Resumen

La deteccin de molculas de patgenos (antgenos y material gentico) y molculas

de respuesta de los hospederos ante la infeccin (anticuerpos) es el principio bsico
de las pruebas diagnsticas moleculares. Estas pruebas han hecho innecesaria la
deteccin directa del microorganismo patgeno agresor. Los nuevos avances en
biologa molecular y el desarrollo de tecnologa robtica y secuenciacin genmica y
proteica han permitido el desarrollo de nuevas pruebas diagnsticas altamente
especficas y de gran rendimiento. La genmica y protemica contribuyen a la
identificacin de biomarcadores y la biotecnologa aporta mtodos para producir
reactivos de alta pureza. La identificacin de genes codificantes de antgenos
especficos, su clonacin y produccin recombinante y la produccin de anticuerpos
monoclonales, fragmentos de stos y anticuerpos de una sola cadena han hecho
posible el desarrollo de nuevas tcnicas inmunolgicas ms seguras y de sensibilidad
y especificidad elevadas. Nuevas molculas de reconocimiento, incluidos los
aptmeros, podrn pronto superar la necesidad de producir anticuerpos mediante
inmunizacin. Para la deteccin de material gentico se han desarrollado nuevas
medidas metodolgicas basadas en la hibridacin y amplificacin (PCR, de punto final
y en tiempo real) en formatos multiplex y en microarreglos y para su deteccin se han
diseado molculas reporteras que permiten su cuantificacin. Aunque estos mtodos
requieren instrumentacin compleja, puede ya anticiparse que pronto sern accesibles
para su aplicacin en salud pblica.




Introduccin

La eficacia de los mtodos para el diagnstico de las enfermedades infecciosas
depende de su sensibilidad y especificidad para la deteccin inequvoca de la
presencia de organismos patgenos o la respuesta especfica del hospedero infectado
ante su presencia. Las nuevas tecnologas basadas en la biologa molecular ha
permitido la identificacin de componentes (biomarcadores) exclusivos de los agentes
infecciosos (bacterias, protozoarios, virus), molculas que participan en la interaccin
de los patgenos con sus hospederos (de reconocimiento e interaccin con sus
clulas y organismos blanco, productos metablicos y toxinas) y molculas que
producen los hospederos en respuesta a la agresin. stas pueden utilizarse para la
deteccin e identificacin, a nivel de grupo y especie, de los agentes agresores y son
la base para el diseo de pruebas diagnsticas moleculares. Para este efecto, los
nuevos desarrollos en biotecnologa han posibilitado la ingeniera molecular de
reactivos para pruebas que dependen de la interaccin de molculas de
reconocimiento, la produccin a gran escala de reactivos altamente purificados, el
desarrollo de pruebas ms sensibles con alta especificidad y la automatizacin de
protocolos diagnsticos para el procesamiento simultneo de un nmero grande de
muestras, lo cual las hace tiles en estudios de salud pblica.
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Deteccin especfica de molculas mediante pruebas inmunolgicas

Las pruebas inmunolgicas estn diseadas para detectar antgenos circulantes de los
patgenos o la presencia de anticuerpos producidos en respuesta a agentes
infecciosos. Algunas de las molculas que participan en la interaccin hospedero-
parsito pueden permanecer en el suero de los sujetos infectados por periodos
prolongados y son detectables aun en casos en los que la infeccin es asintomtica y
despus de su resolucin. La deteccin de estas molculas, si bien no siempre es til
para identificar infecciones activas, lo es para determinar su frecuencia y el grado de
dispersin de los agentes infecciosos en la poblacin humana.

La deteccin de antgenos circulantes en una persona es prueba fehaciente de una
infeccin activa o muy reciente; la presencia de anticuerpos especficos es evidencia
de que el agente microbiano se encuentra o estuvo presente en ese individuo, por lo
que su reconocimiento puede servir como prueba diagnstica de una infeccin aguda
o reciente (IgM), o bien de una infeccin pasada o crnica (IgG).

En la prctica, las mayores limitaciones para el diseo y desarrollo de nuevos sistemas
de diagnstico por mtodos inmunolgicos son la produccin de antgenos y
anticuerpos especficos para las molculas de inters.

La produccin de protenas y secuencias nucleotdicas por medio de tcnicas de
biologa molecular hace posible la obtencin de reactivos de alta pureza en grandes
cantidades. De manera adicional, la estructura de las molculas producida por estas
tcnicas puede modificarse para incrementar su reactividad. La preparacin de
anticuerpos especficos requiere antgenos en cantidad y pureza suficientes. Si bien
los antgenos proteicos pueden obtenerse directamente del organismo que se desea
detectar en la prueba diagnstica, el uso de molculas producidas por metodologa
recombinante tiene varias ventajas: dado que se conoce la secuencia del gen y su
producto correspondiente, es posible introducir en estas secuencias modificaciones
que al cambiar algn grupo qumico especfico facilitan su purificacin, o la hacen ms
antignica y por tanto ms eficiente para la produccin de anticuerpos especficos.
Adems, la produccin de antgenos por medio de tecnologa recombinante permite
aumentar la cantidad y pureza del antgeno producido, adems de acelerar y disminuir
los costos de produccin.Por otra parte, los antgenos de microorganismos peligrosos
pueden producirse en organismos inocuos, con lo que se reduce el riesgo de infeccin
durante la produccin.

Entre las pruebas inmunolgicas ms utilizadas en mtodos diagnsticos figuran las
de hemaglutinacin, inmunodifusin e inmunofluorescencia indirecta (IFI); algunas de
stas constituyen las pruebas de referencia (estndar de oro) para la deteccin de
agentes patgenos. En la actualidad se utilizan los mtodos automatizados en
cmaras de multipozos tipo ELISA y las pruebas rpidas (rapid diagnostic tests, RDT),
en las cuales los antgenos a detectar se fijan a una tira de membrana que se sumerge


directamente en los reactivos de deteccin (anticuerpos) y revelado, con obtencin en
pocos minutos de un resultado. Estas pruebas permiten procesar en forma expedita un
nmero elevado de muestras, con buena sensibilidad y especificidad.

El anlisis del desarrollo de pruebas rpidas (RDT) ejemplifica los procedimientos
moleculares empleados para el diseo de nuevas tcnicas inmunolgicas, as como
las ventajas y limitaciones de este tipo de pruebas para el diagnstico de
enfermedades infecciosas, incluidas malaria, SIDA y sfilis. Las RDT son tiras
diagnsticas que tienen como principio la inmunocromatografa para identificar
antgenos o anticuerpos; un reactivo (antgeno o anticuerpo) es reconocido por otro
reactivo (anticuerpo o antgeno) contenido en un lquido que migra a travs del papel.
El objetivo de estas pruebas es contar con instrumentos diagnsticos que sean
simples, con resultados inmediatos para el diagnstico in situ (junto al paciente) y, de
esa manera, poder instituir tratamiento oportuno (por tal razn se conocen como
pruebas de punto de atencin), y al mismo tiempo tomar decisiones acerca del control
de la dispersin de los agentes patgenos.

Las tiras diagnsticas son producto de la aplicacin de la biologa molecular a varios
niveles, la identificacin de biomarcadores especficos, su clonacin y produccin por
medio de tecnologa recombinante y la produccin de anticuerpos monoclonales para
su captura y deteccin. El caso de las RDT para la deteccin de pacientes malricos
es un buen ejemplo. El diagnstico de infeccin con el parsito de la malaria
(Plasmodium spp.) se basa en la identificacin de un biomarcador como la protena
rica en histidinas 2 (PRH2), la enzima deshidrogenasa de lactato (pLDH) o una
aldolasa parasitaria. Las tiras diagnsticas contienen en su extremo distal anticuerpos
monoclonales que reconocen pLDH o aldolasa, comunes entre las especies del
parsito, pero todas contienen anticuerpos especficos contra P. falciparum, de tal
modo que pueden servir para establecer diagnsticos diferenciales o de infecciones
mixtas.

Para el diagnstico se coloca en el extremo proximal de la tira la muestra sangunea,
junto con un amortiguador de lisis celular que contiene adems un anticuerpo marcado
con un colorante. La migracin del lquido pone en contacto a los tres reactivos y la
fijacin en una banda del anticuerpo marcado. La presencia de pLDH o aldolasa en la
muestra sangunea indica infeccin activa, pero la PRH2 persiste en circulacin hasta
por 14 das despus del tratamiento, por lo que en ese caso puede tratarse de una
infeccin resuelta o persistente. La sensibilidad de la prueba es de 95%, en
comparacin con un anlisis por microscopia, con un lmite inferior de 100
parsitos/l.

