Mdulo Ingeniera Gentica Agropecuaria

Luz Mery Bernal Parra. Ph.D.

4. Estructura del ADN

Para entender la ingeniera gentica y la tecnologa del ADN recombinante, debemos
recordar los conceptos bsicos de biologa molecular.

Todo organismo, an el ms simple, contiene una enorme cantidad de informacin. Esta
informacin se encuentra almacenada en una macromolcula que se halla en todas las clulas:
el ADN (cido desoxirribonucleico). Este ADN est dividido en sub-unidades (la cantidad vara
de acuerdo con la especie) llamadas genes. Cada gen contiene la informacin necesaria para
que la clula sintetice una protena. As, el genoma (y por consecuencia el proteoma), va a ser
el responsable de las caractersticas del individuo (altura, color, resistencia a enfermedades o
a plagas, nmero de frutos, presencia o ausencia de estructuras, etc.).
La estructura de la doble hlice del ADN fue descrita por James Watson y Francis Crick en
1953. Dicho descubrimiento es un hito en la historia de la biologa y su modelo propuesto ha
sido ampliamente confirmado.
Segn este modelo, la molcula de ADN est constituida por dos largas cadenas de
nucletidos con polaridad opuesta, unidas entre s formando una doble hlice. Cada nucletido
est formado por un azcar: la desoxirribosa, una base nitrogenada que puede ser de cuatro
tipos diferentes: adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T) y un grupo fosfato.

Imagen tomada del curso: PCR una herramienta en el diagnstico. Salto, Uruguay

Los nucletidos se enlazan entre s a travs del grupo fosfato formando largas cadenas. La
estructura fosfato-pentosa recorre el esqueleto de la hlice, mientras que las bases se
disponen formando un ngulo recto con el eje de la misma.
Las dos cadenas de polinucletidos que constituyen una molcula de ADN se mantienen
unidas entre s gracias a la formacin de puentes de hidrgeno entre las bases nitrogenadas
complementarias de ambas cadenas que quedan enfrentadas (dos puentes de hidrgeno entre
A y T, y tres puentes de hidrgeno entre G y C)
La estructura de un determinado ADN est definida por la ordenacin o "secuencia" de las
bases nitrogenadas en la cadena de polinucletidos, ocupando precisamente en esta
secuencia de bases la informacin gentica del ADN.
La estructura en doble hlice del ADN, con el apareamiento de bases limitado (A-T; G-C),
implica que el orden o secuencia de bases de una de las cadenas determina automticamente
el orden de la otra, por ello se dice que las cadenas son complementarias.







Representacin esquemtica de la molcula de ADN. Estructura tridimensional de la doble
hlice. Tomada del curso: PCR una herramienta en el diagnstico. ATgen. Salto, Uruguay




Detrs de cualquier carcter de un organismo, existe un gen o un grupo de genes responsables
por su expresin. La estructura que gobierna la expresin de los genes es esencialmente la
misma en todos los organismos y se localiza en el mismo ADN, esta estructura se denomina
opern y fue postulada por Jacob y Monod en 1961, como resultado de las investigaciones en
Escherichia coli. Existe una regin promotora, una regin secuenciadora y una regin
terminadora, que en conjunto actan dentro del proceso de la expresin gnica.

La regin promotora establece el momento, la manera y el lugar de accin del gen. La regin
secuenciadora es el gen propiamente dicho, o sea, el responsable de la sntesis de protenas
que cumplir una funcin especfica determinando una caracterstica fsica en un organismo.
Esta regin se transcribe en ARN mensajero (ARNm) y se traduce en una secuencia de
aminocidos que constituirn una protena. La regin terminadora especifica el final del gen
y determina algunas propiedades del ARNm as como los niveles de expresin del gen.
La carga gentica de un determinado organismo no puede ser idntica a la de otro, aunque se
trate de la misma especie. Sin embargo, debe ser similar para que la reproduccin se pueda
concretar. Una de las propiedades ms importantes del ADN, y gracias a la cual fue posible la
evolucin, es la de dividirse y fusionarse con el ADN de otro individuo de la misma especie
para lograr descendencia diversificada.


