AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN DE ADN Gonzlez Judd Pablo Miguel Hernndez Acatitla Edwin Arturo Grupo: 5QV1 Seccin: 1 Equipo: 5 Introduccin: El desarrollo de la gentica como ciencia ha dado paso a otras ramas del conocimiento que buscan aplicar las bases tericas dilucidadas por la gentica en cuestiones prcticas, as a menos de 60 aos de propuesta la estructura fsica del ADN la biotecnologa y la biologa molecular son realidades cercanas a nuestra vida cotidiana pues juegan cada vez papeles ms grandes en temas centrales de la vida como la salud y la alimentacin, sin embargo muchas de estas aplicaciones tecnolgicas requieren partir de ADN puro para elaborar secuencias, para identificar y en su caso modificar genes entre muchas otras aplicaciones, lo cual plantea una dificultad inicial en cualquier trabajo porque en la clula el ADN no se encuentra libre, sino asociado a protenas y a ARN. As y de manera paralela al desarrollo de estas aplicaciones tecnolgicas han aparecido una gran cantidad de tcnicas para el aislamiento del ADN y no solo esto, sino que se han ido adaptando las ya existentes para extraer ADN de distintas fuentes y con los mejores resultados posibles, en general el aislamiento del ADN de las clulas y de otros componentes celulares se puede dividir en cuatro etapas: 1) Interrupcin de las funciones celulares 2) Lisis celular 3) Desproteinizacin y remocin de otros componentes celulares 4) Recuperacin del ADN Las cuales se logran con distintos tratamientos, entre los que conviene mencionar el amplio uso que tienen las enzimas hoy da, para realizar varias de estas funciones, puesto que tienen la ventaja de ser especficas, para la molcula, o tipo de molculas que se desean retirar del medio de reaccin. Adicionalmente el hecho de que el ADN sea una molcula muy tolerante a los cambios de pH permite usar procesos fisicoqumicos ms o menos agresivos, como la desnaturalizacin de protenas para completar la eliminacin de algunos componentes celulares.
Sin embargo, para obtener ADN de calidad que no se haya degradado durante el proceso y que est libre de protenas es importante considerar ciertas precauciones generales, adicionales a las buenas prcticas de laboratorio, tal y como son: 1. Usar en todo momento guantes, puesto que las nucleasas presentes en la piel y otras impurezas podran degradar la muestra. Sin embargo, no es necesario trabajar en condiciones de esterilidad puesto que a lo largo de la tcnica se usan reactivos que destruirn a cualquier clula contaminante extrayendo tambin su ADN, el cual en comparacin al extrado del cultivo origina, representar una nfima proporcin. 2. Evitar contaminar o alterar los reactivos, lo cual se logra con un uso adecuado de las micropipetas, con la preparacin y conservacin adecuada del material (ej. mantener las enzimas usadas a temperaturas bajas). 3. Evitar movimientos bruscos o agitacin intensa, al igual que pipetear con micropipeta soluciones donde se sepa o suponga hay ADN libre, puesto que las fuerzas de friccin lo alteran rompindolo. En el cuadro n 1, se resumen las principales operaciones desarrolladas durante la prctica para el aislamiento de ADN, junto con un esbozo de su fundamento terico, aunque recalcamos que la tcnica de aislamiento elegida depender de la fuente del ADN y del propsito que se vaya a dar a este. Cuadro. 