorio: Pasteurella, Mannheimia, Bordetella)

UNIDAD DE COMPETENCIA IV: Identificar los principales agentes bacterianos Gram negativos de
importancia veterinaria.

Introduccin:
Las pasteurelas son bacterias facultativas, inmviles y poseen cpsula. No forman esporas. Son
oxidasa positiva. Habitantes normales de las mucosas de las vas respiratorias altas y del tracto
digestivo de animales y hombre. Generalmente se presentan como invasores secundarios
produciendo infecciones del tracto respiratorio, mastitis y ocasionalmente septicmicas.

Pasteurella multocida y Mannheimia haemolytica se asocian al proceso multietiolgico denominado
fiebre de embarque de los bovinos. Pasteurella multocida se asocia a procesos neumnicos en
bovinos y cerdos. Es uno de los agentes etiolgicos de la rinitis atrfica del cerdo (junto con B.
bronchiseptica) y el agente etiolgico del clera aviar.

Mannheimia haemolytica se asocia a procesos neumnicos en ovinos y caprinos, a septicemias en
corderos y a problemas de mastitis en ovinos.

Pasteurella pneumotropica es causa de neumonas y abscesos en cuyos, ratas y hmsters.
Pasteurella gallinarum es parte de la microflora normal de la cavidad nasal de pollos y pavos y se
comporta como oportunista en problemas respiratorios.

Bordetella bronchiseptica son microorganismos aerobios estrictos, pueden presentar motilidad y
generalmente producen cpsulas. No forman esporas. Es una bacteria del epitelio ciliado del tracto
respiratorio de diferentes especies animales. Ocasiona la rinitis atrfica del cerdo en asociacin
con P. multocida. Tambin se ha aislado a partir de neumonas en roedores, gatos, equinos y
perros.

Objetivo: El alumno describir las caractersticas de cultivo, morfolgicas y bioqumicas ms
relevantes de los gneros Pasteurella, Mannheimia y Bordetella de mayor importancia en Medicina
Veterinaria.

Competencias:
Aplicar la tincin de Gram en las diferentes cepas de trabajo para conocer su morfologa
microscpica, afinidad tintorial y agrupacin.
Utilizar los medios de cultivo in vitro para el aislamiento de los gneros Pasteurella,
Mannheimia y Bordetella, as como sus requerimientos atmosfricos.
Identificar las principales especies de los gneros Pasteurella, Mannhemia y Bordetella.





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Realizar las pruebas bioqumicas mnimas necesarias para la identificacin del gnero y
especie de las bacterias estudiadas.
Utilizar las tablas de identificacin para confirmar el gnero y la especie de cada
microorganismo.
Describir los principales procesos patolgicos en los que se presentan los gneros Pasteurella,
Mannheimia y Bordetella.

Lugar de Realizacin:
Laboratorio de prcticas de la FMVZ-UAEM, bajo el apoyo del Departamento de Prcticas de la
Facultad

Tiempo Destinado a la Prctica:
4 Horas (dos sesiones)

Material:

General: Asas bacteriolgicas graduadas, asas bacteriolgicas rectas, portaobjetos, papel
secante, solucin desinfectante, marcador permanente, Mechero, Estufa Bacteriolgica a 37 C
(temperatura constante). Microscopio ptico binocular de campo claro (con objetivos de 4X, 10X,
40X, 100X), tiras de papel filtro.

Seccin:
1 cultivo en agar de Pasteurella multocida
1 cultivo en agar de Mannheimia haemolytica
1 cultivo en agar de Bordetella Bronchiseptica

Por Equipo:
Agar sangre
Agar MacConkey.
Agar de Triple Hierro y Azcar (TSI)
Medio SIM
Urea
Base de rojo de Fenol con Lactosa, glucosa, manitol y maltosa.
Medio MIO.
Reactivo de Oxidasa
Reactivo de Indol
Tren de tincin de Gram
Reactivo de KOH al 3 %

Metodologa:
Primer Da (Sesin Uno)
1. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
2. Inocule y siembre en cada medio de cultivo asignado, la cepa bacteriana establecida a cada
equipo.





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3. Realice la tincin de Gram y compruebe con la prueba de KOH al 3 %
4. Realice la prueba de Oxidasa, utilizando el papel filtro
5. Siembre las pruebas bioqumicas con la cepa bacteriana establecida a cada equipo
6. Incube los medios de cultivo a 37 C por 24 h en microaerobiosis
7. Incube las pruebas bioqumicas a 37 C por 24 h
8. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
9. Anote las observaciones obtenidos de las pruebas realizadas.

Segundo Da (Sesin Dos)
1. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
2. Realice la tincin de Gram, prueba de KOH al 3% y prueba de Oxidasa.
3. Realice la interpretacin de las pruebas bioqumicas.
4. Observe la morfologa colonial y las reacciones que se observan en cada medio de cultivo.
5. Concluya la identificacin del microorganismo con base a los resultados de las pruebas
bioqumicas.
6. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.