Otra particularidad de esta molcula es su universalidad. No importa cun diferente sean dos
especies: el ADN que contengan ser de la misma naturaleza: cido nucleico.

Siguiendo este razonamiento, y teniendo en cuenta el concepto de gen, surgen algunas
cuestiones: Son compatibles las cargas genticas de especies distintas? Puede el
gen de una especie funcionar y manifestarse en otra completamente distinta? Se puede
aislar y manipular el ADN?


La respuesta a todas estas preguntas se resume en dos palabras: Ingeniera Gentica.


La Ingeniera Gentica es una rama de la gentica que se concentra en el estudio del ADN,
pero con el fin de su manipulacin. En otras palabras, es la manipulacin gentica de
organismos con un propsito predeterminado.



Leccin 5. Historia


El ADN haba sido identificado en 1869 como un constituyente del ncleo por el cientfico suizo
Frederick Miescher. No fue sino hasta 1946 cuando Edward Tatum y Joshua Lederberg, de la
Universidad de Yale, demostraron que el ADN era el material de la herencia en bacterias.
Cruzaron cepas de Escherichia coli mutantes, cada una de las cuales era portadora de una
deficiencia nutricional diferente, y obtuvieron una prole bacteriana deficitaria en los requisitos
nutricionales de cada progenitor. Las deficiencias se complementaban mutuamente. Esto
demostr que el ADN era una molcula capaz de alterar la herencia y, por tanto, la gentica
bacteriana. Ms tarde se prob que la misma molcula era el material hereditario de todas las
clulas vivas.


En 1953 James Watson y Francis Crick postularon la estructura helicoidal complementaria del
ADN en los laboratorios Cavendish de Cambridge. Construyeron un modelo tridimensional del
ADN basado en las configuraciones energticamente ms favorables que eran compatibles
con los parmetros helicoidales proporcionados por los datos de la cristalografa de rayos X
producidos por Maurice Wilkins y Rosalind Franklin en el King's College de Londres. En 1962
Crick, Watson y Wilkins fueron galardonados con el Premio Nobel por este trabajo. Crick y
Watson demostraron cmo se interrelacionan las tres subunidades importantes de la molcula
de ADN. Establecieron que el ADN es un polmero macromolecular compuesto de tres tipos
de unidades: desoxirribosas (azcares de cinco carbonos), fosfatos y bases que contienen
nitrgeno. Existen dos tipos de bases, las purinas (adenina y guanina) y las pirimidinas (timina
y citosina). Las bases se unen en pares especficos mediante puentes de hidrgeno: adenina
(A) con timina (T) y guanina (G) con citosina (C). El nmero de puentes de hidrgeno determina
el apareamiento de las bases de una manera fija, con tres puentes de hidrgeno entre G y C
y dos entre A y T. Los nucletidos, compuesto cada uno de ellos por un azcar, un fosfato y
una base, polimerizan en largas cadenas polinucletidas mediante enlaces fosfodister entre
5' y 3'.


En 1958 Frank Stahl y Matthew Meselson, del California Institute of Technology, demostraron
que la replicacin del ADN implica la separacin de las cadenas complementarias de la doble
hlice y la obtencin de idnticas dobles hlices hermanas mediante la replicacin
semiconservativa del ADN. Utilizaron diferencias de densidad para separar las molculas de
ADN parentales de sus molculas hijas. Primero cultivaron Escherichia coli en un medio muy
rico en istopos pesados:
L
C y N. Debido a su densidad y una vez incorporados los istopos,
el ADN ms pesado puede ser claramente separado del ADN ms ligero mediante
centrifugacin a gran velocidad en cloruro de cesio. Cuando las clulas portadoras del ADN
pesado fueron transferidas a un medio normal, ligero, permitiendo que se multiplicaran en
una generacin, todo el ADN pesado fue reemplazado por ADN que pesaba la mitad que el
anterior. Esto indic la presencia de un proceso de replicacin semi-conservativo, por el cual
cada molcula hija posea una cadena pesada procedente de su progenitor y una nueva
cadena, ms ligera.