1: Pasos de la tcnica de extraccin de ADN cromosmico, para un microorganismo Gram negativo. Fundamentos tericos. Reactivo u operacin Componente con el que interacta Fundamento terico Resultado Centrifugacin del cultivo Clulas bacterianas Permite separar por medio de la fuerza centrfuga a las clulas del medio de cultivo para concentrarlas en un volumen menor y permitir el posterior lavado Paquete celular compactado Lavado con TE (50mM/20mM) Clulas bacterianas Eliminar el medio de cultivo (1a adicin de TE), lavando a las clulas, para despus (2a adicin de TE y resuspensin) proporcionar un medio tamponado (pH constante) que permita la accin de las enzimas a utilizar. Adicionalmente el EDTA secuentra iones divalentes, que son requeridos por muchas enzimas y en especial por las nucleasas como cofactores, lo que impide su accin sobre la muestra. Suspensin celular en medio tamponado RNAsa/Incubacin Clulas bacterianas/RNAsa Las enzimas solo son funcionales en un intervalo de temperatura, por lo que la enzima, la cual se mantiene refrigerada, se deja incubar, para permitir que se active y realice posteriormente su accin degradativa sobre el RNA Suspensin celular RNAsa activa Lisozima SDS Pared celular Membrana celular La lisozima interacta con la pared celular hidrolizando el enlace B 1,4 entre los residuos de N-acetil murmico y N-acetil-D-glucosamida, lo que expone a la membrana, la cual luego es degradada por el SDS que por su naturaleza anfiptica desestabiliza a los fosfolpidos de la misma. Simultneamente al liberarse el contenido celular la RNAsa degrada el RNA de la suspensin, dejando como cido nucleico solo al ADN. Suspensin de componentes celulares libres y sin RNA TE NaCl 5 M Suspensin de componentes celulares La accin de la RNAasa y de los otros reactivos utilizados puede o no ejercer un efecto importante sobre el pH del medio, por lo que se agregar un exceso de regulador (a menor concentracin, puesto que ya se haba adicionado), para garantizar la estabilidad del pH. Lo mismo ocurre con el EDTA del regulador que secuestrar a los iones divalentes de la solucin, impidiendo la accin de las nucleasas liberadas con la lisis celular. El cloruro de sodio por otra parte garantiza la solubilidad del ADN, para poderlo separar al realizar extracciones con fenol. Suspensin de componentes celulares libres, tamponada y ADN solubilizado Fenol saturado/ extraccin Protenas Como cido orgnico fuerte y como molcula polar muy estable, el fenol interacta con las protenas desnaturalizndolas. De forma adicional en la fase orgnica de la mezcla se desplazan todos los componentes lipdicos de la misma que son solo solubles en compuestos orgnicos. Solucin de ADN libre de protenas y restos celulares Cloroformo- alcohol isoamlico Protenas Este paso completa la remocin de protenas, por la accin desnaturalizante del cloroformo Solucin libre de protenas (compuesto orgnico polar) y lava el fenol utilizado en las extracciones, Isopropanol ADN Por su polaridad remueve las azcares que pudieran quedar en solucin y al modificar la constante dielctrica de la solucin permite la separacin del ADN, el cual al centrifugarse se separa del seno de la solucin. ADN precipitado libre Etanol 70% ADN Resuspende al ADN y permite su pufiricacin al evaporarse si se utiliza en solucin, modifica la constante dielctrica de la misma y permite igualmente separar al ADN ya libre de otros componentes. ADN
Objetivos: Aislar ADN cromosmico de peso molecular alto, a partir de un cultivo bacteriano. Establecer el espectro de absorcin del ADN aislado. Determinar la concentracin y grado de pureza del ADN obtenido. Adicionalmente mediante el uso del programa DNAMAN se busc: Construir diferentes secuencias de ADN. Determinar para cada una de ellas, la temperatura media de desnaturalizacin. Determinar para cada una de ellas la influencia de las caractersticas de la secuencia en la desnaturalizacin del ADN.
Materiales y mtodos: Confrntese el manual de laboratorio EXPERIMENTOS EN GENTICA MICROBIANA, para vislumbrar el protocolo utilizado para la realizacin de la prctica el cual se sigui como se cita, salvo, la acotacin puntualizada abajo. Para la extraccin de ADN se sigui el apartado A, punto b. Cromosmico de un microorganismos Gram negativo (ejemplo Escherichia coli) la nica modificacin a introducida en el trabaja, se hizo en este apartado en el punto n 8, donde se adicionaron, en lugar de proteinasa K, 50 L de lisozima.