Resultados:
Con la informacin obtenida durante la prctica y la posterior investigacin que tendr que realizar
el alumno, entregar un reporte de prctica tal como lo solicite el docente.

Evaluacin (Criterios):
Cada docente establecer los criterios de evaluacin para otorgar una calificacin durante la
prctica y del reporte de prcticas, con la finalidad de medir el grado de adquisicin de
conocimientos, habilidades, aptitudes/valores de las unidades de competencia que se relacionen
con la prctica.

Cuestionario:
1. Menciona las principales diferencias morfolgicas de entre las enterobacterias y bacterias
Gram negativas que afectan el tracto respiratorio?
2. Qu medios de cultivo y pruebas complementarias necesitaras para confirmar el gnero y
especie de los agentes bacterianos antes mencionados?






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6. Aislamiento e identificacin de bacterias Gram positivas
(Cocos pigenos)

UNIDAD DE COMPETENCIA V: Identificar los principales agentes bacterianos Gram positivos de
importancia veterinaria.

Introduccin:
Los estafilococos son microorganismos facultativos, inmviles, generalmente no poseen cpsula y
no forman esporas. Algunas cepas producen pigmento cuando se cultivan a 37C en medios
enriquecidos. Son catalasa positiva. Los estafilococos son microorganismos ubicuos que con
frecuencia pueden ser comensales de la piel y mucosas de los animales. Son organismos
esfricos que se agrupan en racimos, aunque algunas clulas pueden encontrarse solas, en pares
o en cadenas muy cortas. Son fuertemente Gram positivos.

Staphylococcus aureus produce una gran variedad de infecciones supurativas en heridas,
endometritis, cistitis, piodermas en corderos, perros, gatos y en aves se produce tambin en
abscesos. Staphylococcus hycus, se asocia a la entidad clnica especfica del cerdo conocido
como epidermitis exudativa. Staphylococcus intermedius se asocia a piodermas, otitis,
conjuntivitis, osteomielitis y rara vez mastitis en perros. Staphylococccus saprophyticus es un
patgeno oportunista.

Los estreptococos son microorganismos facultativos, generalmente inmviles, algunas especies
poseen cpsula y no forman esporas. Con excepcin de algunas especies de los grupos B y D, no
producen pigmento. Son catalasa negativo. Los estreptococos son parsitos de las mucosas de los
animales y el hombre. Dadas las condiciones apropiadas, pueden convertirse en grmenes
oportunistas, asocindose a una gran variedad de procesos pigenos.

Las colonias de los estreptococos a las 24 h de incubacin a 37 C en aerobiosis son de 1 a 2 mm
de dimetro, circulares convexas, grisceas o translucidas en forma de gotas de roco. La mayora
de las cepas patgenas producen hemlisis o , lo cual se ve incrementado cuando se cultivan
en atmsfera con 10% de CO
2
. Son organismos esfricos u ovoides que se agrupan en cadenas
cuando son cultivados en medios lquidos.

Streptococcus zooepidemicus y Str. equisimilis producen cervicitis, metritis, abortos, poliartritis y
mastitis en equinos; tambin producen procesos pigenos en bovinos y cerdos. Streptococcus
zooepidemicus y Str. equi producen la gurma o papera de los potros. Streptococcus
zooepidemicus, Str. faecalis y Str. faecium se involucran en diferentes procesos patolgicos de las
aves. Streptococcus agalactiae, Str. disgalactiae y Str. uberis son importantes agentes etiolgicos
de mastitis bovina. Streptococcus canis es agente etiolgico de diferentes procesos purulentos en
perros. Streptococcus suis es el agente etiolgico de la linfadenitis estreptococcica del cerdo.





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Objetivo: El alumno describir las caractersticas de cultivo, morfolgicas y bioqumicas ms
relevantes de las especies de Staphylococcus spp y Streptococcus spp de mayor importancia en
Medicina Veterinaria.

Competencias:
Realizar la tincin de Gram en las diferentes cepas de trabajo para conocer su morfologa
microscpica, afinidad tintorial y agrupacin.
Utilizar los medios de cultivo in vitro para el aislamiento de los gneros Staphylococcus spp y
Streptococcus spp, as como sus requerimientos atmosfricos.
Identificar las principales especies de los gneros Staphylococcus spp y Streptococcus spp.
Realizar las pruebas bioqumicas mnimas necesarias para la identificacin del gnero y
especie de las bacterias estudiadas.
Utilizar las tablas de identificacin para confirmar el gnero y la especie de cada
microorganismo.
Describir los principales procesos patolgicos en los que se presentan los gneros
Staphylococcus spp y Streptococcus spp.