Sin embargo, existen variaciones regionales de HPR2, lo que hace que en
algunas reas la prueba genrica no reconozca parasitemias por debajo de 500
parsitos/l.

Varias pruebas de la efectividad y el costo-beneficio de las RTD se han realizado en
varias partes del mundo. Por ejemplo, debido al aumento de la resistencia de los
parsitos del paludismo a los medicamentos anti-malricos, se han introducido nuevos

esquemas de tratamiento con combinaciones farmacolgicas que requieren una
evaluacin oportuna de su efectividad; para ello las RTD proporcionan ventajas en
relacin con el manejo rpido y masivo de muestras para la deteccin parasitaria.

La disponibilidad de aparatos robticos ha posibilitado la manipulacin automatizada
de cantidades muy pequeas de reactivos y la fijacin de molculas reactivas (cidos
nucleicos, protenas o azcares) en hileras, muy prximas entre s, sobre una matriz
slida plana (una membrana o un vidrio), lo que se denomina microarreglos. Para el
desarrollo de pruebas diagnsticas existen dos tipos de microarreglos de protenas: los
que contienen fijados en la matriz slida anticuerpos para la deteccin de diversos
antgenos (biomarcadores de patgenos) y los que contienen antgenos especficos de
los patgenos para la deteccin de anticuerpos en muestras sanguneas. Un ejemplo
de estos ltimos se desarroll para la deteccin simultnea de anticuerpos en sueros
humanos contra Toxoplasma gondii, el virus de la rubeola, citomegalovirus y el virus
del herpes simple tipos 1 y 2. El desempeo diagnstico de estos microarreglos se
compar con el de una prueba ELISA comercial, lo cual puso de manifiesto las
ventajas de este tipo de pruebas de alto desempeo respecto de las tcnicas
inmunolgicas tradicionales: ambas pruebas pueden utilizarse para el diagnstico de
infecciones recientes (deteccin de IgM), pero en los microarreglos, adems de la
investigacin simultnea de varios patgenos, la reproducibilidad de los resultados es
mayor, se utilizan cantidades de reactivos menores y, por ltimo, la incorporacin de
curvas de calibracin en la matriz permite que sta se procese bajo las mismas
condiciones que las muestras, de tal modo que se eliminan las variaciones debidas al
tiempo de manipulacin, temperatura, contenido de grasa, protenas, y otros factores,
en los sueros problema.
Ingeniera molecular de anticuerpos

Los anticuerpos se unen con alta especificidad y sensibilidad a protenas, azcares,
lpidos y molculas diversas; en consecuencia, usados como reactivos, pueden
identificar de forma eficaz una gran variedad de biomarcadores de agentes patgenos.
No obstante, stos presentan algunas dificultades de produccin e inconvenientes
para las aplicaciones biotecnolgicas. Por consiguiente, la produccin tradicional de
anticuerpos contra el antgeno deseado, por medio de inmunizaciones de animales, no
siempre es exitosa; asimismo, es posible que la especificidad y la sensibilidad de los
anticuerpos producidos puede ser limitada por las caractersticas genticas de la
especie animal utilizada.

Si bien la tecnologa recombinante ha revolucionado la
produccin, diseo y adecuacin para funciones especficas de protenas, la estructura
de los anticuerpos formada por dos cadenas pesadas y dos ligeras dificulta su
produccin por medio de esta tecnologa. Adems, estas molculas requieren
modificaciones postraduccionales, como glucosilacin, doblamiento y formacin de
puentes disulfuro, lo que impide su produccin en forma recombinante en organismos
procariontes. La metodologa para la preparacin de anticuerpos monoclonales
revolucion la produccin de anticuerpos, ya que hace posible obtener anticuerpos
dirigidos contra un solo epitopo, se pueden almacenar las clulas para volver a
elaborarlos cuando sea necesario y se pueden producir cantidades suficientes de

reactivos.No obstante, esta medida es todava costosa y encarece su inclusin en
pruebas diagnsticas.

Varias intervenciones moleculares se han empleado para resolver las limitaciones de
produccin y el diseo de anticuerpos con mayor afinidad por sus antgenos y
estructuras ms sencillas y estables. Las cadenas pesadas (VH) y ligeras (VL) que
conforman los anticuerpos pueden producirse de manera aislada y conservar su
capacidad de unirse de manera especfica a sus antgenos,

pero con afinidad y
solubilidad reducidas. Las molculas que contienen aparejadas las regiones
complementarias (CDR) de las cadenas VH y VL son suficientes para mantener su
unin especfica a los antgenos. Los mtodos de biologa molecular se emplean para
generar protenas semisintticas derivadas de los anticuerpos,

estructuralmente ms
sencillas, que incluyen las regiones variables funcionales, con capacidad de unin a un
antgeno y estables en diversas condiciones ambientales; entre stas figuran las
siguientes: fragmentos ab (Fab);

fragmentos variables (Fv); y regiones variables
conformadas con una sola cadena (scFv).

Estas molculas se producen como
fragmentos Fab de anticuerpos monovalentes, como cadenas nicas (SCFv) que
contienen las regiones VH y VL unidas por un polipptido puente y que mantienen su
funcionalidad, como por ejemplo su capacidad de inhibir el desarrollo de
patgenos. Las molculas formadas por un solo dominio variable (VHs) se pueden
disear por computadora para hacerlas complementarias a la estructura de su
molcula blanco. Tambin se producen fragmentos correspondientes a las regiones
variables de los anticuerpos conformados con dos cadenas peptdicas ensambladas
en una sola cadena peptdica (dsFv). Algunas de estas variantes de anticuerpos se
producen a gran escala en organismos modelo comoEscherichia coli o sistemas de
virus, procariotes y eucariotes.

La produccin de fragmentos de protenas en
bacterifagos filamentosos de tipo f (fagos f1, fd y M13) tambin se ha empleado para
la elaboracin de scFvs, para cuyo fin se clona el fragmento de inters para producirla
fusionada con una protena de cpside expuesta en la superficie del virin (phage
display) .

Los fagos son muy convenientes para expresar dominios de anticuerpos, ya
que son estables en forma cristalizada o liofilizada y ello facilita su almacenaje y
transporte y se pueden producir en gran cantidad y a bajo costo. Ejemplos de la
aplicacin de esta tecnologa son la produccin de fagos capaces de identificar
antgenos de bacterias del gnero Bacillus spp., incluido B. anthracis, los cuales tienen
alto potencial para diagnstico ya que son especficos y sensibles y se pueden
manipular en diversas plataformas de ensayos diagnsticos y se experimenta con
fagos tiles para la neutralizacin de ataques terroristas, ya que se ha demostrado que
la inmunizacin pasiva tiene efectos significativos en el tratamiento.







Una alternativa para la produccin de nuevos reactivos de reconocimiento es la
ingeniera de molculas (protenas y otras molculas) diferentes de las Igs, con
capacidad de unirse de manera especfica a un antgeno. Una ventaja adicional de
estos moldes es que pueden generarse molculas que no tengan reacciones
inmunitarias cruzadas y que para el revelado de sus pruebas no dependan, a su vez,
de segundos anticuerpos que puedan presentar reconocimiento cruzado. Entre estas
molculas se encuentran las protenas ricas en leucina, lipocalinas y tendamistat.

Por otra parte, por medio de la sntesis qumica de oligonucletidos, se generan
molculas de ARN y ADN (genes sintticos), con propiedades de reconocimiento
altamente especfico de molculas que en algunos casos es superior al de los
anticuerpos. Los aptmeros son muy estables ante condiciones ambientales, pueden
producirse contra molculas poco inmunognicas y su afinidad y especificidad de
unin a los antgenos pueden mejorarse clonando los aptmeros como genes
sintticos y la introduccin dirigida de variaciones en su secuencia evolucin dirigida.
Por otra parte, durante la sntesis de los aptmeros se pueden introducir tomos que
funcionan como etiquetas para su deteccin como los quantum dots (Q-dots) y al
aplicarse se puede inducir su unin covalente al sitio blanco, lo que permite que el
complejo aptmero-molcula blanco pueda lavarse en condiciones extremas, antes de
su lectura, para mejorar la especificidad y estabilidad de las pruebas diagnsticas. Los
aptmeros son eficientes en pruebas y formatos bien establecidos y pueden competir
con los anticuerpos en diagnstico e investigacin.

