PRACTICA:

PRACTICA N9
EXTRACCIN DE ADN


INTEGRANTES:

Lucila Atilia Castillo Villodas
Kelvin Joseph Ledesma Espinoza
Ivette Alessandra Justiniano Agurto


FACULTAD:
Medicina


AO:
1ER AO



INFORME
INTRODUCCIN
La secuenciacin del ADN es un conjunto de mtodos
y tcnicas bioqumicas cuya finalidad es la determinacin del orden
de los nucletidos (A, C, G y T) en unoligonucletido de ADN. La
secuencia de ADN constituye la informacin gentica heredable
del ncleo celular, los plsmidos, la mitocondria y cloroplastos (En
plantas) que forman la base de los programas de desarrollo de los
seres vivos. Una vez que la muestra es obtenida, se debe degradar
para obtener el material gentico que se encuentra dentro de las
clulas individuales.
Contiene dos ingredientes fundamentales:
Un detergente especialmente diseado (el cual contiene sodio) y una
enzima llamada proteinasa K.
El detergente que se puede usar es el SDSque acta rompiendo
enlaces no covalentes en las protenas, desnaturalizndolas,
provocando que estas molculas proteicas pierdan su
conformacin nativa. Esto ocurre porque el SDS se une a las
zonas apolares del polipptido. Ello proporciona al polipptido
una carga negativa que resulta proporcional a la longitud de la
cadena y a la masa molecular de la protena. La repulsin
electrosttica creada por la unin del SDS a la protena es uno
de las causas de que la protena pierda su conformacin nativa,
eliminndose de este modo las diferencias en conformacin de
las diferentes protenas que han de ser separadas en el gel.

El hidrxido de sodio es otro compuesto que contiene sodio
que se utiliza para extraer el ADN de una clula. La frmula
qumica es NaOH. El hidrxido de sodio es una base. Una
solucin de hidrxido de sodio hace la solucin muy bsica o
alcalina. El hidrxido de sodio puede actuar al aflojar la
estructura rgida de una pared o membrana celular, por lo
tanto libera el ADN.

Proteinasa K Es una enzima que degrada las protenas de las
membranas celulares, por ello se le utiliza en los mtodos de
extraccin de cidos nucleicos de bacterias o clulas humanas,
porque rompe las membranas y degrada las protenas
liberadas al medio.
Una vez en el bao de agua caliente, el detergente corroe la
membrana celular de la muestra y la membrana nuclear que rodea el
material gentico de la clula. Una vez que estas membranas son
alteradas, la proteinasa K degrada una protena llamada histona, que
envuelve al ADN. El tubo Eppendorf se retira del bao de agua, y
una solucin de sal concentrada se aade para agrupar la protena
indeseada y los restos celulares. El tubo se coloca en una pequea
centrfuga, en donde la fuerza centrfuga deja el ADN difundido en
una capa de la solucin por encima del exceso de material ms
pesado. A continuacin, el ADN se retira y se coloca en otro tubo. Se
agrega alcohol isoproplico y se mezcla cuidadosamente. Este
proceso hace que el ADN de la solucin se agrupe en filamentos
visibles. Entonces, el material se coloca otra vez en la centrfuga para
forzar a las hebras de ADN a juntarse. El alcohol se retira y el ADN
se deja secar. Una vez que se haya completado el proceso, la muestra
de ADN resultante podr ser almacenada y utilizada para cualquiera
de sus muchos propsitos.(* GERALD KARP, BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR:
CONCEPTOS Y EXPERIMENTOS, , pag742).




















OBJETIVOS
o Aprender los pasos que se llevan a cabo para la extraccin de
cidos nucleicos.
o Aislar y purificar ADN a partir de muestras de sangre.
o Cuantificar el ADN mediante un mtodo altamente sensible.













PROCEDIMIENTO :


1) Se proceder a tomar 4 muestras de sangre para eso se utilizar
Jeringas de 10 mL con aguja.











2) Verter 200 ml de la muestra de sangre obtenida en tubos
Vacuteinercon EDTA y posteriormente roturarlos con los apellidos
de los alumnos.