Lugar de Realizacin:
Laboratorio de prcticas de la FMVZ-UAEM, bajo el apoyo del Departamento de Prcticas de la
Facultad

Tiempo Destinado a la Prctica:
4 Horas (dos sesiones)

Material:

General: Asas bacteriolgicas graduadas, asas bacteriolgicas rectas, portaobjetos, papel
secante, solucin desinfectante, marcador permanente, Mechero, Estufa Bacteriolgica a 37 C
(temperatura constante). Microscopio ptico binocular de campo claro (con objetivos de 4X, 10X,
40X, 100X).

Seccin:
1 cultivo en agar de Staphylococcus aureus
1 cultivo en agar de Staphylococcus epidermidis
1 cultivo en agar de Streptococcus agalactiae
1 cultivo en agar de Streptococcus disgalactiae
1 cultivo en agar de Steptococcus hemoltico
1 cultivo en agar de Enterococcus faecalis

Por Equipo:
1. Plasma de Conejo.
2. Agar sangre.





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3. Medio selectivo (Staphylococcus): Agar sal y manitol, Agar staphylococcus 110 Agar
Chapman stone.
4. Agar sangre con azida de sodio
5. Agar MacConkey
6. Agua Oxigenada (reactivo de catalasa).
7. Agar de Triple Hierro y Azcar (TSI)
8. Urea
9. Base de rojo de fenol con lactosa, glucosa, manitol, trehalosa, sorbitol y maltosa.
10. Medio MR-VP.
11. Tren de tincin de Gram
12. Reactivo de KOH al 3 %

Metodologa:

Primer Da (Sesin Uno)
1. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
2. Inocule y siembre en cada medio de cultivo asignado, la cepa bacteriana establecida a cada
equipo.
3. Realice la tincin de Gram y compruebe con la prueba de KOH al 3 %
4. Realice la prueba de catalasa, y efectu la prueba de coagulasa en portaobjetos
5. Siembre las pruebas bioqumicas con la cepa bacteriana establecida a cada equipo
6. Incube los medios de cultivo y pruebas bioqumicas a 37 C por 24 h
7. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
8. Anote las observaciones obtenidos de las pruebas realizadas.

Segundo Da (Sesin Dos)
1. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
2. Realice la tincin de Gram, prueba de KOH al 3% y prueba de catalasa.
3. Realice la interpretacin de las pruebas bioqumicas.
4. Observe la morfologa colonial y las reacciones que se observan en cada medio de cultivo.
5. Concluya la identificacin del microorganismo con base a los resultados de las pruebas
bioqumicas.
6. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.

Resultados:
Con la informacin obtenida durante la prctica y la posterior investigacin que tendr que realizar
el alumno, entregara un reporte de prctica tal como lo solicite el docente.

Evaluacin (Criterios):
Cada docente establecer los criterios de evaluacin para otorgar una calificacin durante la
prctica y del reporte de prcticas, con la finalidad de medir el grado de adquisicin de
conocimientos, habilidades, aptitudes/valores de las unidades de competencia que se relacionen
con la prctica.







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Cuestionario:
1. Menciona las principales diferencias morfolgicas de entre las bacterias Gram positivas y
bacterias Gram negativas?
2. Cules son las diferencias entre Staphylococcus y Streptococcus?
3. Qu medios de cultivo y pruebas complementarias necesitaras para confirmar el gnero y
especie de los agentes bacterianos antes mencionados?









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7. Aislamiento e identificacin de agentes micticos

UNIDAD DE COMPETENCIA VII: Identificar los principales agentes micticos de importancia
veterinaria.

Introduccin:
Los dermatofitos forman un grupo de hongos relacionados taxonmicamente, que muestran
afinidad por tejidos queratinizados tales como piel, pelo, plumas, uas, y cuernos. Dentro de este
grupo de hongos se incluyen tres gneros: Epidermophyton, Microsporum y Trichophyton, de los
cuales nicamente los dos ltimos tienen importancia en Medicina Veterinaria.

La mayora de los dermatofitos son habitantes del suelo. Algunas especies que se han adaptado al
husped son parsitos de los animales. Las infecciones por dermatofitos se conocen como
dermatofitosis y se caracterizan por producir lesiones superficiales. En los animales domsticos no
existe diferencia clnica notoria en cuanto a tipo y forma de las lesiones. Estas son generalmente
circulares, con descamacin, alopecia y prurito, con o sin formacin de costras.

Objetivo: El alumno describir las caractersticas de cultivo y morfolgicas ms relevantes de las
micosis ms importantes del grupo de los dermatofitos de mayor importancia en Medicina
Veterinaria.

Competencias:
Realizar la tincin de lactofenol azul de Algodn en las diferentes muestras de trabajo para
conocer su morfologa microscpica.
Utilizar los medios de cultivo in vitro para el aislamiento de dermatofitos, as como sus
requerimientos atmosfricos.
Identificar las principales especies de cada gnero mictico de importancia Medicina
Veterinaria.
Utilizar las tablas de identificacin para confirmar el gnero y la especie de cada
microorganismo.
Describir los principales procesos patolgicos en los que se presentan los gneros
pertenecientes al grupo de los dermatofitos.