Biologa molecular de cidos nucleicos y mtodos diagnsticos

Si bien los organismos comparten de manera variable en su genoma genes comunes
(ortlogos), estos genes y otros no compartidos presentan secuencias especficas de
gnero, especie y cepa que hacen posible su identificacin inequvoca. Una vez
identificadas las secuencias exclusivas de patgeno, stas pueden utilizarse para el
desarrollo de reactivos para pruebas diagnsticas. En la prctica se desarrollan de
forma constante nuevos equipos para la manipulacin, secuenciacin y deteccin de
cidos nucleicos, lo que permite que est en desarrollo una gran cantidad de
proyectos de secuenciacin de genomas de microorganismos; de igual modo, muchas
de las bases de datos generadas, completas o en proceso, y las herramientas
informticas para su anlisis estn disponibles libremente en internet. Tambin estn
disponibles bases de datos con informacin sistematizada sobre microorganismos con
potencialidad patognica, segn sean la agresividad, potencialidad de dispersin,
datos epidemiolgicos y tcnicos para el diagnstico de enfermedades infecciosas.







Deteccin de cidos nucleicos

La deteccin del material gentico de un microorganismo en muestras biolgicas
indica la presencia del patgeno en los sujetos de estudio en el momento de obtener la
muestra. Esta deteccin permite la identificacin de infecciones de manera directa sin
la necesidad del cultivo del agente patgeno causal y la deteccin de ARN mensajeros
indica que el organismo en cuestin est metablicamente activo. Las pruebas
diagnsticas basadas en cidos nucleicos se basan en la deteccin directa de su
presencia por medio de sondas especficas (hibridacin), pero tambin es posible
incrementar su sensibilidad por medio de la amplificacin de secuencias especficas
diagnsticas (reaccin en cadena de la polimerasa) del material gentico presente en
las muestras.

La hibridacin se basa en la capacidad de dos cadenas sencillas de cido nucleico,
ADN o ARN, complementarias en su secuencia de bases, de formar enlaces
especficos y crear una doble hlice en cualquier combinacin: ADN-ADN, ADN-ARN y
ARN-ARN. Durante la hibridacin una molcula de secuencia conocida (la sonda
diagnstica) busca e identifica a su complementaria en una mezcla de molculas de
cido nucleico, aunque sta sea muy compleja. La hibridacin se puede efectuar en
diversos formatos, en solucin o con la cadena blanco unida a un soporte slido o
incluso in situ, esto es, en un corte de tejido o un microorganismo completo fijado. La
sonda diagnstica puede producirse por sntesis qumica o tcnicas recombinantes y
durante su produccin se le incorporan etiquetas para su deteccin (enzimas para
deteccin colorimtrica, fluorescencia). El nmero de molculas blanco presentes en la
muestra determina el nmero de molculas de la sonda que se fijan al formato, lo cual
determina la intensidad de la seal. La especificidad de la seal obtenida depende del
grado de complementariedad entre las dos cadenas de ADN (la sonda y el gen
investigado) y su sensibilidad (que se limita al nmero de copias del gen investigado
en el material biolgico).

En formato individual, la hibridacin es til para detectar o confirmar los resultados de
otras pruebas.

Nuevos desarrollos que usan el principio de hibridacin son los microarreglos.

En este
formato, las sondas de ADN se imprimen o sintetizan (con formacin de celdas) por
medios automticos directamente sobre soportes slidos de vidrio o polipropileno y
estas secuencias, fijadas en el soporte slido, se incuban con muestras que contienen
el material gentico en estudio, previamente marcado, de tal modo que al hibridarse se
presenta una seal en la celda reconocida.

En el momento presente, los altos costos de los mtodos basados en microarreglos
impiden su empleo en estudios poblacionales; no obstante, esta tcnica se ha utilizado
para estudios epidemiolgicos que incluyen nmeros pequeos de muestras, como la
genotipificacin de cepas de virus de la inmunodeficiencia humana resistentes a
tratamiento, y para determinar el origen de infecciones sintomticas y asintomticas
con poliovirus en una poblacin previamente vacunada.






PCR

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es un procedimiento muy sensible
que utiliza una polimerasa de ADN; este procedimiento permite amplificar y
detectar de manera especfica, a partir de una sola molcula blanco, secuencias
particulares de ADN. La reaccin depende de oligonucletidos cortos (cebadores o
sondas) que tienen la secuencia adecuada (complementaria) para hibridar en los
extremos de cadenas sencillas del ADN blanco, las cuales se obtienen mediante la
desnaturalizacin del ADN original. Una vez unida, la sonda sirve como ancla para
que la polimerasa inicie la produccin de la cadena complementaria a la secuencia
blanco, de tal manera que se forman molculas de ADN de doble cadena. La
desnaturalizacin de este ADN, la hibridacin con la sonda y la sntesis de la cadena
complementaria con ciclos repetidos permiten la obtencin de grandes cantidades
de ADN especfico del microorganismo investigado, lo cual facilita su deteccin. El
reconocimiento del material producido se obtiene mediante electroforesis en geles
de agarosa y la identificacin de bandas del tamao molecular esperado por medio
de tincin con bromuro de etidio. La sensibilidad y especificidad de la PCR han
permitido el desarrollo de mtodos diagnsticos para una gran variedad de agentes
infecciosos: bacterias, protozoarios, virus y helmintos. La prueba de PCR descrita se
conoce como de punto final, ya que la reaccin se detiene hasta que todos los
reactivos necesarios para la amplificacin se han utilizado. A partir del mtodo
bsico de PCR se han desarrollado variantes para detectar ADN o ARN, con objeto
de hacerlo cuantitativo (vase ms adelante) y aplicar sistemas diagnsticos
automatizados que realizan el procesamiento de las muestras desde la purificacin
del material gentico hasta su anlisis.

Existen numerosas pruebas diagnsticas que usan la PCR con el formato de punto
final; en stas, la reaccin se realiza en un nmero predeterminado de ciclos y los
productos se analizan por electroforesis. Por ejemplo, las especies
de Corynebacterium: C. diphteriae, C. ulcerans y C. pseudotuberculosis, son
patgenas slo cuando producen la toxina diftrica, para lo cual necesitan copias
completas del gen tox. Mediante pruebas de PCR se puede reconocer la presencia
del gen aun en muestras de pacientes que han recibido antibiticos, en quienes ya
no es posible cultivar la bacteria. Sin embargo, en algunas cepas que poseen el gen
tox, debido a mutaciones en la regin de control del gen, ste no es activo, por lo
que los pacientes positivos por PCR an se los considera como casos presuntivos.

La PCR de punto final tambin se usa para el diagnstico y clasificacin de los
parsitos del gnero Leishmania spp., los cuales poseen una mitocondria
modificada llamada cinetoplasto en la que existen dos tipos de molculas de ADN,
los maxicrculos y los minicrculos. En la secuencia de los minicrculos, se presentan
regiones conservadas y variables, entre las cuales se encuentran algunas
especficas de especie/aislado (oxidasa de citocromo y regiones espaciadoras
intergnicas), a partir de las cuales se pueden disear pares de oligonucletidos
iniciadores que al amplificar permiten distinguir entre gneros, especies y
poblaciones de parsitos. Este mtodo se puede aplicar a diferentes tipos de
muestras, como sangre o aspirados de ndulos linfticos, y en la actualidad se ha
probado para la evaluacin de la efectividad de nuevos frmacos, la identificacin
de portadores asintomticos y de animales que sirven como reservorios en la
naturaleza.

En la PCR multiplex se incorporan a la reaccin de amplificacin ms de un par de
sondas especficas para diferentes secuencias blanco. Los fragmentos generados
pueden reconocerse por su tamao o por medio de marcadores incluidos en las
sondas. Entre las aplicaciones de este sistema figuran el anlisis de muestras en las


que hay varias molculas blanco del mismo organismo, la confirmacin de que ste
se halla presente, o bien la investigacin de forma simultnea de varios patgenos,
para lo cual se incluyen sondas especficas para cada microorganismo. La dificultad
principal de la PCR multiplex es el diseo adecuado de los oligos con el fin de evitar
interacciones inespecficas entre ellos y reconocimientos cruzados y lograr que los
amplicones resultantes se puedan diferenciar unos de otros. Para el diseo de estos
cebadores se han desarrollado programas computacionales
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que incluyen como
elementos de seleccin secuencias especficas de los patgenos en estudio y
composicin de stos para que los procesos de amplificacin requieran las mismas
condiciones (temperatura de fusin). De esta manera se genera un sistema de
tubo nico, en el cual se coloca la muestra en un tubo que se cierra con los
reactivos de purificacin y amplificacin y ya no se abre sino hasta obtener el
resultado, lo cual reduce el riesgo de manipular muestras peligrosas.