3) Usando una micropipeta y una punta estrilextraer 200 uL de
buffer de lisis y unin posteriormente extraer 40 uL de proteinasa
K y luego verterlo a 8 tubos eppendorf.









4) Seguidamente extraer 1,5 mL de sangre de cada uno de los tubos
vacuteiner con la ayuda de la micropipeta y la punta estril e
introducirlo en cada tubo EPPENDORF (Buffer lisis y unin;
proteinasa K). Luego rotularlos.

APELLIDO DEL ALUMNO ROTULO DEL TUBO
Garcia 1 y 2
Davila 3 y 4
Huaylinos 5 y 6
Lopez 7y 8










5) La mezcla obtenida incubarlo durante 10 min a 70 C. Esto permitir
la activacin de la proteinasa K y as lograndose la liberacin de la
histona asociada al ADN.











6) Agregar 100 uL de isopropileno(Conserva el ADN sin alterarlo) a los
8 tubos eppendorf.













7) Extraer 500 L de la solucin resultante de cada tubo eppendorfcon
la ayuda de la micropipeta y luego agregarlo a 8 tubos colectores
con filtro y llevarlo a la centrifugadora a 8000rpmx 1min.
























8) Luego de esta primera centrifugacin observaremos que en el filtro
se queda el ADN( Debido a atraccin de cargas ya que el ADN tiene
carga negativo por los grupos fosfatos y el filtro tiene carga positiva)
y en el tubo colector se recepciona los restos celulares.











9) Despus de centrifugar agregar 500 uL de buffer removedor de
inhibidores a los 8 tubos y nuevamente centrifugar a 8000 rpm x 1
min.







10) Despus de esta 2 centrifugacin desechar el tubo colector y
reemplazarlo por otro tubo colector. Luego agregar 500 uL de buffer
de lavado (Limpia la muestra del buffer inhibidor) y centrifugar por
tercera vez a 8000 rpm x 1 minuto.














BUFFER DE
LAVADO









11) Despus de esta 4 centrifugacin agregar 500 uL de buffer de
lavado y centrifugar a 8000 rpm x 3 min.






















12) La solucin de ADN obtenida someterla a 70 C por 2 minutos
de esta manera se lograr evaporar el buffer de lavado.


13) Finalmente ,agregaremos 50 uL de buffer de elucin al filtro y
centrifugarlo a 14000 rpm x 1 minuto. De este modo podemos
obtener ADN purificado





1) En un criovial de 0,5 ml agregar 200 uL de buffer de cuantificacin
de ADN este permitir que el fluorforo se integre al ADN.










2) Luego a la solucin resultante se agregar 1 uL de fluorforo.


















3) Por ltimo se agregar 1 ul de la solucin de ADN obtenida en el
experimento anterior.











4) Incubar a temperatura de ambiente por 1 minuto y colocarlo en el
equipo fluorometro y realizar la lectura.













RESULTADOS:
Observaremos que el fluorforo se integra en la hebra del ADN y este
emitir florescencia en en el ADN. De esta manera se determinar que a
mayor cantidad de ADN se emitir mayor florescencia. Concluyendo que la
CANTIDAD DE ADN ES DIRECTAMENTE PROPORCIONAL A LA
FLORESCENCIA.



OBSERVACIN: Se guardar las 8 muestras de ADN (1 uL cada una)
para utilizarlas en la otra prxima prctica.