Lugar de Realizacin:
Laboratorio de prcticas de la FMVZ-UAEM, bajo el apoyo del Departamento de Prcticas de la
Facultad

Tiempo Destinado a la Prctica:
4 Horas (dos sesiones, separadas por una semana una de otra)








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Material:

General: Asas bacteriolgicas graduadas, asas bacteriolgicas rectas, portaobjetos, cubreobjetos,
papel secante, solucin desinfectante, marcador permanente, Mechero, Estufa Bacteriolgica entre
24 y 28 C (temperatura constante). Microscopio ptico binocular de campo claro (con objetivos de
4X, 10X, 40X, 100X), Hojas y mangos de Bistur, pinzas sin dientes de uso clnico.

Por Equipo:
Agar sangre.
Medio selectivo: Agar Sabouraud, agar para seleccin de hongos (agar micobitico) o agar
tripticasa de soya.
Agar MacConkey
Base de rojo de fenol con lactosa, glucosa, manitol, trehalosa, sorbitol y maltosa.
Tren de tincin lactofenol azul de algodn

Metodologa:

Primer Da (Sesin Uno)
Preparacin y Acondicionamiento de la Muestra:
La muestra ha utilizar para el aislamiento e identificacin micolgica debe ser caracterstica, y
debe ser tomada bajo las debidas medidas de bioseguridad exigidas para este gnero y del
tamao adecuado, y procesarse inmediatamente.

Procedimiento:
1. Con un hisopo estril se toma la muestra y se siembra en una caja de agar Sabouraud o agar
micobitico, agar sangre y agar Mc Conkey, e inocular bajo el procedimiento de aislamiento en
cultivo puro incubando a 30 C por 24 a 72 h.

2. Sembrado en el microcultivo:
a. Dentro de una caja petr estril agregar entre 2 a 4 mL de agua bidestilada estril.
b. Colocar un soporte y poner un portaobjetos con un cuadro de Agar Sabouraud o
Agar para hongos de aproximadamente 1 cm
2
.
c. Con el asa tomar la muestra y sembrar por picadura en cada lado del agar,
posteriormente colocar el cubreobjetos, tapar la caja e incubar de 24 a 28 C de
entre 24 a 120 h aprox.
d. Una vez observado crecimiento se procede a la realizacin del frotis, previa
inactivacin del cultivo.

3. Preparacin del frotis.
a. Introduce un algodn impregnado con formol al 10 % en la caja y djalo actuar
durante 30 minutos con el fin de inactivar al hongo.
b. En un portaobjetos coloca dos gotas separadas de lactofenol azul de algodn. Con
las pinzas toma cada uno de los cubreobjetos y colcalos sobre cada una de las
gotas del colorante.





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c. Obsrvese las preparaciones en el microscopio de campo claro con los objetivos 10
X y 40 X
d. Observa las estructuras fungales y sus caractersticas morfolgicas.

Segundo Da (Sesin Dos)
Interpretacin de Resultados:
La identificacin se lleva a cabo mediante la observacin de las colonias fungales y la preparacin
de frotis hmedos a partir de estas o a partir de microcultivos con el fin de determinar la morfologa
microscpica (ver Anexo 5).

1. Identificacin en medio de cultivo: las cajas de estos medios deben ser revisadas
peridicamente hasta por 190-200 h a 24 a 28 C y observar la textura, tamao y pigmento de la
superficie y base de las colonias desarrolladas. La mayora de los dermatofitos producen colonias
con micelio de aspecto algodonoso o polvoso.

2. Tincin de Azul de Algdon: los dermatofitos producen dos tipos de aleuriosporas; las
macroaleuriosporas (multicelulares, septadas) y las microaleuriosporas (unicelulares, no septadas)
la morfologa caracterstica de dichas estructuras permite la identificacin de cada una de las
especies.

Epidermophyton produce abundantes macroaleuriosporas de pared gruesa y lisas, en forma de
raqueta y no produce microaleuriosporas.

Trichophyton produce pocas macroaleuriosporas con forma alargada (forma de basto), de pared
lisa y delgada, y produce abundantes microaleuriosporas.

Microsporum produce abundantes macroaleuriosporas en forma de huso, con pared gruesa y
spera (a menudo descritas como ornamentadas) y produce pocas microaleuriosporas. Otras
estructuras microscpicas que ocasionalmente son tiles para la identificacin de los dermatofitos
son la presencia de hifas espirales o en forma de peine (hifas pectinadas); la presencia de
clamidosporas terminales; de artrosporas.

Resultados:
Con la informacin obtenida durante la prctica y la posterior investigacin que tendr que realizar
el alumno, entregara un reporte de prctica tal como lo solicite el docente.