Para la identificacin de los productos amplificados se han propuesto varias
alternativas, adems del uso de la electroforesis en agarosa. En un sistema para la
deteccin de productos de PCR en una reaccin multiplex, los oligos iniciadores se
acoplaron a microesferas, de tal modo que los productos quedaron acoplados a
stas y eran distinguibles en un citmetro de flujo, lo que permita la
automatizacin de la lectura y la distincin de hasta de 80 blancos diferentes en
una reaccin. De la misma forma, los oligos pueden acoplarse a molculas de
tamao diverso disponibles en el comercio (Qiagen Masscode Technology, Qiagen,
Hilden, Alemania), con capacidad de distinguir hasta 64 diferentes tamaos y por
tanto el mismo nmero de secuencias especficas. Otra manera de identificar
productos diferentes en una PCR multiplex consiste en utilizar oligos marcados con
faros moleculares (beacons, vase ms adelante), los cuales emiten seales
fluorescentes a distintas longitudes de onda.Las pruebas basadas en la PCR
multiplex son tiles para reconocer infecciones por patgenos que comparten
cuadros sintomticos comunes; con este propsito se dise una prueba para
investigar la causa de las fiebres virales hemorrgicas, que incluye sondas para
identificar 10 diferentes virus.

Para mejorar la sensibilidad en los ensayos multiplex se aplica tambin el principio
de las reacciones anidadas, en las cuales la reaccin se realiza primero con un
juego de iniciadores externos, que en los primeros ciclos genera un fragmento
grande. En una segunda etapa, el producto de la primera ronda de amplificacin
se convierte en el molde con un segundo juego de iniciadores que se hallan dentro
del producto primario (anidados), lo cual asegura la especificidad del amplificado
de la primera ronda.

PCR en tiempo real.
Los puntos finales de las reacciones de PCR varan entre las muestras debido a la
cantidad de ADN blanco presente en stas. Adems, el punto final es difcil de
precisar ya que la amplificacin, despus de una fase exponencial, alcanza una
meseta en la que los reactivos comienzan a agotarse. Estas condiciones son
determinantes de las limitaciones de este mtodo, entre ellas bajas precisin y
sensibilidad, adems de que no puede ser cuantitativa. En los mtodos de PCR en
tiempo real, las molculas del fragmento blanco que se amplifican se detectan al
mismo tiempo que se generan (durante la fase exponencial de la amplificacin),
con base en varias estrategias que dependen de molculas fluorescentes
(fluorforos) cuya emisin es proporcional al nmero de molculas producidas, lo
que permite hacer la prueba de forma cuantitativa.Un fluorforo es una molcula
que absorbe radiacin de una longitud de onda determinada (luz UV o lser) y
luego emite la energa absorbida en forma de luz de una longitud de onda
determinada, pero diferente a la empleada para su excitacin; esto hace posible su

identificacin. La utilizacin de fluorforos tambin permite realizar reacciones de
amplificacin multiplex y detectar cada molcula blanco con un fluorocromo
diferente.

El mtodo ms sencillo de deteccin de los productos de PCR en tiempo real es la
aplicacin de un fluorforo marcador, como el SYBRgreen, el cual emite
fluorescencia cuando se intercala en el surco mayor de la doble hlice del ADN. Otra
forma de reconocer productos de PCR en tiempo real consiste en usar
los beacons (faros moleculares). En este sistema se generan sondas que poseen
un fluorforo principal en el extremo 5 y otro fluorforo de menor intensidad en
el extremo 3 con diferente espectro de emisin (beacons). Cuando estas sondas
se encuentran como molculas nicas se pliegan sobre s mismas y la proximidad
de los fluorforos genera el efecto FRET (fluorescence resonance energy transfer),
en el cual el fluorforo secundario apaga la emisin del primario. Al ocurrir la
reaccin de PCR, el beacon forma parte de las molculas amplificadas, con lo que el
fluorforo principal se separa del secundario y recupera su fluorescencia, de tal
manera que la poblacin de hbridos se puede medir porque su nmero es
directamente proporcional a la magnitud de la fluorescencia. Los beacons pueden
prepararse con diferentes fluorforos, como SYBRgreen, fluorescena (FAM),
Texas red, Rhodamina 6G, Cy3, Cy5, entre otros, y DABCYL como apagador, lo que
posibilita realizar combinaciones para la deteccin multiplex.

En un ejemplo de aplicacin se investig en muestras sanguneas humanas la
presencia de los genes gag de HIV-1, env HIV-2, tax del virus T-linfotrpico tipo 1
y pol del tipo 2, mediante los juegos debeacons correspondientes, marcados con
diferentes fluorforos; esto permiti determinar la carga viral en las muestras;

el
mtodo es rpido, sensible, especfico y seguro para el operador.


En la PCR llamada TaqMan adems del efecto FRET se utilizan las actividades de
la polimerasa Taq, que acta como polimerasa en direccin 5>3 y como
exonucleasa en direccin 3>5. A diferencia de la reaccin de la PCR estndar, en
el TaqMan se lleva a cabo una hibridacin con una sonda complementaria de una
regin interna de la secuencia blanco, antes de la amplificacin. La sonda interna
tiene una temperatura de fusin 10C superior a la de los iniciadores en los
extremos y posee en su extremo 5 un fluorforo verde (6-carboxifluorescena,
FAM), cuyo espectro de emisin est apagado (quenched) por la proximidad
espacial de un segundo colorante fluorescente . En una reaccin de PCR, el primer
paso de cada ciclo es un aumento de la temperatura para la desnaturalizacin de
las cadenas de ADN, seguido de un descenso de la temperatura para la
renaturalizacin, durante la cual se unen los iniciadores a los lados de la secuencia
blanco. En la reaccin TaqMan, durante la renaturalizacin la sonda TaqMan, en
virtud de su afinidad mayor, se une a su sitio blanco antes de que lo hagan los
iniciadores de amplificacin. Para la fase de sntesis los iniciadores se unen,
empieza la conformacin de molculas de ADN y durante el avance de la
polimerasa Taq, sta choca con la sonda y por su actividad de exonucleasa la
degrada (se come la sonda, de tal modo que el fluorforo de la sonda se libera y
la seal se activa, lo que posibilita su medicin. Se han publicado varios ensayos
diagnsticos con base en este mtodo, como el descrito para reconocer Chalmydia
trachomatis y tuberculosis.

En este tipo de prueba tambin se pueden hacer
combinaciones de juegos de iniciadores y sondas con fluorforos que emitan a
distintas longitudes de onda para identificar varios blancos en reacciones
multiplex. El sistema Scorpions es similar al anterior en tanto que incluye el juego
de fluorforos, principal y apagador, y el uso de un iniciador para la reaccin de
PCR, pero con la incorporacin covalente de una secuencia adicional formada por
un bloqueador en la regin 5; empero, a diferencia del anterior, no hay
degradacin de molculas. En este formato se han diseado mtodos diagnsticos,
como los descritos para Helicobacter pylori

y Micoplasma.


Espectrometra de masas y diagnstico

En la actualidad, los mtodos de espectrometra de masas (MS) disponibles permiten
identificar molculas orgnicas e inorgnicas de forma rpida, confiable y con alto
rendimiento. La identificacin de protenas por MS es paralela a la acumulacin de
secuencias de cidos nucleicos (genmica) y su control por bioinformtica para
conocer las protenas codificadas por ellas y con estas protenas virtuales hacer
experimentos in silico, consistentes en la prediccin de los iones que se generan
durante la fragmentacin en los diferentes sistemas de anlisis. En una sola ronda de
fragmentacin/separacin de iones se obtienen huellas digitales (grfica de valores
de masa/carga de los iones, m/z), que permiten identificar a la molcula exacta por
comparacin con las huellas digitales generadas tericamente a partir de las bases de
datos genmicas. Con estos estudios es posible identificar biomarcadores de
patgenos especficos. La MS tambin puede usarse para identificar secuencias de
ADN, que permite emplearla para el anlisis automatizado y rpido de productos de
PCR.

Esta aplicacin es til en ensayos de PCR multiplex, como en el sistema
denominado Masstag-PCR, en el cual los oligos para realizar la PCR se marcan con
grupos qumicos de masa conocida (MassTag) y la cantidad de los productos
generados durante la amplificacin se mide mediante un sistema de espectrometra de
masas en fase lquida por la cantidad de las etiquetas incorporadas. Esta tcnica se
ha aprobado para el diagnstico diferencial e identificar hasta 22 agentes patgenos
de muestras clnicas causantes de enfermedades respiratorias y virales hemorrgicas,
con sensibilidad y especificidad elevadas.

