PRACTICA N 1 Principios bsicos para el anlisis microbiolgico de alimentos
PRACTICA N 2 Mtodos de muestreo para el examen microbiolgico de alimentos PRACTICA N 3 Evaluacin microbiolgica de superficies inertes y vivas (manos de manipuladores de alimentos) PRCTICA N 4 Numeracin de microorganismo mesfilos aerobios viables en alimentos no fermentables, carne de res, pollo y pescado. PRACTICA N 5 Investigacin y numeracin de Bacillus cereus en productos de panificacin PRACTICA N 6 Investigacin y numeracin de Staphylococcus aureus coagulasa positivo PRACTICA N 7 Investigacin de Salmonella en alimentos (ovoproductos). PRCTICA N 8 Control de esterilidad de conservas PRACTICA N 9 Numeracin de coliformes totales y coliformes termotolerantes (E. coli) por el mtodo del nmero ms probable de tubos mltiples NMP/ml/g PRACTICA N 10 Numeracin de mohos y levaduras PRCTICA N 11 Aislamiento, purificacin y aplicacin de hongos (Basidiomicetos) en la elaboracin de un producto fermentado.
PRACTICA N 1 PRINCIPIOS BSICOS PARA EL ANLISIS MICROBIOLGICO DE ALIMENTOS I. OBJETIVO
Conocer los principios bsicos sobre la preparacin de materiales para el examen microbiolgico de alimentos. Conocer las diferentes tcnicas para la numeracin de microorganismos en alimentos.
II. FUNDAMENTO TEORICO 2.1 MEDIDAS DE ASEPSIA DURANTE EL PROCESAMIENTO Durante el procesamiento se utiliza un mechero Bunsen que, debido a la fuerza la circulacin del aire en sentido vertical y hacia arriba, es capaz de crear un ambiente semiestril en la zona inmediata alrededor y debajo de la llama, de forma que los riesgos de contaminacin disminuyen considerablemente. Durante el proceso de dilucin se debe trabajar cerca al mechero. Normalmente se emplea el calor directo, flameando las bocas de los tubos de ensayo, matraces, pipeta, etc. antes y despus de su utilizacin, a pesar de estar esterilizados previamente. El uso de gorra y mascarillas durante el procesamiento de las muestras de alimentos debe ser obligatorio. 2.2 RE SUSPENSIN Y HOMOGENIZACIN DEL ALIMENTO Los mtodos de aislamiento y numeracin de microorganismos presentes en las muestras de alimentos, generalmente requieren de un tratamiento preliminar para liberar dentro del medio fluido, los microorganismos que pudieran estar aprisionados en las estructuras del alimento o en superficies. Comnmente se utiliza un aparato elctrico de trituracin (licuadora o vortex) y mezcla. As una homogenizacin excesiva puede dar como resultado, recuentos bajos, por el contrario por el contrario, una homogenizacin insuficiente puede no, liberar de todos los microorganismos que se encuentran aprisionados, o no conseguir su distribucin homognea en la suspensin del alimento. Todos los homogeneizados generan aerosoles, por lo que se debe tener mucho cuidado para evitar el riesgo de la formacin de los aerosoles, especialmente si se sospecha que el alimento puede contener grmenes patgenos. Durante este procedimiento se debe considerar medidas de asepsia. Otro factor de gran importancia en la numeracin de microorganismos en los alimentos la naturaleza del diluyente usado, siendo el ms adecuado el agua peptonada al 1%. Sin embargo, de acuerdo a la naturaleza del alimento se pueden utilizar otros diluyentes, tales como: solucin salina peptonada, solucin tween o agua destilada estril. 2.3 MTODOS DIRECTO DE RECUENTO DE MICROORGANISMOS Se trata de conocer el nmero total de microorganismos presentes en el alimento. Se considera como un indicador de las caractersticas higinicas generales del alimento. En general se investiga la presencia de microorganismos aerobios, anaerobios facultativos; aunque, en ciertas situaciones (alimentos envasados al vaco), puede ser de inters hacer recuentos de anaerobios totales, coliformes, mesfilos aerobios, mohos y levaduras, etc. Se han desarrollado tcnicas que hacen posible la automatizacin del proceso. a.- Recuento en Placa Consiste en el plaqueo de una muestra de volumen conocido del alimento que se analiza. El resultado es funcin de una serie de factores como son el mtodo de muestreo, el tipo de microorganismo, el tipo de alimento y las caractersticas del medio de cultivo. b.