Evaluacin (Criterios):
Cada docente establecer los criterios de evaluacin para otorgar una calificacin durante la
prctica y del reporte de prcticas, con la finalidad de medir el grado de adquisicin de
conocimientos, habilidades, aptitudes/valores de las unidades de competencia que se relacionen
con la prctica.






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Cuestionario:
1. Menciona las principales diferencias morfolgicas entre las bacterias y los hongos
microscpicos?
2. Qu diferencia hay entre la tincin de Gram y la tincin Lactofenol azul de algodn?
3. Qu medidas de bioseguridad utilizaras para manipular y procesar muestras de
enfermedades micticas?





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ANEXOS:
Anexo 5: Principales agentes micoticos de importancia en medicina veterinaria (Hungerford, et al.,
1998)


a) Microsporum canis b) Microsporum gypseum

c) Conidiobolus coronatus d) Sporothrix schenckii

e) Aspergillus flavus f) Blastomyces dermatitidis

g) Malassezia pachydermatis h) Trichophyton mentagrophytes






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8. Determinacin de la susceptibilidad in vitro a los antimicrobianos

UNIDAD DE COMPETENCIA VIII: Identificar los mecanismos de accin y resistencia de los
antimicrobianos utilizados en medicina veterinaria

Introduccin:
En la actualidad se encuentra una gran cantidad de antibiticos en el mercado, algunos solamente
son especficos para determinadas bacterias, otros nicamente las inhiben y otros actan solo
sobre las Gram positivas.

Debido al abuso de los antibiticos, las bacterias han adquirido resistencia a ellos, de ah que
cuando se presenta un paciente en el que no surten efectos los antibiticos, se debe considerar
que el microorganismo que lo est infectando se ha hecho resistente.

En la seleccin del antibitico ms adecuado para el tratamiento de una infeccin bacteriana se
deben tomar en cuenta diversos factores que dependen tanto del tipo de antibitico elegido y de su
efecto sobre el agente causal que se aslo del proceso infeccioso.

Se han propuesto diversos mtodos para medir in vitro la susceptibilidad bacteriana a los
antibiticos, de los cuales el ms popular es el mtodo de difusin en agar, prueba cualitativa en la
que se utilizan discos de papel filtro impregnado con concentraciones conocidas de los diferentes
antibiticos. Estos discos se colocan sobre la superficie del agar Muller-Hinton previamente
inoculado con la cepa problema (ver Anexo 6).

Despus de la incubacin se observan halos de inhibicin de desarrollo bacteriano alrededor de
los discos con antibiticos a los cuales el microorganismo es susceptible. Por el contrario, si la
bacteria es resistente hay crecimiento alrededor del disco (ver Anexo 6).

Objetivo: El alumno determinar la susceptibilidad a los antimicrobianos empleados para Gram
positivos y Gram negativos mediante el mtodo de difusin en agar.

Competencias:
Realizar el mtodo de difusin en agar como prueba de susceptibilidad in vitro a los
antimicrobianos.
Identificar los principales antimicrobianos empleados para agentes bacterianos Gram positivos
y Gram negativos.
Analizar los resultados de la prueba de susceptibilidad in vitro para clasificara los agentes
bacterianos en susceptibles, susceptibilidad intermedia y resistentes a los antimicrobianos a los
que fueron desafiados.
Describir los principales mecanismos de accin de los antimicrobianos en los principales
gneros bacterianos de importancia Medicina Veterinaria.





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Lugar de Realizacin:
Laboratorio de prcticas de la FMVZ-UAEM, bajo el apoyo del Departamento de Prcticas de la
Facultad

Tiempo Destinado A La Prctica:
4 Horas (dos sesiones)

Material:

General: Asas bacteriolgicas graduadas, pinzas de diseccin sin dientes de uso clnico, Comps
de calibracin, Vernier, regla o platilla diseada para este propsito, hisopos estriles, papel
secante, solucin desinfectante, marcador permanente, Mechero, Estufa Bacteriolgica a 37 C
(temperatura constante).

Seccin:
1 cultivo en agar de E. coli
1 cultivo en agar de Staphylococcus spp
Medio Agar Muller-Hinton
Caldo Muller-Hinton
Multidiscos de 12 antibiticos para bacterias Gram positivos (Sanofi Diagnostics Pasteur, S. A.)
Multidiscos de 12 antibiticos para bacterias Gram negativos (Sanofi Diagnostic Pasteur, S. A.)

Metodologa:

Primer Da (Sesin Uno)
Preparacin y Acondicionamiento de la Muestra:
Preparar el medio de agar Mueller-Hinton de acuerdo a las instrucciones del fabricante, el pH final
a temperatura ambiente deber estar entre 7.2 y 7.4, este medio favorece el crecimiento de casi
todos los microorganismos para los que son ms importantes las pruebas de susceptibilidad.