Espectrometra de masas y diagnstico

En la actualidad, los mtodos de espectrometra de masas (MS) disponibles permiten
identificar molculas orgnicas e inorgnicas de forma rpida, confiable y con alto
rendimiento. La identificacin de protenas por MS es paralela a la acumulacin de
secuencias de cidos nucleicos (genmica) y su control por bioinformtica para
conocer las protenas codificadas por ellas y con estas protenas virtuales hacer
experimentos in silico, consistentes en la prediccin de los iones que se generan
durante la fragmentacin en los diferentes sistemas de anlisis. En una sola ronda de
fragmentacin/separacin de iones se obtienen huellas digitales (grfica de valores
de masa/carga de los iones, m/z), que permiten identificar a la molcula exacta por
comparacin con las huellas digitales generadas tericamente a partir de las bases de
datos genmicas. Con estos estudios es posible identificar biomarcadores de
patgenos especficos. La MS tambin puede usarse para identificar secuencias de
ADN, lo que permite emplearla para el anlisis automatizado y rpido de productos de
PCR.

Esta aplicacin es til en ensayos de PCR multiplex, como en el sistema
denominado Masstag-PCR, en el cual los oligos para realizar la PCR se marcan con
grupos qumicos de masa conocida (MassTag) y la cantidad de los productos
generados durante la amplificacin se mide mediante un sistema de espectrometra de
masas en fase lquida por la cantidad de las etiquetas incorporadas.
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Esta tcnica se
ha aprobado para el diagnstico diferencial e identificar hasta 22 agentes patgenos
de muestras clnicas causantes de enfermedades respiratorias y virales hemorrgicas,
con sensibilidad y especificidad elevadas.

VACUNAS FABRICADAS POR BIOTECNOLOGA PARA PREVENIR
ENFERMEDADES

Algunas de las vacunas actuales se producen mediante tcnicas de ingeniera
gentica. Son ms eficaces y seguras. Incluso se estudian vacunas comestibles.


Desde la dcada de 1980 se desarrollan vacunas mediante tcnicas de ingeniera
gentica. La vacuna contra la hepatitis B fue el primer exponente de esta nueva
generacin de inoculantes. La investigacin biotecnolgica aplicada a la inmunizacin
propone mejorar las vacunas tradicionales, aumentar la eficacia preventiva y encontrar
nuevas vas de administracin. Incluso, se ensayan vacunas comestibles.

Las vacunas y la prevencin de enfermedades

Las vacunas, junto a la potabilizacin del agua y el uso del jabn, son fundamentales
para la prevencin y el control de las enfermedades infecciosas. Histricamente, las
vacunas lograron detener el avance de la fiebre amarilla, la peste negra, la difteria, el
tifus y la viruela, entre otras enfermedades que diezmaron poblaciones.

El descubrimiento de la vacunacin, en el siglo XVII, estuvo ligado al ganado vacuno
(de all la "vacuna") de donde se extrajo el primer inoculante que prob ser efectivo
contra la viruela. Actualmente los laboratorios utilizan componentes microscpicos, de
virus y bacterias, para la produccin de las vacunas.

El modo de accin de las vacunas consiste en inocular el agente causante de la
enfermedad que se quiere combatir. Pero, previamente se lo modifica en el laboratorio
de modo que quede inactivo. Al vacunar a una persona con el agente inactivo se evita
la enfermedad, pero se estimula la reaccin inmune que deja al cuerpo en alerta para
evitar el desarrollo de la enfermedad ante futuras infecciones.


Produccin de vacunas y seguridad

Si bien las vacunas que contienen el agente extrao resultan eficaces, presentan
dificultades en el proceso de produccin. Se requieren medidas muy estrictas para
asegurar la completa inactivacin del agente infeccioso y, adems, implica el manejo
en el laboratorio de microorganismos patgenos.

Esto cambi cuando se comprendi que no es necesaria la presencia de los
microorganismos enteros para la inmunizacin. Alcanza con introducir en la vacuna
solo los componentes especficos que despiertan las defensas del cuerpo.

Desde entonces, se comenzaron a fabricar las vacunas de subunidades que incluyen
una fraccin del microorganismo, en lugar del agente infeccioso completo. Las
primeras vacunas de este tipo fueron contra el ttanos y la difteria.


Nuevas vacunas obtenidas por biotecnologa

Si bien el diseo de las vacunas de subunidades represent un gran avance al evitar
inocular microorganismos enteros, no solucionaba el inconveniente de cultivar
microorganismos potencialmente peligrosos en el laboratorio.

Fue en la dcada de 1980, con el avance de la ingeniera gentica y el conocimiento
del ADN de virus y bacterias, que se empezaron a desarrollar las vacunas
recombinantes. Surga la nueva generacin de vacunas biotecnolgicas, y la vacuna
contra la hepatitis B fue la primera en desarrollarse. La hepatitis B es una infeccin
potencialmente mortal causada por el virus de la hepatitis B (VHB).

Segn la Organizacin Mundial de la Salud se calcula que en el mundo hay 2000
millones de personas infectadas por el VHB y ms de 350 millones con infeccin
heptica crnica, informa la OMS. Adems, indica que la vacuna contra la hepatitis B
tiene una eficacia del 95% en la prevencin de la enfermedad y sus consecuencias.

Originalmente, la vacuna contra la hepatitis B se fabricaba extrayendo de la sangre de
los enfermos la subunidad del virus responsable de la infeccin. La vacuna era eficaz,
pero no poda producirse en grandes cantidades debido a la escasez de donantes. La
solucin lleg con las vacunas recombinantes, o biotecnolgicas.

La tcnica de produccin de la vacuna recombinante consiste en extraer del virus de la
hepatitis B el gen que tiene la informacin para fabricar las partculas infecciosas. Ese
fragmento de ADN viral se introduce dentro de levaduras. Al multiplicarse en el
laboratorio, las levaduras modificadas genticamente fabrican enormes cantidades de
partculas virales de la hepatitis B, capaces de satisfacer la demanda mundial de
vacunas.


Investigaciones cientficas y nuevas vacunas

En la actualidad se estn estudiando vacunas contra diferentes enfermedades, como
la malaria, el herpes, el sida, el clera y el dengue, entre otras, y se estn mejorando
vacunas tradicionales. Existen, adems, otros desarrollos novedosos. Por ejemplo, el
doctor Rudolf Valenta de la Universidad de Medicina de Viena, est usando las
tcnicas de ingeniera gentica para crear una vacuna contra la alergia al polen, con
resultados exitosos.

"Estos resultados podran ser el puntapi inicial para el desarrollo de vacunas ms
efectivas para el tratamiento de las formas ms comunes de alergia, e inclusive para la
vacunacin profilctica, seal el investigador. Otra lnea de investigacin se orienta a
encontrar nuevas vas de administracin de vacunas. Una opcin que est en
desarrollo son las vacunas comestibles.


Vacunas comestibles, nuevas tendencia

La idea de las vacunas comestibles es desarrollar alimentos transgnicos que posean
en su composicin la sustancia que desencadena las defensas del cuerpo. Es decir
que, al ingerir el alimento en la dosis indicada, se estara incorporando la vacuna y
previniendo la enfermedad.

Una ventaja de estas vacunas es que podran administrarse en forma oral, lo que
evitara los molestos pinchazos. Adems, podran fabricarse localmente, utilizando los
cultivos regionales. Esto permitira el acceso masivo a la vacunacin, incluso en zonas
alejadas de centros sanitarios. La posibilidad de acceder a la vacunacin es
fundamental si se consideran los datos que aporta un estudio publicado en 2009 por la
OMS, Vacunas e inmunizacin: situacin mundial.

Segn este informe, si no se generaliza el uso de las vacunas en un promedio de ms
del 90% de la poblacin mundial, hacia el ao 2015 se sumaran por ao ms de dos
millones de muertes de nios y nias menores de cinco aos. A pesar de todo ello, el
panorama general es de prudente optimismo, entusiasmo, energa y dedicacin,
indica el estudio.

La obtencin de vacunas se encuentra en una fase dinmica y las vacunas llegan a
un nmero cada vez mayor de personas.
Hay muchos motivos para creer que la inmunizacin seguir siendo durante mucho
tiempo uno de los pilares fundamentales de la salud pblica.