- Filtros de membrana Utilizados cuando el nmero de bacterias es bajo. Son filtros con un poro de 0,45 mm que retienen las bacterias. Se filtra un volumen dado y se coloca el filtro sobre una placa del medio de cultivo apropiado. La muestra puede haber sido procesada para epifluorescencia previamente, lo que facilita el recuento (la epifluorescencia se puede provocar con naranja de acridina que tie especficamente los cidos nucleicos). c.- Contaje de microcolonias al microscopio Se aade un pequeo volumen de agar-cultivo a un portaobjeto y se incuba para seguir la formacin de microcolonias al microscopio. d.- Films secos (Petrifilm) Son pelculas deshidratadas de medios de cultivos generales o selectivos en las que se deposita 1 ml de la muestra que rehidrata el medio. Tras la incubacin se hace el recuento. 2.4 MTODO INDIRECTO PARA EL RECUENTO DE MICROORGANISMOS a.- Nmero Ms Probable (NMP/g o ml) Basado en series de diluciones y clculo estadstico del nmero de bacterias presentes en las diluciones ms altas. Se puede hacer con 3 5 tubos. b.- Mtodos basados en la reduccin de colorantes Usando azul de metileno. Colorantes reducidos por las bacterias; al reducirse cambian de color y esto es medible. Usado en medios lquidos (lcteos). 2.5 COMPUTO DEL RECUENTO ESTNDAR EN PLACA Completada la incubacin seleccionar las placas que contengan entre 30 y 300 colonias. Contar el nmero de colonias, multiplicando por el inverso de la dilucin redondeando la cantidad a dos cifras. Reportar el nmero de colonias por gramo o mililitro de muestra. Se debe tomar en cuenta las siguientes consideraciones: Cuando solo una dilucin tiene el rango apropiado, se debern contar las colonias, multiplicando por el inverso de la dilucin. Cuando hay dos diluciones cuyo rango es el apropiado, se deben contar las colonias de cada dilucin y luego se promedian las cuentas de dos diluciones. Cuando la dilucin menor tenga menos de 30 colonias contar las colonias y multiplicar por el inverso de la dilucin. Cuando la dilucin mxima tenga ms de 300 colonias, se deber escoger un rea de la placa donde la distribucin colonial sea representativa, contando posteriormente las colonias multiplicando por el factor adecuado para obtener la cuenta de la placa. Cuando en ninguna de las placas haya desarrollo de colonias, reportar como menor del inverso de la menor dilucin usada. 2.6.- CRITERIOS MICROBIOLGICOS Los criterios microbiolgicos de calidad sanitaria e inocuidad se sujetaran a lo expresado en la presente norma sanitaria de la Direccin General de Salud Ambiental- DIGESA, de acuerdo a lo siguiente: PRACTICA N 2 MTODOS DE MUESTREO PARA EL EXAMEN MICROBIOLGICO DE ALIMENTOS
I. OBJETIVOS Preparar los materiales necesarios para la toma de muestras. Exponer los elementos bsicos necesarios en los diferentes tipos de muestreo de alimentos
II. FUNDAMENTO TEORICO Los mtodos de muestreo y los procedimientos para la toma de muestras debern basarse en normas nacionales o internacionales referidas a alimentos y apropiadas para fines microbiolgicos. La mayora de las pruebas de control de calidad se realiza a peticin del fabricante interesado en demostrar al consumidor la calidad de su producto. El muestreo para el control de calidad debe preestablecerse y programarse de modo que las mnimas variaciones que pueden apreciarse en los lotes de ciertos productos, se detecten rpidamente para que puedan introducirse de inmediato modificaciones en el proceso antes de que ocurran cambios apreciables que alteren las preferencias del consumidor, en las grandes factoras se realiza el muestreo al comienzo y al final de las operaciones de procesado as como tambin en la facturacin y durante su almacenamiento. En el caso que se sospeche de una toxiinfeccin alimentario el muestreo se dirigir directo y especficamente al alimento consumido, sospechoso de haberla causado Un alimento de riesgo en salud pblica es aquel que, en razn a sus caractersticas de composicin, especialmente en sus contenidos de nutrientes, actividad de agua (Aw) y pH, favorece el crecimiento microbiano y por consiguiente, cualquier deficiencia en su proceso, manipulacin, conservacin, transporte, distribucin y comercializacin, puede