Tomar con una asa bacteriolgica de 4 a 5 colonias aisladas del mismo tipo morfolgico e inocular
en 4 mL de caldo Mueller-Hinton, se incuba a 35 C hasta que aparece una turbidez ligera
(generalmente 2 a 5 horas), la turbidez se ajusta con solucin salina estril o caldo estril hasta
tener una densidad de 0.5 de MacFarland, comparable con un estndar de sulfato de bario [El
estndar se prepara mezclando 0.5 mL de BaCl
2
0.048 M (1.175 % peso/volumen de BaCl
2
H
2
0)
con 99.5 mL de H
2
SO
4
al 1% v/v (0.36N)].

La suspensin ajustada del inoculo no debe permanecer ms de 15 a 20 minutos antes de
proceder a inocular en la caja de Petr.







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Procedimiento:
1. Para inocular el agar se utiliza un hisopo estril de algodn, el cual se humedece con la
suspensin, se quita el exceso de caldo presionado y girando el hisopo sobre la pared interna
del tubo, por arriba del nivel del caldo, se estra el medio en tres direcciones sobre la totalidad
de la superficie de agar, para obtener un inculo uniforme, se efecta un ltimo barrido del
hisopo sobre el reborde de la caja de Petr y el agar. Cuando el inculo se haya secado (de 3 a
5 minutos) se procede a colocar los discos.
2. Los discos se toman con pinza estril y se colocan en el medio en un tiempo menor de 15
minutos despus de haber inoculado la placa, los discos debern presionarse ligeramente para
asegurar un contacto con la superficie, deber prevenirse una sobreposicin de las zonas de
inhibicin con la distribucin adecuada de los discos y con un lmite no menor de 15 mm de los
bordes de la placa.
3. Despus de 15 minutos de haber colocado los discos, invertir la caja de Petr e incubar a 35
C. El tiempo de incubacin es de 18 a 24 horas.

Interpretacin:

Segundo Da (Sesin Dos)
La medicin de los halos de inhibicin se hace con comps de calibracin, Vernier, regla o platilla
diseada para este propsito, por el fondo de la caja la cual se ilumina con luz reflejada. El punto
final de todos los sistemas de lectura ser hasta la completa inhibicin del crecimiento determinada
visualmente, ignorando colonias tenues o muy pequeas que pueden ser observadas con
minuciosidad (ver Anexos 6 y 7).

Resultados:
Con la informacin obtenida durante la prctica y la posterior investigacin que tendr que realizar
el alumno, entregara un reporte de prctica tal como lo solicite el docente.

Evaluacin (Criterios):
Cada docente establecer los criterios de evaluacin para otorgar una calificacin durante la
prctica y del reporte de prcticas, con la finalidad de medir el grado de adquisicin de
conocimientos, habilidades, aptitudes/valores de las unidades de competencia que se relacionen
con la prctica.

Cuestionario:
1. Que otros medios de cultivo se pueden utilizar para preparar el inoculo?
2. Cmo sabremos que el tubo con el inoculo ya est listo para ser inoculado?
3. Que otros medios de cultivo se pueden utilizar en lugar del agar Mueller-Hinton?












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Anexos:
Anexo 6: Visualizacin de los diferentes resultados obtenidos en la prueba de susceptibilidad in
vitro, por el mtodo de difusin en Agar (Kirby-Bauer).














Anexo 7: Clasificacin de la susceptibilidad antimicrobiana con base al dimetro de los halos de
inhibicin en bacterias Gram positivas y Gram negativas.
ANTIBITICO CONCENTRACIN
(MICROGRAMOS/mL)
DIMETRO DEL HALO DE INHIBICIN
EN mm (***)
Resistente
()
Intermedio Susceptible
()
AMIKACINA 30 14 15-16 17
AMPICILINA
Enterobacteriaceae
Staphylococcus spp.
Enterococcus spp.
Estreptococcus spp.
10
11
28
16
21

12-13


22-29

14
29
17
30
CARBENICILINA
Enterobacteriaceae
Pseudomona aeruginosa
100
17
13

18-22
14-16

23
17
CEFALOTINA 30 14 15-17 18
CEFOTAXIMA 30 14 15-22 23
CEFTAZIDIMA 30 14 15-17 18
CETRIAXONA 30 13 14-20 21
CEFUROXIMA 30 14 15-17 18
CLORANFENICOL 30 12 13-17 18
DICLOXACILINA
Estafilococcus spp.
1
10

11-12

13
ENOXACIMA
Enterobacteriaceae
10
14

15-17

18
ERITROMICINA
Enterococcus spp.
15
13

14-17

18
GENTAMICINA 10





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Enterobacteriaceae 12 13-14 15
NETILMICINA 30 12 13-14 15
NITROFURANTOINA 300 14 15-16 17
PEFLOXACINA 5 14 15-22 23
PENICILINA
Etaphylococcus spp
N. gonorrhoeae
Enterococcus spp.
Estreptococcus spp.
10 UI
28
19
14
19

29
20

20
TETRACICLINA
Enterobacteriaceae
30
14

15-18

19
TRIMETROPRIM-
SULFAMETOXAZOL

25

10

11-15

16
(***): Instructivo de multidiscos Gram positivos, Gram negativos BIO-RAD








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9. Procesamiento de muestras enviadas al laboratorio de bacteriologa y micologa

UNIDADES DE COMPETENCIA QUE SE RELACIONAN CON LA PRCTICA:
UNIDAD DE COMPETENCIA I, III, IV, V, VI, VIII

Introduccin:
Un adecuado diagnstico y tratamiento de las diversas enfermedades producidas por bacterias y
hongos, generalmente requiere de la deteccin e identificacin del agente etiolgico. Esto se logra
en el laboratorio a travs del examen microscpico, aislamiento e identificacin del agente y la
prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos.

