Enzimas

Enzimas
! Definicin
Protenas que aceleran las reacciones qumicas
en el organismo.

! Cmo funcionan?
Estabilizando el estado de transicin
Bajando la energa de activacin

! Qu se hace con ellas?
Manipulacin de los cidos nuclecos (DNA, RNA)
Clasificacin
! Enzimas que cortan las cadenas de DNA y
RNA
! Enzimas que reparan las cadenas de DNA
y RNA
! Enzimas que sintetizan las cadenas de DNA
y RNA
! Enzimas que agregan o remueven el grupo
fosfato de los extremos de las cadenas de
DNA y RNA
! Enzimas y protenas que protegen, envuelven,
giran y desenrollan el DNA
1. Nucleasas : Enzimas que cortan, acortan o
degradan las molculas de cidos nucleicos

2. Ligasas : Unen molculas de cidos nucleicos

3. Polimerasas : Hacen copias de las molculas

4. Enzimas modificadoras : Sacan o agregan grupos
qumicos

5. Topoisomerasas : Introducen o remueven el
super enrollamiento del DNA circular cerrado
Grado de manipulacin de las Enzimas
" Enzimas modificadoras de protenas
Proteasas
" Enzimas modificadoras DNA
Enzimas de Restriccin y Metilasas
Otras Nucleasas, DNasas
Fosfatasas, Kinasas and Ligasas
Topoisomerasas y Recombinasas
DNA Polimerasas
" Enzimas modificadoras RNA
RNA Polimerasas
RNasas
Grado de manipulacin de las Enzimas
! Tripsina (residuos His o Ser )
! Proteasa, corta despus de un a bsico.
([K/R]^X)
- Proteinasa K
! Proteasa (Tritirachium album), corta despus de
residuos alifticos y aromticos.
- Proteasa Alkalina
! Proteasa (Bacillus licheniformis), activa sobre
pH9, corta despus de residuos largos sin carga.
Proteasas

Proteasa TEV
Proteasa Cistena (Tobacco Etch Virus) (NIa protena)
(ENLYFQ^G)

Factor Xa
Proteasa Serina que convierte protrombina a trombina
(I[E/D]GR^X)

Proteasa
Proteasa Rhinovirus 3C Humano protena GST de fusin
Proteasa Cistena (LEVLFQ^GP)

Trombina
Proteasa Serina que convierte fibringeno a una forma
activa que se ensambla en fibrina (LVPR^GS)
Proteasas Especficas
Endonucleasas sitio especficas dsDNA.

Cepas bacterianas diferentes, expresan
diferentes enzimas de restriccin.
Reconocen secuencias cortas de DNA
Cortan (hidrolizan) el DNA en ambas hebras, en
fragmentos definidos y reproducibles.
mapeo y clonamiento

Herramientas bsicas para el clonamiento de
genes: caracterizadas alrededor de 3700
comercializadas alrededor de 200
Enzimas de Restriccin y Metilasas
Enzimas de Restriccin
" enzimas que reconocen y cortan ds DNA
en sitios especficos sitios de corte,
denominados sitios de restriccin



EcoRI

1
enzima encontrada
Escherichia coli
Especie categoria
R13
cepa

Ejemplos:
EcoR I: Escherichia coli RY 13
EcoICR I: Escherichia coli ICR
BamH I: Bacillus amyloliquefaciens H
Hinc II: Haemophilus influenzae Rc
Enzimas diferentes reconocen su sitio
especfico con distinta frecuencia

EcoRI Reconoce secuencia hexamrica: 4
-6
Sau3A1 Reconoce secuencia tetramrica : 4
-4

Sau3A1 corta la molcula de DNA con mayor
frecuencia
sticky ends
COHESIVOS

blunt ends
ROMOS

Extremos cohesivos
Sitios de corte palindrmicos
EcoRI site GAATTC
Cortan dentro del sitio
EcoRI sitio G^AATTC, Type II

EcoRV sitio



Isosquizmeros: Enzimas que reconocen el mismo sitio y
cortan en la misma posicin.
Neosquizmeros: Enzimas que reconocen el mismos sitio
pero cortan en diferente posicin.
Sitios de reconocimiento
cortan dsDNA:
5 overhangs, ej., EcoR I, G^AATTC
3 overhangs, ej., Pst I, CTGCA^G
extremos romos/Blunt ends, ej., Sma I, CCC^GGG

Extremos colgantes pueden unirse a la base complementaria a
travs de enlaces de hidrgeno.
Enzimas de restriccin con palndromes interrumpidos,
podran no siempre unirse.
ej., BstE II G^GTNACC

Enzimas de restriccin diferentes pueden producir extremos
cohesivos que son compatibles o se pueden unir

Enzimas de Restriccin
extremos cohesivos / Sticky Ends
Todas requieren
Mg2+ cofactor
Generan extremos 5 fosfato y 3 OH
Son afectadas por la concentracin de sal

Unen la segunda secuencia de
reconocimiento al sitio alostrico

Modelo de corte
La enzima posiciona Mg2+ cerca del enlace fosfato a cortar
Ataque nucleoflico
Mg2+ se enlaza al agua protonada 3 OH
Enzimas de restriccin/Mecanismo
Metilasas
reconocen la mismas secuencias / endonucleasas
metilan cada hebra en una base y posicin
especfica
4-metilcitosina
5-metilcitosina
5-hidroximetilcitosina
6-metiladenina
Metilacin; el DNA deja de ser substrato de la
endonucleasa.
Base para el sistema de defensa de Restriccin /
Modificacin
Enzimas de Restriccin y Metilasas
Actividad Star
Prdida de la actividad
pH alto
Cationes divalentes diferentes al Mg, ej., Mn
Presencia de Glicerol

cccDNA
necesitan 3-5 veces ms enzima

Digestin de sitios cerca de los
extremos de la molcula lineal del DNA
Productos de PCR
3 a 6 nucletidos extras
Otras consideraciones
- Degradan molculas de DNA rompiendo los enlaces
fosfodister. nucletido / nucletido en una hebra
de DNA.