ocasionar trastornos a la salud del consumidor. En el control de calidad de alimentos es necesario tomar en cuenta ciertas normas. El inspector utiliza equipos y materiales diferentes durante la inspeccin, puede utilizar aquellos de uso comn, tales como cuchillos, cucharones, esptulas, bolsas, frascos estriles, etc. A veces se puede necesitar material especializado termmetro para medir la humedad en los cereales y caladores, etc. 2.1 DEFINICIONES Muestra Una muestra consiste en una o ms unidades de producto extrado de un lote. Es definida como la fraccin de un material sobre la que se estudian ciertas caractersticas que posteriormente se generalizan a todo el conjunto. Contra muestra Es una porcin adicional de la muestra tan parecida a la original como sea posible, debe tomarse al mismo tiempo y en la misma forma y cantidad que la muestra original para asegurar que las condiciones sean idnticas. Muestreo Accin organizada de extraer una muestra para su anlisis. Se muestrea para obtener una muestra representativa de todas las unidades del lote, es decir una versin simplificada de la poblacin que reproduzca de algn modo sus rasgos bsicos; con el propsito de aceptar o rechazar dicho lote. Lote Cantidad determinada de unidades de caractersticas similares fabricadas bajo condiciones presumiblemente uniformes que se identifican por tener el mismo cdigo o clave de produccin. Una cantidad determinada de un alimento producida en condiciones esencialmente iguales. Muestra representativa Es aquella que es tomada conforme las normas de muestreo establecidas, que toman en consideracin el tamao del lote, la naturaleza y la forma de acondicionamiento del producto. Alimento apto para consumo humano Alimentos que cumplen con los criterios de calidad sanitaria e inocuidad establecidos por la norma sanitaria. Criterios microbiolgicos Define la aceptabilidad de un producto o un lote de un alimento basado en la ausencia o presencia en cantidad de microorganismos por unidad de masa, volumen, superficie o lote. Agentes microbianos: Son los microorganismos de vida til, indicadores y patgenos sealados en la disposicin. 2.2 PLANES DE MUESTREO Los planes de muestro solo se aplican a lotes o lote de alimentos y bebidas, se sustentan en el riesgo para la salud y las condiciones normales de manipulacin y consumo del alimentos. Los planes de muestreo se expresan en planes de 2 o 3 clases que dependen del grado de peligro involucrado. Un plan de muestreo de 2 clases de usa cuando no se puede tolerar la presencia o ciertos niveles de microorganismo en ninguna de las unidades de muestra. Un plan de muestreo de 3 clases se usa cuando se puede tolerar cierta cantidad de microorganismos en algunas de las unidades de muestra. Al disear un plan de muestreo para un alimento en particular deben establecerse los valores de n, m, M y c en donde: Categora: grado de riesgo que representan los microorganismos en relacin a las condiciones previsibles de manipulacin y consumo del alimento. n: nmero de unidades de muestra seleccionada al azar de un lote, que se analizan para satisfacer los requerimientos de un determinado plan de muestreo. c: nmero mximo permitido de unidades de muestra rechazables en un plan de muestreo de 2 clases o un nmero mximo de unidades de muestra que puedan contener un numero de microorganismos comprendidos entre n y m en un plan de muestreo de 3 clases. Cuando se detecta un nmero de unidades de muestra mayor a c se rechaza el lote. m: valor umbral o limite microbiolgico que separa la calidad aceptable de la rechazable. En general un valor igual o menor a m, representa un producto aceptable y los valores superiores a m indican lotes inaceptables. M: Los valores de recuentos microbianos superiores a M son inaceptables, el alimento representa un riesgo para la salud. El programa de muestreo se aplica a: Registro Sanitario y Certificacin Sanitaria Oficial de Exportacin y se basa en el tipo y riesgo que conllevan las especies microbianas analizadas y las condiciones previsibles de manejo y consumo a las que se someter el alimento luego de su fabricacin o elaboracin. Las categoras del Programa de Muestreo se indican en el