Una vez que la muestra ha sido debidamente registrada e identificada, lo ideal es que sean
trabajadas de inmediato, pero cuando esto no sea posible ser necesario mantenerlas en
refrigeracin (4 a 8 C) hasta que puedan ser procesadas. Sin embargo, es conveniente considerar
que existen muestras que deben ser trabajadas de inmediato ya que el proceso de refrigeracin no
puede lograr que se conservan sin presentar alteraciones y multiplicaciones bacterianas, aunque
sea a un ritmo ms lento, por ejemplo: orina, semen, alimento, agua, material fecal y leche.

Objetivo: El alumno aplicar los conocimientos para la realizacin del diagnstico bacteriolgico y
micolgico de muestras clnicas como son: observacin directa, aislamiento e identificacin de los
microorganismos aislados en leche, heces y procesos pigenos.

Competencias:
Valorar conforme a los lineamientos de conservacin y envo de muestras al laboratorio, la
aceptacin o el rechazo de una muestra para diagnstico.
Discutir los datos importantes de una historia clnica para orientar el diagnstico bacteriolgico
y micolgico (establecer un diagnstico presuntivo al proceso de laboratorio).
Utilizar los procedimientos tcnicos para el aislamiento de agentes bacterianos o micticos.
Realizar la identificacin de los microorganismos aislados a partir de las muestras clnicas.
Emitir el resultado final del diagnstico bacteriolgico o micolgico.
Realizar la prueba de susceptibilidad in vitro a los antimicrobianos de los microorganismos de
importancia aislados

Lugar de Realizacin:
Laboratorio de prcticas de la FMVZ-UAEM, bajo el apoyo del Departamento de Prcticas de la
Facultad

Tiempo Destinado a la Prctica:
4 Horas (dos sesiones)







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Material:

General: Asas bacteriolgicas graduadas, asas bacteriolgicas rectas, portaobjetos, papel
secante, solucin desinfectante, marcador permanente, mechero, estufa bacteriolgica a 37 C
(temperatura constante). Microscopio ptico binocular de campo claro (con objetivos de 4X, 10X,
40X, 100X), tiras de papel filtro.

Por Equipo:
agar Sangre
agares selectivos: MacConkey, Sal y manitol, Agar dextrosa y papa
agar de Triple Hierro y Azcar (TSI)
Medio SIM
Citrato de Simmons
Urea
Lisina descarboxilasa
agar de Fenilalanina
Base de rojo de fenol con lactosa, glucosa, manitol y maltosa.
Medio MIO.
Reactivo de cloruro frrico.
Reactivo de Oxidasa
Reactivo de Indol
Tren de tincin de Gram
Reactivo de KOH al 3%

Metodologa:

Leche:
La siguiente metodologa es la sugerida por el Consejo Nacional de la Mastitis de los Estados
Unidos de Amrica, en su publicacin procedimientos de diagnstico de la mastitis bovina

Primer Da (Sesin Uno)
a) Las muestras refrigeradas deben ser calentadas a 25 C durante 15 minutos con el fin de
liberar los microorganismos atrapados en la grasa de la leche.
b) La muestra debe agitarse vigorosamente para homogeneizarla.
c) Inmediatamente proceda a realizar dos frotis fijos, teir con Gram, obsrvalos y anotar los
resultados.
d) Inocula 3 asadas de la muestra (son necesarias por los menos 0.025 mL) en la caja de agar
sangre, agar MacConkey, agar Sal y manitol y a partir de este inculo realiza la primera estra
y completa la tcnica para aislamiento en cultivo puro. Incuba 24 horas a 37 C, en algunos
casos ser necesario incubar hasta 48 h.

Segundo Da (Sesin Dos)
a) De las colonias aisladas describe nmeros relativos y morfologa macroscpica.
b) Realiza un frotis a partir de las colonias representativas del aislamiento y describe forma,
agrupacin y reaccin al Gram.
c) Realiza las pruebas de identificacin necesarias para determinar gnero y especie.





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d) Realizar un antibiograma y determinar la susceptibilidad antimicrobiana de los
microorganismos aislados.
e) Emite un resultado definitivo y de acuerdo a este sealar los comentarios y/o recomendaciones
tiles para el clnico.