RESUMEN
La Terapia Gnica es una metodologa que aborda la insercin de material gentico en
un individuo para tratar una enfermedad ya sea de forma directa (in vivo) o
indirectamente, a travs del uso de clulas como vehculo de liberacin (ex vivo). La
aplicacin de este procedimiento conlleva la aparicin de riesgos, por lo cual ha
despertado un gran dilema tico. Hasta el momento, en humanos, solo se ha
practicado la terapia somtica y a pesar de que se ha avanzado considerablemente en
las investigaciones y ensayos, an existen problemas que limitan su uso. Tal es el
caso del empleo de vectores virales que pueden causar inflamacin y toxicidad en el
tejido hospedero. La posibilidad de aplicacin de la Terapia Gnica depende de
mltiples factores como son: tipo y patrn de herencia, tipo de mutacin, tamao del
gen, control gnico y tejido donde se manifieste la enfermedad. A pesar de las
dificultades que an se presentan, existe un consenso a favor de la aplicacin de este
procedimiento, siempre y cuando los beneficios sean mayores que los riesgos. La
terapia germinal ha sido rechazada por muchos cientficos porque sus ventajas no
compensan los peligros asociados a la misma, adems de que existen alternativas
teraputicas con el mismo potencial y que no comparten los mismos riesgos. Hasta el
momento, se han realizado varios protocolos clnicos de Terapia Gnica y los
resultados han sido prometedores lo que posibilita la continuacin de su aplicacin en
un futuro inmediato.








INTRODUCCION
A raz del conocimiento de que las funciones biolgicas estn determinadas por la
informacin que portan los genes, es que surge en la dcada de los 80, la Terapia
Gentica. El desarrollo de este campo estuvo respaldado por la posibilidad de aislar
los genes, modificarlos e insertarlos en un organismo defectuoso posibilitando que el
mismo pudiera ejercer una funcin de la que careca con anterioridad. De manera, que
este trmino responde al hecho de que las consecuencias del mal funcionamiento de
un gen (la aparicin de una enfermedad) puede eliminarse permanentemente si se
sustituye el gen daado.
Hasta hace algunos aos, la aplicacin de estos procedimientos teraputicos
constituan un sueo, pues no exista el conocimiento bsico de cmo actuaban los
genes. Por el contrario, en la actualidad, existen mltiples estudios que han aportado
evidencias experimentales a favor de la aplicacin de la Terapia Gnica.1 Esta ciencia,
aun en sus primeros pasos, apunta hacia una estrategia alternativa que permitir en
un futuro aportar soluciones a una amplia gama de enfermedades. El uso de la
Terapia Gnica puede traer consecuencias beneficiosas, pero tambin graves para las
personas tratadas y para las futuras generaciones. El uso de este procedimiento tiene
implicaciones sociales y ticas que han generado gran preocupacin al personal
mdico e investigadores especialistas en el tema. Para entender los principios propios
que rigen la deliberacin tica referida a la Terapia Gentica es imprescindible el
conocimiento de los aspectos tcnicos generales del procedimiento.






TERAPIA GNICA. DEFINICIN Y MTODOS DE APLICACIN

No existe an un consenso en relacin con la definicin exacta de la Terapia Gnica;
segn Lacadena se puede definir de dos formas: La primera definicin considera que
este procedimiento se basa en la administracin deliberada de material gentico en un
paciente con la intencin de corregir un defecto gentico especfico; mientras que la
segunda, considera que la Terapia Gnica es una tcnica teraputica mediante la cual
se inserta un gen funcional en las clulas de un paciente humano para corregir un
defecto gentico o para dotar a las clulas de una nueva funcin.

La primera definicin solo enmarca los protocolos encaminados a corregir los defectos
genticos de algunas enfermedades monognicas recesivas; sin embargo, no incluye
una serie de procedimientos que se sale de esta lnea y que hoy en da se estn
realizando; la segunda definicin tiene como desventaja que enmarca la realizacin de
tratamientos que no son propiamente teraputicos, pero que se presentan
enmascarados como tal. El traspaso de los lmites del concepto de Terapia Gnica
puede tener una gran trascendencia social. De ah que algunos autores opinen que la
utilizacin amplia del concepto puede ser considerada una forma de hacer ms
aceptables procedimientos de ingeniera gentica humana que de otro modo podran
contar con una mayor oposicin social.
En este sentido, Soutullo considera que resulta ms apropiado definir la Terapia
Gnica como la modificacin gentica de clulas de un paciente para tratar alguna
enfermedad. Est claro que este concepto no elimina de forma radical los problemas
antes sealados, pero deja explcito los usos de la Terapia Gnica con fines
teraputicos y deja fuera utilidades preventivas o eugensicas no propiamente
curativas.
El mayor problema de la Terapia Gnica tiene como base la existencia de dos tipos de
intervenciones sobre la base de las clulas que sean blancos del procedimiento: la
Terapia Gnica germinal y la Terapia Gnica somtica. La de tipo germinal tiene como
objetivo eliminar radicalmente las enfermedades que son producidas por defectos en
algn gen mediante la sustitucin del gen daado en el individuo y en su
descendencia.
Este resultado se alcanza realizando la modificacin gentica de las clulas
embrionarias implicadas en la formacin de vulos y espermatozoides. Este
procedimiento no ha sido aplicado en humanos; pero, sin dudas, la posibilidad de su
aplicacin constituye un problema de carcter cientfico y tico, pues existen
limitaciones en relacin con la tecnologa para la manipulacin de este tipo de clulas,
adems esta modificacin pasara a todas las clulas de la descendencia. Por su
parte,en la terapia somtica se modifican las caractersticas genticas de las clulas
que no son germinales; es decir, las que pertenecen a un tejido adulto por lo que las
consecuencias genticas de este procedimiento no son transmitidos a la
descendencia.En la actualidad, los protocolos clnicos de Terapia Gnica que se han
llevado a cabo han sido de terapia somtica, la terapia germinal no est autorizada en
ningn pas.
Aunque, en teora, la terapia gnica podra aplicarse tambin a las clulas germinales,
las evidencias apuntan hacia la aplicacin de la Terapia Gnica somtica durante
algunos aos. Sin embargo, no cabe duda de que con el progreso de la terapia
somtica se obtendr un dominio ms amplio de la misma y esto puede contribuir al
desarrollo de la terapia germinal.
Para llevar a cabo la Terapia Gnica somtica es necesario introducir los productos
gnicos en el tejido diana y existen dos formas de alcanzar este objetivo: 1) la Terapia
Gnica ex vivo, mediante la cual se usan clulas modificadas genticamente in vitro
con el sistema de expresin deseado, que portan la informacin gentica deseada y
luego se implantan en el organismo receptor y 2) la Terapia Gnica in vivo, que se
lleva a cabo por el tratamiento directo de las clulas hospederas in situ con vectores,



ya sean virales o no virales, que expresan el o los genes de inters teraputico.
Ambos tipos de terapia, in vivo y ex vivo, usan vectores, virales o no virales, que
expresan el gen o los genes de inters teraputico. Los vectores no virales incluyen
liposomas, ADN desnudo y complejos ADN-protenas, mientras los vectores virales
derivan de virus que se atenan con el objetivo de prevenir la infeccin destructiva en
los tejidos diana. Los vectores no virales, aunque se prefieren desde el punto de vista
de la bioseguridad, son menos eficientes que los virales. De ah que la principal
desventaja de la terapia in vivo est dada por el uso, en la mayora de los casos, de
los vectores virales. El uso de estos sistemas de expresin conlleva a la modificacin
funcional de las clulas infectadas y la evaluacin de estas modificaciones son
extremadamente complejas e incompletas cuando las clulas modificadas son las del
organismo hospedero.
La principal inconveniencia que se deriva del uso de vectores virales incluye la
seguridad de su utilizacin, pues se conoce que estos vectores pueden causar
inflamacin y toxicidad en el tejido hospedero.
Muchos son los vectores virales que han sido objeto de estudio en el campo de la
Terapia Gnica, dentro de ellos los ms ampliamente usados para lograr la liberacin
del transgn de inters han sido los adenovirales, los adenoasociados, los herpes
virus, los retrovirus y los lentivirus. Cada uno de ellos tiene sus ventajas y
desventajas, y aunque no existe an un consenso en relacin con cul es el idneo
para su uso en la Terapia Gnica, muchos autores concuerdan en que los vectores
adenoasociados y lentivirales son los ms convenientes.
Una de las caractersticas importantes que se deben de considerar al escoger el tipo
de vector viral es la posibilidad de integrarse al genoma hospedero y, en este caso, la
seleccin depende de los objetivos que se quieran alcanzar con este procedimiento.



Por ejemplo, cuando se utilizan clulas como vehculo de liberacin de genes que
tienen la potencialidad de dividirse, tanto in vitro como in vivo, resulta beneficioso el
uso de vectores virales que se integren al genoma y con esta caracterstica se logra
adems una expresin ms duradera del gen de inters en el tejido hospedero.
Este tipo de vector tambin es elegible en el caso de que se quieran tratar clulas
cancerosas con genes, cuyos productos proteicos detengan el crecimiento de las
clulas afectadas. Si por el contrario, el objetivo est dirigido a realizar una Terapia
Gnica in vivo en el tejido cerebral, constituido de manera predominante por clulas en
no divisin, pueden utilizarse vectores virales que permanezcan de forma episomal.