La molcula de ADN en doble hlice de Watson y Crick posee en su estructura bioqumica
la informacin gentica que permite la transmisin exacta de la informacin gentica de una
generacin a otra, al mismo tiempo que especifica la secuencia de aminocidos de las cadenas
polipeptdicas de todas las protenas necesarias para la clula. La replicacin del ADN aporta
propiedades especiales. La totalidad de su informacin puede ser copiada de forma muy
precisa mediante la separacin de sus cadenas, seguida de la sntesis de dos cadenas
completamente nuevas. Este mecanismo de replicacin del ADN implica la existencia de
diversos sistemas enzimticos que poseen la habilidad de reparar una cadena rota o daada.


El trabajo de investigacin sobre los sistemas enzimticos de la replicacin del ADN fue
iniciado por Arthur Kornberg en la Universidad de Stanford. En 1958 la ADN-polimerasa I fue
aislada y utilizada para sintetizar ADN en un tubo de ensayo. Usando una cadena de ADN
como molde, la ADN -polimerasa I es capaz de sintetizar una cadena complementaria
mediante la formacin de enlaces fosfodister entre bases apropiadas. Este trabajo tuvo su
continuacin en 1960 con el descubrimiento de la ARN-polimerasa, una enzima capaz de
sintetizar cadenas de RNA (cido ribonucleico) usando el ADN monocatenario como molde.
Se observ que las clulas eucariotas contienen tres ARN-polimerasas diferentes, cada una
con un papel funcional distinto. El ARN ribosmico (rARN) se transcribe a partir de genes del
ADN-ribosmico (rADN) mediante la enzima ARN-polimerasa I. La sntesis del ARN mensajero
(mARN) est catalizada por la ARN-polimerasa II y la subsiguiente adicin de la cola poli-
adenina es llevada a cabo por la enzima poli-A-sintetasa. Aproximadamente al mismo tiempo
se descubri el ARN mensajero y se demostr que organiza los aminocidos en protenas.


En 1956 experimentos realizados por Francis Crick confirmaron la hiptesis de que los
mensajes genticos del ADN son transmitidos por su secuencia de pares de bases. Se observ
que tres bases adyacentes (un triplete) codifican para cada aminocido, constituyendo un
codn. Mediante el uso de una molcula de ARN mensajero sinttico que consista nicamente
en uracilo (poli-U) se encontr el primer fragmento del cdigo gentico.


En 1961 se localizaron los genes responsables de proporcionar resistencia antibitica a las
bacterias en cromosomas supernumerarios llamados plsmidos. Estos ltimos son muy
importantes, pues pueden ser utilizados como vehculos o vectores para transportar molculas
de DNA extraas y clonadas. En 1967 se descubri la enzima ADN-ligasa que es capaz de
unir (ligar) cadenas de ADN entre s. Tres aos ms tarde se purificaba la primera
endonucleasa de restriccin a partir de bacterias, estas enzimas cortan el ADN nicamente en
sitios especficos. En 1978 el Premio Nobel de Medicina fue otorgado conjuntamente a Warner
Arber, Ramilln Smith y Daniel Mathans por el descubrimiento de dichas enzimas y su
aplicacin en biologa molecular.


El conocimiento y el uso de las ligasas y las endonucleasas de restriccin permitieron la unin
entre s de fragmentos de ADN creados por una enzima de restriccin. La primera molcula de
ADN recombinante fue generada en 1972 en la Universidad de Stanford por Paul Berg. Un ao
ms tarde se insertaban fragmentos de ADN extraos en ADN plasmdico, creando as
plsmdos quimricos. Estos plsmidos pudieron ser insertados funcionalmente en Escherichia
coli, y el ADN extrao pudo replicarse y clonarse junto con el ADN plasmdico y bacteriano.
Este gran progreso hizo posible que se pueda clonar cualquier gen o fragmento de ADN en
clulas bacterianas.


En 1975, en la Universidad de Edimburgo, E. M. Southern desarroll la tcnica que permite
blotar ADN en filtros de nitrocelulosa partiendo de geles de agarosa. Esta tcnica se conoce
con el nombre de Southern blot y permite hibridar ADN digerido con enzimas de restriccin,
con sondas de ADN o ARN marcadas radiactivamente. La tcnica de Southern blot ha facilitado
enormemente la capacidad de localizar molculas de DNA.