Heces:
Primer Da (Sesin Uno)
a) Realiza un frotis fijo a partir de la muestra y teir con Gram, observar y anotar los resultados.
NOTA: Debido a que las heces contiene una microflora normal abundante el valor diagnstico del
frotis tiene un valor relativo salvo algunas excepciones importantes.
b) Inocular una asada de la muestra en la caja de agar sangre, agar MacConkey, agar Sal y
manitol y realizar la tcnica para aislamiento en cultivo puro. Incuba a 37 C durante 24 horas.
c) Inocular aproximadamente 0.500g de la muestra en el tubo con caldo selenito. Incuba a 37 C
durante 6-18 h y subcultivar en el medio de verde brillante con la tcnica para aislamiento en
cultivo puro. Incuba a 37 C durante 24 h.

Segundo Da (Sesin Dos)
a) Observar el desarrollo bacteriano en los medios de cultivo inoculados, describir nmeros
relativos y morfologa de las colonias aisladas.
b) Realizar un frotis fijo a partir de las colonias representativas del aislamiento, teir con Gram y
describir agrupacin y reaccin tintorial.
c) Realizar las pruebas bioqumicas necesarias para determinar el gnero y especie del
microorganismo aislado.
d) Realizar un antibiograma y determinar la susceptibilidad antimicrobiana de los
microorganismos aislados.
e) Emitir un resultado definitivo y de acuerdo con este, sealar los comentarios y/o
recomendaciones tiles para el clnico.

Orina, Agua, Semen y Procesos Pigenos:
Primer Da (Sesin Uno)
a) Con uno de los hisopos de la muestra se inocula en el 1er. cuadrante de la caja de agar
sangre, agar MacConkey, agar sal y manitol, as como realizar un frotis directo a partir de la
muestra. Teir con Gram, obsrvar y anotar la forma, agrupacin, reaccin tintorial y nmeros
relativos.
b) Con el asa, se estria el resto de las cajas inoculadas bajo el proceso de siembra para
aislamiento en cultivo puro.
c) Incubar los medios a 37 C durante 24 h.

Segundo Da (Sesin Dos)
a) Observar el desarrollo bacteriano en los medios de cultivo inoculados, describir nmeros
relativos y morfologa de las colonias aisladas.
b) Realizar las pruebas de identificacin bioqumica necesarias para determinar gnero y especie
del microorganismo aislado.
c) Realizar un antibiograma y determinar la susceptibilidad antimicrobiana de los
microorganismos aislados.





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d) Emitir un resultado definitivo y de acuerdo a este, sealar los comentarios y/o
recomendaciones tiles para el clnico.

Alimento:
Primer Da (Sesin Uno)
a) Inocular aproximadamente 0.500g en 9.5 mL de caldo selenito y caldo lactosado, e incubar por
4 h a 37 C.
b) A partir del caldo selenito, inocular en las cajas de agar MacConkey y agar verde brillante; y a
partir del caldo lactosado inocular en las cajas de agar sangre y agar Sal y manitol.
c) Realizar la tcnica para aislamiento en cultivo puro.
d) Incubar a 37 C durante 24 horas.

Segundo Da (Sesin Dos)

a) Observar el desarrollo bacteriano en los medios de cultivo inoculados, describir nmeros
relativos y morfologa de las colonias aisladas.
b) Realizar un frotis fijo a partir de las colonias representativas del aislamiento, teir con Gram y
describir agrupacin y reaccin tintorial.
c) Realizar las pruebas bioqumicas necesarias para determinar el gnero y especie del
microorganismo aislado.
d) Realizar un antibiograma y determinar la susceptibilidad antimicrobiana de los
microorganismos aislados.
e) Emitir un resultado definitivo y de acuerdo con este, sealar los comentarios y/o
recomendaciones tiles para el clnico.

Resultados:
Con la informacin obtenida durante la prctica y la posterior investigacin que tendr que realizar
el alumno, entregara un reporte de prctica tal como lo solicite el docente.

Evaluacin (Criterios):
Cada docente establecer los criterios de evaluacin para otorgar una calificacin durante la
prctica y del reporte de prcticas, con la finalidad de medir el grado de adquisicin de
conocimientos, habilidades, aptitudes/valores de las unidades de competencia que se relacionen
con la prctica.









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IV. BIBLIOGRAFA

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V. ACTUALIZACIN

Manual de Prcticas de Laboratorio de Bacteriologa y Micologa. Facultad de Medicina Veterinaria
y Zootecnia de la Universidad Autnoma del Estado de Mxico. Toluca, Mxico; 08 de Julio de
2013.

Primera Edicin


FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

Director:
Dr. en C. Jos Mauro Victoria Mora

Elabor:
MVZ. Salvador Lagunas Bernab
M. en C. Luis Fernando Vega Castillo

Revis:
M. en C. Pomposo Fernndez Rosas
QFB. Roberto Daz Guadarrama