DISCUSIONES :
1. Por qu el uso de las tarjetas FTA?
El uso de las tarjetas FTA es muy ventajoso porque me permiten
obtener, aislar, transportar y archivar cidos nucleicos, todo a
temperatura ambiente.
Las tarjetas FTA utilizan la tecnologa patentada FTA de Whatman
(una marca de Ciencias de la Vida de GE Salud especializada en
productos de filtracin de laboratorio y tecnologas de separacin),
que simplifica la manipulacin y el procesamiento de los cidos
nucleicos.
Las tarjetas FTA contienen productos qumicos que lisan las clulas,
desnaturalizan las protenas y protegen los cidos nucleicos de las
nucleasas, del dao oxidativo y del dao por luz UV. Las tarjetas FTA
inactivan rpidamente los organismos infecciosos de la sangre e
impiden el crecimiento de bacterias y otros microorganismos
patgenos. Utiliza Patentes de EE. UU. n. 5496562, 5756126,
5807527,5972386, 5985327 y otras patentes pendientes.
Ventajas y beneficios:
Captura de cido nucleico en un paso sencillo
Los cidos nucleicos capturados estn listos para posteriores
aplicaciones en menos de 30 minutos
El ADN obtenido en las tarjetas FTA es estable durante aos a
temperatura ambiente
Las tarjetas FTA se conservan a temperatura ambiente antes y
despus de la aplicacin de la muestra, reduciendo la necesidad del
uso de congeladores en el laboratorio
Adecuadas para prcticamente cualquier tipo de clula y/o
microorganismo

2Por qu se us el isopropanol?
Para extraer el ADN de la solucin, este se hace insoluble mediante
la adicin de etanol o isopropanol (alcohol isoproplico). Al hacer
esto, el ADN se hace visible en la solucin como una sustancia
blanca filiforme. A pesar de que cuando el ADN es insoluble se lo
puede aislar de los componentes celulares restantes, no es
"utilizable". Despus de aislarlo, se elimina el alcohol, y el ADN debe
ser devuelto a una solucin buffer biolgica, tal como la solucin
Tris, para ser utilizado.






3Por qu se usa la proteinasa K?
La proteinasa k es serina proteasa que tiene como una de sus
funciones degradar a la queratina, debido a ellos su nombre de
proteinasak.Esta protena se obtiene a partir del hongo
tritirachium lbum. Tiene como funcin liberar el ADN nuclear al
medio y digerir las protenas. Luego de esto se desproteiniza la
muestra mediante una deshidrogenacin y precipitacin de
protenas celulares provocadas con una solucion saturada de NaCl, y
finalmente se obtiene ADN por precipitacin con alcohol etlico
absoluto.


4Por qu se utiliz el buffer de lisis?
El buffer de lisis es utilizado en la extraccin del ADN porque posee
detergentes que son afines qumicamente a los lpidos de la
membrana celular y nuclear, provocando su ruptura, debido a
tambien a la presencia de EDTA, que es un quelante (captura a
iones divalentes como el Ca y Mg, responsables de mantener la
integridad de la membrana celular).






5Por qu se utiliz el buffer de lavado?
El buffer de lavado es un buffer que posee ciertos componentes que
me sirven para purificar el ADN. Esto me ser til en el proceso de
purificacin del ADN.

6Por qu se utiliz el buffer de inhibicin?
El buffer de inhibicin de remocin es tambien un buffer de lavado
pero que posee menos componentes.
La funcin de este buffer es la de dejarme al ADN ms puro.


7Por qu se utiliz el buffer de elucin?
El buffer de elucin es el ltimo buffer utilizado ya que me sirve
para hidratar al filtro, lo que provocar su hinchazn y por ende
causar el descenso del ADN







8Por qu el uso de la tcnica de Cromatografa de adsorcin?
La tcnica de cromatografa de adsorcin es muy eficiente ya que
me permite obtener ADN muy puro.
Esta tcnica se basa en la absorcin y desorcin de cidos nucleicos.
Bajo condiciones nativas, el cido nucleico se halla recubierto de
molculas de agua, formando una estructura ordenada, lo que
mantiene la solubilidad del ADN en soluciones acuosas.
Al adicionar sales coatrpicas, estas desestabilizan la ordenada
estructura de la capa hidratante que cubre al ADN, provocando un
entorno hidrofobico ( GERALD KARP, BIOLOGIA CELULAR Y
MOLECULAR: CONCEPTOS Y EXPERIMENTOS, 6ta Ed. China 2011,
pag752.)