- Existen 2 tipos de nucleasas:
1. Exonucleasas : Remueven nucletidos uno a uno
desde los extremos de la molculas de DNA (ej.
Nucleasa BAL31, E. coli Exonucleasa III, etc)
2. Endonucleasas : Rompen enlaces fosfodister
dentro de la molcula de DNA (ej. S1 Nucleasa,
Mung Bean Nucleasa, DNAsa, etc.
Nucleasas
Exonucleasas
Exonucleasas
Exonucleasa III
3 # 5 actividad exonucleasa
Para DNA de doble hebra (ds), no de hebra simple (ss),
inicia en roturas (nicks)
deleciones nested, sondas ssDNA, o secuenciacin
Exonucleasa VII
3 # 5 o 5 # 3 direccin
specfica para ss
No libera mononucletidos
Exonucleasa Lambda
5 # 3 direccin
Exonucleasa para ds, no puede iniciar en roturas (nicks)
Endonucleasas
Endo - y Exonucleasas
Nucleasa Bal31
Altamente especfica para actividad
endodeoxynucleasa ss
Actividad Exonucleasa capaz de degradar
simultneamente extremos 3 y 5 de ds DNA
Neurospora Crassa Nucleasa
En ssDNA o RNA : acta como una endonucleasa
En dsDNA (y ssDNA) : acta como una exonucleasa

1.Fosfatasa Alkalina (AP) : Remueve el grupo
fosfato presente en el extremo 5 de la molcula de
DNA.
Ej., Calf Intestinal Alkaline Phosphatase
Shrimp Alkaline Phosphatase
Usos : Previene la recircularizacin del plsmido
durante el clonamiento.

2. Kinasa Polinucleotdica : Agrega grupos
Fosfatos en el extremo 5, transfiere !-PO4 desde
ATP a 5-OH de ss o ds DNA o RNA.
Ej., T4 Kinasa
Usos: Marcaje
Enzimas Modificadoras de DNA
Kinasas
3. Transferasa Terminal deoxinucleotdica :
Agrega 1 o ms deoxinucletidos sobre el extremo
3 de una molcula DNA.
Usos : Reacciones para agregar colas de nt en 3.


4. DNA Metilasa (dam & dcm) : Transfieren
grupos metil en residuos internos de A o C en
secuencias especficas para producir DNA duplex
metilado.
Enzimas Modificadoras de DNA
5. T4 DNA Ligasa / T4 RNA Ligasa

une extremos romos y/o cohesivos, como tambin
repara roturas ss (nicks) en duplex de DNA, RNA o
hbridos DNA/RNA.



Enzimas Modificadoras de DNA
Cataliza formacin enlace fosfodister entre
3-OH y 5-P en DNA
T4 DNA Ligasa
usada en clonamiento
Requiere ATP, Mg2+ y DTT
Amplio rango de temperatura, ptima a 25 C
Inhibida por alta concentracin de sal
(ej. 150 mM NaCl)
DNA Ligasa Resumen
RNA Ligasas
Nucleasa Bal 31
Nucleasa S1
DNasa I
! DNA Polimerasa I & Klenows
! T4 DNA Polimerasa
! Transcriptasa Reversa : MMLV & AMV
! Polimerasa Termostable de DNA : Taq & Pfu
DNA Polimerasas
" Enzimas que sintetizan una nueva hebra de
DNA complementaria a partir de un templado de
DNA o RNA.
" Biologa Molecular :
Estructura general DNA Polimerasas
DNA Polimerasa
Klenom fragment
E. coli DNA polimerasa I
3 actividades / 1 polipptido
Klenom fragment Klenom fragment Klenom fragment
Klenom fragment
DNA damage
DNA Polimerasa
DNA Polimerasa
DNA Polimerasa
DNA Polimerasa
DNA Polimerasa
Reaccin Proofreading
Exonucleasa

RNA-dependiente DNA Polimerasa

Templado de RNA

5-->3 polimerasa, 5-->3 riboexonucleasa
y 3-->5exoribonucleasa

Usada en la sntesis de cDNA

Marcaje de DNA con extremos sin completar
(reaccin de relleno/filling reaction)
Transcriptasa Reversa
Transcriptasa Reversa
DNA Polimerasas
cada monmero es agregado como 5" trifosfato

el enlace fosfodiester es formado por ataque nucleoflico del 3" OH
del primer extremo del fosfato de un monmero activado (trifosfato),
junto a la eliminacin de pirofosfato terminal

Se necesita de un cebador (primer) con un 3" OH libre

La elongacin de la cadena es de 5" 3"

Se requiere de un apareamiento correcto en el extremos 3"

Polimerizacin puede ser procesiva o distributiva

La polaridad de la nueva cadena sintetizada es opuesta a la del
templado; la cadena creciente y el templado son antiparalelos!!!
Generalizaciones de TODAS
las DNA Polimerasas
5 Overhang Fill-in (Blunt for
cloning) - Klenow