PROBLEMAS DE APLICACIN DE LA TERAPIA GNICA
A pesar de que se han observado pequeos avances en las investigaciones y los
ensayos de Terapia Gnica realizados hasta ahora, los logros han sido limitados y los
resultados bastante modestos. Uno de los elementos que limitan el desarrollo de la
Terapia Gnica se basa en que este procedimiento puede ser empleado en el
tratamiento de mltiples enfermedades; sin embargo, su aplicacin est matizada por
determinados factores que condicionan su uso. Segn Soutullo, estos factores son los
siguientes:
1. Tipo de herencia: las enfermedades mendelianas, determinadas por la accin de un
nico gen, son mejores candidatas que las enfermedades multifactoriales que, adems
de depender de la accin conjunta de varios genes, estn influidas por factores
ambientales.
2. Patrn de herencia: las enfermedades recesivas son mejores candidatas a ser
tratadas mediante terapia gnica que las dominantes. En las primeras, es suficiente
aadir una copia del gen sano para recuperar el fenotipo normal, mientras que en las
segundas sera necesario recurrir a algn tipo de modificacin dirigida del gen daado,
lo que complica enormemente las posibilidades de intervencin.
3. Naturaleza de la mutacin que causa la enfermedad: las enfermedades que se
generan por prdida de la funcin son mejores candidatas que las que se generan
como consecuencia de una ganancia funcional. En las primeras, el gen afectado deja
de producir la protena codificada por el mismo o se produce una protena que no es
funcional. Por tanto, en principio, basta con introducir una copia del gen normal para
que se produzca la protena funcional y la correccin surta efecto. En las segundas, se
produce una protena mutante o un producto txico. El tratamiento de estas dolencias
incluye estrategias ms complejas encaminadas a corregir la mutacin causante del
dao o a bloquear el gen mutado.
4. Control de la expresin gnica: aquellos genes que no necesitan un excesivo
control de su expresin, manteniendo un fenotipo funcional con niveles variables de
producto gnico, son los ms fciles de tratar. Por el contrario, cuando la expresin
gnica requiere un control estricto, los problemas que se presentan son mucho
mayores.
5. Tamao del gen que se inserta en el vector: los genes con secuencias de pequeo
tamao son siempre mejores candidatos, mientras que los genes con un ADN
codificante de gran tamao pueden ser difciles de transferir al interior de las clulas
debido a la dificultad de encontrar vectores adecuados.
6. Tejido donde se manifiesta la enfermedad: la enfermedad ser ms fcilmente
tratable si se manifiesta en un tejido cuyas clulas puedan ser extradas, cultivadas
con facilidad in vitro, resistentes a la manipulacin y reintroducidas sin dificultad en el
organismo. Adems, sera deseable que fuesen clulas de larga vida, de ser posible
que permanecieran durante toda la vida del paciente. Las clulas que ms se
aproximan a estas condiciones tisulares son las clulas madres adultas, sobre todo,
las de la mdula sea por lo que, en principio, seran las mejores candidatas.
Por otra parte, existen problemas metodolgicos que pueden contribuir con el
desarrollo de complicaciones en el paciente y deben de ser considerados cuando se
aplica la transferencia gnica. El ms frecuente se debe a que, en la mayora de los
casos, la aplicacin clnica de un ensayo est avalada por las investigaciones en
modelos experimentales. Los modelos animales existentes para prevenir la seguridad
del vector a usar, en ocasiones, no reproducen las consecuencias de la administracin
del vector de igual modo que como sucede en el humano. Esto se debe a que los virus
que son patognicos en los humanos, por lo general, presentan perfiles de riesgos
diferentes en los animales.1 Adems de que la variabilidad de respuesta de los
humanos frente a un mismo vector es muy amplia y la respuesta de cada persona est
modulada por las exposiciones previas que dicha persona haya tenido frente a un virus
similar al usado en la transferencia gnica. De ah, que algunos investigadores, en
ensayos clnicos en fase I, usando adenovirus, hayan concluido que no se obtuvo una
curva lineal de dosis-toxicidad y, por tanto, la evaluacin del vector usado fue
problemtica. Estos problemas no solo se presentan con la transferencia de genes,
pues los modelos animales mimetizan las dificultades que se pueden presentar en el
humano pero no las predicen exactamente. De manera que lo que marca la diferencia
en la ocurrencia de los riesgos es la frecuencia con que los efectos adversos ocurren
en los ensayos clnicos, la ocurrencia de los mismos simultneamente y la limitada
experiencia del ser humano para evaluar y manejar estos efectos.

APLICACIONES CLNICAS DE LA TERAPIA GNICA
Los primeros ensayos de terapia gnica realizados en humanos se remontan a la
dcada de 1990. Estos ensayos incluyeron el tratamiento de una inmunodeficiencia
combinada severa producida por la deficiencia de la enzima adenosn desaminasa. La
ausencia de esta enzima origina una disfuncin de las clulas T y B que provoca la
muerte de los pacientes antes de los dos aos de edad por infeccin masiva. La
eficacia de estos estudios fue limitada; sin embargo, una dcada despus se
realizaron
protocolos ms refinados que arrojaron beneficios clnicos prometedores. En estos
estudios se realiz la transferencia ex vivo de la enzima adenosn desaminasa
utilizando clulas hematopoyticas. A pesar de que en la mayora de los casos se
observ una mejora de los pacientes tratados, se report un caso en el que la terapia
fall.15 Sin dudas, esto demuestra que si bien esta tcnica resulta prometedora, an
existen aspectos en los que hay que profundizar.
La Terapia Gnica ha sido aplicada en humanos a las enfermedades
neurodegenerativas. Esto se debe a que la mayora de los desrdenes que se
presentan a nivel del tejido cerebral se manifiestan con prdida neuronal; de ah que
una salida para lograr la restauracin del tejido daado sea el implante de clulas
capaces de diferenciar a neuronas, la liberacin de genes con funcin neuroprotectora
y neurorestauradora o de enzimas cuya funcin se afecta como consecuencia de la
prdida neuronal. En este sentido, se han llevado a cabo dos ensayos clnicos de
Terapia Gnica in vivo y ex vivo. El primero consisti en la liberacin de la enzima
cido glutmico descarboxilasa, responsable de la sntesis del cido -amino-butrico
para aliviar los sntomas caractersticos de la Enfermedad de Parkinson. Un mes
despus de la ciruga no se haban detectado problemas de toxicidad, fiebre o
disfunciones neurolgicas adicionales. Recientemente, se realiz la fase I de un
estudio en el que se implantaron fibroblastos genticamente modificados para liberar
NGF en ocho pacientes con la Enfermedad de Alzheimer. Despus de 22 meses de
seguimiento, no se detectaron efectos adversos asociados al procedimiento, mejor la
funcin cognitiva de seis pacientes y en una autopsia se demostr una respuesta
significativa a la liberacin de NGF.

Implicaciones sociales y ticas de la aplicacin de la Terapia Gnica en humanos
El conocimiento actual de la genmica supone la posibilidad real de modificar el
genoma humano con trascendencia definitiva para el individuo e incluso a nivel de la
descendencia. El lmite para esta aplicacin solo se circunscribe a la disponibilidad de
tcnicas necesarias, por lo que la aplicacin de la Terapia Gnica suscita una
preocupacin de la comunidad que se ve fuertemente ligada a la tica y la biotica.
Mediante la manipulacin gentica se pueden proponer objetivos teraputicos o fines
de intensificacin o perfeccionamiento de caractersticas del ser humano y, por tanto,
se corre el riesgo de caer en la eugenesia. Esta situacin se agravara si la terapia que
se aplica es la germinal, pues se creara una descendencia con caractersticas
beneficiosas sobre el resto de las personas, no beneficiadas con la terapia. De ah
que exista gran preocupacin en relacin con establecer una definicin de la Terapia
Gnica que circunscriba los usos de la Terapia Gnica a fines teraputicos y deje
fuera otras utilidades diagnsticas, preventivas o eugensicas no propiamente
curativas. Como especificamos anteriormente, en la aplicacin de la Terapia Gnica
cabe distinguir intervenciones en clulas somticas y en clulas de la lnea germinal.
La terapia somtica presenta principios ticos ms limitados que la terapia germinal.
Esto se debe a que la terapia por transferencia gnica somtica afecta solo al paciente
enfermo. Sin embargo existe un consenso a favor de su aplicacin, siempre y cuando
los beneficios sean mayores que los riesgos y justifiquen estos ltimos.
La aplicacin Terapia Gnica somtica est acompaada de numerosos riesgos, por
esta razn, en muchos pases se han establecido comits de evaluacin tica y de
8seguridad en la experimentacin clnica. Todos estos comits se rigen por normas,
cuyo cumplimiento es obligatorio cuando se aplica esta ciencia.
En el uso de la Terapia Gnica se ponen de manifiesto los principios de autonoma,
beneficencia y justicia. La obtencin del consentimiento libre e informado del paciente,
estableciendo claramente los riesgos del procedimiento, as como el mantenimiento de
la confidencialidad de los datos, son aspectos clave y necesarios para mantener el
principio de autonoma. Para respetar la beneficencia se deben sopesar los beneficios
y riesgos del procedimiento, y los beneficios que se obtengan con el procedimiento
deben justificar los riesgos. El aspecto relacionado con la justicia resulta el ms
complicado ya que esta es una tecnologa que necesita de grandes recursos por lo
que el costo de su aplicacin es elevado. A pesar de que todo paciente tiene el mismo
derecho a recibir un tratamiento cuando lo necesite, la aplicacin de esta ciencia
puede generar una desigualdad entre grupos sociales en cuanto a la posibilidad de
recibir los beneficios de esta tcnica, sobre todo en pases que se encuentran en vas
de desarrollo y carecen de recursos econmicos para desarrollar la Terapia Gnica. La
solucin en este sentido depende de la erradicacin de las diferencias entre la
medicina de ricos y pobres.

La transferencia de genes a clulas embrionarias, por el momento, no tiene gran
demanda prctica, adems de que despierta muchas consideraciones cientficas y
ticas. Los defensores de este tipo de terapia plantean como ejemplo su aplicacin en
el caso de que se desee evitar la transmisin a su descendencia de una enfermedad
heredada de modo recesivo; pero, en este caso, parecera ms lgico permitir la
implantacin de un embrin normal en lugar de intentar la correccin de un embrin
afectado. En nuestra consideracin, siempre que sea posible resolver el problema
mediante la transferencia gnica somtica se debe evitar el uso de clulas germinales,
pues en esta ltima opcin no existe an gran experiencia, en este sentido, que
permita predecir las consecuencias de su aplicacin. Por estas razones, la terapia
germinal plantea problemas ticos y jurdicos ms complejos que la terapia que se
realiza en clulas somticas.
Aunque la terapia germinal en el futuro pueda contribuir a erradicar defectos genticos
en las estirpes intervenidas, tambin tendr efectos de modificacin definitiva del
componente gentico intervenido y de transmisin a las generaciones sucesivas, cuya
trascendencia para la especie humana no se conoce todava con precisin ni es
9posible, por lo mismo, controlar sus potenciales efectos negativos, en su mayora
todava desconocidos.
Una de las dificultades que se deriva de la aplicacin de la Terapia Gnica germinal es
el consentimiento informado. La pregunta es si tenemos derecho a decidir por las
generaciones futuras. Se ha planteado que la terapia gnica germinal viola la dignidad
humana porque cambia el contenido gentico de las siguientes generaciones, cuyo
consentimiento no puede ser obtenido y cuyo inters es difcil de dilucidar.25 Tambin
afectara la integridad del patrimonio gentico humano, seleccionando y determinando
caractersticas de las futuras generaciones. Sin embargo, si se perfeccionara la
tcnica, se podra aceptar la terapia gnica germinal, pues sera ms simple realizar
una sola vez el procedimiento que tener que llevar a cabo la terapia gnica somtica



en cada generacin. Si el propsito es prevenir el sufrimiento humano y la muerte
prematura (y dado que stos son valores universales y, por tanto no requieren previo
consentimiento), sera lgico actuar en beneficio de generaciones futuras. En este
caso, prevalecera el principio de beneficencia por sobre el de autonoma. Adems,
hay enfermedades que implican el Sistema Nervioso Central, en las que una
intervencin temprana en el embrin sera el nico medio de conseguir una terapia
efectiva, ya que sera muy complicado reparar genticamente las clulas nerviosas
despus del nacimiento. Pero, en el estado actual de la tcnica, ticamente la
posibilidad de dao pone al principio de no maleficencia por encima del de
beneficencia, debido al riesgo para las generaciones futuras.
La Terapia Gnica podra ser usada para conseguir una mejora gentica. La
aceptacin en la sociedad de la mejora gentica llevara, con seguridad, a la
discriminacin y a la devaluacin de ciertas categoras de personas cuyos genes no se
consideraran dignos de imitar. No hay criterio objetivo, libre de prejuicios, que pueda
establecer qu cualidades son mejores que otras. Si se tuviese acceso libre a esta
tcnica, existe el peligro de utilizarla para dar ventaja a ciertos privilegiados. Se podra,
por ejemplo, incrementar la inteligencia de ciertas personas o mejorar las capacidades
fsicas de atletas. Fcilmente sera una forma de ejercer discriminacin. Habra un
reforzamiento biolgico de las distinciones de clase, ya que, con toda seguridad, el
mejoramiento gentico estara slo al alcance de los pudientes. Esta tcnica podra
ser usada para seleccionar ciertas caractersticas humanas y crear una clase social,
con la correspondiente devaluacin de otras caractersticas que no seran
adecuadamente valoradas. No se avizora an cmo podra salvarse el principio de
justicia equitativa,




sobre todo si lo medimos a nivel internacional. Adems, hay que aadir que, en el
estado actual de la tecnologa, no se justifica la mejora gentica porque se pueden
producir daos irreversibles en el organismo. Slo se justifica emplear la ingeniera
gentica en el caso de intervenciones teraputicas de aquellas enfermedades que
amenazan la vida de las personas.

CONCLUSIONES
La Terapia Gnica es una gran promesa para el futuro, aplicable a una variedad de
enfermedades que han estado fuera del alcance de la terapia convencional, como es
el caso del tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central (SNC), donde no
han sido eficientes algunos mtodos por la carencia de un sistema de dispensacin
eficiente que cruce la barrera hematoenceflica,26 los efectos asociados con la
administracin sistmica y la inestabilidad de las molculas.27 Los resultados
obtenidos en los ensayos clnicos hasta ahora realizados, demuestran que resulta
factible laaplicacin de la terapia gnica, tanto in vivo como in vitro. De hecho, en el
caso de laliberacin de NGF mediante el implante de fibroblastos, se ha planteado que
resulta factible la aplicacin de otros ensayos clnicos. Si bien, la aplicacin de la
TerapiaGnica de manera inmediata resulta prometedora, todava quedan aspectos
los quehay que profundizar.
Actualmente, la cuestin de los vectores de transferencia de genes es uno de los
problemas tcnicos ms importantes que se presenta y que hasta ahora ha limitado la
obtencin de resultados satisfactorios. Definitivamente, se necesita el desarrollo de
vectores de nuevas generaciones para solucionar los problemas de bioseguridad
implcitos al utilizar la Terapia Gnica.
Pese a los problemas tcnicos de terapia gnica somtica, esta temtica se ha ido
desarrollando y siguen siendo una va muy prometedora, para la lucha contra un buen
nmero de enfermedades genticas. Existe un amplio acuerdo sobre la idea de que la
terapia gnica somtica no plantea problemas ticos distintos a los de cualquier otro
tratamiento teraputico nuevo en fase experimental. Pero se considera muy necesario
que los protocolos que se pongan en prctica se desarrollen con un control estricto por
parte de las comisiones cientficas y ticas destinadas a tal fin. Por lo que se refiere a
terapia germinal, resulta rechazable porque sus supuestas ventajas no compensan los
peligros asociados a la misma, toda vez que existen alternativas teraputicas con el
mismo potencial y que no comparten los mismos riesgos.
Teniendo en cuenta que los riesgos relacionados con la transferencia gnica poseen
mayores incertidumbres que las terapias convencionales, los comits de ticas tienen
un papel fundamental. Estos comits estn obligados a evaluar la proporcionalidad
entre la magnitud de los riesgos y los posibles beneficios teraputicos, as como vigilar
la ocurrencia de riesgos en el experimento una vez que el mismo haya sido aprobado.
Los participantes de un ensayo de terapia gnica estn expuestos a posibles daos
imprevistos que pueden ser serios y latentes. Por esta razn, se debe garantizar la
calidad cientfica del procedimiento y que el aporte de conocimientos del ensayo
justifique la exposicin de los pacientes a los riesgos. Uno de los aspectos que atentan
contra el buen desarrollo de este tipo de terapia es la existencia de comits de ticas
locales encargados de la revisin de los ensayos. Se recomienda, en estos casos, que
el proyecto experimental sea enviado, adems, a equipos revisores expertos.28