CUESTIONARIO
1. Describa las normas de bioseguridad mnimas que se deben seguir en
un laboratorio de anlisis clnico.
Para prevenir la adquisicin de enfermedades infectocontagiosas
relacionadas con el trabajo del personal del laboratorio, es fundamental
implementar medidas de buenas prcticas de bioseguridad.
El trabajador tiene el derecho a conocer los riesgos existentes en su lugar
de trabajo y es, en ltima instancia, el responsable de cumplir las medidas
de bioseguridad instauradas en la institucin
Los procedimientos que implican el uso de elementos de proteccin
personal (EPP) para impedir la contaminacin con material infeccioso o
txico durante su manipulacin en el laboratorio se denominan tcnicas
de barrera y son utilizados como una medida de contencin en el manejo
de material infeccioso en el laboratorio.
En el trabajo de todo laboratorio, es imprescindible conocer y respetar las
normas bsicas de bioseguridad con el fin de resguardar la seguridad del
personal:
Delimitar las reas tcnicas y las administrativas en el laboratorio.
Las reas de trabajo deben mantenerse ordenadas, limpias y libre de
materiales no relacionados con el trabajo.
No est permitido comer, beber, fumar, manipular lentes de contacto,
maquillarse o aplicarse cremas en las reas de trabajo.
No guardar alimentos o bebidas en refrigeradores destinados al
almacenamiento de muestras o reactivos.
No pipetear con la boca.
Si usa lentes de contacto extremar la proteccin de la mucosa ocular.
Est prohibido el uso y almacenamiento de decoraciones festivas o de
otro tipo en el rea tcnica.
Al momento de salir de las reas tcnicas retirar los EPP y lavar manos
con abundante agua y jabn.
Utilizacin de sealizaciones en el laboratorio que permitan entregar
informacin clara y rpida al personal tanto interno como externo. El
propsito de las sealizaciones es indicar la ejecucin de una actividad,
prohibir una accin o conducta, advertir respecto de una situacin o
condicin ambiental o instruir sobre cmo realizar una actividad.
La Higiene de manos es una prctica fundamental en el laboratorio y
puede ser realizada de dos formas, lavado de manos con agua y jabn o
uso de soluciones de alcohol.
Dado que el lavado de manos es una prctica fundamental es muy
importante conocer:
En qu momento se debe realizar
Cada vez que se contaminen con cualquier fluido biolgico, cuando se
retiran los guantes de procedimiento, cuando se retire de su rea de
trabajo y/o sale del laboratorio, etc.
2. Si se desea realizar un anlisis gentico con valor pronstico en un
paciente con cncer de tiroides, indique qu muestras deberan ser
analizadas y proponga un mtodo de extraccin de dicha muestra.
Creo que se podra tomar una muestra de sangre para visualizar hormonas
y una biopsia para ver con ms detalle el tejido.
El procedimiento en el que se toma para una muestra de sangre sera
conveniente sacarla de la zona donde se haya el tumor. Se debe verificar
si la sangre contiene concentraciones anormales de hormona estimulante
de la tiroides (HET).
Para el tejido es conveniente realizar una extraccin del ndulo o lbulo
de la tiroides durante una ciruga para que un patlogo pueda observar las
clulas y tejidos al microscopio, y verificar si hay signos de cncer.
3. Investigue: Cul es la diferencia ms resaltante entre extraer ADN de
fluidos y de tejidos slidos?
La diferencia est en que la extraccin de ADN de fluidos tiene un acceso
directo, es decir, un acceso facilitado y proporciona un muestra
abundante en el sentido de material para poder visualizar, mientras que
la extraccin de tejidos solidos (biopsia) es solo en el caso de querer
estudiar mutaciones somticas siendo de foco el tejido, como algunos
tumores.


4. Investigue: Cules son los pasos a seguir para la purificacin de ARN?
Pasos generales:
Homogeneizar clulas
Purificar el RNA (total o no total)
Cuantificar el RNA purificado
Calidad del RNA






Referencias bibliogrficas:

* GERALD KARP, BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR: CONCEPTOS Y
EXPERIMENTOS, 6ta Ed. China 2011, pag742.
*De Robertis-HIB-PONZIO: BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR De de
Robertis, 15ta edicin, editorial El Ateneo, buenos aires-argentina
2003,pag 358,359,360.