Resultados: Habiendo trabajado con la cepa W3350 de Escherichia coli, se aisl el ADN, segn el protocolo indicado, el ADN seco fue re suspendido en 200L de agua estril, para medir sus absorbancias por espectrofotometra de radiacin ultravioleta y con esos datos calcular la pureza y al concentracin final de ADN, datos que se resumen en el cuadro 2.
Cuadro. 2: Absorbancia a distintas longitudes de onda, concentraciones y pureza del ADN obtenido a partir de E. coli (Seccin 1, Gpo. 5QV1). Concentracin de DNA g Equipo A 260 nm A 280 nm Pureza Formula Relacin 1 0.1496 0.0848 1.76 6.64 7.48 2 0.095 0.028 3.39 4.22 4.75 3 0.1345 0.0843 1.59 5.97 6.72 4 0.822 0.384 1.94 36.5 41.1 5 0.1375 0.0753 1.82 6.11 6.87 Se denotan los resultados del equipo 5, donde se obtuvo una pureza de 1.82, la cual es apropiada para trabajar, ntese adicionalmente la variacin que existe entre la concentracin de ADN calculada segn la frmula y segn la relacin, que vara en un 10% aproximadamente. Igualmente por espectrofotometra de radiacin ultravioleta se construy el espectro de absorcin del ADN obtenido, haciendo un barrido de longitudes de onda desde los 220 hasta los 280 nm, en intervalos de 10 en 10 nm. Los resultados de este espectro de absorcin se muestran en el cuadro 3 y en el grfico 1. Este espectro fue construido solo por los equipos de trabajo 2 y 4, por lo que se muestran los resultados del equipo 4. Cuadro. 3: Espectro de absorcin del ADN obtenido a partir de E. coli (Seccin 1, Gpo. 5QV1). Longitud de onda Absorbancia 220 0.716 230 0.403 240 0.505 250 0.761 260 0.822 270 0.636 280 0.384
Grfico. 1: Espectro de absorcin del ADN obtenido a partir de E. coli (Seccin 1, Gpo. 5QV1). Los resultados obtenidos haciendo uso del programa informtico DNAMAN se anexan tal y como fueron arrojados por el mismo, al final de la prctica como anexo 1. Discusin de resultados: El trabajo realizo, puede evaluarse con respecto a dos parmetros, la pureza y la concentracin del ADN en general, puede decirse que la tcnica siempre que sea comprendida y por lo tanto aplicada al pie de la letra no presenta gran dificultad operativa por lo que los errores que pudieras presentarse difcilmente pudieran achacarse al operario, a menos claro que este no se hubiera familiarizado de antemano con la tcnica, no la comprendiera o fuese en extremo descuidado. Otros factores de variacin que pudieran introducirse en al tcnica sera la preparacin y el manejo de los reactivos, como es el caso de las enzimas y su ya citada (cfr. introduccin) termolabilidad, otro ejemplo notable de variaciones en este sentido, pudiera introducirlo el SDS que no debe de almacenarse a bajas temperaturas por que en tales condiciones precipita. Los errores introducidos en las determinaciones por los instrumentos y equipos sera muy difciles de detectar dado que las magnitudes de medida utilizadas escapan a la percepcin humana, sin embargo, estos errores pudieras evitarse dado al equipo su mantenimiento preventivo y cuidando al mximo las condiciones de trabajo, para usarlo de la mejor manera. Salvo las variaciones ya comentadas, en general el espectro obtenido, permite observar que el ADN aislado tiene un alto grado de pureza, puesto que presenta un solo mximo de absorbancia a 260nm, tal y como lo refiere la bibliografa, cuestin que adems se complementa con el clculo terico de la pureza que al dar un valor de 1.82 indica que el % de protenas existentes es muy bajo y permitira trabajar con la muestra como si fuera 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 220 230 240 250 260 270 280 A b s o r b a n c i a
Longitud de onda nm ADN puro, puesto que este clculo no hace sino relacionar la cantidad de protenas con la de ADN. La cantidad de ADN aislada variar segn el clculo que se utilice para determinar dicho valor, pues este se mide indirectamente por la absorbancia de la muestra a 260 nm, sin embargo esta variacin no excede el 10% por lo que se puede decir que se aislaron entre 6.11 y 6.87 g de ADN. Para la construccin de espectro se tom la muestra de mayor pureza, puesto que en alla se esperaban menos interferencias, pero las conclusiones arrojadas por este espectro bien son vlidas para nuestro equipo puesto que la pureza es similar. An as cabe hacerse mencin de que para la construccin del espectro se tom la pureza ms alta, pero al hacerse una segunda lectura con el mismo instrumento aparicin un segundo dato con una pureza mayo cuestin que puede deberse al manejo del aparato que mostraba el grfico de manera directa sin tomar individualmente las lecturas, an cuando con cada cambio de longitud de onda debiera ajustarse la lectura a 0 con el blanco. Finalmente y con respecto al uso del programa DNAMAN se encontr, tal y como lo predice la bibliografa que a mayor % de G-C la Tm aumenta significativamente, cuestin cierta, an para cambios en apariencia pequeos del % de G-C, toda variacin encontrada aqu corresponder a la secuencia misma, obedeciendo en primer lugar al % de G-C y despus a la longitud de la cadena, pues an para cadenas con secuencias diferentes pero misma longitud y mismo % de G-C la Tm, permaneca en intervalos muy estrechos. Como perspectivas de este trabajo sera interesante analizar computacionalmente cadenas ms largas y experimentalmente probar distintas tcnicas de extraccin comparndolas entre s a la hora de calcular rendimientos y pureza, para as proponer una tcnica mejorada, para el trabajo rutinario en el laboratorio de gentica microbiana. Conclusiones: Se logr aislar ADN cromosmico de Escherichia coli, en cultivo. Se logr construir el espectro de absorcin del ADN aislado encontrndose que presenta un mximo de absorcin a 260 nm. Se determin que se aislaron en total 6.11-6.87 g de ADN con una pureza de 1.82. Mediante el uso del programa DNAMAN se construyeron 9 diferentes secuencias de ADN a las cuales se les determin computacionalmente la temperatura media de desnaturalizacin, encontrndose que esa aumenta conforme en la secuencia aumenta la proporcin de G-C.
Referencias bibliogrficas: 1) Espinoza Lara A. et. Al. EXPERIMENTOS EN GENTICA MICROBIANA, IPN-ENCB, Mxico 2011. 2) Gonzlez de Buitrago TCNICAS Y MTODOS DE LABORATORIO CLNICO, 2 ed. Ed. Masson, 2005, Espaa 3) Madigan M.T. et Al. BIOLOGA DE LOS MICROORGANISMOS. 12 edicin, Pearson, Mxico 2009. 4) Molina N. et. Al. COMPARACIN DE MTODOS DE LISIS Y EXTRACCIN DE ADN DE TROFOZOTOS DE Giardia Lamblia. Parasitol Latinoam 61:133-137 2006, FLAP, en http://www.scielo.cl/pdf/parasitol/v61n3-4/art06.pdf, sitio pblico en internet consultado el 24/VII/11 a las 23:55 hrs. 5) Sigma life sciences. MICROBIOLOGY MANUAL. Sigma-Aldrich corporation. 3 th edition, 2009, U.S.A. 6) Tortora MICROBIOLOGY AN INTRODUCCIN. Ed. Benjamin Cummings, 9 th edition, 2006, U.S.A. 7) http://www.uprm.edu/biology/profs/massol/manual/p4-dna.pdf sitio pblico en internet consultado el 25/VII/11 a las 00:12 hrs. 8) http://www.unicartagena.edu.co/librose/LABORATORIO%20N%C2%BA7%20AISLAMIENTO%20E%20I DENTIFICACION%20DEL%20DNA.pdf sitio pblico en internet consultado el 1/IX/11 a las 23:55 hrs. 9) http://www.molecularstation.com/es/dna/genomic-dna-isolation/ sitio pblico en internet consultado el 1/IX/11 a las 23:50 hrs.