PRCTICA N 2

FORMAS DE EXPRESAR LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

INTRODUCCIN
La determinacin de la actividad de una enzima consiste en averiguar cuanto de enzima
activa hay en una muestra, esta se expresa en Unidades de actividad enzimtica "U"
principalmente, en Katales, como numero de recambio o como actividad especifica,
dependiendo de la enzima y de las caractersticas del trabajo.
Las Unidades de actividad enzimtica (U) vienen a ser los moles de sustrato
transformados por minuto, bajo condiciones adecuadas y estrictamente controladas de pH y
temperatura. Los Katales por su parte, son los moles de sustrato transformados por
segundo, tambin bajo condiciones adecuadas de pH y temperatura; estas unidades de
expresin de la actividad son utilizadas para enzimas o muestras enzimticas muy activas.
El nmero de recambio viene a ser el nmero de molculas de sustrato transformadas por
una sola enzima (o un solo centro activo), en un segundo, esta forma de expresin es
tambin para enzimas de alta actividad. La actividad especifica son las Unidades de
actividad enzimtica por miligramo de protena, esta unidad es utilizada en procesos de
purificacin de enzimas.
Algunas veces es imposible utilizar alguna de estas formas de expresar la actividad
enzimtica, al hacer la evaluacin de una enzima; esto ocurre cuando el sustrato es un
polimero cuyo pero molecular es variable, como en el caso del almidn, el glucgeno, la
quitina, la celulosa, etc., en donde no hay manera de determinar en molaridad el sustrato
transformado, ya que no existe un peso molecular definido del mismo, al inicio de la
reaccin. En tal sentido, se puede hacer la medida de una consecuencia de la accin de la
enzima. A continuacin presentamos algunos ejemplos:

ENZIMA METODOLOGA
Proteasas Capacidad para coagular la leche.
Liberacin de algn aminocido especifico.
Accin sobre pelculas fotogrficas.
Amilasas Prdida de la capacidad de formar complejos de color yodo amilasa.
Disminucin de la viscosidad inicial.
Incremento del poder reductor.
Pectinasas Capacidad para clarificar jugo de manzana.
Disminucin de la viscosidad inicial.
Incremento en el poder reductor.
Disminucin del precipitado alcohlico del medio de reaccin
Al hacer la determinacin de la actividad de una enzima, si no existe especificacin sobre
las condiciones de la determinacin, muchas veces el trabajo requiere el establecerlas
previamente. En tal sentido, se debe conocer perfectamente la reaccin qumica catalizada
por la enzima en prueba; el sustrato o sustratos que participan, el producto o productos
formados, la necesidad o no de cofactores, participacin de moduladores, condiciones de
pH, temperatura y fuerza inica apropiadas, as como el valor de la K
M
, el cual nos permite
saber cuanto de sustrato debemos utilizar para garantizar que estamos en una reaccin de
orden cero, por lo menos el intervalo de tiempo que dura la medida de la actividad de la
enzima.
El siguiente problema por resolver, es la decisin sobre qu es ms conveniente medir, si el
consumo de sustrato, la formacin de producto o alguna modificacin del cofactor, lo cual
va a depender de 4 factores fundamentalmente, la precisin, la sencillez, la rapidez y el
costo del mtodo de determinacin. Est en el investigador en enzimas decidir que es lo
ms conveniente para su trabajo.
Para expresar los resultados obtenidos en alguna de las unidades de medida propuestas, es
fundamental realizar una curva de calibracin, para cualquiera de los mtodos de
determinacin de actividad empleado; por esta razn en la presente practica, vamos a
elaborar las curvas de calibracin para el mtodo qumico de ureasa desarrollado en la
prctica 1 y la curva de amilasas utilizando como sustrato almidn de papa.
OBJETIVOS:
1. Que el alumno aprenda a elaborar una curva de calibracin.
2. Que el alumno determine el intervalo de validez del mtodo empleado.
3. Que el alumno sepa calcular y utilizar el factor de calibracin.
4. Que el alumno sepa expresar sus resultados en alguna de las unidades de expresin
propuestas.
PARTE EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO 1
DETERMINACIN DE LA CURVA DE CALIBRACIN DEL REACTIVO DE NESSLER
EN LA CUANTIFICACIN DEL AMONIO
Procedimiento
En diez tubos de ensayo prepare soluciones acuosas de sulfato de amonio SO
4
(NH4
+
)
2
, las
cuales contengan equitativamente entre 0,1 y 2 micromoles de la sal; a partir de una
solucin madre de concentracin 5 x 1O
-4
M.
Complete con agua destilada cada tubo hasta hacer un volumen final de 4,5ml (con la
mxima precisin posible), mezclar bien.
Aadir a cada tubo 0,5 ml de reactivo de Nessler y mezclar.
Esperar diez minutos a temperatura ambiente y luego leer en el espectrofotmetro a una
longitud de onda de 420 o empleando filtro azul.
Nota: no olvide considerar un blanco y asimismo, descarte todo tubo que no sea totalmente
transparente.
Resultados
Coloque en la siguiente tabla los resultados obtenidos:
Ttulo: Curva de Calibracin para amonio( ureasa)

ml de
sulfato de
amonio
ml de
H
2
O
moles de
SO
4
(NH
4
+
)

Absorbancia
Absorbancia
neta
moles
de amonio
moles de
urea
0.1 4.4 0.05 0.213 0.213 0.05
0.2 4.3 0.1 0.289 0.289 0.1
0.4 4.1 0.2 0.625 0.625 0.2
0.8 3.7 0.4 1.416 1.416 0.4
1.6 2.9 0.8 >1 >1 0.8
2.0 2.5 1 >1 >1 1
Blanco: 4.5 ml de H
2
O dd + 0.5 ml de reactivo de Nessler
En el siguiente espacio, pegue el papel milimetrado donde a graficado moles de urea vs
Absorbancia neta:


0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

moles de urea
Absorbancia vs moles de urea
INTERROGANTES
1. Entre qu concentraciones de amonio la curva cumple con la ley de Lambert y Beer?