cuadro El plan de dos clases provenientes de un muestreo por atributos; en este caso la aceptacin o el rechazo estar definido por n y c.; el plan de tres clases proveniente de un muestreo por atributos; en este caso la aceptacin o el rechazo estar definido por n, m, M y c, donde c tendr como lmites m y M. Se rechazarn todos aquellos resultados cuyos valores sean superiores a M; ninguna de las muestras del plan de tres clases sobrepasar el valor de M. Cuadro 1 Planes de muestreo para combinaciones de diferentes grados de riesgo para la salud y diversas condiciones de manipulacin (*) SEVERIDAD, TIPO DE RIESGO PARA LA SALUD CONDICIONES NORMALES DE MANIPULACIN Y DE RIESGO PARA CONSUMO DEL ALIMENTO LUEGO DEL MUESTREO Condiciones que reducen el riesgo Condiciones que no modifican el riesgo Condiciones que pueden aumentar el riesgo Sin riesgo directo para la salud (contaminacin general, vida til y alteracin) Categora 1 3 clases n=5 , c=3 Categora 2 3 clases n=5 , c=2 Categora 3 3 clases n=5 , c=1 Riesgo para la salud bajo, indirecto (indicadores) Categora 4 3 clases n=5 , c=3 Categora 5 3 clases n=5 , c=2 Categora 6 3 clases n=5 , c=1 Moderado, directo , diseminacin limitada Categora 7 3 clases n=5 , c=2 Categora 8 3 clases n=5 , c=1 Categora 9 3 clases n=10 , c=1 Moderado, directo , diseminacin potencialmente extensa Categora 10 2 clases n=5 , c=0 Categora 11 2 clases n=10 , c=0 Categora 12 2 clases n=20 , c=0 Grave directo Categora 13 2 clases n=15 , c=0 Categora 14 2 clases n=30 , c=0 Categora 15 2 clases n=60 , c=0 (*) Fuente: Mtodos de muestreo para el anlisis microbiolgico, principios; principios y aplicaciones especificas. International Commission on Microbiological Specification for Foods (ICMFS) 2.3 EXCEPCIONES EN QUE n ES DIFERENTE DE 5 a) Nmero de unidades de muestra para registro sanitario de alimentos y bebidas En nmero de unidades de muestra de alimentos y bebidas (n) para la inscripcin en el registro sanitario podr ser igual a uno (n=1) y deber ser calificada con los limites ms exigentes (m) indicadas en la presente disposicin para este tipo de alimentos o bebidas. b) Nmero de unidades de muestra para la verificacin del plan HACCP Para la verificacin del Plan HACCP, el nmero de unidades de muestra de los planes de muestreo podr ser igual a uno (n=1) y deber ser calificada con los limites ms exigentes (m) indicadas en la presente disposicin para este tipo de alimentos o bebidas. Esto proceder si una persona natural o jurdica que opera o intervenga en cualquier proceso de fabricacin, elaboracin, e industrializacin de alimentos y bebidas, demuestre mediante documentacin histrica con un mnimo de de 6 meses, que cuentan con procedimientos eficaces basados en los principios del sistema HACCP. c) Nmero de unidades de muestra para la vigilancia sanitaria de alimentos preparados Para el caso de la vigilancia sanitaria de alimentos y bebidas preparados provenientes de establecimientos de comercializacin, preparacin y expendio, se podr tomar una unidad (n=1) de muestra por cada tipo de alimento preparado que debern ser calificadas con los limites ms exigentes (m), indicados en la presente disposicin. 2.4 MICROORGANIMOS QUE CONSTITUYEN PELIGRO Y GENERAN RIESGO PARA LA SALUD DEL CONSUMIDOR Los microorganismos correspondientes a las clases de criterios microbiolgicos, se agrupan como: (i) microorganismos que no implican riesgo para la salud pero s para la vida til del producto, (ii) microorganismos de riesgo indirecto bajo (indicadores), y (iii) microorganismos de riesgo directo para la salud (patgenos). Los microorganismos del grupo (i) Las categoras 1, 2 y 3 definen los microorganismos asociados con la vida til y alteracin del producto tales como: a) Mohos b) Levaduras, levaduras osmfilas c) Aerobios mesfilos d) Psicrotolerantes e) Hetertrofos f) Esporulados termfilos g) Lactobacillus h) Bacterias acido lcticas Los microorganismos del grupo (ii) Estos son los microorganismos indicadores de higiene, incluyen a las categoras 4,5 y 6 se encuentran los microorganismos no patgenos que suelen estar asociados a ellos como: a) Escherichia coli b) Coliformes totales c) Enterobacterias A excepcin de preparacin en polvo o frmula para lactantes que se consideran en el grupo de microorganismo patgenos Los microorganismos del grupo (iii) estn subdivididos en: (1) Microorganismos de riesgo moderado, directo de diseminacin limitada: Las categoras 7,8 y 9 corresponden a microorganismo patgenos cuya cantidad en los alimentos condiciones su peligrosidad para causas enfermedades alimentarias tales como a) Staphylococcus aureus b) Clostridium perfringens c) Bacillus cereus d) Pseudomonas aeruginosa e) Campylobacter jejuni f) Yersinia enterocoltica g) Vibrio cholerae h) Vibrio parahaemolyticus i) Listeria monocytogenes (2) Microorganismos de riesgo para la salud moderado, directo, diseminacin posiblemente extensa: Estn las categoras 10, 11 y 12 a) Salmonella b) Shigella c) Escherichia coli patgeno (3) Microorganismos de riesgo para la salud grave directo: Las categoras 13, 14 y 15 a) Brucella b) Clostridium botulinum A, B, E y F c) Clostridium perfringens tipo C d) Shigella disenteriae e) Vibrio cholerae O1 f) Virus de la hepatitis A g) E. coli enterohemorrgico O 157:H7 h) Salmonella typhi i) Salmonella paratyphi A, B y C 2.5 INDICACIONES PARA EL MUESTREO Las razones principales que llevan a la toma de muestra son: Para controlar la calidad y establecer la vida til. Para controlar la higiene durante la produccin y las tcnicas de manipulacin Cuando se sospecha que el alimento es la responsable de la toxi-infecciones alimentarias o como consecuencia de denuncias de los consumidores. La mayora de las de las pruebas de control de calidad se realizan a peticin del fabricante, interesado en demostrar la calidad de su producto. 2.6 MUESTRA NO REPRESENTATIVA Se toma con fines de investigacin en laboratorio, utilizando la tcnica de muestreo casual y en cantidades mnimas. Esta muestra se toma con la finalidad de: prevenir infracciones de la ley. Cuando se muestrean en locales de produccin, en las diferentes fases de transformacin como en producto terminado que aun no est comercializado o puede estar en comercio. Tambin se realiza con la finalidad de apoyar a los productores a mejorar la calidad de los alimentos y preservar al mismo tiempo la salud pblica. Estas muestras no representan o no reflejan las caractersticas del lote. Sera un error escoger de un lote solo la muestras deteriorada, el inspector tambin debe escoger muestras buenas. 2.7 MUESTRA REPRESENTATIVA Se ejecuta muestreos representativos solo en casos particulares, esto es cuando despus de un control previo surgen algunas dudas como la calidad de la partida o lote. La toma de muestra representativa puede ser motivada principalmente por razones de carcter higinico sanitario o para determinar la calidad del producto. Estas muestras representan reflejan las caractersticas del lote. 2.8 TCNICAS DE MUESTREO SEGN EL TIPO DE MUESTRA 2.8.1 Toma de muestra de Productos a granel Para productos ensacados o a granel el plan de muestreo se aplica de acuerdo a la tabla 3. Cuando el producto es homogneo es preciso utilizar una sonda caladora para tomar las muestras del saco seleccionado. Cuando los productos no son homogneos es necesario extender el producto en el suelo y mezclar al azar para obtener una capa uniforme. La muestra se debe obtener de 5 puntos diferentes como mnimo. Deben ser tomadas aspticamente, usando contenedores y utensilios estriles y debidamente protegidos contra las contaminaciones externas, adems estas deben ser mantenidas en condiciones que no permitan la multiplicacin o destruccin de la microflora original presente. 2.8.2 Toma de muestra de Productos Acondicionados Es necesario tomar las muestras de acuerdo a la tabla N 2, que toma en consideracin el peso del embalaje y el tamao del lote, permitiendo as la toma de muestra representativa. Las muestras deben tomarse al azar de la parte superior, central y de la base, evitando que la muestra sea de un solo lugar. Por ejemplo si tenemos un lote constituido por 1,200 cajas, que contiene cada uno 12 latas de 1 kg, para calcular el nmero total de unidades tenemos: 1,200 x 12 = 14,400 unidades, con este nmero se busca en la tabla N 2 el nmero de muestras a recolectar, en la tabla se observa 13 unidades.
Cuadro N 2 Cantidad mnima de muestras para anlisis Tipo de alimento Cantidad Cereales Harinas Masa alimentara Pan Pasteles y kekes Aceite Grasa hidrogenadas Cacao Chocolate Leche 1,000 g 1,000 g 1,000 g 1,000 g 300 g 1,000 g 1,000 g 200 g 200 g 1 L Leche en polvo Pudn Helado Vinos Cerveza Vinagre Licores Refrescos Miel Caf Frutas, hortalizas frescas Jugos Carne fresca Carne en conserva y embutidos Conserva 500 g 250 g 200 g 1 L 1 L 1 L 750 g 1 L 250 g 250 g
500 ml. 250 g 250 g 1,000 g
Fuente: Direccin General de Salud Ambiental
Cuadro N 3 Plan de muestreo para productos acondicionados Tamao de lote (N) Tamao de la muestra (N) Peso neto igual o menor de 1 kg 4,800 o menos 4,801- 24,000 24,001- 48,000 48,001-84,000 48,001-114,000 84,000-240,000 144,001-240,000
6 13 21 29 38 48 60 Peso neto mayor de 1K pero menor de 4.5K 2,400 o menos 2,401 15,000 15,00 24,000 24,000 42,000 42,000 72,000 72,000 120,000 Mas de 120,000
6 13 21 29 38 48 60 Peso neto mayor de 4.5 K
600 o menos 601 2,000 2,001 7,200 7,001 15,000 15,001 24,000 24,001- 42,000 Ms de 42,000
6 13 21 29 38 48 60 Fuente Direccin General de Salud Ambiental DIGESA
Cuadro N 4 Plan de muestreo para productos en sacos N Total de sacos N de sacos para colectar la muestra Cantidad de cada muestra primaria (K) Cantidad de muestra global (K) Cantidad de muestra definitiva (K)
Fuente: Direccin General de Salud Ambiental DIGESA 2.8.3 Muestreo de Alimentos de Venta Ambulatoria La toma de muestra se realizara considerando a los productos de mayor riesgo epidemiolgico, de acuerdo a los productos de mayor preferencia por los consumidores. Entre los alimentos considerados de alto riesgo para la salud del consumidor son aquellos con excesiva manipulacin, ejemplo ceviche de pescado, mariscos, ensaladas de verduras, salsa, aj a base de queso, carnes, leches, refrescos, etc. La cantidad de muestra a recogerse deber ser de 100 a 200 g ml. La recoleccin de la muestra se debe llevar a cabo en las mismas condiciones en que es distribuido en el punto de venta. Deben ser recolectadas en frascos, en bolsas estriles y debidamente identificadas, deben acondicionarse en cajas refrigerantes con paquete de hielo. El transporte de las muestras al laboratorio deber efectuarse en el menor tiempo posible. De acuerdo al tipo de estudio que se est realizando ser necesario llenar formularios con datos del lugar de muestreo, de los manipuladores, entre los datos del alimento se debe considerar los siguientes datos: La hora en que fue preparada Tiempo aproximado de exposicin del alimento Temperatura aproximada a la que se ha mantenido Fecha y hora de muestreo Lugar de recoleccin de la muestra. 2.9 ALIMENTOS DE MAYOR RIESGO EN SALUD PBLICA Carne, productos crnicos y sus preparados. Leche y derivados lcteos. Productos de la pesca y sus derivados. Productos preparados a base de huevo. Alimentos de baja acidez empacados en envases sellados hermticamente (pH > 4.5). Alimentos o comidas preparados de origen animal listos para el consumo. Agua envasada. Alimentos infantiles. 2.10 TRANSPORTE DE MUESTRAS Para obtener resultados microbiolgicos confiables, la muestra debe ser examinada a la brevedad posible y debe cumplir los siguientes requisitos: Si no se procesa de inmediato la muestra debe mantenerse a temperatura baja de 6 o C en cajas trmicas para su transporte. Si las muestras son enviadas de lejos, la muestra debe ser tomada en material estril y enviada en caja trmica u otro material resistente que permita mantener temperaturas inferiores a 10 o C y convenientemente acondicionada para evitar la ruptura de los frascos. 2.11 METODOS DE ENSAYO Con el fin de que los resultados deben comprables y reproducibles, los mtodos de ensayo utilizados en cada una de las determinaciones deben ser mtodos internacionales o nacionales normalizados, reconocidos y acreditados por el organismo nacional de acreditacin 2.12 REPORTE DE ENSAYO Los informes de ensayo, certificados de anlisis y otra forma de reporte emitidos por los laboratorios, debern indicar los mtodos de anlisis empleados y la expresin de resultados acorde con el mtodo debe expresarse en UFC/g, UFC/mL, NMP/g, NMP/mL, NMP/100 mL, Ausencia o presencia/25 g o mL. III. MATERIALES Y METODOS 3.1 MATERIALES Bolsa de polietileno estril o de primer uso de 30 x 15 cm Frascos de muestreo con tapa rosca estriles de 250 ml de capacidad Caldo peptonado bufferado. Guantes descartables Papel toalla Plumones de tinta indeleble de punta gruesa Etiquetas Precinto de seguridad Tarjetas de identificacin Guantes descartables Cajas conservadoras con paquete de hielo 3.2 MTODOS 3.2.1 Procedimiento para el muestreo de alimentos Para realizar esta actividad tambin es necesario la concurrencia de 2 muestreadores y se procede de la siguiente forma: Uno de los muestreadores con guantes descartables abre la bolsa Hacer que el manipulador introduzca las 2 manos dentro de la bolsa El otro muestreador va echando el caldo peptonado finamente para que el manipulador lave sus manos. El lquido de lavado se recupera en el mismo frasco del medio de cultivo Identificar la muestra colocando la etiqueta de identificacin y tomar nota del precinto de seguridad. Anotar los datos de inters. Las muestras de alimentos preparados deben ser transportados al laboratorio en cajas conservadoras de hielo para evitar su deterioro.
3.2.2 Muestreo de Superficies Inertes El muestreador con guantes descartables toma los hisopos Empapar o embeber bien los hisopos en el caldo peptonado bufferado para lavar las superficies a muestrear. En el caso que superficies planas realizar el hisopado con movimientos de arriba abajo, con movimientos transversales, diagonalmente y finalmente con movimiento circular y levantar todo el lquido, exprimiendo constantemente el hisopo dentro del frasco. Colocar el hisopo contaminado dentro del frasco con el medio de cultivo Cerrar el frasco, identificar la muestra colocando la etiqueta de identificacin, paralelamente al muestreo se deben anotar todos los datos de inters.
PRACTICA N 3 EVALUACIN MICROBIOLGICA DE SUPERFICIES VIVAS E INERTES
I. OBJETIVOS Evaluar la calidad microbiolgica de superficies inertes (tabla de picar) Evaluar la calidad microbiolgica de manos de manipuladores de alimentos II. FUNDAMENTO TERICO Sea por mtodos rpidos o convencionales, los ensayos microbiolgicos se realizan utilizando mtodos normalizados por organismos internacionales como la Organizacin Internacional para la Estandarizacin (ISO). Mtodos Oficiales de Anlisis de la Asociacin Internacional de Qumicos Analticos Oficiales (AOAC), as como la Comisin Internacional de Especificaciones Microbiolgicas para Alimentos (ICMSF), entre otros, utilizando la tcnica de recuento en placa. El procedimiento para seleccionar muestras debe estar en funcin de los riesgos sanitarios relacionados a las diferentes etapas de la cadena alimentaria, sea la de fabricacin, la elaboracin y/o expendio. Las evaluaciones microbiolgicas de superficies considera a los indicadores de higiene como los Coliformes totales y Staphylococcus aureus. Tambin se considera patgenos como Salmonella sp. Vibrio Cholerae en caso signifiquen un peligro para el proceso. 2.1 MUESTREO DE SUPERFICIES a.- Superficies inertes Se seleccionan aquellas que estn o tendrn contacto directo con los alimentos, que no sern sometidos a un proceso trmico posterior u otro que disminuye la carga microbiana. b.- Superficies vivas Se seleccionaran las manos de los manipuladores, con o sin guantes que estn en contacto con los alimentos destinados al consumo humano. Se debe seleccionar el mtodo de muestreo que debe estar en funcin de las caractersticas de las superficies a muestrear. 2.2 MTODOS DE MUESTREO a.- Mtodo del hisopo Se utiliza en superficies inertes regulares e irregulares, tales como tabla de picar, bandejas, mesas de trabajo, utensilios, cuchillas de equipos, cortadora de embutidos, cortadora de pan de molde, fajas transportadoras, tolvas, mezcladoras, pisos, paredes y otros. b.- Mtodo de esponja Se utiliza preferentemente para muestrear superficies de mayor rea. c.- Mtodo del enjuague Se utiliza para superficies vivas (manos) y para objetos pequeos o para el muestreo de superficies interiores de envases, botellas, bolsas de plstico, etc. 2.3 PARMETROS PERMISIBLES Cuadro N 5 Lmites microbiolgicos permisibles SUPERFICIES Mtodo de enjuague Superficies Vivas Superficies inertes Ensayo Limite de deteccin mtodo Limite permisible Limite de deteccin mtodo Limite permisible Coliformes totales < 100 ufc/manos < 100 ufc/manos < 25 ufc/super. Muestra < 25 ufc/super. Muestra Staphylococcus aureus < 100 ufc/manos < 100 ufc/manos ----- ------- Patgenos Ausencia manos Ausencia manos Ausencia Ausencia Fuente: Direccin General de Salud Ambiental - DIGESA III. MATERIALES Y MTODOS 3.1 MATERIALES Hisopos de almidn u otro material equivalente de largo aproximado 12 cm. Esponja estril de poliuretano o de celulosa de 5 cm x 5 cm Plantilla estril con un rea abierta en el centro de 5cm x 5 cm Frasco con tapa rosca de 250 ml con 100 ml de solucin diluyente Pinzas estriles Bolsas de polietileno de primer uso Tubo de ensayo con tapa hermtica de 10 ml. Solucin diluyente estril Plantilla estril con un rea abierta en el centro de 100 cm 2 (10 cm x10cm) o alternativamente, plantilla estril con un rea abierta en el centro de 25 cm 2 (5cm x 5 cm). Guantes descartables de primer uso Caja trmica Refrigerantes 3.2 METODOS 3.2.1 Procedimiento para la toma de muestra a.- Mtodo del hisopo Colocar la plantilla 10 cm x 10 cm sobre la superficie a muestrear. Humedecer el hisopo, en la solucin diluyente y presionar ligeramente en la pared del tubo con un movimiento de rotacin para quitar el exceso de solucin. Con el hisopo inclinado en un ngulo de 30 frotar 4 veces la superficie delimitada por la plantilla. Asegurar el hisopado en toda la superficie. En el caso de utilizar la superficie de 5 cm x 5 cm repetir esta operacin tres veces ms, en lugares diferentes de la misma superficie para obtener 100 cm 2 . Colocar el hisopo en el tubo con la solucin diluyente, quebrando la parte de hisopo que estuvo en contacto con los dedos del muestreador. Para superficies irregulares en el caso de utensilios, se repetir la operacin con 3 utensilios ms (total 4 como mximo) con el hisopo considerando el rea que est en contacto con el alimento o con la boca. b.- Mtodo de esponja Procedimiento Retirar la esponja de su envoltura con la pinza estril o con guantes descartables Humedecer la esponja con la solucin diluyente estril En condiciones aspticas frotar vigorosamente el rea a muestrear, en el caso de superficies regulares frotar el rea delimitada por la plantilla y en superficies irregulares frotar abarcando la mayor cantidad de superficie. Colocar la esponja en el frasco con el resto de la solucin diluyente o alternativamente colocar en una bolsa con diluyente. c.- Mtodo de enjuague para manos de manipuladores El mtodo consiste en realizar un enjuague (botellas frascos, utensilios) o inmersin (manos, objetos pequeos) en una solucin diluyente. Vaciar el diluyente del frasco (100ml) en una bolsa plstica de primer uso. Introducir las manos a muestrear hasta la altura de la mueca Solicitar al manipulador que realice un frotado de los dedos y particularmente alrededor de las uas y la palma de las manos, adicionalmente el muestreador deber realizar la misma operacin a travs de las paredes de la bolsa. Luego de retirar las manos se regresa el lquido al frasco o se anuda la bolsa y esta se coloca en otra bolsa para que quede segura. 3.2.3 Clculo y expresin de resultados Para superficies vivas, el numero de colonias obtenidas (ufc) se multiplicar por el factor de dilucin y por el volumen de la solucin diluyente utilizando en el muestreo (100ml). Para objetos pequeos o para el muestreo de superficies interiores de envases, botellas, bolas de plstico, entre otros el nmero de colonias obtenidas se multiplica por el factor de dilucin y por el volumen de solucin diluyente y se divide entre las 4 superficies muestreadas. Los resultados se expresaran: Para superficies vivas: ufc/manos Para superficies inertes: ufc/superficie muestreada (envase, botellas) IV. RESULTADOS Describir los resultados con tablas, ilustraciones y/o grficos, reportar la variabilidad microbiana presente en manos de manipuladores y superficies de los utensilios. Reportar la numeracin de microorganismos indicadores de la mala higiene en manos y superficie inerte. V. CONCLUSIONES En directa relacin a los objetivos, es decir para cada objetivo una respuesta puntual VI. DISCUSIONES Interpreta y explica los resultados en forma amplia con sustento bibliogrfico y antecedentes referidos al ensayo.
PRCTICA N 4 NUMERACIN DE MICROORGANISMO MESFILOS AEROBIOS VIABLES EN ALIMENTOS NO FERMENTABLES
I. OBJETIVOS
Realice el flujo de operaciones para la numeracin de Microorganismos Mesfilos Aerobios Viables. Realice la tcnica de siembra por incorporacin en el medio Plate Count la muestra de alimento previamente diluido. Realiza el clculo y reporte de resultados para rechazar o aceptar el producto
II. FUNDAMENTO TERICO
Se trata de conocer el nmero total de microorganismos presentes en el alimento, esta prueba permite determinar la calidad del alimento, los microorganismos mesfilos aerobios viables se consideran como indicadores de las caractersticas higinicas generales del alimento. En general se investiga la presencia de microorganismos aerobios, anaerobios facultativos; aunque, en ciertas situaciones (alimentos envasados al vaco), puede ser de inters hacer recuentos de anaerobios totales, coliformes, mesfilos aerobios, mohos y levaduras, etc. III. MATERIALES Y MTODOS 3.1 MATERIALES Medios de cultivo: Agar plate count Agua peptonada Reactivos y medios de confirmacin TTC (2,3,5 trifenil tetrazolium chloride)
3.2 METODOS Ver Apndice 1 (Diagrama del flujo de operaciones, ISO 4833:2003)