Entre las concentraciones de 0.1-0.4 ya que sale una lnea recta a partir de esa
concentracin
2. Calcule el Factor de calibracin promedio, para urea:

FC
2
= 0.1/0.289 = 0.346

FC
2
= 0.2/0.625 = 0.32

FC
2
= 0.4/1.416 = 0.2825

__
FC = 0.316
EXPERIMENTO 2
ELABORACIN DE LA CURVA DE CALIBRACIN PARA EL FERRICIANURO DE
POTASIO EN LA CUANTIFICACIN DE MALTOSA
Fundamento
El ferricianuro en presencia de carbonato de sodio concentrado es muy sensible a la
reduccin a ferrocianuro, por pequeas cantidades de azcares reductores; por esta razn,
es utilizado como mtodo qumico en determinaciones enzimticas de hidrlisis de
polisacridos. Su utilidad se debe a que mientras est oxidado es de color amarillo y cuando
se reduce se vuelve transparente.
Procedimiento
Preparar 6 tubos de ensayo que contengan entre 0,01 y 0,18 mg de maltosa (se emplea este
azcar reductor porque es el principal producto de las amilasas que estudiaremos
posteriormente, sobre el almidn; se debe preparar la curva de calibracin con el azcar
reductor que se forme durante la catlisis, pues cada uno de ellos tiene distinto
comportamiento).
Completar con agua destilada hasta un volumen final de 1,5 ml.
Adicionar a cada tubo, 2 ml de reactivo de color (0,5g de ferricianuro de potasio en un litro
de carbonato de sodio 0,5M).
Cubrir cada uno de los tubos con un trozo de papel aluminio (sin estropearlo), para evitar el
ingreso del oxgeno, el cual puede reoxidar al ferrocianuro cuando este, est a altas
temperaturas
Llevar los tubos a bao mara hirviente por exactamente 15 minutos.
Enfriarlos, luego descubrirlos y leer sus absorbancias a 420 nm (o filtro azul). Considerar
que el color es estable entre 10 a 30 minutos.
Preparar adicionalmente un tubo blanco con 1,5 ml de agua destilada o el buffer que se
emplear en las determinaciones enzimticas, y 2 ml del reactivo. Una buena lectura para el
blanco es de 0,850; si no es as, es que est fallando el cromgeno o la sensibilidad del
espectrofotmetro.
Resultados
Coloque en la siguiente tabla sus resultados:
Ttulo: Curva de Calibracion para Maltosa

ml de maltosa
10 mg %
ml de agua
destilada
mg de maltosa Absorbancia Absorbancia
neta
0.1 1.4 0.01 0.837 0.065
0.3 1.2 0.03 0.644 0.258
0.6 0.9 0.06 0.442 0.460
0.9 0.6 0.09 0.167 0.735
1.2 0.3 0.12 0.017 0.885
1.5 ---- 0.15 0.018 0.884
Blanco: 0.902 de absorbancia
A continuacin plotee mg de maltosa vs Absorbancia neta en papel milimetrado y pguelo
en el espacio siguiente:

0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16
A
b
s
o
r
v
a
n
c
i
a

mg de maltosa
Absorbancia neta


INTERROGANTES
1. Cul es el rango de utilidad del reactivo para maltosa?

A partir de la concentracion de 0.065 a 0.885
2. Calcular el factor de calibracin promedio, para miligramos de maltosa:

FC
1
= 0.01/0.065 = 0.154 FC
2
= 0.03/0.258 = 0.116

FC
2
= 0.06/0.460 = 0.130 FC
2
= 0.09/ 0.735= 0.122

FC
2
= 0.12/0.885 = 0.136

FC
2
= 0.15/0.884 = 0.169


___
FC = 0.132
INTERROGANTES:
1. Cul de los dos mtodos es ms conveniente? Por qu?

El mtodo de obtencin de amonio por la enzima ureasa ya que si se conoce el peso
molecular del sustrato y se puede medir en unidades de actividad enzimticas
2. Exprese los resultados del experimento 1 de la prctica 1 en unidades de actividad
enzimtica (U)

TUBOS 1 2 3 4 5
Absorbancia
neta
0.213 0.289 0.625 1.416 >1
Actividad
enzimtica (U)

3. Cul sera la unidad de expresin de la actividad enzimtica en el experimento 2 de
esta prctica?



4. Cmo se usa el factor de calibracin promedio? Cul es su beneficio?

El dar mayor precisin a las medidas hechas obteniendo un promedio entre los factores de
calibracin de cada medida hecha ya que relaciona las concentraciones con sus respectivas
absorbancias netas.
5. Qu importancia tiene la elaboracin de un mayor nmero de estndares en estos
mtodos?

El obtener mayores resultados para poder obtener un promedio y este nos dara un valor
mas preciso respecto a cual seria la mejor concentracin que se debe usar en estos metodos

6. Escriba las frmulas del ferricianuro y del ferrocianuro: